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(1)一点法
该法考虑背景吸收，直接从谱图中分析波数处读取谱图纵坐标的透过率，再由公式lg1/T=A计算吸光度。实际上这种
(2)基线法
通过带两翼透过率大点作光谱吸收的切线，作为该谱线的基线，则分析波数处的垂线与基线的交点，与最高吸收峰顶点
由红外光
一点法:测量I、I的方法有一点法和基线法两种 0t
当景吸收较
图1 一点法测量A
基线:背景吸收较大可忽略，有其它峰影响使测量峰不对称时， 可用基线法测I、I。通过测量峰两边的峰谷作一切线，以两切
如图2所示。
(2) 外吸收光谱法:物质吸收红外区射，起分子中 .... 因此，在相应范围内，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，即可求出溶液中物浓度和含量。 .... 含量测定时可选择一个欲测成分的特征吸收峰，此吸收峰不被其他成所干扰即可。 ... 峰，做基线及量取峰高吸收度比值，依
在红定量分析中，许多计算吸光度A的方法，我们所使用的红外仪器因为没备数 据站，用其它方法计算非常麻烦。所以我
作
吸光度法测定花青素含量
吸光度法测定花青素含量
一、 试验器材
1 材料与试剂
花青素标样；体积分数95%的乙醇；盐酸、甲醇、正丁醇、硫酸铁铵，均为分析纯。
2 仪器与设备
超声细胞粉碎机、
二.
1、标准曲线的绘制
准确配制量度为0.50 mg/mL的花青素标准溶液，分别吸0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL置于6支10mL具塞比色管中，各加入甲醇溶液至1.0mL，然后加入6.0mL正丁醇—盐酸溶液（体积比为95∶5）和0.2mL量数为2％的硫酸铁铵溶液（临用时配制），摇匀后，置沸水浴中加热40 min，然后迅速却，在波长400~600 nm处进行扫描，确定其最大吸收波530nm，于最大吸收波长处测定花青素标准溶液吸光度，得到标准曲线方程。将待测溶液在最大吸收
B3吸光度测定方法研究
1,过滤方法对吸光度测定值的影响
1)取约1.00g样品至10ml容量中，加0.1N盐酸适量，振摇、超声，使样品溶解，再加0.1N盐酸稀释到刻度，摇，即得样品溶液。在450nm波长下测定吸光度Abs值。再分别用不同的过滤方
样品 Abs值 T%值 pH值
0.042 90.78% 2.64 不过滤
0.016 96.20% 2.64 过滤并弃去约2ml初滤液
0.016 96.24% - 过滤并弃去约4ml初滤液
过并弃去
过滤并弃去约4ml初滤液后，再
0.016 96.38% - 用同一个滤头过滤3遍，再换新
滤头过滤一遍
2)滤后样品的
5min 10min 20min 30min 时间
0.16 0.16 0.16 0.16 Abs值
结论: 1)过滤时弃去初滤液的多少，对样品的习惯渎职没有明显影响;
2)过滤
2，过
将过前、过滤后吸光度测定样品溶液，用B3纯度测定流动相A稀释到约2000U/ml后，进行HPLC
主成分
6561465 93.74% 过滤前
0.47%
6605480 93.71% 过滤后
结论:
3，不同pH下样品溶液的稳定性
分别取约3份2.50g样至3个25ml容量瓶中，先加约10ml水，振摇、超声，使样品分散，再别加1N盐酸适量，振摇、超声，使样品溶解，加水稀释到刻度，
在450nm波
时间 pH值3.52 pH值2.49 pH值2.02
0min 0.68 0.54 0.52
5min 0.66 0.52 0.51
10min 0.66 0.51 0.51
20min 0.66 0.52 0.50
30min 0.66 0.51 0.50
60min 0.66 0.51 0.49
90min 0.68 0.50 0.49
120min - 0.50 -
180min - 0.50 -
200min 0.73 - -
240min - 0.50 -
300min - 0.50 -
结
，不同pH下样品溶液在450nm波长附近的最大吸收的变化 4
分别0分钟、60分钟时，扫描上述3个不同pH值的样品溶液在400nm~500nm内的吸收值，没有发
5，两种不同溶解测定方法的精密度
稀盐直接溶解法:称取约2.50g品至25ml容量瓶中，加0.1N盐酸适量，振摇、超声，使样品溶解，再加0.1N盐酸稀释到刻度，摇匀，即得样品溶液。在450nm波长下测定
1)
样品
1 0.086 0.049 2.57
2 0.086 0.055 2.60
3 0.109 0.055 2.60
4 0.060 0.045 2.59
5 0.065 0.042 2.60
2)concord提供的方法:际测
测定:称取2.50g样品至25ml量瓶中，先加约10ml水，振摇、超声，使样品分散，再加1N盐酸2.5ml，振摇、声，使样品溶解，加水稀释到刻度，摇匀，即得样品溶液。在450nm波长
样品
1(容
2 0.080 0.044 2.44
3 0.073 0.048 2.41
4 0.074 0.043 2.40
5 0.063 0.042 2.40
1分光光度法测定溶液的吸光度与
第九章 习题
一、填空题
1(光光度法测定溶
本部件组成。
3(影响显
显色温度 、 溶剂 、 共存离子 。
4(有甲、乙两个不同浓度的同一有色物质溶液，在相同条件下，测得的吸
-4光度，甲为0.20，乙为0.30，若甲的浓度为4.0×10mol/L，则乙的浓度为 6 -4×10mol/L 。
5(分光光度法中，
二、选择题
1(以邻
A(蒸馏水 B(不含邻二氮菲试液
2+2+C(不Fe的试剂参比溶液 D(含Fe的邻二氮菲溶液 2(分光光度
A(的强度 B(溶液的浓度 C(入射光的波长 D(液层的厚度 3(用721型分光光度
A(欧姆
C、为
4(有两
射光强度，溶液浓度都相等，以下哪种说法正确( D )
A(透过光
C(吸光
5(人眼
A(300-700 nm B(200-400nm
C(200-600 nm D(400-780nm
6(硫酸
A(蓝色
7(目
A(入射
C(透过
8(定水中Fe含量，取3.00 μg/mL的Fe标准溶液10.0 0mL，显色后稀释至50.00 mL，测
A(1.07 μg/L B(1.07 mg/L C(10.7 μg/L D(10.7 mg/L
9(比色分
A(溶剂 B(试剂空白 C(试样空白 D(掩蔽褪色参比
10(
A(透光率
C(透光
三、是非题
1(入
2+2(Cu和氨水形成的显色反应属于配位反应。(?)
3(吸光
4(物
5(比色
6(不少显色反
7(不同
8(用分光
四、问答题
1(符合朗伯—比尔定律的有色溶液，当溶液的浓度增大后，λmax、T、A,和有无变化,有什么变化,
,答:当
2(什
答:将种同的单色光依次通过某一种有色溶液，测量一波长下的有色溶液对该波长的吸收程度(吸光度)，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，得到的曲线是光吸收曲线。一系列的标准溶液，用相同厚度的比色皿，在同样波长的单色光下适宜的空白溶液调节仪器零点及透光率，并别测出各标准溶液的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，，以组成量度为横
3(光度
答:(1)入射
(2)蚕比溶液要选择合适。
(3)
一般度下溶液的测定用普通光度法测定。但在溶液浓度较高时，测得的吸光度因为离朗伯-比尔定律，采用示差法。这种方法测定的参比
4(参
答:(1)
(2)不
(3)不
(4)
五、计算题
-11(在
测
0.0350解:标准溶液中含Fe: ，,20.000438/molL160
0.370=k b ×0.000438
0.410= k b c
c =0.00243 mol/L
2+2+-12(用双硫腙光度法测定Pb，Pb的浓度为0.08 mg ?(50mL)，用2 cm比
,色皿
,30.0810207，,6,，7.72910/molL解:0.08 mg/ 50 mL换算成: ,35010，
11lglg1411,,53%T ,,,,,，AkbckLmolcmlg,1.7810,6，，Tbc27.72910
3+-3(
2+1.0 cm的吸收池在480 nm处测得吸光度为0.740，计算Fe(SCN)配合物的摩尔吸光系数。
,30.08810，
,556
A0.740411,, ,,,，kLmolcm2.3510,5，，bc1.03.14310
4(磺基水杨酸法测微量铁。标准溶液是由0. 2160 gNHFe(SO)?12HO4422溶于水中稀释至500 mL
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 体积V/mL
吸光度 0.0 0.165 0.320 0.480 0.630 0.790
某
-1同的条件显色测定吸光度。测得A=0.500。求试液中的铁含量，以mg?mL表示(铁
0.2160解:标准溶液含铁量:/mL mug,,/5000.8959482.20
在算机上作得
,32505.646810，试液中铁含量:，,0.1412/mgmL 2.005.00
*5(设
3 -1-14-1-1数分别为1.98×10L?mol?cm和2.80×10 L?mol?cm。Y组分在波长λ和λ12
4-1-12-1-1处的摩尔光
340.3011.981022.04102,，，，，，，，ccxy解: 420.3982.801023.13102,，，，，，，，ccxy
-6-6 解得:cx=7.03×10mol/L, cy=6.69×10mol/L
吸光度
OD 值
1.
A ＝－lgT ＝εb c
A ——吸光度，又称光密度“O.D”。
T ——透光
ε——摩
b ——
C ——样品浓度（mol/L）。
由上式可以
2. DNA和RNA 的OD 值
2.1 原理
嘌呤碱和嘧啶碱有共双，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因核酸具有紫外吸收性。DNA 钠盐的紫外吸收在260nm 附近有最大吸收值（图3-25），在230nm 处为吸收低谷，其吸光率（absorbance ）以A260表示，A260是核酸的重要性质，RNA 钠盐的吸收曲线DNA 无明显区别，蛋白质在280nm 处有最大的吸收峰，盐和小分子集中在230nm 处，对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用酸的吸光系数算溶液中核酸的量，核酸的比吸数是指浓度为1μg／mL 的核酸水溶在260nm 处的吸光率，天然状态的双链DNA 的比吸光系数为0.020，变性DNA 和RNA 的吸光数为0.022。据朗波－比尔光吸收定律A ＝-lgT ＝εbc知，c ＝A/εb，而b 通常为1cm ，所以，通常以1OD 值相当于50μg／mL 双螺
2.2 纯度
DNA RNA 的纯度可以通过测定260nm ，230nm 280nm 的紫外吸收值来测定，纯的DNA OD260／280在1.8-1.9，OD260／230应大于2.0，纯的RNA OD260／280在1.9-2.0，如果DNA 比值高于1.8-1.9，可能有RNA 没有去除干净，如果DNA 比值小于1.8-1.9，
2.3 浓度
DNA RNA 的量，据朗波－比光吸定律A ＝-lgT ＝εbc知测量样品的浓度为c ＝A/εb，又知ε＝0.020，在b ＝1cm 的情况下，c ＝A/（0.020×1）＝50×A ，则未稀释的样品的浓度
2.4 注意事项：
1) 比色杯应为石英杯，玻璃杯在此波长时读数不准。
2)
3) 这种比值
4) 既含有RNA 又含有蛋白质也可能使比值维持在1.8，这个时候要根据电泳情况鉴定是不是含有RNA ，或者测定一下是不是含有蛋白质；
5) A260/A280比值可提供DNA 纯度的一个参考，但A260/A280 比值会受pH 影响。如果未调pH ，比值可能与实际差很。如果需要准确数值，建议在10 mM Tris Cl, pH 8.5中检测，此时
6) 进
7) 可以在220-330 nm 之间进行扫描，此扫描可以检测是否有其它因素影响OD260，如在325 nm 处有吸光值说明有污染物或比色皿不干净。)
8) DNA的量与260 nm处的吸光度值（OD 值）成正比，在引物设计时，1个OD 值的合成DNA 的重
