救你妈吧我在游会
范文一：聚乙二醇在蛋白质纯化中的应用
聚乙二醇在蛋白质纯化中的应用
摘要：本课题将对聚乙二醇在蛋白质纯化中的作用、优势、应用范围及对于性质鉴定的影响等方面进行研究，为从生物体中提取活性蛋白质组分提供更好的方法和思路，并为聚乙二醇在蛋白质纯化中的应用提供依据。
关键词：聚乙二醇 ;球蛋白; 清蛋白
Abstract: In this thesis, PEG used in protein purification will be studied it’s function, advantage , application scope and other aspects. From these facts , It can provide better way and better thinking in extracting protein alive ,and also offer basis of purification.
Key words: polyethylene Glycol , globulin,albumin
1 材料和方法
1.1材料
5%卵清蛋白溶液（新鲜鸡蛋清：水=1：9）为自己所配制的溶液；紫外扫描光谱仪Lambda17型（PERKIN-ELMER公司）；荧光分光光度计LS50B型（HITACHI公司）；FTIR谱仪NEXUS670型（Nicolt公司）；其他试剂为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1不同沉淀蛋白质方法的比较，即用硫酸铵的盐析法；用乙醇的有机溶剂沉淀法；用聚乙二醇的有机溶剂沉淀法和用5%三氯乙酸的有机酸沉淀法
1.2.2 产物性质鉴定用紫外光谱比较法和红外光谱比较法
2 结果与分析
2.1 用聚乙二醇提纯蛋白质不需要考虑盐浓度、PH,甚至蛋白质的绝对溶解度（在水中）等因素(
即三者对于用聚乙二醇提纯蛋白质来说影响不大).
2.1.1证明蛋白质在聚乙二醇中的溶解度与盐浓度无关
不同盐浓度卵清蛋白溶液（硫酸铵）直接加入聚乙二醇
不同盐浓度卵清蛋白溶液（硫酸铵）用聚乙二醇反透析比较
注 ：反透析法就是把聚乙二醇放在透析袋中，让水能进出透析袋中，而蛋白质不能进出透析袋.
结果： 在试管底都出现乳白色絮状沉淀，沉淀的量如上面的表格所示,其波动值
结果： 在试管底都出现乳白色絮状沉淀，沉淀的量如上面的表格所示,沉淀的量基本相等，加水后能继续溶解(证明其未变性).
2.1.3证明蛋白质在聚乙二醇中的溶解度与蛋白质的绝对溶解度无关(注:本实验的基础是建立在《基础生物化学实验》第136页实验结果的基础上的.)
溶解度不同的蛋白质溶于聚乙二醇，根据其盐析所需要硫酸铵的量的不同，证明其球蛋白与清蛋白溶解度不一样。反透析法析出的蛋白质，再溶解，盐析，析出的顺序和5%卵清蛋白溶液盐析析出顺序相同。
结果：球蛋白为白色沉淀，清蛋白为乳白色絮状沉淀（把上清液倒出，然后加水再溶解，再加为分级沉淀。盐析法先把溶液加到半饱和时，析出的是球蛋白，然后加到饱和时，析出的蛋白质为清蛋白。）
2.2证明聚乙二醇有保护蛋白质的功能
(1) 一般认为析出后加水能继续溶解的蛋白质，是没有变性的.
(2) 检验蛋白质是否变性的方法可有: ①结晶比较，最可靠，但比较难的到
晶体
②再溶解，简单，但不一定可靠
(3) 分别用硫酸铵、乙醇、聚乙二醇和5%三氯乙酸分别对5%卵清蛋白溶液进行蛋白质沉淀并对比该组反应
结果：加入硫酸铵得到沉淀物，加水后能继续溶解。
加入乙醇的溶液上方变为白色，加水后不能继续溶解
加入聚乙二醇的一次性沉淀，沉淀物加水可继续溶解
加入5%三氯乙酸的为白色沉淀，加水不溶解
3．讨论
聚乙二醇广泛的应用范围：
3.1聚乙二醇对可溶性高分子化合物的修饰作用:
聚乙二醇作为可溶性高分子化合物可修饰酶蛋白的侧链，提高酶的稳定性，改变酶的一些重要性质。如聚乙二醇修饰天冬酰胺酶、尿激酶，修饰过的酶在血液中的半衰期无一例外的成几倍，几十倍的增长，抗原性消失，耐热性提高，并具有耐酸性、碱性和抗蛋白酶的作用。
3.2在细胞融合当中的作用:
把小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（淋巴细胞）在聚乙二醇的介导下发生融合。
参考文献:
1、《生物化学》第二版 沈同王镜岩主编196-225, 166-168
2、《细胞生物学》第一版 翟中和丁明孝王喜忠主编 69
3《基础生物化学实验》第二版 王秀奇 秦淑媛高天慧 颜卉君主编 135-138
4、《生物化学》第三版王镜岩主编345
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范文二：超滤技术在蛋白质纯化中的应用
中国药师 2004年第7卷第3期
表2 穿琥宁注射剂与其他药物在常用输液中不适宜的配伍
配伍药物庆大霉素阿米卡星氧氟沙星环丙沙星阿米卡星西索米星妥布霉素 头孢唑林钠
Vit C
203
用量
8000u 50mg 50ml 50ml 50mg 10mg 2万u
配伍输液
0. 9%氯化钠注射液0. 9%氯化钠注射液
配伍方式
将穿琥宁50mg 配伍适量药物用
0. 9%氯化钠注射液溶解稀释至50ml 。将穿琥宁50mg 加入50ml 氧氟沙星或环丙沙星注射液
配伍稳定性
穿琥宁注射液与庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、氧氟沙星配伍后有沉淀生成, 不
[2]
宜配伍。
注射用穿琥宁与阿米卡星、西索米星和妥布霉素这些酸性较强的氨基糖苷类抗生素配伍后有沉淀生成, 外观浑浊。不宜配伍, 且不宜交叉使用同一针头[3]。
1. 5h 内有沉淀生成,pH 值无显著变化,
中
5%葡萄糖注射液5%葡萄糖注射液5%葡萄糖注射液
将穿琥宁40mg 用适量5%葡萄糖注射液溶解, 加入各配伍药物溶解稀释至50ml
将800mg 注射用穿琥宁与其配伍溶于0. 9%氯化钠注射液300
ml 。室温观察4h
5g
0. 9%氯化钠注射液
200mg
5%葡萄糖注射液
不溶性微粒数明显超限, 穿琥宁含量在4
h 内显著下降, 临床上应禁止合瓶使
500ml 5%葡萄糖溶液中含500mg 穿琥宁和适量药物。在(20±3) ℃和(38±1) ℃恒温水浴中观
用[4]。
穿琥宁注射液与Vit C 配伍后(20±3) ℃时外观呈淡黄色, 且含量下降, (38±
1) ℃时黄色加深且含量无法测定。穿琥
阿米卡星
Vit B 6
察6h
将穿琥宁200%24h C 不宜配伍[6]。Vit B 6配伍立即出现乳白色浑浊, 24h 后仍浑浊。临床输液中穿琥宁与这两种药物不能合用[7]。
5 郭洁文, 侯小玲, 秦乐平. 注射用穿琥宁与4种抗生素配伍的稳定
200mg 100mg
5%葡萄糖注射液5%葡萄糖注射液
他药物配伍输液, 致无异议的配伍方案, 这样才能做到安全、合理有效用药。
参 考 文 献
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(2003204214收稿)
超滤技术在蛋白质纯化中的应用
张笑颜 (沈阳第一制药厂 沈阳110023) 张庆义 吴永刚 (沈阳三生制药股份有限公司)
关键词 超滤 蛋白质 应用
中图分类号:TQ460. 6 文献标识码:A 文章编号:10082049X (2004) 0320203203
超滤(ultrafiltration ,UF ) 技术自1861年Schmidt 进行第一个超滤试验至今, 已有1个多世纪。超滤在工业上的应用始于20世纪60年代中期, 目前已广泛应用于化学工业、医药工业、工业废水处理、纯
204China Pharmacist 2004, V ol. 7 N o. 3
水制备和生物工程领域, 发展迅速, 前景良好。
超滤是以压差为驱动力的膜分离技术。选用不同孔径的不对称性微孔膜, 按照截留分子量的大小, 可分离300～1000kD 的大分子物质。溶质或悬浮物料按大小不同而分离, 比膜孔小的物质和溶剂一起透过膜, 而较大的物质则被截留[1]。这是一个简单的过程, 在操作过程中无相变化, 不会改变产品的性能和活性; 超滤过程不用添加任何化学药剂, 无需热处理, 特别适用于热敏性物质, 对不稳定产品是安全的; 超滤设备和工艺较其它分离方法简单, 耗能低, 滤膜可以反复多次使用; 超滤处理量大, 处理时间短, 样品残留小, 产品收率高。正是由于超滤技术具有如此多的优越性, 所以广泛应用于基因工程下游蛋白质的分离纯化。主要用于脱盐、浓缩、缓冲液置换、蛋白质分级分离以及除热原过程。1 超滤膜的选择
同, 在选择膜的时候需要注意。
由于超滤的滤过性能受到所用膜材质、被处理微粒的电荷、分子大小及形状等方面的影响, 其精度不可能很高, 要使蛋白质达到较好的分离效果, 一般要求超滤膜截留分子量与目标蛋白分子量相差10倍以上。2 超滤中存在的主要问题及解决方法2. 1 膜污染
膜污染通常分为表面污染和内部污染, 表面污染是由于蛋白质与膜相互作用而在膜表面吸附; 内部污染是由于蛋白质沉淀而堵塞膜孔径。蛋白质吸附在膜表面上常是形成污染的主要原因, 调节料液的pH 远离等电点可使吸附作用减弱。但如吸附是由于静电引力, 则应调至等电点。盐类对污染也有很大影响,pH 高, 盐类易沉淀;pH 低, 盐类沉积较少。加入络合剂如E DT A 等可防止钙离子等沉淀。2. 2 浓差极化与切向流过滤
。(,TFF ) 是防止浓差。TFF 是指液体在泵的驱动下沿着与膜表面相切的方向流动, 在膜上形成压力, 使部分液体透过膜, 而另一部分液体切向地流过膜表面, 将被膜截留的粒子和大分子冲走, 避免它们在膜表面上堆积, 造成膜堵塞和流速下降。所以TFF 是一种理想的分离方法。3 超滤在蛋白质纯化中的应用
在蛋白质的纯化过程中超滤的最主要应用是脱盐和浓缩。超滤法脱盐和浓缩的特点是批处理量大, 操作时间短, 蛋白回收率高。郭立新等在丙种球蛋白制品的生产过程中将超滤技术用于蛋白质的脱醇和浓缩[2]; 温涛等将超滤技术用于人血白蛋白浓缩和脱醇[3]; 李继珩等在人超氧化物岐化酶的纯化中采用超滤技术进行蛋白质的脱盐和浓缩[4]; 张和平等采用超滤法浓缩分离免疫初乳中的抗体[5]; 丁凤平等在肝素生产中应用超滤技术进行浓缩[6]。以上这些应用都取得了良好的脱盐和浓缩效果。
超滤技术还用于蛋白质的分级分离, 这方面的报导也比较多。马培松等进行了平板式膜分离免疫球蛋白的研究[7]; 罗桂荣等在细胞色素丙的纯化过程中使用了超滤技术[8]; 樊晶等应用萃取2超滤两步法从过期人血中提纯人血白蛋白[9]; 周柏林应用超滤技术分离血浆蛋白[10]。若想使两种蛋白质用超滤完全分离, 其分子量差异必须达10倍以上。与色谱法比较, 超滤分离精度不高, 同时不能多组分的分
超滤技术的关键是超滤膜, 超滤膜上的微孔具有不对称结构。在滤膜的工作面上有一层极薄的致密层, 该层微孔的孔径小至2～15nm 。下部是结构
较疏松的支持层, 孔径大于15nm 。这种膜结构使流经膜表面时, , 也不会停留。而小分子物质和溶剂则在压力驱动下穿过致密层上的微孔后能顺利穿过下部的疏松支持层, 进入膜的另一侧, 从而使超滤膜在长期连续运行中保持较恒定的产量和分离效果。
超滤膜的材质有许多种, 不同材质超滤膜的特点也不相同, 一般常用的超滤膜有聚砜膜和再生纤维素膜。聚砜膜通透性好, 流速较快, 耐酸碱能力强, 操作的pH 范围是1～14, 可用NaOH 清洗和保存。适合于蛋白浓度较高的溶液(如蛋白浓度>20g ?L -1) , 操作温度4～50℃。再生纤维素膜蛋白吸附低, 适合于蛋白浓度较低的溶液(如蛋白浓度<20g ?l="" -1)="" ,="" 有利于提高蛋白收率。耐溶剂性能好,="" 可承受含有乙醇的溶液,="" 耐酸碱性能好,="" 操作的ph="" 范围是2～13,="" 可用naoh="" 清洗,="" 操作温度(4～50)="">
超滤膜的孔径是用分子量(NMW L ) 来标定的, 比膜标定分子量大的粒子和分子将被截留, 而比膜标定分子量小的粒子或分子将透过膜; 但是, 超滤膜的孔径不是绝对的, 膜在截留大部分比其标定分子量大的溶质的同时, 也会截留一部分比其分子量小的溶质。因为溶质的形状、可压缩性和与溶液中其它物质的相互作用, 都会影响膜对它的截留性。另外, 不同超滤膜生产厂家, 标定膜分子量的标准不
中国药师 2004年第7卷第3期
离。故通常不用超滤进行蛋白质的精细分离。
对于分子量小于3kD 的产品, 超滤还有除热原作用。张惠新等对中空纤维超滤膜去除细菌内毒素效果进行了研究[11]。一次超滤, 就可以使热原水平达标, 对产品无任何污染, 并且对产品的吸附小, 不会影响产品的收率。
超滤技术虽然广泛地应用于蛋白质的分离纯化, 但也有一定的局限性, 如果要分离的两种产品的分子量相差不到5倍, 则无法用超滤进行分离。如果产品的分子量小于3kD , 则不能用超滤进行浓缩, 因为通常超滤膜的最小分子量位1000NW M L 。
随着生物工程产业的不断发展, 对下游分离、纯化技术提出了更高的要求。传统的真空浓缩、溶媒萃取、透析、离心、沉淀、除热原等方法已经不能满足生产的需要。超滤技术由于其在蛋白质分离方面的种种优越性, 应用必然会越来越广泛。
参 考 文 献
1 俞俊棠, 唐孝宣主编. 生物工艺学[M].上海:
华东化工学院出版
205
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(2003207207收稿)
伊曲康陈子安 雷招宝 ( 丰城331100)
关键词 伊曲康唑 肝毒性
中图分类号:R978.5 文献标识码:A 文章编号:10082049X (2004) 0320205202
伊曲康唑(itraconazole ,ITR , 斯皮仁诺) 为三唑类抗真菌药, 抗真菌谱比酮康唑(ketoconazole , KET ) 氟康唑(fluconazole ) 更广, 对多种真菌具有强力的抗菌作用。适用于治疗敏感真菌引起的各种真菌病。一般认为ITR 比KET 安全, 因为国内外关于KET 肝毒性致死的病例数不断增加, 而到目前为止国内还没有ITR 因肝毒性致死的病例报告。但2001年美国FDA 已收到24例ITR 致肝衰竭并有数例死亡的报告[1]。国内许礼宾等[2]报告ITR 治疗182例甲癣的病人97例进行了肝功能检测者无1例发现异常。然而,Tucker 等[3]进行的研究发现ITR 使7%的病人出现肝功能异常。本文就国内(6例) 国外(5例, 其中1例是与两性霉素B 合用所致) 关于ITR 肝毒性的个案报告进行综合报道, 以期引起临床工作者的注意。1 病人基本情况[4～10]
11例病人中男5例, 女6例, 年龄26～75岁。
所患疾病:甲癣4例, 慢性跖和趾甲真菌病2例, 支气管肺曲霉菌病2例, 牛皮癣、致命性肺芽生菌病、食管念珠菌病各1例。病人无肝炎、输血或手术史。2 肝毒性的临床表现
病人一般症状为乏力、厌食、恶心、右上腹部疼痛、腹胀、黄疸、棕色尿或大便灰白色; 体温升高至40℃以上; 肝胆B 超检查一般正常; 个别病人还伴有皮肤瘙痒、体重减轻、头痛、失眠等症状。3 肝毒性的实验室结果
实验室检查结果均有天门冬氨酸转氨酶(AST ) 、丙氨酸氨基转移酶(A LT ) 、碱性磷酸酶(AP ) 、
γγ乳酸脱氢酶(LDH ) 、2谷酰基转移酶(2G T ) 异常升
高; 有黄疸者则总胆红素和结合胆红素升高; 甲、乙、
丙型肝炎(-) ; 弓形体病、E B 病毒、衣原体、巨细胞病毒均为阴性。下面将实验室数据报告比较完整的6例病人的实验室结果(单位:u/L , 圆括号内数据为正常值上限的倍数) 列于表1。
范文三：蛋白质的应用
蛋白质的用途 吸收充足的蛋白质，会使一个人体力充沛，耐力持久。而蛋白质缺乏会导致贫血。不过缺乏任何一种营养素也都有形成贫血的可能。 正常情况下，补充充分蛋白质，我们就可以抵抗多种疾病及病毒传染。我们身体里能低抗病毒传染的东西还有两种：一种是抗体，我们的肝脏产生抗体，抗体的功能是转化各种病毒成为无害物质。二是白血球，是防止病菌侵袭，它能将细菌吃掉，白血球的任务可分两种：一部分在淋巴和血液里循环，另一部分在淋巴和血液里循环，另一部分驻在血管壁中，肺的小气囊中及其他组织内，随时消灭入侵的病菌。这种白血球内的某些成分，也是由蛋白质形成的，唯有食物内高蛋白充足时才能够产生。蛋白质也能防止体液成为酸性或碱性。也就是说，它有中和体液作用。体液也是制造各种荷尔蒙的基本原料。蛋白质也是防止血液凝固不可缺的食物。它还有很多种用途，如果没有它，生命简直不可能延续下去。 近几年来，医学界正在做一种实验，就是由健康人的血液内将免疫性的球蛋白质抽出，再注射到营养不良的人体内，这种方法主要是帮助营养差的人，预防感冒，而且公认颇有效果，假如营养充足，身体就会产生各种抗体，以抵御病毒的侵袭。据实验，一个人低蛋白食物改换成高蛋白质食物，身体内所产生的抗体，在一周内会增加一倍。 一、蛋白质在生物体内的作用 早在1878年，恩格斯就指出" 生命是蛋白体存在的形式" ，他科学地提出了蛋白质与生命的关系。现代生物化学和分子生物学的实践完全证实并发展了这一科学论断，蛋白体就是蛋白质和核酸的原生质，它们是生命活动过程中最重要的物质基础。 蛋白质在生命活动中的重要性，主要表现在两个方面： （一）蛋白质是构成生物体的基础成分 蛋白质是生物的主体，不论是低等动物还是高等动物。人体内蛋白质含量占人体总固体量的45%，皮肤、内脏、血液、骨骼、神经系统等都是以其为主体成份；植物中也是如此，特别是植物种子。 （二） 食物蛋白质（氨基酸）的生理功能 维持组织器官的生长发育、更新和修补被损伤细胞的作用。蛋白质是人体细胞的主要组成成份，儿童必须食入足量的蛋白质，才能维持其生长发育；成人也必须食入足量的蛋白质才能维持其组织的更新，特别是组织损伤时也需要蛋白质作为修复的原料。合成重要的生化物质，如酶、核酸、血经蛋白、免疫系统物质、神经递质和激素及合成各种人体需要的蛋白质。 供应能量。每克蛋白质可产生4千卡热量。 蛋白质维持生长发育、更新、修补组织和合成重要含氮化合物，是必不可少的，是糖和脂肪不能代替的。 蛋白质不仅在功能上与糖、脂肪不同，组成也不同。根据蛋白质的元素分析证明，除碳、氢、氧外，一切蛋白质皆含有氮、硫、磷、铁、锰、碘和锌等元素。 二、 蛋白质分类 蛋白质种类繁多，功能复杂，人体有十万种以上的不同蛋白质，生物界蛋白质种类约为10的10次方数量级。划分的形式也很多，一般可根据分子形状、组成、溶解度或者根据在机体的部位进行划分。 按组成分类： 单纯性蛋白质：分解后只是氨基酸，如清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白子、硬蛋白和植物谷蛋白等。结合蛋白质，由单纯蛋白质与非蛋白部分组成如：糖、色、脂、磷、金属、蛋白等。 按机体部位分： 中心蛋白质：组成内脏器官（心肝脾肺肾大脑等）、血液、免疫系统去除脂肪后的部分称为中心蛋白质。 周围蛋白质：组成骨骼、肌肉去除脂肪后的部分称为周围蛋白质。
范文四：重组蛋白质的分离纯化
重组蛋白质的分离纯化
摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体
随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术
1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。盐析法的特点是成本低,不需要特别设备，操作简单、安全,对蛋白质的一些生物活性成分破坏较少,缺点是选择性不强。
1.2 有机溶剂沉淀法向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，降低水的活度，随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而使蛋白质凝聚和沉淀。其特点是：选择性高；其次，沉淀后所得产品不需脱盐，残留的沉淀剂通过挥发即可除去。但是有机沉淀剂对具有生物活性的蛋白质、酶类具有失活作用，因而常常需在低温下进行操作。
1.3 等电点沉淀法其原理是通过调节溶液的pH值，使两性电解质在溶液pH值处于等电
点时，分子表面净电为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，两性电解质的溶解度下降，从而沉淀析出。
1.4 变性沉淀法利用生物大分子物质对物理、化学等外部环境因子敏感性的差异而选择性地使一种组分发生变性形成沉淀，而另一些组分保持不变，从而达到分离、除杂和提纯的目的。此方法包括：热变性沉淀分离；酸碱变性沉淀分离；利用表面活性剂或有机溶剂引起变性沉淀分离；利用酶进行变性分离。
2 液液萃取技术
液液萃取技术是常用分离技术之一，在生物化工中也有广泛的应用。然而，大部分生物物质是有生物活性的，需要在低温或室温条件下进行分离纯化，而采用传统萃取技术无法完成。
双水相萃取技术是近年来发展很快的一种生物分离方法，与传统的液液分离方法相比，双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势：蛋白质在其中不易变性；分相时间短，一般只需5～15 min ；易于放大和进行连续性操作；萃取环境温和，生物相容性高；聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等[3]。近年来一些学者将双水相萃取技术与膜分离技术结合起来，较好地解决了生物大分子在两相界面的吸附和乳化作用并且加快了萃取速率。还有一些学者利用亲和反应的高度专一性，在萃取剂上接上一定的亲和配基，使得双水相萃取体系不仅具有处理量大的特点，而且具有专一性，提高了萃取效率。
液液反胶团(Reversed Micelles ,RM) 体系萃取技术是90 年代以来发展较快的另一种萃取技术, 是依赖表活剂液液萃取技术的一个分支 [4]。反胶团是离子型表面活性剂分散在非极性溶液中形成的,由表活剂的极性头向内形成一个围绕“水核”的纳米级微团[5]。在这微团中由于表活剂极性头的保护，可使包溶的的蛋白质不易变性。此外反胶团萃取体系还具有操作条件温和，对目标蛋白选择性好，容量大和易于扩大再生产的优点。当然反胶团体系萃取技术也有其不足之处，以往采用单一表活剂AOT 或季氨盐的反胶团萃取体系易受溶液pH、温度、离子强度和离子种类等因素的影响。目前为了克服这些缺点，往往在反胶团体系中加其它表活剂作助剂或者采用阴、阳和非离子复合型表活剂的反胶团体系的方法来解决
[6]。
3 层析法
3.1 离子交换层析原理是用离子交换剂作为吸附剂，将溶液中的离子依靠静电引力吸附在吸附剂上，同时从吸附剂上置换出另一种离子，然后用适当的溶液将吸附物从吸附剂上置换下来，进行浓缩富集，从而达到分离的目的。其吸附作用来自离子间的静电作用。
蛋白质为两性物质，不同的pH，所带的电荷也不同。不同的pH和不同的离子强度下，蛋白质在不同的离子交换树脂上的吸附程度也不同。如果能够选择适当的条件，对蛋白质的分离纯化能起到事半功倍的效果。多数蛋白对酸碱不太稳定，因此对蛋白来说多用弱离子交换树脂。有一类特殊的商品化离子交换树脂，Sigma产品目录上成为聚缓冲液交换剂。先用某一pH缓冲液平衡聚缓冲液交换剂，再用另一pH缓冲液平衡，就能在这种离子交换剂上建立一个pH梯度。上样后，用一种具有pH梯度的聚缓冲液洗脱树脂时，被吸附样品中的蛋白质就能按照他们的等电点次序被依次洗脱。在这个过程中，同时产生聚焦作用，致使个蛋白质分级变得很窄，样品高度浓缩，整个分离过程也呈现出很高的分辨率，称为层析聚焦技术
[7]。
3.2 疏水层析蛋白质内部有疏水部分，蛋白质表面常存在非极性氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸）形成疏水区、蛋白质的疏水程度取决于暴露的或埋藏的氨基酸的疏水性之和。疏水性氨基酸的数目、疏水性及他们的分布形成了蛋白质的特性。不同的蛋白质分子的疏水性强弱有较大差异。疏水层析就是利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质分离纯化的方法。
在离子强度较高的盐溶液中，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，暴露出疏水部位，疏水性相互作用增大。故蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相盐析盐浓度（离子强度）的提高而增大。因此，疏水层析中蛋白质的吸附需在高浓度盐溶液中进行，而洗脱则主要采用降低流动相离子强度的线性梯度洗脱法或逐次洗脱法。
由于疏水层析分析纯化蛋白质的原理与离子交换层析完全不同，因此疏水层析与离子交换层析互补短长，用于离子交换层析难以分离的蛋白。周维国等人以Octyl Sepharose 4 Fast Flow为层析介质分离硫酸铵分步沉淀法制备的重组蛋白MSH-Ang粗纯化样品，,回收率达85%,重组蛋白MSH-Ang纯度达65%以上[8]。
3.3 反相层析反相层析利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性（疏水性）的差别进行蛋白质的分离纯化。与疏水层析相似，反相层析中溶质也是通过疏水性相互作用分配于固定相表面。但是反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现出强烈的疏水性，必须采用极性有机溶剂（如甲醇、乙腈等）或水溶液进行溶质的洗脱分离，多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。
反相层析主要用于相对分子量较小的蛋白质的分离纯化。其中运用最广泛的是反相液相色谱。Boyes等报道了用连续 RPLC 对细菌原液中的重组人淀粉状蛋白前体多肽片段进行分离[9]。
3.4 亲和层析许多生物活性物质具有与其他某些物质可逆结合的性质，生物物质的这种结合能力成为亲和力。生物亲和力具有高度的特异性，即一种生物物质只能与另一种特定的物质结合。亲和层析是将有亲和力吸附作用的物质分子（配基）偶联在固体介质（载体）上作为固定相，用以分离纯化目的蛋白的方法。
亲和层析具有高度的选择性、分辨率和载量优的特点，只需要一步处理便可从一个混杂有多种高浓度无关蛋白质的复杂材料中纯化出少量的目的蛋白，纯化系数可达数千倍，回收率很高，并且对纯化物有浓缩效果，是分离纯化蛋白质的有力工具。
根据配体与生物大分子之间相互作用体系的不同，可以把亲和层析分为以下四种类型。
3.4.1.生物亲和层析
利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析。典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素-受体等。陈嫚用交联琼脂糖为载体,三聚氯氰为活化剂,刺桐胰蛋白酶抑制剂为配基,制备亲和填料，再用此亲和填料吸附重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体
( reteplase，r-PA )，得到高纯度的r-PA[10]。林敏等将编码有一个血吸虫谷胱甘肽S转移酶(GST)基因的pGEX表达载体与重组基因进行融合表达,其表达产物易为GSTrapTM亲和层析柱中的GST单体特异性吸附,洗脱,浓缩后经5%NaHCO3特殊处理而获得高纯度的重组融合蛋白[11]。GST柱具有纯化条件温和、蛋白回收率高的优点,但它的非特异性吸附过高,如对纯度要求不高时,可作为较好的选择。
3.4.2.免疫亲和层析
利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统，称免疫亲和层析。许多典型的亲和层析纯化蛋白质的过程已经使用了单克隆抗体作为亲和配体。目前,利用抗体-抗原模式,有可能得到每一种目标蛋白的单抗,然后以单抗为配基,通过亲和层析技术分离纯化重组蛋白。此种方法的纯化倍数、活性回收率非常高。
FLAG融合标签是由八个氨基酸(AspTyrLysAspAspAspAspLys)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的免疫吸附纯化。利用FLAG融合标签可以建立一个基于融合多肽的高效检测和纯化系统。FLAG标签结构短小,且与融合蛋白质之间含有一个肠激酶切割位点,可以通过肠激酶切割被除去。现已发展出了M1、M2和M5三种抗-FLAG单克隆抗体,FLAG融合抗原标签技术已经广泛用于重组蛋白质的纯化[12]。
陈登鸿就用单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素[13]。
3.4.3.固定化金属离子亲和层析
利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。目的蛋白质表面裸露的供电子氨基酸残基,如组氨酸的咪唑基,半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基,十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合。洗脱时,通过改变pH，加竞争的螯合试剂等方法，依据各蛋白组分与介质的亲和程度不同将目标蛋白与杂蛋白分离。这是固定化金属离子亲和层析用于蛋白质分离纯化的根据。已发现金属离子如锌离子和铜离子能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巯基结合。金属离子亲和层析具有分辨率高选择性好的特点，给分离蛋白质带来了很大方便。
冉波等利用镍离子亲和层析纯化获得带有六聚组氨酸尾的口蹄疫病毒VP1epi重组蛋白
[14]。张怀等人以Ni2+-IDA-Sepharose Fast Flow为层析介质,在变性条件下以咪唑和pH洗脱方式对Hepcidin(铁调素)融合蛋白进行纯化,纯化后的融合蛋白纯度大于95 %,而且不含咪唑,有利于下一步铁调素的制备[15]。金属螯合亲和层析的另一个优点是层析过程既可以在常规的非变性条件下进行纯化又可以应用于含6mol/L盐酸胍或8mol/L尿素的变性条件。这一优点尤其对以包涵体形式表达的重组蛋白纯化尤为有利[16]。
在实际应用过程中金属螯合亲和层析填料大都采用琼脂糖为介质，而琼脂糖颗粒表面较为粗糙,容易产生一些非特异性吸附现象。这一现象尤其出现在小量蛋白的分离或含疏水性蛋白多的情况中，而且也不适应快速分离蛋白，大大影响了金属螯合层析的分离效果。针对这一情况，90年代以来国外的一些科学家采用磁化或超顺磁化介质克服了这一缺点[17]。含有氧化铁的交联琼脂糖是常用的磁化填料，它们的颗粒非常细,表面极其光滑，将蛋白的非特异吸附降到最低的水平。美国的Qiagen公司已将此技术利用到商品化。
近年来，人们还将基因重组技术与金属螯合层析结合起来，在基因水平上为蛋白质的分
离纯化提供方便。其基本原理是在目的基因的N端或C端加上6个His,这样表达出的蛋白就可以直接用于金属螯合层析当中。QIAexpress系统就是美国Qiagen公司提供的商品化的试剂盒。该系统利用的pQE系列载体不仅有6个His编码序列还含有强启动子和多克隆位点等成分，可以将目的基因在宿主细胞中高效表达。表达后的产物可直接用金属螯合层析进行分离,有时可取得一步纯化的效果[18]。
3.4.4.拟生物亲和层析
拟生物亲和层析是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位，以人工合成的配基为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析。如染料亲和层析(DAFC)和氨基酸亲和层析(包括多肽亲和层析(AALA) [13]。染料配基，例如三嗪(Triazine)或三苯甲烷化合物，能通过共价键牢固地结合到亲和载体上。
此外，国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度，主要有AKTA系统、扩张柱床吸附层析、径向膜层析、灌注层析、置换层析等。
置换层析的分离原理是被吸附的各组分对固定相吸附部位的直接竞争作用的结果,依据与固定相的亲和性不同在置换剂的推动下,形成一系列已分离的置换序列[14]。
置换层析与传统洗脱层析的比较见下表：
表1置换层析与传统洗脱层析的比较
置换层析常常用于分离其他层析技术无法去除的分子量大小和带电荷数均与目的蛋白极为相似的杂蛋白，甚至可以去除目的蛋白的折叠异构物。置换层析的另一大优点是在高分辨率的情况下依然保持很高的上样量,这无疑为重组蛋白的生产提供了有效的手段。
4 重组蛋白包涵体的分离纯化
4.1 包涵体的形成包涵体形成的原因：(1)高水平表达时，疏水作用和离子作用以及蛋白质自身的错误折叠导致表达蛋白在宿主细胞胞质中形成包涵体；(2)宿主细胞内的还原性
环境使表达蛋白二硫键稳定性下降，出现错配二硫键；(3)宿主细胞蛋白酶对异源蛋白的降解作用；(4)原核细胞内缺乏真核生物蛋白质的加工与修饰系统；蛋白质形成的动力学研究表明：蛋白质折叠是一个产热过程，多种蛋白质在体内折叠过程中均有不耐热的中间体形成，这些中间体在宿主细胞温度升高时成为包涵体的前体物质，随后聚合成包涵体[21]。
4.2 包涵体对分离纯化的影响
在原核表达系统中表达的重组蛋白多以无活性的包涵体形式存在，需复性为活性蛋白分子才能加以应用。实践证明，包涵体对蛋白质的分离纯化有几方面的影响：(1)可以很容易的与胞内可溶性蛋白杂志分离，使得分离纯化较容易完成。包涵体具有高密度，对机械搅拌和超声破碎不敏感，并且在水溶液中通常不溶，因此可以通过简单的离心就可以分离得到，并且可以较容易的与胞内可溶性的杂质蛋白分离，有利于表达蛋白的分离纯化；(2)包涵体可以从匀浆液中以低速离心出来，以促溶剂(如尿素、盐酸胍、SDS)溶解，在适当条件下(pH、离子强度与稀释)复性，产物经过一个变形的过程，较易形成错误折叠和聚合体；(3)包涵体的形成虽然增加了提取的步骤，但包涵体中目的蛋白的纯度较高，可达20%~80%，且重组蛋白以包涵体的形式表达能有效地抵御如大肠杆菌中蛋白酶对表达蛋白的降解；(4)对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白，包涵体的形成无疑是最佳的选择。
4.3 包涵体蛋白的分离纯化
4.3.1.包涵体的分离纯化
用机械或超声等方法粉碎细菌，离心后取沉淀。由于包涵体相对稳定。可在去垢剂溶液或低浓度变性剂(如尿素)中初步洗涤纯化，而进一步纯化目前多用凝胶电泳(如SDS-PAGE、微过滤电泳等)、超滤／透析及各种色谱方法分离，常用的色谱方法有固定金属离子亲和色谱(如Ni—NTA亲合色谱)、Sepharose离子交换色谱、反相高教液相色谱(HPLC)、分子筛(SephadexoG-10)凝胶柱层析等。
具体选用何种工艺需要根据不同的重组蛋白而定，但在选择方法时基本要遵从以下原则：(1)选择能够最有效利用不同性质进行分离的方法；(2)尽可能用高得率的步骤；(3)把比较费事的和能有效提高纯度的步骤放到最后去做。
4.3.2.包涵体蛋白的溶解与还原
为了将包涵体中非天然折叠的多肽链打开，用高浓度的尿素和盐酸胍结合还原剂还原并溶解但涵体蛋白，但高浓度的尿素和盐酸胍会便蛋白质完全变性，不利于随后的复性。 Tris缓冲液、TritonX一100，强阴离子及阳离子表面活性剂(N一十六烷基吡啶氧化物、十六烷基三甲基氯化铵等)等溶剂则能使包涵体蛋白保持部分活性，从而提高重组蛋白的复性率。
4.3.3.包涵体蛋白的复性
蛋白质复性过程同时受到动力学及热力学因素的影响。形成天然活性蛋白质要求形成正确的二硫键及相互作用的结构域单元。所以，常在复性液中加入还原／氧化的巯基促进正确二硫键的形成。
复性前通常用稀释、透析、凝胶过滤层析等方法除去变性剂以促进复性，低浓度变性剂有助于提高活性蛋白最终产量，故复性液中常需加入一定浓度的变性剂 J。复性时加入低分子量添加剂(如L-精氨酸、去垢剂、Ca2+ 等)抑制蛋白聚集或利用基质结合技术也可提高复性率。
一般的复性方法是在低浓度蛋白质的条件下，用空气氧化或还原／氧化谷胱甘肽氧化法促进变性蛋白质复性，复性率低。使用含有还原剂的阳离子表面活性剂(N-十六烷基吡啶氧化物)可一步溶解及复性包涵体蛋白，不需进一步的快速稀释或透析即能提高复性率。用碱性溶液溶解包涵体并用强阴离子交换剂固定蛋白，则可在相当高的浓度一步进行蛋白的纯化与复性，克服了复性必需在低蛋白浓度的限制。反相微团是表面活性剂在有机溶剂中形成的纳米水平(1～10nm)的水相液滴，能在接近中性、低盐浓度的条件下纯化、抽提蛋白质，反相微团的水相池中溶解的蛋白质可保持部分活性，是一种快速、可连续操作、有潜力的液提取技术，适用于重组蛋白的大批量生产
综上所述，一般首先是菌体破碎，放出包涵体，包涵体经多次不同溶液洗涤后，溶解，然后利用柱层析纯化。纯化后蛋白用复性剂恢复蛋白活性。大致程序如此，其间可能由于不同蛋白或工艺需要，采用不同方法纯化，但基本以此程序为准[22]。
4.4 复性蛋白质的检测蛋白质的复性必须要有相应的检测方法，以鉴定复性蛋白质的生化、免疫学、物理性质及蛋白变性态与天然态的区别，检测的方法可以帮助优化复性方法和复性条件。最常见的方法有以下几种[23]：
(1) 凝胶电泳 其中最常用的是还原和非还原的SDS-PAGE，适于鉴定产物的纯度及复性蛋白质的聚集状态。
(2) 色谱学方法 主要利用蛋白质的色谱保留行为来研究已复性蛋白质、折叠中间体、聚集体与天然状态的蛋白质的构象差异。最常用的色谱方法是凝胶排阻色谱(SEC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC).
(3) 光谱学方法 主要有紫外色谱、荧光色谱和圆二色谱CD等，这些方法可用来研究蛋白质复性过程中构象的变化，特别用于鉴定折叠中间体和复性蛋白质的构象。
(4) 黏度与浊度 蛋白质的折叠状态不同，其溶解度存在一定差异，从而影响其黏度的变化，因此可以通过测定溶液的浊度来反映蛋白质聚集的快慢与程度，通常检测600nm或400nm处的吸光度。
(5) 免疫学方法 利用酶联免疫、蛋白印迹测定不同状态蛋白质的抗体-抗原结合力的差异，来测定不同状态蛋白质的构象变化。
(6) 生物学活性及比活性的测定 这是一个对最后的折叠状态进行评价的重要指标，一般通过动物或细胞模型直接测定复性蛋白所具有的生物学效应来表示。
4.5 重组Prohibitin融合蛋白包涵体的纯化
Prohibitin是近年来新发现的一种分子量为29．8kD、与肿瘤有关的蛋白。由异丙基一β—D硫代半乳糖苷(IPTC)诱导重组大肠杆菌BL2l(pET30a(+)-prohibitin)表达，其融合蛋白包涵体经过离心、超声破碎、洗涤、变性、复性后，用Ni—NTA Agarose亲和层析柱分离纯化 通过12％ SDS—PAGE胶和Bradford法检测其纯度和目的蛋白含量，用ELISA对纯化后的蛋白进行鉴定，纯度达90％以上。含量约0.3mg／ml[24]。
蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，由于重组蛋白在组织和细胞中仍以
复杂混合物的形式存在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来,而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索和选择一套综合上述方法的适当分离程序，以获得较高纯度的制品。综观重组蛋白质分离纯化技术的新进展,我们可以看到这样一个发展趋势:今后重组蛋白的分离纯化的技术发展将围绕着快速,高分辨率,高上样量,易于操作,低成本和电脑控制的全自动化等技术而展开。希望今后科学工作者能找出更多更好的方法来提纯蛋白质。
范文五：蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化
1.溶菌酶活性的测定
采用浊度法,用60mmol／L、pH6．2的磷酸缓冲液配制一定浊度0450--0．6"-'0．7)的溶壁微球菌(Micrococcus Lysodleikticus)为底物，取0．1mL酶液加入2．5mL底物(20℃)中，在波长450nm处读取反应体系3minl勾每隔1 5s的吸光度。以△彳45dmin变化0．001个吸光度值为一个活性单位。 酶活力=△450nm／lminx0．001 x0．1mL 式中：△450nm--lmin内吸光度的变化
2.阴离子交换柱纯化蛋白是看缓冲液中的盐离子浓度的，PH7.4只是作为缓冲保证蛋白活性的，你用阴离子交换柱要用盐梯度来洗脱，一般都是氯化钠，从0摩尔开始，逐渐增加盐的浓度，上限不定
3.上样过程是这样的，首先是样品上柱，这时候目的蛋白和一部分杂蛋白都会傍柱的，这时候出来的是FlowThrough里面应该有不上柱的杂蛋白，接下来在用无盐buffer冲洗一定的柱体积，会冲洗出一定量结合不牢固的蛋白，然后再用含盐的buffer洗脱，这一步要逐渐增加盐的浓度，可以拉线性也可以走梯度，一般不会直接用1摩尔的盐洗脱，应为1摩尔的盐基本上能洗脱阴离子柱上所有的蛋白了。
4.作酶的纯化时，每一部分，包括穿透峰，都应该做酶活测定，因为在事先是不能肯定需要纯化的蛋白是否就一定挂上柱了，只有当确定了目的蛋白对某种柱子的结合之后，确定穿透峰里面没有目的蛋白，才可以不用测定活性。否则就可能带来损失。 5.【1】分离胶的浓度和最佳分离范围： （1）SDS-PAGE分离胶浓度 －－－ 最佳分离范围 （KD) 6%胶 －－－－ －－－－－－－－50-150 8%胶 －－－－ －－－－－－－－30-90 10%胶 －－－－－－－－－－－－20-80 12%胶 －－－－－－－－－－－－10－40
（2）分离胶浓度（％） －－－ 线性分离范围（KD) 15 －－－－－ －－－－－－ －－12-43 10 －－－－ －－－－－－－－－16-68 7.5 －－－－－－－－－－－－36-94
5.0 －－－－ －－－－－－－ －57-212 【2】浓缩胶一般都是选4％或者5％ 下面是5％胶的配制方法：
成分 ----- 配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升) 5%胶 － － 2 － － 3 － － 4 － － 6 － － 8 － － 10
蒸馏水 － － 1.4 － － 2.1 － － 2.7 － － 4.1 － － 5.5 － － 6.8 30%Acr-Bis(29:1) － － 0.33 － － 0.5 － － 0.67 － － 1.0 － － 1.3 － － 1.7
1M Tris, pH8.8 － － 0.25 － － 0.38 － － 0.5 － － 0.75 － － 1.0 － － 1.25
10%SDS －－ 0.02 －－ 0.03 － － 0.04 －－ 0.06 － － 0.08 － － 0.1 10%过硫酸铵 － － 0.02 －－ 0.03 － － 0.04 － － 0.06 －－－ 0.08 － － 0.1
TEMED － － 0.002 －－ 0.003 －－ 0.004 － － 0.006－ － 0.008 － － 0.01 6.酶液应在-5~-20℃下冻存，量大的话建议浓缩冻干，若制成酶粉的话可在4℃下保藏 7.对于酶的纯化 建议你不要过柱子 这样浪费时间又得到的纯品少，用等电点把不同分子量
的酶给分离开，在用冷冻离心机把酶给分离出来，这样快而且酶还不失活。试一试吧。
实验室蛋白常用试剂配方
来源：生物谷 2008-10-22 访问量：9685 评论(0) 分享0
1、PBS:
取ZLI-9061 PBS溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，测pH值应在7.2~7.4之间，若偏离此范围，请用0.1N的HCL或NaOH调整。 2、TBS：
2.1 Tris缓冲液配方：（0.5 M pH7.6） Tris（三羟甲基氨基甲烷） 60.57g 1N HCL 约420ml 双蒸水 加至1000ml
Tris缓冲液配制方法：
先以少量双蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入HCl后，用HCl（1N）或NaOH（1N）将pH调至7.6， 最后双蒸水加至1000ml。此液为储备液，4℃冰箱中保存。 2.2 TBS配方：
Tris-HCI缓冲液（0.5M pH7.6） 100ml NaCI 8.5~9g (0.15mol/L) 双蒸水 加至1000ml TBS配制方法：
先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀。 3、枸橼酸盐缓冲液（Citrate buffer）： 3.1 储存液：
A. 0.1M枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸（C6H8O7·H20）溶于1000ml蒸馏水中。
B. 0.1M枸橼酸钠溶液：称取29.41g枸橼酸钠（C6H5Na3O7·2H20）溶于1000ml蒸馏水中。 3.2 工作液：
取9ml A液和41ml B液加入450ml蒸馏水中，溶液pH值应为6.0 0.1 4、胰酶（Trypsin）：
4.1 ZLI-9011胰蛋白酶消化液：
常用浓度为0.125%，即使用前将一滴试剂1胰酶溶液和三滴试剂2胰酶稀释液均匀混合（1:3稀释），则可直接滴加使用。胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从0.05%（1:10稀释）至0.25%（1:1稀释）。
4.2 ZLI-9010胰蛋白酶：
取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.05%或 0.1% pH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。 5、胃酶（Pepsin）：
4%胃蛋白酶，用0.1mol/L HCL配制。 6、DAB：
6.1 ZLI-9032/9033 DAB Kit：
使用前只需将试剂盒提供的A、B、C三种试剂各一滴加至1ml双蒸水中，即可获得1ml DAB工作液，简单易用。
6.1 ZLI-9030 DAB：
6mgDAB溶于10mlTBS（0.05M pH7.6），再加入0.1ml浓度为3％的H2O2，过滤掉沉淀物，即可。 7、AEC：
4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml浓度为0.1M的醋酸缓冲液（pH5.2），然后加入0.15ml 3%H2O2，过滤掉沉淀物。 8、RIPA：
1×PBS，1%NP 40，0.5 sodium deoxycholate，0.1% SDS（此液体可长期保存）。以下抑制剂以储存液方式保存，临用前加入RIPA中。
8.1 10mg/ml PMSF异丙醇溶液（用量为10 l/ml）
8.2 Aprotinin（Sigma产品，用量为30 l/ml） 8.3 1000mM sodium orthovanadate冷冻液 （用量为10 l/ml） 9、Blotto A：
常规使用1×PBS，5% milk，0.05% Tween 20。 10、Blotto B：
与Phosphotyrosine抗体共用，1×PBS，1% milk，0.05% Tween 20。部分实验中milk可完全去除，但可能引起背景增高。
从牛奶中分离酪蛋白和乳糖
一、引言
牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在，
胶粒直径约为20～800纳米，平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白等电点PH=4.7时，酪蛋白沉淀。脱脂乳中除去酪蛋白后剩下的液体为乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，还有溶解状态的乳糖，乳中糖类的99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、结晶制取乳糖。 二、实验材料和试剂 脱脂乳或脱脂奶粉。
醋酸-醋酸钠缓冲溶液（PH=4.7），95%乙醇，乙醚，碳酸钙粉末，苯肼试剂。 三、实验步骤
1. 从牛奶中分离酪蛋白
在烧杯中加入2g脱脂奶粉，再加入40ml40℃，PH=4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液40ml， 用PH精密试纸检验液体的PH值。静置冷却至室温，倾去上层清液（留作分离乳糖用），剩下的悬浮液分别装入两支离心试管中，用转速为2000转/分离心分离3～5分钟，倾出上层清液，（合并于上一清液中），得酪蛋白粗品。于离心管中加入5ml蒸馏水，用玻棒充分搅拌，洗涤除去其中的水溶性杂质（如乳清蛋白，乳糖以及残留的缓冲溶液），离心后弃去上层液，再用蒸馏水洗一次。于试管中加入5ml95%乙醇，充分搅拌，离心后弃去乙醇溶液，用乙醇洗涤主要是除去磷脂类物质。最后再用5ml乙醚以同样方法洗涤，以除去脂肪类物质。将酪蛋白沉淀物凉干，称重、并计算得率。 2. 从牛奶中分离乳糖
在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。过滤除去沉淀，在滤液中加入1～2粒沸石，加热浓缩至3～5ml，加入10ml 95%乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品。
3. 乳糖成脎试验
取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%，在试管中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼试剂①，摇匀，试管口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇，加热10～15分钟后，取出放置冷却，乳糖脎成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形态，可证实为乳糖。 ①苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。
硫酸铵沉淀法纯化蛋白的原理和操作及配比用表
2010-01-06 13:41:05| 分类： 蛋白质纯化|字号 订阅
今天作的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质，从之前作过的经验知道，这一个步骤是有名的烦，要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。
相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到，与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵，会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子数也多(NH4+, SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合。
蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域，水分子会在这些非极性区的表面聚集，形成类似『水笼』的构造(请见下图)，以便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液加入硫酸铵，后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的吸引，因而沉淀下来。因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸铵沉淀下来。
在计算所添加的硫酸铵的重量方面，找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机 这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这四个数值，就可以得到需要添加的硫酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积，算是一个很不错的网站。
此外另一个比较值得提的，是我有用两种方式加入硫酸铵，第一种是固体的硫酸铵模碎加入，另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下：
1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液
利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。 不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。
2.操作的容易度： 硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵
固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以当你要溶解的蛋白质很多时，这是很累的步骤。然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分，要先加热让它饱合后，回到操作温度让它过饱和，最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。
3.蛋白质溶液的体积放大程度 硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵
这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分，举例来说，要让100 ml的硫酸铵百分比从0%到25%， 如果是加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100 ml变成107 ml左右，但若是加入硫酸铵饱和溶液，会让溶液变成125 ml！而且若是要提高到50%，须加等量的硫酸铵饱和溶液，所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。
因此在加入硫酸铵时，若是低百分浓度可以利用硫酸铵饱和溶液，然而如果是高百分浓度的，除非不在意蛋白质溶液体积的放大(反正都要离心离下来)，否则还是用固体硫酸铵来的好。
所以今天从0%拉到25%及从25%拉到50%时，都是利用硫酸铵饱和溶液，但是当要从50%拉到75%时，我选择利用固体硫酸铵，因为如果用硫酸铵饱和溶液， 离心机无法离那么多的溶液体积。
–盐酸缓冲液（0.05M，25℃）
50毫升0.1M三羟甲基氨基甲烷（）溶液与X毫升0.1N盐酸混匀后，加水稀释至100毫升。
pH X(毫升) 7.10 7.20 7.30 7.40 7.50 7.60 7.70 7.80 7.90 8.00
45.7 44.7 43.4 42.0 40.3 38.5 36.6 34.5 32.0 29.2
8.10 8.20 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70 8.80 8.90
26.2 22.9 19.9 17.2 14.7 12.4 10.3 8.5 7.0
pH
X(毫升)
三羟甲基氨基甲烷（Tris）HOCH2 CH2OH
C HOCH2 NH2 分子量=121.14;
0. 1M溶液为12.114克/升。Tris溶液可从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严。
8.
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