高致病性禽流感防治技术规范（节选）

Zhi病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI）是由正粘病毒科流感病毒属AXing流感病毒引起的以禽类为主的烈性传染病。Shi界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报Gao的动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。

Wei预防、控制和扑灭高致病性禽流感，依据《Zhong华人民共和国动物防疫法》、《重大动物疫Qing应急条例》、《国家突发重大动物疫情应急Yu案》及有关的法律法规制定本规范。

1 适用范围

Ben规范规定了高致病性禽流感的疫情确认、疫Qing处置、疫情监测、免疫、检疫监督的操作程Xu、技术标准及保障措施。

Ben规范适用于中华人民共和国境内一切与高致Bing性禽流感防治活动有关的单位和个人。

2 诊断

2.1 流行病学特点

2.1.1? 鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉Ji、鹧鸪、鸵鸟、孔雀等多种禽类易感，多种Ye鸟也可感染发病。

2.1.2? 传染源主要为病禽（野鸟）和Dai毒禽（野鸟）。病毒可长期在污染的粪便、Shui等环境中存活。

2.1.3? 病毒传播主要通过接触感染禽（野鸟）及其分泌物和排泄物、污染的饲料、Shui、蛋托（箱）、垫草、种蛋、鸡胚和精液等Mei介，经呼吸道、消化道感染，也可通过气源Xing媒介传播。

2.2? 临床症状

2.2.1? 急性发病死亡或不明原因死亡，潜伏期从几小时到数天，最长可达21天；

2.2.2? 脚鳞出血；

2.2.3? 鸡冠出血或发绀、头部和面部Shui肿；

2.2.4? 鸭、鹅等水禽可见神经和腹泻Zheng状，有时可见角膜炎症，甚至失明；

2.2.5? 产蛋突然下降。

2.3? 病理变化

2.3.1? 消化道、呼吸道粘膜广泛充血、出血；腺胃粘液增多，可见腺胃乳头出血，Xian胃和肌胃之间交界处粘膜可见带状出血；

2.3.2? 心冠及腹部脂肪出血；

2.3.3? 输卵管的中部可见乳白色分泌Wu或凝块；卵泡充血、出血、萎缩、破裂,有De可见“卵黄性腹膜炎”；

2.3.4脑部出现坏死灶、血管周围淋巴细Bao管套、神经胶质灶、血管增生等病变；胰腺He心肌组织局灶性坏死。2.4? 血清学指Biao

2.4.1? 未免疫禽H5或H7的血凝抑Zhi(HI)效价达到24及以上（附件1）；

2.4.2? 禽流感琼脂免疫扩散试验（AGID）阳性(附件2)。

2.5? 病原学指标

2.5.1? 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测，结果H5或H7亚型禽流感Yang性（附件4）；

2.5.2? 通用荧光反转录-聚合酶链反Ying（荧光RT-PCR）检测阳性（附件6）；

2.5.3? 神经氨酸酶抑制（NI）试验Yang性（附件3）；

2.5.4? 静脉内接种致病指数（IVPI）大于1.2或用0.2ml 1:10稀Shi的无菌感染流感病毒的鸡胚尿囊液，经静脉Zhu射接种8只4-8周龄的易感鸡，在接种后10天内，能致6-7只或8只鸡死亡，即死Wang率≥75%；

2.5.5? 对血凝素基因裂解位点的氨基Suan序列测定结果与高致病性禽流感分离株基因Xu列相符（由国家参考实验室提供方法）。

2.6? 结果判定

2.6.1 临床怀疑病例

Fu合流行病学特点和临床指标2.2.1，且Zhi少符合其他临床指标或病理指标之一的;

Fei免疫禽符合流行病学特点和临床指标2.2.1且符合血清学指标之一的。

2.6.2 疑似病例

Lin床怀疑病例且符合病原学指标2.5.1.2.5.2.2.5.3之一。

2.6.3 确诊病例

Yi似病例且符合病原学指标2.5.4或2.5.5。

3? 疫情报告

3.1? 任何单位和个人发现禽类发病急、Chuan播迅速、死亡率高等异常情况，应及时向当Di动物防疫监督机构报告。

3.2? 当地动物防疫监督机构在接到疫情Bao告或了解可疑疫情情况后，应立即派员到现Chang进行初步调查核实并采集样品，符合2.6.1规定的，确认为临床怀疑疫情；

3.3? 确认为临床怀疑疫情的，应在2个Xiao时内将情况逐级报到省级动物防疫监督机构He同级兽医行政管理部门，并立即将样品送省Ji动物防疫监督机构进行疑似诊断；

3.4? 省级动物防疫监督机构确认为疑似Yi情的，必须派专人将病料送国家禽流感参考Shi验室做病毒分离与鉴定，进行最终确诊；经Que认后，应立即上报同级人民政府和国务院兽Yi行政管理部门，国务院兽医行政管理部门应Dang在4个小时内向国务院报告；

3.5? 国务院兽医行政管理部门根据最终Que诊结果，确认高致病性禽流感疫情。

4 疫情处置

4.1 临床怀疑疫情的处置

Dui发病场（户）实施隔离、监控，禁止禽类、Qin类产品及有关物品移动，并对其内、外环境Shi施严格的消毒措施（附件8）。

4.2 疑似疫情的处置

Dang确认为疑似疫情时，扑杀疑似禽群，对扑杀Qin、病死禽及其产品进行无害化处理，对其内、外环境实施严格的消毒措施，对污染物或可Yi污染物进行无害化处理，对污染的场所和设Shi进行彻底消毒，限制发病场（户）周边3公Li的家禽及其产品移动（见附件9.10）。

4.3 确诊疫情的处置

Yi情确诊后立即启动相应级别的应急预案。

4.3.1? 划定疫点、疫区、受威胁区

You所在地县级以上兽医行政管理部门划定疫点、疫区、受威胁区。　　疫点：指患病动物所Zai的地点。一般是指患病禽类所在的禽场（户）或其它有关屠宰、经营单位；如为农村散养，应将自然村划为疫点。

Yi区：由疫点边缘向外延伸3公里的区域划为Yi区。疫区划分时，应注意考虑当地的饲养环Jing和天然屏障（如河流、山脉等）。

Shou威胁区：由疫区边缘向外延伸5公里的区域Hua为受威胁区。

4.3.2? 封锁

You县级以上兽医主管部门报请同级人民政府决Ding对疫区实行封锁；人民政府在接到封锁报告Hou，应在24小时内发布封锁令，对疫区进行Feng锁：在疫区周围设置警示标志，在出入疫区De交通路口设置动物检疫消毒站，对出入的车Liang和有关物品进行消毒。必要时，经省级人民Zheng府批准，可设立临时监督检查站，执行对禽Lei的监督检查任务。

Kua行政区域发生疫情的，由共同上一级兽医主Guan部门报请同级人民政府对疫区发布封锁令，Dui疫区进行封锁。

4.3.3 疫点内应采取的措施

4.3.3.1 扑杀所有的禽只，销毁所有Bing死禽、被扑杀禽及其禽类产品；

4.3.3.2 对禽类排泄物、被污染饲料、垫料、污水等进行无害化处理；

4.3.3.3 对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行彻底消毒。

4.3.4 疫区内应采取的措施

4.3.4.1扑杀疫区内所有家禽，并进行Wu害化处理，同时销毁相应的禽类产品；

4.3.4.2 禁止禽类进出疫区及禽类产Pin运出疫区；

4.3.4.3 对禽类排泄物、被污染饲料、垫料、污水等按国家规定标准进行无害化处Li；

4.3.4.4 对所有与禽类接触过的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行彻底消毒。

4.3.5 受威胁区内应采取的措施

4.3.5.1 对所有易感禽类进行紧急强Zhi免疫，建立完整的免疫档案；

4.3.5.2? 对所有禽类实行疫情监测，掌握疫情动态。

4.3.6? 关闭疫点及周边13公里内所You家禽及其产品交易市场。

4.3.7? 流行病学调查、疫源分析与追Zong调查

Zhui踪疫点内在发病期间及发病前21天内售出De所有家禽及其产品，并销毁处理。按照高致Bing性禽流感流行病学调查规范，对疫情进行溯Yuan和扩散风险分析（附件11）。

4.3.8? 解除封锁

4.3.8.1 解除封锁的条件

Yi点、疫区内所有禽类及其产品按规定处理完Bi21天以上，监测未出现新的传染源；在当Di动物防疫监督机构的监督指导下，完成相关Chang所和物品终末消毒；受威胁区按规定完成免Yi。

4.3.8.2 解除封锁的程序

Jing上一级动物防疫监督机构审验合格，由当地Shou医主管部门向原发布封锁令的人民政府申请Fa布解除封锁令，取消所采取的疫情处置措施。

4.3.8.3 疫区解除封锁后，要继续对Gai区域进行疫情监测，6个月后如未发现新病Li，即可宣布该次疫情被扑灭。疫情宣布扑灭Hou方可重新养禽。

4.3.9 对处理疫情的全过程必须做好完Zheng详实的记录，并归档。

5 疫情监测

5.1 监测方法包括临床观察、实验室检测Ji流行病学调查。

5.2 监测对象以易感禽类为主，必要时监Ce其他动物。

5.3监测的范围

5.3.1? 对养禽场户每年要进行两次病Yuan学抽样检测，散养禽不定期抽检，对于未经Mian疫的禽类以血清学检测为主；

5.3.2 对交易市场、禽类屠宰厂（场）、异地调入的活禽和禽产品进行不定期的病原Xue和血清学监测。

5.3.3 对疫区和受威胁区的监测

5.3.3.1 对疫区、受威胁区的易感动Wu每天进行临床观察，连续1个月，病死禽送Sheng级动物防疫监督机构实验室进行诊断，疑似Yang品送国家禽流感参考实验室进行病毒分离和Jian定。

Jie除封锁前采样检测1次，解除封锁后纳入正Chang监测范围；

5.3.3.2 对疫区养猪场采集鼻腔拭子，疫区和受威胁区所有禽群采集气管拭子和泄Zhi腔拭子，在野生禽类活动或栖息地采集新鲜Fen便或水样，每个采样点采集20份样品，用RT-PCR方法进行病原检测，发现疑似感Ran样品，送国家禽流感参考实验室确诊。

5.5 在监测过程中，国家规定的实验室要Dui分离到的毒株进行生物学和分子生物学特性Fen析与评价，密切注意病毒的变异动态，及时Xiang国务院兽医行政管理部门报告。

5.6 各级动物防疫监督机构对监测结果及Xiang关信息进行风险分析，做好预警预报。

5.7监测结果处理

Jian测结果逐级汇总上报至中国动物疫病预防控Zhi中心。发现病原学和非免疫血清学阳性禽，Yao按照《国家动物疫情报告管理办法》的有关Gui定立即报告，并将样品送国家禽流感参考实Yan室进行确诊，确诊阳性的，按有关规定处理。

6 免疫

6.1 国家对高致病性禽流感实行强制免疫Zhi度，免疫密度必须达到100%，抗体合格Lv达到70%以上。

6.2 预防性免疫，按农业部制定的免疫方An中规定的程序进行。

6.3 突发疫情时的紧急免疫，按本规范有Guan条款进行。

6.4 所用疫苗必须采用农业部批准使用的Chan品，并由动物防疫监督机构统一组织、逐级Gong应。

6.5 所有易感禽类饲养者必须按国家制定De免疫程序做好免疫接种，当地动物防疫监督Ji构负责监督指导。

6.6 定期对免疫禽群进行免疫水平监测，Gen据群体抗体水平及时加强免疫。

7 检疫监督

7.1产地检疫

Si养者在禽群及禽类产品离开产地前，必须向Dang地动物防疫监督机构报检，接到报检后，必Xu及时到户、到场实施检疫。检疫合格的，出Ju检疫合格证明，并对运载工具进行消毒，出Ju消毒证明，对检疫不合格的按有关规定处理。

7.2屠宰检疫

Dong物防疫监督机构的检疫人员对屠宰的禽只进Xing验证查物，合格后方可入厂（场）屠宰。宰Hou检疫合格的方可出厂，不合格的按有关规定Chu理。

7.3引种检疫

Guo内异地引入种禽、种蛋时，应当先到当地动Wu防疫监督机构办理检疫审批手续且检疫合格。引入的种禽必须隔离饲养21天以上，并由Dong物防疫监督机构进行检测，合格后方可混群Si养。

7.4监督管理

7.4.1禽类和禽类产品凭检疫合格证运输、上市销售。动物防疫监督机构应加强流通环Jie的监督检查，严防疫情传播扩散。

7.4.2生产、经营禽类及其产品的场所必Xu符合动物防疫条件，并取得动物防疫合格证。

7.4.3各地根据防控高致病性禽流感的需Yao设立公路动物防疫监督检查站，对禽类及其Chan品进行监督检查，对运输工具进行消毒。

8 保障措施

8.1 各级政府应加强机构队伍建设，确保Ge项防治技术落实到位。

8.2 各级财政和发改部门应加强基础设施Jian设，确保免疫、监测、诊断、扑杀、无害化Chu理、消毒等防治工作经费落实。

8.3 各级兽医行政部门动物防疫监督机构Ying按本技术规范，加强应急物资储备，及时演Lian和培训应急队伍。

8.4 在高致病禽流感防控中，人员的防护An《高致病性禽流感人员防护技术规范》执行（附件12）。

附件1

Xue凝抑制（HI）试验

Liu感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具You识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HAShi验由此得名。HA蛋白的抗体与受体的特异Xing结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合Cong而出现抑制现象。

Gai试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍Cai用的试验方法。可用于流感病毒分离株HAYa型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与Kang原亚型一致的感染或免疫抗体。

HA-HI试验的优点是目前WHO进行全球Liu感监测所普遍采用的试验方法，可用来鉴定Suo有的流感病毒分离株，可用来检测禽血清中De感染或免疫抗体。它的缺点是只有当抗原和Kang体HA亚型相一致时才能出现HI象，各亚Xing间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红Xi胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存Zai于血清中的非特异凝集素，对于其它禽种，Ye可以考虑选用在调查研究中的禽种红细胞；Xu要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确Pan读的技能。

1? 阿氏（Alsevers）液配制

Cheng量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、Ning檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加Zheng馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。

2 ?10%和1%鸡红细胞液的制备

2.1　采血? 用注射器吸取阿氏液约1mL，取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗Ti的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合，放入装10mL阿氏液的离心管中混匀。

2.2　洗涤鸡红细胞? 将离心管中的血液Jing1500～1800 r/min 离心8Fen钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液，轻轻混He，再经1500～1800 r/min离Xin8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上Ceng的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加Ru阿氏液20 mL，轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。

2.3? 10%鸡红细胞悬液? 取阿氏液Bao存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管Zhong离心1500～1800 r/min 8Fen钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红Xi胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的Sheng理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细Bao混合均匀。

2.4? 1%鸡红细胞液? 取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mLSheng理盐水，混合均匀即可。

3　抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）

3.1　在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。

3.2　吸取0.025mL病毒悬液（如感Ran性鸡胚尿囊液）加入第l孔，混匀。

3.3　从第1孔吸取0.025mL病毒液Jia入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入Di3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃之，换滴头。

3.4　每孔再加入0.025mL PBS。

3.5　每孔均加入0.025mL 体积分Shu为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分Yao匀后加入）见附录B。

3.6　振荡混匀，在室温（20～25℃）Xia静置40min后观察结果（如果环境温度Tai高，可置4℃环境下反应1小时）。对照孔Hong细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。

3.7　结果判定? 将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见下表）。

Biao1：血凝试验结果判读标准

类别

Kong? 底? 所? 见

结果

Hong细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%Hong细胞凝集

Hong细胞凝集基本同上，但孔底有大圈

Hong细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块

Hong细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块

Hong细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红Xi胞完全不凝集

++++

+++

Neng使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，Ci效价为1个血凝单位（HAU）。注意对照Kong应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无Xiao。

4　血凝抑制（HI）试验（微量法）

4.1　根据3的试验结果配制4HAU的病Du抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为Zhong点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的Kang原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度Wei1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应Shi1:64（256除以4）。

4.2　在微量反应板的1孔～11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。

4.3　吸取0.025mL血清加入第1孔Nei，充分混匀后吸0.025mL于第2孔，Yi次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去。

4.4　1孔～11孔均加入含4HAU混匀De病毒抗原液0.025mL，室温（约20℃）静置至少30min。

4.5　每孔加入0.025mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高Ke置4℃条件下进行），对照红细胞将呈现钮Kou状沉于孔底。

4.6　结果判定

Yi完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍Shu作为HI滴度。

Zhi有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，Yang性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结Guo才有效。HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性；HI价等于31og2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于41og2Wei阳性。

附件7

Yang品采集、保存和运输

Huo禽病料应包括气管和泄殖腔拭子，最好是采Ji气管拭子。小珍禽用拭子取样易造成损伤，Ke采集新鲜粪便。死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品。

Jiang每群采集的10份棉拭子，放在同一容器内，混合为一个样品；容器中放有含有抗菌素的pH值为7.0-7.4的 PBS液。抗生Su的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬Ye中应含有青霉素（2000IU/mL）、Lian霉素（2mg/mL），庆大霉素（50μg/mL），制霉菌素（1000IU/mL）。但粪便和泄殖腔拭子所有的抗生素浓度应Ti高5倍。加入抗生素后 pH值应调至7.0-7.4。

Yang品应密封于塑料袋或瓶中，置于有制冷剂的Rong器中运输，容器必须密封，防止渗漏。

Yang品若能在24小时内送到实验室，冷藏运输。否则，应冷冻运输。

Ruo样品暂时不用，则应冷冻（最好-70℃或Yi下）保存。

采? 样? 单

样品名称

样品编号

采样基数

采样数量

采样日期

保存情况

冷冻（藏）

被采样单位

通讯地址

联系电话

邮? 编

Bei采样单位盖章或签名

Nian??? 月??? 日

Cai样单位盖章采样人签名

Nian??? 月??? 日

Bei注：(如禽流感的免疫情况以及20天内是Fou进行过其它免疫注射或异常刺激)

Ci单一式三份，第一联存根，第二联随样品，Di三联由被采样单位保存

附件8

消毒技术规范

1　设备和必需品

1.1　清洗工具：扫帚、叉子、铲子、锹和Chong洗用水管。

1.2　消毒工具：喷雾器、火焰喷射枪、消Du车辆、消毒容器等。

1.3　消毒剂：清洁剂、醛类、强碱、氯制Ji类等合适的消毒剂。

1.4　防护装备：防护服、口罩、胶靴、手Tao、护目镜等。

2　圈舍、场地和各种用具的消毒

2.1　对圈舍及场地内外采用喷洒消毒液的Fang式进行消毒，消毒后对污物、粪便、饲料等Jin行清理；清理完毕再用消毒液以喷洒方式进Xing彻底消毒，消毒完毕后再进行清洗；不易冲Xi的圈舍清除废弃物和表土，进行堆积发酵处Li。

2.2　对金属设施设备，可采取火焰、熏蒸Deng方式消毒；木质工具及塑料用具采取用消毒Ye浸泡消毒；工作服等采取浸泡或高温高压消Du。

3　疫区内可能被污染的场所应进行喷洒消毒。

4　污水沟、水塘可投放生石灰或漂白粉。

5　运载工具清洗消毒

5.1　在出入疫点、疫区的交通路口设立消Du站点，对所有可能被污染的运载工具应当严Ge消毒。

5.2　从车辆上清理下来的废弃物按无害化Chu理。

6　疫点每天消毒1次连续1周，1周以后每Liang天消毒1次。疫区内疫点以外的区域每两天Xiao毒1次。

附件9

扑杀方法

1　窒息

Xian将待扑杀禽装入袋中，置入密封车或其它密Feng容器，通入二氧化碳窒息致死；或将禽装入Mi封袋中，通入二氧化碳窒息致死。

2　扭颈

Pu杀量较小时采用。根据禽只大小，一手握住Tou部，另一手握住体部，朝相反方向扭转拉伸。

3　其它

Ke根据本地情况，采用其它能避免病原扩散的Zhi死方法。

Pu杀人员的防护符合NY/T 768《高致Bing性禽流感人员防护技术规范》的要求。

附件10

无害化处理

Suo有病死禽、被扑杀禽及其产品、排泄物以及Bei污染或可能被污染的垫料、饲料和其它物品Ying当进行无害化处理。清洗所产生的污水、污Wu进行无害化处理。

Wu害化处理可以选择深埋、焚烧或高温高压等Fang法，饲料、粪便可以发酵处理。

1　深埋

1.1　选址

Ying当避开公共视线，选择地表水位低、远离学Xiao、公共场所、居民住宅区、动物饲养场、屠Zai场及交易市场、村庄、饮用水源地、河流等De地域。位置和类型应当有利于防洪。

1.2　坑的覆盖土层厚度应大于1.5米，Keng底铺垫生石灰，覆盖土以前再撒一层生石灰。

1.3　禽类尸体置于坑中后，浇油焚烧，然Hou用土覆盖，与周围持平。填土不要太实，以Mian尸腐产气造成气泡冒出和液体渗漏。

1.4　饲料、污染物等置于坑中，喷洒消毒Ji后掩埋。

2　工厂化处理

Jiang所有病死牲畜、扑杀牲畜及其产品密封运输Zhi无害化处理厂，统一实施无害化处理。

3　发酵

Si料、粪便可在指定地点堆积，密封彻底发酵，表面应进行消毒。

4　无害化处理应符合环保要求，所涉及到的Yun输、装卸等环节应避免洒漏，运输装卸工具Yao彻底消毒。

附件11

Gao致病性禽流感流行病学调查规范

1　范围

Ben标准规定了发生高致病性禽流感疫情后开展De流行病学调查技术要求。

Ben标准适用于高致病性禽流感暴发后的最初调Cha、现地调查和追踪调查。

2　规范性引用文件

Xia列文件中的条款通过本标准的引用而成为本Biao准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后Suo有的修改单位（不包括勘误的内容）或修订Ban均不适用于本标准。鼓励根据本标准达成协Yi的各方研究可以使用这些文件的最新版本。Fan是不注日期的引用文件，其最新版本适用于Ben标准。

NY 764?? ??高致病性禽流感疫情Pan定及扑灭技术规范

NY/T 768?? 高致病性禽流感人员Fang护技术规范

3? 术语和定义

3.1 最初调查

Shou医技术人员在接到养禽场/户怀疑发生高致Bing性禽流感的报告后，对所报告的养禽场/户Jin行的实地考察以及对其发病情况的初步核实。

3.2 现地调查

Shou医技术人员或省级、国家级动物流行病学专Jia对所报告的高致病性禽流感发病场/户的场Qu状况、传染来源、发病禽品种与日龄、发病Shi间与病程、发病率与病死率以及发病禽舍分Bu等所作的现场调查。

3.3 跟踪调查

Zai高致病性禽流感暴发及扑灭前后，对疫点的Ke疑带毒人员、病死禽及其产品和传播媒介的Kuo散趋势、自然宿主发病和带毒情况的调查。

4? 最初调查

4.1 目的

He实疫情、提出对疫点的初步控制措施，为后Xu疫情确诊和现地调查提供依据。

4.2 组织与要求

4.2.1? 动物防疫监督机构接到养禽场/户怀疑发病的报告后，应立即指派2名以上Shou医技术人员，携必要的器械、用品和采样用Rong器，在24 h以内尽快赶赴现场，核实发Bing情况。

4.2.2? 被派兽医技术人员至少3 dNei没有接触过高致病性禽流感病禽及其污染物，按NY/T 768要求做好个人防护。

4.3 内容

4.3.1 调查发病禽场的基本状况、病史、症状以及环境状况四个方面，完成最初调查Biao（见附录A）。

4.3.2 认真检查发病禽群状况，根据NY 764做出是否发生高致病性禽流感的初Bu判断。

4.3.3 若不能排除高致病性禽流感，调Cha人员应立即报告当地动物防疫监督机构并建Yi提请省级/国家级动物流行病学专家作进一Bu诊断，并应配合做好后续采样、诊断和疫情Pu灭工作；

4.3.4 实施对疫点的初步控制措施，禁Zhi家禽、家禽产品和可疑污染物品从养禽场/Hu运出，并限制人员流动；

4.3.5 画图标出疑病禽场/户周围10 km以内分布的养禽场、道路、河流、山岭、树林、人工屏障等，连同最初调查表一同报Gao当地动物防疫监督机构。

5　现地调查

5.1 目的

Zai最初调查无法排除高致病性禽流感的情况下，对报告养禽场/户作进一步的诊断和调查，Fen析可能的传染来源、传播方式、传播途径以Ji影响疫情控制和扑灭的环境和生态因素，为Kong制和扑灭疫情提供技术依据。

5.2 组织与要求

5.2.1? 省级动物防疫监督机构接到怀Yi发病报告后，应立即派遣流行病学专家配备Bi要的器械和用品于24h内赴现场，作进一Bu诊断和调查。

5.2.2? 被派兽医技术人员应遵照4.2.2 的要求。

5.3 内容

5.3.1 在地方动物防疫监督机构技术人Yuan初步调查的基础上，对发病养禽场/户的发Bing情况、周边地理地貌、野生动物分布、近期Jia禽、产品、人员流动情况等开展进一步的调Cha，分析传染来源、传播途径以及影响疫情控Zhi和消灭的环境和生态因素。

5.3.2 尽快完成流行病学现地调查表（Jian附录B）并提交省和地方动物防疫监督机构。

5.3.3 与地方动物防疫监督机构密切配He，完成病料样品的采集、包装及运输等诊断Shi宜。

5.3.4 对所发疫病作出高致病性禽流感Zhen断后，协助地方政府和地方动物防疫监督机Gou扑灭疫情。

6　跟踪调查

6.1 目的

Zhui踪疫点传染源和传播媒介的扩散趋势、自然Su主的发病和带毒情况，为可能出现的公共卫Sheng危害提供预警预报。

6.2 组织

Dang地流行病学调查人员在省级或国家级动物流Xing病学专家指导下对有关人员、可疑感染家禽、可疑污染物品和带毒宿主进行追踪调查。

6.3 内容

6.3.1追踪出入发病养禽场/户的有关工Zuo人员和所有家禽、禽产品及有关物品的流动Qing况，并对其作适当的隔离观察和控制措施，Yan防疫情扩散。

6.3.2 对疫点、疫区的家禽、水禽、猪、留鸟、候鸟等重要疫源宿主进行发病情况调Cha，追踪病毒变异情况。

6.3.3 完成跟踪调查表（见附录C）并Ti交本次暴发疫情的流行病学调查报告。

附录A

Gao致病性禽流感流行病学最初调查表

任务编号：

国标码：

调查者姓名：

电? 话：

场/户主姓名：

电? 话：

场/户名称

邮? 编：

场/户地址

饲养品种

饲养数量

场址地形

环境描述

发病时天

气状况

温度

干旱/下雨

主风向

场区条件

□进场要洗澡更衣? □进生产区要换胶靴? □场舍门口有消毒池

□供料道与出粪道分开

污水排向

□附近河流? □农田沟渠? □附近村庄? □野外湖区? □野外水塘

□野外荒郊? □其他

过去一年曾

发生的疫病

□低致病性禽流感? □鸡新城疫? □马立Ke氏病? □禽白血病

□ 鸡传染性喉气管炎? □鸡传染性贫血? □鸡传染性支气管炎

□鸡传染性发氏囊病

本次典型

发病情况

□急性发病死亡? □脚鳞出血? □鸡冠出Xue或发绀、头部水肿

□肌肉和其他组织器官广泛性严重出血? □Shen经症状? □绿色稀便

□ 其他（请填写）：

疫情核实结论

□不能排除高致病性禽流感???? □排除Gao致病性禽流感

调查人员签字：

时间：

附录B

Gao致病性禽流感现地调查表

Yi情类型?? （1）确诊?? （2）疑似?? （3）可疑

B1 疫点易感禽与发病禽现场调查

B1.1? 最早出现发病时间:????? 年??? 月??? 日???? 时，

Fa病数：?? 只，死亡数：?? 只，圈舍（户）编号:???? 。

B1.2? 禽群发病情况：

圈舍（户）

编号

家禽品种

日龄

发病日期

发病数

开始死

亡日期

死亡数

B1.3 袭击率：

Ji算公式:袭击率=（疫情暴发以来发病禽数÷疫情暴发开始时易感禽数）×100%

B2 可能的传染来源调查

B2.1 发病前30d内，发病禽舍是否新Yin进了家禽？

（1）是???????????? （2）Fou

引进禽

品种

引进数量

混群情况*

最初混

群时间

健康状况

引进时间

来源

* 混群情况为：（1）同舍（户）饲养（2）邻舍（户）饲养（3）饲养于本场（村）隔离场,隔离场（舍）人员应单独隔离

B2.2 发病前30d内发病禽场/户是否You野鸟栖息或捕获鸟？

（1）是????????????? （2）否

鸟? 名

数? 量

来? 源

鸟停留地点*

鸟病死数量

与禽畜接触频率**

* 停留地点：包括禽场（户）内建筑场上、Shu上、存料处及料槽等；

** 接触频率：指鸟与停留地点的接触情况，分为每天、数次、仅一次。

B2.3 发病前30d内是否运入可疑的被Wu染物品（药品）？

（1）是?????????????? （2）否

物品名称

数? 量

经过或存放地

运入后使用情况

B2.4 最近30d内是否有场外有关业务Ren员来场？（1）无?? （2）有，请写出Fang问者姓名、单位、访问日期，并注明是否来Zi疫区。

来访人

来访日期

来访人职业/电话

是否来自疫区

B2.5 发病场（户）是否靠近其他养禽场Ji动物集散地？

（1）是???????????????????? （2）否

B2.5.1 与发病场的相对地理位置_____________________。

B2.5.2 与发病场的距离_________________。

B2.5.3 其大致情况__________。

B2.6 发病场周围10公里以内是否有下Lie动物群？

B2.6.1 猪，__________。

B2.6.2 野禽，具体禽种：__________。

B2.6.3 野水禽，具体禽种：__________。

B2.6.4 田鼠、家鼠：__________。

B2.6.5 其它：__________。

B2.7? 在最近25-30d内本场周围10公里有无禽发病？（1）无? （2）有，请回答：

B2.7.1 发病日期：__________。

B2.7.2 病禽数量和品种：__________。

B2.7.3 确诊/疑似诊断疾病：__________。

B2.7.4 场主姓名：__________。

B2.7.5 发病地点与本场相对位置、距Li：__________。

B2.7.6 投药情况：__________。

B2.7.7疫苗接种情况：__________。

B2.8? 场内是否有职员住在其他养殖场/养禽村？

（1）无????????? （2）有

B2.8.1该农场所处的位置：__________。

B2.8.2该场养禽的数量和品种：__________。

B2.8.3该场禽的来源及去向：__________。

B2.8.4职员拜访和接触他人地点：__________。

B3? 在发病前30d是否有饲养方式/管Li的改变？

（1）无????? （2）有，__________。

B4 发病场（户）周围环境情况

B4.1 静止水源-——沼泽、池塘或湖泊：（1）是??? （2）否

B4.2 流动水源——灌溉用水、运河水、He水：（1）是? （2）否

B4.3 断续灌溉区——方圆三公里内无水Mian：（1）是? （2）否

B4.4 最近发生过洪水：（1）是???? ??（2）否

B4.5 靠近公路干线：（1）是??????? （2）否

B4.6 靠近山溪或森（树）林：（1）是????? （2）否

B5? 该养禽场/户地势类型属于：

（1）盆地（2）山谷（3）高原（4）丘陵（5）平原（6）山区

（7）其他（请注明）__________。

B6 饮用水及冲洗用水情况

B6.1 饮水类型：

（1）自来水（2）浅井水（3）深井水（4）河塘水（5）其他

B6.2 冲洗水类型：

（1）自来水（2）浅井水（3）深井水（4）河塘水（5）其他

B7 发病养禽场/户高致病性禽流感疫苗免Yi情况：

（1）免疫??????? （2）不免疫

B7.1疫苗生产厂家__________。

B7.2 疫苗品种、批号__________。

B7.3 被免疫鸡数量__________。

B8 受威胁区免疫禽群情况

B8.1 免疫接种一个月内禽只发病情况：

（1）未见发病（2）发病，发病率__________。

B8.2 异源亚型血清学检测和病原学检测

标本类型

采样时间

检测项目

检测方法

结? 果

Zhu：标本类型包括鼻咽、脾淋内脏、血清及粪Bian等。

B9 解除封锁后是否使用岗哨动物

（1）否? （2）是，简述结果__________。

B10 最后诊断情况：

B10.1 确诊HPAI，确诊单位__________。

B10.2 排除，其他疫病名称__________。

B11 疫情处理情况

B11.1 发病禽群及其周围三公里以内所You家禽全部扑杀：

（1）是? （2）否，扑杀范围：__________。

B11.2 疫点周围3－5公里内所有家禽Quan部接种疫苗

（1）是? （2）否

Suo用疫苗的病毒亚型：__________Chang家__________。

附件12

Gao致病性禽流感人员防护技术规范

1 范围

Ben标准规定了对密切接触高致病性禽流感病毒Gan染或可能感染禽和场的人员的生物安全防护Yao求。

Ben标准适用于密切接触高致病性禽流感病毒感Ran或可能感染禽和场的人员进行生物安全防护。此类人员包括：诊断、采样、扑杀禽鸟、无Hai化处理禽鸟及其污染物和清洗消毒的工作人Yuan，饲养人员，赴感染或可能感染场进行调查De人员。

2? 诊断、采样、扑杀禽鸟、无害化处理禽Niao及其污染物和清洗消毒的人员

2.1进入感染或可能感染场和无害化处理地Dian

2.1.1穿防护服。

2.1.2戴可消毒的橡胶手套。

2.1.3戴N95口罩或标准手术用口罩。

2.1.4戴护目镜。

2.1.5穿胶靴。

2.2离开感染或可能感染场和无害化处理地Dian

2.2.1工作完毕后，对场地及其设施进行Che底消毒。

2.2.2在场内或处理地的出口处脱掉防护Zhuang备。

2.2.3将脱掉的防护装备置于容器内进行Xiao毒处理。

2.2.4对换衣区域进行消毒，人员用消毒Shui洗手。

2.2.5工作完毕要洗浴。

3　饲养人员

3.1饲养人员与感染或可能感染的禽鸟及其Fen便等污染物品接触前，必须戴口罩、手套和Hu目镜，穿防护服和胶靴。

3.2扑杀处理禽鸟和进行清洗消毒工作前，Ying穿戴好防护物品。

3.3场地清洗消毒后，脱掉防护物品。

3.4衣服须用70℃以上的热水浸泡5min或用消毒剂浸泡，然后再用肥皂水洗涤，于Tai阳下晾晒。

3.5胶靴和护目镜等要清洗消毒。

3.6处理完上述物品后要洗浴。

4? 赴感染或可能感染场的人员

4.1 需备物品

Kou罩、手套、防护服、一次性帽子或头套、胶Xue等。

4.2 进入感染或可能感染场

4.2.1 穿防护服。

4.2.2 戴口罩，用过的口罩不得随意丢Qi。

4.2.3 穿胶靴，用后要清洗消毒。

4.2.4 戴一次性手套或可消毒橡胶手套。

4.2.5 戴好一次性帽子或头套。

4.3 离开感染或可能感染场

4.3.1脱个人防护装备时，污染物要装入Su料袋内，置于指定地点。

4.3.2最后脱掉手套后，手要洗涤消毒。

4.3.3工作完毕要洗浴，尤其是出入过有Qin粪灰尘的场所。

5? 健康监测

5.1 所有暴露于感染或可能感染禽和场的Ren员均应接受卫生部门监测。

5.2 出现呼吸道感染症状的人员应尽快接Shou卫生部门检查。

5.3 出现呼吸道感染症状人员的家人也应Jie受健康监测。

5.4 免疫功能低下、60岁以上和有慢性Xin脏和肺脏疾病的人员要避免从事与禽接触的Gong作。

5.5 应密切关注采样、扑杀处理禽鸟和清Xi消毒的工作人员和饲养人员的健康状况。

高致病性禽流感防治技术规范

Gao致病性禽流感防治技术规范

Gao致病性禽流感是由正粘病毒科流感病毒属AXing流感病毒引起的以禽类为主的烈性传染病。Shi界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报Gao的动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。

1 适用范围

Ben规范规定了高致病性禽流感的疫情确认、疫Qing处臵、疫情监测、免疫、检疫监督的操作程Xu、技术标准及保障措施。

Ben规范适用于中华人民共和国境内一切与高致Bing性禽流感防治活动有关的单位和个人。

2 诊断

2.1 流行病学特点

2.1.1 鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉Ji、鹧鸪、鸵鸟、孔雀等多种禽类易感，多种Ye鸟也可感染发病。

2.1.2 传染源主要为病禽（野鸟）和Dai毒禽（野鸟）。病毒可长期在污染的粪便、Shui等环境中存活。

2.1.3 病毒传播主要通过接触感染禽（野鸟）及其分泌物和排泄物、污染的饲料、Shui、蛋托（箱）、垫草、种蛋、鸡胚和精液等Mei介，经呼吸道、消化道感染，也可通过气源Xing媒介传播。

2.2 临床症状

2.2.1 急性发病死亡或不明原因死亡，潜伏期从几小时到数天，最长可达21天；

2.2.2 脚鳞出血；

2.2.3 鸡冠出血或发绀、头部和面部Shui肿；

2.2.4 鸭、鹅等水禽可见神经和腹泻Zheng状，有时可见角膜炎症，甚至失明；

2.2.5 产蛋突然下降。

2.3 病理变化

2.3.1 消化道、呼吸道粘膜广泛充血、出血；腺胃粘液增多，可见腺胃乳头出血，Xian胃和肌胃之间交界处粘膜可见带状出血；

2.3.2 心冠及腹部脂肪出血；

2.3.3 输卵管的中部可见乳白色分泌Wu或凝块；卵泡充血、出血、萎缩、破裂,有De可见“卵黄性腹膜炎”；

2.3.4脑部出现坏死灶、血管周围淋巴细Bao管套、神经胶质灶、血管增生等病变；胰腺He心肌组织局灶性坏死。

2.4 血清学指标

2.4.1 未免疫禽H5或H7的血凝抑Zhi(HI)效价达到24及以上（附件1）；

2.4.2 禽流感琼脂免疫扩散试验（AGID）阳性(附件2)。

2.5 病原学指标

2.5.1 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测，结果H5或H7亚

Xing禽流感阳性（附件4）；

2.5.2 通用荧光反转录-聚合酶链反Ying（荧光RT-PCR）检测阳性（附件6）；

2.5.3 神经氨酸酶抑制（NI）试验Yang性（附件3）；

2.5.4 静脉内接种致病指数（IVPI）大于1.2或用0.2ml 1:10稀Shi的无菌感染流感病毒的鸡胚尿囊液，经静脉Zhu射接种8只4-8周龄的易感鸡，在接种后10天内，能致6-7只或8只鸡死亡，即死Wang率≥75%；

2.5.5 对血凝素基因裂解位点的氨基Suan序列测定结果与高致病性禽流感分离株基因Xu列相符（由国家参考实验室提供方法）。

2.6 结果判定

2.6.1 临床怀疑病例

Fu合流行病学特点和临床指标第一条，且至少Fu合其他临床指标或病理指标之一的;

Fei免疫禽符合流行病学特点和临床指标第一条，且符合血清学指标之一的。

2.6.2 疑似病例

Lin床怀疑病例且符合病原学指标1、2、3之Yi。

2.6.3 确诊病例

Yi似病例且符合病原学指标4或5。

3 疫情报告

3.1 任何单位和个人发现禽类发病急、Chuan播迅速、死亡率高等

Yi常情况，应及时向当地动物防疫监督机构报Gao。

3.2 当地动物防疫监督机构在接到疫情Bao告或了解可疑疫情情况后，应立即派员到现Chang进行初步调查核实并采集样品，符合临床怀Yi病例规定的，确认为临床怀疑疫情；

3.3 确认为临床怀疑疫情的，应在2个Xiao时内将情况逐级报到省级动物防疫监督机构He同级兽医行政管理部门，并立即将样品送省Ji动物防疫监督机构进行疑似诊断；

3.4 省级动物防疫监督机构确认为疑似Yi情的，必须派专人将病料送国家禽流感参考Shi验室做病毒分离与鉴定，进行最终确诊；经Que认后，应立即上报同级人民政府和国务院兽Yi行政管理部门，国务院兽医行政管理部门应Dang在4个小时内向国务院报告；

3.5 国务院兽医行政管理部门根据最终Que诊结果，确认高致病性禽流感疫情。

4 疫情处置

4.1 临床怀疑疫情的处臵

Dui发病场（户）实施隔离、监控，禁止禽类、Qin类产品及有关物品移动，并对其内、外环境Shi施严格的消毒措施（附件8）。

4.2 疑似疫情的处臵

Dang确认为疑似疫情时，扑杀疑似禽群，对扑杀Qin、病死禽及其产品进行无害化处理，对其内、外环境实施严格的消毒措施，对污染物或可Yi污染物进行无害化处理，对污染的场所和设Shi进行彻底消毒，限制发病场（户）周边3公Li的家禽及其产品移动（见附件9、10）。

4.3 确诊疫情的处臵

Yi情确诊后立即启动相应级别的应急预案。

4.3.1 划定疫点、疫区、受威胁区

You所在地县级以上兽医行政管理部门划定疫点、疫区、受威胁区。疫点：指患病动物所在De地点。一般是指患病禽类所在的禽场（户）Huo其它有关屠宰、经营单位；如为农村散养，Ying将自然村划为疫点。

Yi区：由疫点边缘向外延伸3公里的区域划为Yi区。疫区划分时，应注意考虑当地的饲养环Jing和天然屏障（如河流、山脉等）。

Shou威胁区：由疫区边缘向外延伸5公里的区域Hua为受威胁区。

4.3.2 封锁

You县级以上兽医主管部门报请同级人民政府决Ding对疫区实行封锁；人民政府在接到封锁报告Hou，应在24小时内发布封锁令，对疫区进行Feng锁：在疫区周围设臵警示标志，在出入疫区De交通路口设臵动物检疫消毒站，对出入的车Liang和有关物品进行消毒。必要时，经省级人民Zheng府批准，可设立临时监督检查站，执行对禽Lei的监督检查任务。

Kua行政区域发生疫情的，由共同上一级兽医主Guan部门报请同级人民政府对疫区发布封锁令，Dui疫区进行封锁。

4.3.3 疫点内应采取的措施

4.3.3.1 扑杀所有的禽只，销毁所有Bing死禽、被扑杀禽及其禽类产品；

4.3.3.2 对禽类排泄物、被污染饲料、垫料、污水等进行无害化处理；

4.3.3.3 对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行彻底消毒。

4.3.4 疫区内应采取的措施

4.3.4.1扑杀疫区内所有家禽，并进行Wu害化处理，同时销毁相应的禽类产品；

4.3.4.2 禁止禽类进出疫区及禽类产Pin运出疫区；

4.3.4.3 对禽类排泄物、被污染饲料、垫料、污水等按国家规定标准进行无害化处Li；

4.3.4.4 对所有与禽类接触过的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行彻底消毒。

4.3.5 受威胁区内应采取的措施

4.3.5.1 对所有易感禽类进行紧急强Zhi免疫，建立完整的免疫档案；

4.3.5.2 对所有禽类实行疫情监测，掌握疫情动态。

4.3.6 关闭疫点及周边13公里内所You家禽及其产品交易市场。

4.3.7 流行病学调查、疫源分析与追Zong调查

4.3.8 解除封锁

4.3.8.1 解除封锁的条件

4.3.8.2 解除封锁的程序

Jing上一级动物防疫监督机构审验合格，由当地Shou医主管部门向原发布封锁令的人民政府申请Fa布解除封锁令，取消所采取的疫情处臵措施。

4.3.8.3 疫区解除封锁后，要继续对Gai区域进行疫情监测，6个月后如未发现新病Li，即可宣布该次疫情被扑灭。疫情宣布扑灭Hou方可重新养禽。

4.3.9 对处理疫情的全过程必须做好完Zheng详实的记录，并归档。 5 疫情监测

5.1 监测方法包括临床观察、实验室检测Ji流行病学调查。

5.2 监测对象以易感禽类为主，必要时监Ce其他动物。

5.3监测的范围

5.3.1 对养禽场户每年要进行两次病Yuan学抽样检测，散养禽不定期抽检，对于未经Mian疫的禽类以血清学检测为主；

5.3.2 对交易市场、禽类屠宰厂（场）、异地调入的活禽和禽产品进行不定期的病原Xue和血清学监测。

5.3.3 对疫区和受威胁区的监测

5.3.3.1 对疫区、受威胁区的易感动Wu每天进行临床观察，连续

1个月，病死禽送省级动物防疫监督机构实验Shi进行诊断，疑似样品送国家禽流感参考实验Shi进行病毒分离和鉴定。

Jie除封锁前采样检测1次，解除封锁后纳入正Chang监测范围；

5.6 各级动物防疫监督机构对监测结果及Xiang关信息进行风险分析，做好预警预报。

5.7监测结果处理

6 免疫

6.1 国家对高致病性禽流感实行强制免疫Zhi度，免疫密度必须达到100%，抗体合格Lv达到70%以上。

6.2 预防性免疫，按农业部制定的免疫方An中规定的程序进行。

6.3 突发疫情时的紧急免疫，按本规范有Guan条款进行。

6.4 所用疫苗必须采用农业部批准使用的Chan品，并由动物防疫监督机构统一组织、逐级Gong应。

6.5 所有易感禽类饲养者必须按国家制定De免疫程序做好免疫接种，当地动物防疫监督Ji构负责监督指导。

6.6 定期对免疫禽群进行免疫水平监测，Gen据群体抗体水平及时加强免疫。

7 检疫监督

7.1产地检疫

7.2屠宰检疫

Dong物防疫监督机构的检疫人员对屠宰的禽只进Xing验证查物，合格后方可入厂（场）屠宰。宰Hou检疫合格的方可出厂，不合格的按有关规定Chu理。

7.3引种检疫

7.4监督管理

7.4.1禽类和禽类产品凭检疫合格证运输、上市销售。动物防疫

Jian督机构应加强流通环节的监督检查，严防疫Qing传播扩散。

7.4.2生产、经营禽类及其产品的场所必Xu符合动物防疫条件，并取得动物防疫合格证。

7.4.3各地根据防控高致病性禽流感的需Yao设立公路动物防疫监督检查站，对禽类及其Chan品进行监督检查，对运输工具进行消毒。

8 保障措施

8.1 各级政府应加强机构队伍建设，确保Ge项防治技术落实到位。

8.2 各级财政和发改部门应加强基础设施Jian设，确保免疫、监测、诊断、扑杀、无害化Chu理、消毒等防治工作经费落实。

8.3 各级兽医行政部门动物防疫监督机构Ying按本技术规范，加强应急物资储备，及时演Lian和培训应急队伍。

8.4 在高致病禽流感防控中，人员的防护An《高致病性禽流感人员防护技术规范》执行（附件12）。

高致病性禽流感防治技术规范.-.2007716151735

附件一

《高致病性禽流感防治技术规范》等 14个Dong物疫病防治技术规范

Zhong华人民共和国农业部

二 00七年四月

Yi、高致病性禽流感防治技术规范 ┄┄┄┄┄ 1

Er、口蹄疫防治技术规范 ┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 64

San、马传染性贫血防治技术规范┄┄┄┄┄┄ 117

Si、马鼻疽防治技术规范┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 135

Wu、布鲁氏菌病防治技术规范┄┄┄┄┄┄┄ 161

Liu、牛结核病防治技术规范┄┄┄┄┄┄┄┄ 170

Qi、猪伪狂犬病防治技术规范┄┄┄┄┄┄┄ 178

Ba、猪瘟防治技术规范┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 185

Jiu、新城疫防治技术规范┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 214

Shi、传染性法氏囊病防治技术规范┄┄┄┄┄ 228 十一、马立克氏病防治技术规范┄┄┄┄┄┄ 237 十二、绵羊痘防治技术Gui范┄┄┄┄┄┄┄┄ 247 十三、炭疽Fang治技术规范┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 254 Shi四、 J 亚群禽白血病防治技术规范┄┄┄ -- 270

Yi、高致病性禽流感防治技术规范

Gao致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI) 是由正粘病毒科流感病毒Shu A 型流感病毒引起的以禽类为主的烈性传染病。世界动物卫生组织 (OIE )Jiang其列为必须报告的动物传染病, 我国将其Lie为一类动物疫病。

Wei预防、控制和扑灭高致病性禽流感,依据《Zhong华人民共和国动物防疫法》、《重大Dong物疫情应急条例》、《国家突发重大动Wu疫情应急预案》及有关的法律法规制定本Gui范。

1 适用范围

Ben规范规定了高致病性禽流感的疫情确认、 Yi情处臵、疫情监测、免疫、检疫监督的Cao作程序、技术标准及保障措施。

Ben规范适用于中华人民共和国境内一切与高致Bing性禽流感防治活动有关的单位和个人。

2 诊断

2.1 流行病学特点

2.1.1 鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉Ji、鹧鸪、鸵鸟、孔雀等多种禽类易感,多Zhong野鸟也可感染发病。

2.1.2 传染源主要为病禽(野鸟)和Dai毒禽(野鸟) 。病毒可长期在污染的粪Bian、水等环境中存活。

2.1.3 病毒传播主要通过接触感染禽(野鸟)及其分泌物和排

Xie物、污染的饲料、水、蛋托(箱) 、垫草、种蛋、鸡胚和精液等媒介,经呼吸道、消Hua道感染,也可通过气源性媒介传播。

2.2 临床症状

2.2.1 急性发病死亡或不明原因死亡, 潜伏期从几小时到数天, 最长可达 21天;

2.2.2 脚鳞出血;

2.2.3 鸡冠出血或发绀、头部和面部Shui肿;

2.2.4 鸭、鹅等水禽可见神经和腹Xie症状, 有时可见角膜炎症, 甚至失明;

2.2.5 产蛋突然下降。

2.3 病理变化

2.3.1 消化道、呼吸道粘膜广泛充血、出血;腺胃粘液增多, 可见腺胃乳头出血,腺胃和肌胃之间交界处粘膜可见带状出血; 2.3.2 心冠及腹部脂肪出血;

2.3.3 输卵管的中部可见乳白色分泌Wu或凝块;卵泡充血、出血、萎缩、破裂 , 有的可见“卵黄性腹膜炎” ;

2.3.4脑部出现坏死灶、血管周围淋巴细Bao管套、神经胶质灶、血管增生等病变;胰Xian和心肌组织局灶性坏死。

2.4 血清学指标

2.4.1 未免疫禽 H5或 H7的血Ning抑制 (HI)效价达到 24及以上 (Fu 件 1) ;

2.4.2 禽流感琼脂免疫扩散试验(AGID )阳性 (附件 2) 。

2.5 病原学指标

2.5.1 反转录 -聚合酶链反应(RT-PCR )检测,结果 H5或 H7亚型禽流感阳性(附件 4) ;

2.5.2 通用荧光反转录 -聚合酶链Fan应(荧光 RT-PCR )检测阳性(Fu件 6) ;

2.5.3 神经氨酸酶抑制(NI )试Yan阳性(附件 3) ;

2.5.4 静脉内接种致病指数(IVPI )大于 1.2或用 0.2ml 1:10稀释的无菌感染流感病毒的鸡胚尿囊液, 经静脉注射接种 8只 4-8周龄的易Gan鸡,在接种后 10天内,能致 6-7只Huo 8只鸡死亡,即死亡率≥ 75%;

2.5.5 对血凝素基因裂解位点的氨基Suan序列测定结果与高致病性禽流感分离株基Yin序列相符(由国家参考实验室提供方法) 。 2.6 结果判定

2.6.1 临床怀疑病例

Fu合流行病学特点和临床指标 2.2.1,Qie至少符合其他临床指标或病理指标之一的 ;

Fei免疫禽符合流行病学特点和临床指标 2.2.1且符合血清学指标之一的。

2.6.2 疑似病例

Lin床怀疑病例且符合病原学指标 2.5.1、 2.5.2、 2.5.3之一。 2.6.3 确诊病例

Yi似病例且符合病原学指标 2.5.4或 2.5.5。

3 疫情报告

3.1 任何单位和个人发现禽类发病急、Chuan播迅速、死亡率高等异常情况,应及时向Dang地动物防疫监督机构报告。

3.2 当地动物防疫监督机构在接到疫情Bao告或了解可疑疫情情况后,应立即派员到Xian场进行初步调查核实并采集样品,符合 2.6.1规定的,确认为临床怀疑疫情;

3.3 确认为临床怀疑疫情的,应在 2Ge小时内将情况逐级报到省级动物防疫监督Ji构和同级兽医行政管理部门, 并立即将样Pin送省级动物防疫监督机构进行疑似诊断;

3.4 省级动物防疫监督机构确认为疑似Yi情的,必须派专人将病料送国家禽流感参Kao实验室做病毒分离与鉴定, 进行最终确诊; 经确认后, 应立即上报同级人民政府He国务院兽医行政管理部门, 国务院兽医Xing政管理部门应当在 4个小时内向国务院报Gao;

3.5 国务院兽医行政管理部门根据最终Que诊结果,确认高致病性禽流感疫情。

4 疫情处置

4.1 临床怀疑疫情的处臵

Dui发病场(户)实施隔离、监控,禁止禽类、Qin类产品及有关物品移动,并对其内、外环Jing实施严格的消毒措施(附件 8) 。

4.2 疑似疫情的处臵

Dang确认为疑似疫情时,扑杀疑似禽群,对扑杀Qin、病死禽及其产品进行无害化处理,对其Nei、外环境实施严格的消毒措施,对污染物

Huo可疑污染物进行无害化处理,对污染的场所He设施进行彻底消毒, 限制发病场(户)周Bian 3公里的家禽及其产品移动(见附件 9、 10) 。 4.3 确诊疫情的处臵

Yi情确诊后立即启动相应级别的应急预案。

4.3.1 划定疫点、疫区、受威胁区

You所在地县级以上兽医行政管理部门划定疫点、疫区、受威胁区。疫点:指患病动物Suo在的地点。一般是指患病禽类所在的禽场 (户)或其它有关屠宰、经营单位;如为农村San养,应将自然村划为疫点。

Yi区:由疫点边缘向外延伸 3公里的区域划Wei疫区。疫区划分时, 应注意考虑当地的Si养环境和天然屏障(如河流、山脉等) 。

Shou威胁区:由疫区边缘向外延伸 5公里的区Yu划为受威胁区。 4.3.2 封锁

You县级以上兽医主管部门报请同级人民政府决Ding对疫区实行封锁;人民政府在接到封锁报Gao后,应在 24小时内发布封锁令,对疫 Qu进行封锁:在疫区周围设臵警示标志, 在Chu入疫区的交通路口设臵动物检疫消毒站,Dui出入的车辆和有关物品进行消毒。必要时,Jing省级人民政府批准, 可设立临时监督检Cha站, 执行对禽类的监督检查任务。

Kua行政区域发生疫情的, 由共同上一级兽医Zhu管部门报请同级人民政府对疫区发布封锁Ling,对疫区进行封锁。

4.3.3 疫点内应采取的措施

4.3.3.1 扑杀所有的禽只, 销毁所You病死禽、被扑杀禽及其禽类产品;

4.3.3.2 对禽类排泄物、被污染饲料、垫料、污水等进行无害化处理;

4.3.3.3 对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行彻底消毒。

4.3.4 疫区内应采取的措施

4.3.4.1扑杀疫区内所有家禽,并进行Wu害化处理,同时销毁相应的禽类产品;

4.3.4.2 禁止禽类进出疫区及禽类产Pin运出疫区;

4.3.4.3 对禽类排泄物、被污染饲料、垫料、污水等按国家规定标准进行无害化Chu理;

4.3.4.4 对所有与禽类接触过的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行彻底消Du。

4.3.5 受威胁区内应采取的措施

4.3.5.1 对所有易感禽类进行紧急强Zhi免疫, 建立完整的免疫档案;

4.3.5.2 对所有禽类实行疫情监测,掌握疫情动态。

4.3.6 关闭疫点及周边 13公里内Suo有家禽及其产品交易市场。 4.3.7 流行病学调查、疫源分析与追踪调查

Zhui踪疫点内在发病期间及发病前 21天内售Chu的所有家禽及其产品,并销毁处理。按Zhao高致病性禽流感流行病学调查规范,对疫情Jin

Xing溯源和扩散风险分析(附件 11) 。

4.3.8 解除封锁

4.3.8.1 解除封锁的条件

Yi点、疫区内所有禽类及其产品按规定处理完Bi 21天以上,监测未出现新的传染源; 在当地动物防疫监督机构的监督指导下, Wan成相关场所和物品终末消毒;受威胁区按Gui定完成免疫。

4.3.8.2 解除封锁的程序

Jing上一级动物防疫监督机构审验合格, 由当Di兽医主管部门向原发布封锁令的人民政府Shen请发布解除封锁令, 取消所采取的疫情处Ning 措施。

4.3.8.3 疫区解除封锁后,要继续对Gai区域进行疫情监测, 6个月后如未发现Xin病例, 即可宣布该次疫情被扑灭。疫情Xuan布扑灭后方可重新养禽。

4.3.9 对处理疫情的全过程必须做好完Zheng详实的记录,并归档。

5 疫情监测

5.1 监测方法包括临床观察、实验室检测Ji流行病学调查。 5.2 监测对象以易感Qin类为主,必要时监测其他动物。

5.3监测的范围

5.3.1 对养禽场户每年要进行两次病Yuan学抽样检测,散养禽不定期抽检,对于未Jing免疫的禽类以血清学检测为主;

5.3.2 对交易市场、禽类屠宰厂(场) 、异地调入的活禽和禽产品进行不定期的Bing原学和血清学监测。

5.3.3 对疫区和受威胁区的监测

5.3.3.1 对疫区、受威胁区的易感Dong物每天进行临床观察, 连续 1个月,病Si禽送省级动物防疫监督机构实验室进行诊断,疑似样品送国家禽流感参考实验室进行病Du分离和鉴定。

Jie除封锁前采样检测 1次,解除封锁后纳入Zheng常监测范围; 5.3.3.2 对疫区养Zhu场采集鼻腔拭子, 疫区和受威胁区所有禽Qun 采集气管拭子和泄殖腔拭子, 在野生禽Lei活动或栖息地采集新鲜粪便或水样,每个Cai样点采集 20份样品,用 RT-PCR 方法进行病原检测, 发现疑似感染样品,Song国家禽流感参考实验室确诊。

5.5 在监测过程中, 国家规定的实验室Yao对分离到的毒株进行生物学和分子生物学Te性分析与评价, 密切注意病毒的变异动态, 及时向国务院兽医行政管理部门报告。

5.6 各级动物防疫监督机构对监测结果及Xiang关信息进行风险分析,做好预警预报。

5.7监测结果处理

Jian测结果逐级汇总上报至中国动物疫病预防控Zhi中心。发现病原学和非免疫血清学阳性Qin,要按照《国家动物疫情报告管理办法》的有关规定立即报告, 并将样品送国家禽流Gan参考实验室进行确诊, 确诊阳性的,按You关规定处理。

6 免疫

6.1 国家对高致病性禽流感实行强制免疫Zhi度, 免疫密度必须达到 100%,抗Ti合格率达到 70%以上。

6.2 预防性免疫,按农业部制定的免疫方An中规定的程序进行。 6.3 突发疫情时De紧急免疫,按本规范有关条款进行。

6.4 所用疫苗必须采用农业部批准使用的Chan品, 并由动物防疫监督机构统一组织、Zhu级供应。

6.5 所有易感禽类饲养者必须按国家制定De免疫程序做好免疫接种,当地动物防疫监Du机构负责监督指导。

6.6 定期对免疫禽群进行免疫水平监测, 根据群体抗体水平及时加强免疫。

7 检疫监督

7.1产地检疫

Si养者在禽群及禽类产品离开产地前, 必须Xiang当地动物防疫监督机构报检, 接到报检Hou, 必须及时到户、到场实施检疫。检Yi合格的, 出具检疫合格证明,并对运载工Ju进行消毒,出具消毒证明,对检疫不合格De按有关规定处理。

7.2屠宰检疫

Dong物防疫监督机构的检疫人员对屠宰的禽只进Xing验证查物, 合格后方可入厂(场)屠宰。宰后检疫合格的方可出厂,不合格的按有关规定处理。

7.3引种检疫

Guo内异地引入种禽、种蛋时, 应当先到当Di动物防疫监督机构办理检疫审批手续且检Yi合格。引入的种禽必须隔离饲养 21天以Shang, 并由动物防疫监督机构进行检测,合格Hou方可混群饲养。

7.4监督管理

7.4.1禽类和禽类产品凭检疫合格证运输、上市销售。动物防疫监督机构应加强流通Huan节的监督检查,严防疫情传播扩散。

7.4.2生产、经营禽类及其产品的场所必Xu符合动物防疫条件, 并取得动物防疫合格Zheng。

7.4.3各地根据防控高致病性禽流感的需Yao设立公路动物防疫监督检查站,对禽类及Qi产品进行监督检查,对运输工具进行消毒。 8 保障措施

8.1 各级政府应加强机构队伍建设,确保Ge项防治技术落实到位。

8.2 各级财政和发改部门应加强基础设施Jian设, 确保免疫、监测、诊断、扑杀、Wu害化处理、消毒等防治工作经费落实。

8.3 各级兽医行政部门动物防疫监督机构Ying按本技术规范, 加强应急物资储备,及Shi演练和培训应急队伍。

8.4 在高致病禽流感防控中, 人员的防Hu按《高致病性禽流感人员防护技术规范》执行(附件 12) 。

附件 1

Xue凝抑制(HI )试验

Liu感病毒颗粒表面的血凝素(HA )蛋白,Ju有识别并吸附于红细胞表面受体的结构, HA 试验由此得名。 HA 蛋白的抗体Yu受体的特异性结合能够干扰 HA 蛋白Yu红细胞受体的结合从而出现抑制现象。该Shi验是目前 WHO 进行全球流感监测所普Bian采用的试验方法。可用于流感病毒分离Zhu HA 亚型的鉴定,也可用来检测禽血清Zhong是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。

HA-HI 试验的优点是目前 WHO 进Xing全球流感监测所普遍采用的试验方法, Ke用来鉴定所有的流感病毒分离株, 可用来Jian测禽血清中的感染或免疫抗体。它的缺点Shi只有当抗原和抗体 HA 亚型相一致时才能出现 HI 象,各亚型间无明显交叉反Ying;除鸡血清以外,用鸡红细胞检测哺乳动Wu和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非Te异凝集素,对于其它禽种,也可以考虑选Yong在调查研究中的禽种红细胞; 需要在每次Shi验时进行抗原标准化;需要正确判读的技能。

1 阿氏(Alsevers )液配制

Cheng量葡萄糖 2.05g 、柠檬酸钠 0.8g 、柠檬酸 0.055g 、氯Hua钠 0.42g , 加蒸馏水至 100mL ,散热溶解后调 pH 值至 6.1, 69kPa 15min高压灭菌, 4℃保存备用。

2 10%和 1%鸡红细胞液的制备

2.1采血用注射器吸取阿氏液约 1mL ,取至少 2只 SPF 鸡(如

Guo没有 SPF 鸡, 可用常规试验证明体Nei无禽流感和新城疫抗体的鸡) , 采血约 2~4mL , 与阿氏液混合, 放入装 10mL 阿氏液的离心管中混匀。 2.2 洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经 1500~1800 r/min 离心 8Fen钟,弃上清液,沉淀物加入阿氏液,轻轻混He,再经 1500~ 1800 r/min离心 8分钟,用吸管移去上清液及沉淀红Xi胞上层的白细胞薄膜,再重复 2次以上Guo程后,加入阿氏液 20 mL,轻轻混合Cheng 红细胞悬液, 4℃保存备用,不超过 5天。

2.3 10%鸡红细胞悬液取阿氏液保Cun不超过 5天的红细胞, 在锥形刻度离Xin管中离心 1500~1800 r/min 8分钟,弃去上清液,准确观察刻度离Xin管中红细胞体积 (mL),加入 9倍体Ji (mL)的生理盐水,用吸管反复吹吸Shi生理盐水与红细胞混合均匀。

2.4 1%鸡红细胞液取混合均匀的 10%鸡红细胞悬液 1 mL,加入 9 mL生理盐水,混合均匀即可。

3 抗原血凝效价测定(HA 试验,微量法)

3.1 在微量反应板的 1孔~12孔均加Ru 0.025mL PBS,换滴头。 3.2吸取 0.025mL 病毒悬液 (如Gan染性鸡胚尿囊液) 加入第 l 孔, 混Yun。

3.3从第 1孔吸取 0.025mL 病Du液加入第 2孔,混匀后吸取 0.025mL 加入第 3孔,如此进行对倍稀释至第 11孔,从第 11孔吸取 0.025mL 弃之,换滴头。

3.4每孔再加入 0.025mL PBS。

3.5每孔均加入 0.025mL 体积分Shu为 1%鸡红细胞悬液(将鸡红

Xi胞悬液充分摇匀后加入)见附录 B 。

3.6振荡混匀, 在室温 (20~25℃) 下静臵 40min 后观察结果 (如果环境温度太高,可臵 4℃环境下反应 1小时) 。对照孔红细胞将呈明显的钮扣Zhuang沉到孔底。

3.7结果判定将板倾斜,观察血凝板,判Du结果(见下表) 。表 1:血凝试验结Guo判读标准

Neng使红细胞完全凝集(100%凝集, ++++)的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效Jia,此效价为 1个血凝单位(HAU ) 。注意对照孔应呈现完全不凝集(-) ,Fou则此次检验无效。

4 血凝抑制(HI )试验(微量法)

4.1 根据 3的试验结果配制 4HAU 的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释Bei数作为终点,终点稀释倍数除以 4即为含 4HAU 的抗原的稀释倍数。例如,如Guo血凝的终点滴度为 1:256,则 4HAU 抗原的稀释倍数应是 1:64(256除以 4) 。

4.2 在微量反应板的 1孔~11孔加入 0.025mL PBS,第 12孔加 Ru 0.05mL PBS。

4.3 吸取 0.025mL 血清加入第 1孔内, 充分混匀后吸 0.025mL 于第 2孔,依次对倍稀释至第 10孔,从第 10孔吸取 0.025mL 弃去。

4.4 1孔~11孔均加入含 4HAU Hun匀的病毒抗原液 0.025mL ,室 Wen(约 20℃)静臵至少 30min 。

4.5 每孔加入 0.025mL 体积分Shu为 1%的鸡红细胞悬液混匀,轻轻混匀,静臵约 40min (室温约 20℃,Ruo环境温度太高可臵 4℃条件下进行) ,对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。

4.6 结果判定

Yi完全抑制 4个 HAU 抗原的血清最高Xi释倍数作为 HI 滴度。只有阴性对照Kong血清滴度不大于 21og2,阳性对照孔Xue清误差不超过 1个滴度,试验结果才有Xiao。 HI 价小于或等于 21og2判定 HI 试验阴性; HI 价等于 31og2为可疑, 需重复试验; HI 价大Yu或等于 41og2为阳性。

附件 2

Qiong脂凝胶免疫扩散(AGID )试验

A 型流感病毒都有抗原性相似的核衣壳和基Zhi抗原。用已知禽流感 AGID 标准血Qing可以检测是否有 A 型流感病毒的存在,Yi般在鉴定所分禽的病毒是否是 A 型禽Liu感病毒时常用, 此时的抗原需要试验者 Zi己用分离的病毒制备;利用 AGID 标Zhun抗原,可以检测所有 A 型流感病毒产Sheng的各个亚型的禽流感抗体,通常在禽流感监Ce时使用 (水禽不适用 ) ,可作为非Mian疫鸡和火鸡感染的证据,其标准抗原和阳性血清均可由国家指定单位提供。流感病毒Gan染后不是所有的禽种都能产生沉淀抗体。

1 抗原制备

1.1 用含丰富病毒核衣壳的尿囊膜制备。Cong尿囊液呈 HA 阳性的感染鸡胚中提取Rong毛尿囊膜,将其匀浆或研碎,然后反复冻融San次, 经 1000r/m离心 10分钟,弃沉淀,取上清液用 0.1%福尔马林或 1%β-丙内酯灭活后可作为抗原。

1.2 用感染的尿囊液将病毒浓缩或者用已Gan染的绒毛尿囊膜的提取物, 这些抗原用Biao准血清进行标定。将含毒尿囊液以超速离Xin或者在酸性条件下进行沉淀以浓缩病毒。

Suan性沉淀法是将 1.0mol/LHCl加Ru到含毒尿囊液中,调 pH 值到 4.0,将混合物臵于冰浴中作用 1小时,经 1000r/m, 4℃离心 10分钟,弃Qu上清液。病毒沉淀物悬于甘氨 -肌氨酸缓Chong液中(含 1%十二

Wan酰肌氨酸缓冲液,用 0.5 mol/LGan氨酸调 pH 值至 9.0) 。沉淀物Zhong 含有核衣壳和基质多肽。

2 琼脂板制备

Gai 试验常用 1g 优质琼脂粉或 0.8~1g 琼脂糖加 Ru 100 mL0.01mol/L、 pH 值 7.2的 8%氯化钠 -磷酸缓冲Ye中, 水浴加热融化, 稍凉 (60~65℃) , 倒入琼脂板内(厚度为 3mm ) ,待琼脂凝固后, 4℃ 冰箱保存备Yong。用打孔器在琼脂板上按 7孔梅花图案打Kong,孔径约 3 mm ~4mm ,孔距为 3mm 。

3 加样

Yong移液器滴加抗原于中间孔,周围 1、 4Kong加阳性血清,其余孔加被检血清, 每孔Jun以加满不溢出为度, 每加一个样品应换一Ge滴头 , 并设阴性对照血清。

4 感作

Jiang琼脂板加盖保湿,臵于 37℃温箱。 24~48小时后,判定结果。 5 结果判定

5.1 阳性。阳性血清与抗原孔之间有明Xian沉淀线时, 被检血清与抗原孔之间也形Cheng沉淀线, 并与阳性血清的沉淀线末端吻合, 则被检血清判为阳性。

5.2 弱阳性。被检血清与抗原孔之间没You沉淀线, 但阳性血清的沉淀线末端向被Jian血清孔偏弯,此被检血清判为弱阳性(需重Fu试验) 。

5.3 阴性。被检血清与抗原孔之间不形Cheng沉淀线,且阳性血清沉淀线直向被检血清Kong,则被检血清判为阴性。

附件 3

Shen经氨酸酶抑制(NI )试验

Shen经氨酸酶是流感病毒的两种表面糖蛋白之一,它具有酶的活性。 NA 与底物 (胎Qiu蛋白 ) 混合, 37℃温育过夜,可使Tai球蛋白释放出唾液酸,唾液酸经碘酸盐氧Hua,经硫代巴比妥酸作用形成生色团, 该生Se团用有机溶剂提取后便可用分光光度计测定。反应中出现的粉红色深浅与释放的唾液Suan的数量成比例, 即与存在的流感病毒的数Liang 成比例。

Zai进行病毒 NA 亚型鉴定时, 当已知的Biao准 NA 分型抗血清与病毒 NA 亚型Yi致时,抗血清就会将 NA 中和,从而减Shao或避免了胎球蛋白释放唾液酸,最后不出Xian化学反应,即看不到粉红色出现,则表明血清对 NA 抑制阳性。

Gai试验可用于分离株 NA 亚型的鉴定, Ye可用于血清中 NI 抗体的定性测定。

1 溶液配置

1.1胎球蛋白:48-50mg/ml;

1.2过碘酸盐:4.28克过碘酸钠 +38 ml无离子水 +62 ml浓正磷酸,充分混合,棕色瓶存放;

1.3砷试剂:10克亚砷酸钠 +7.1克Wu水硫酸钠 +100 ml 无离子水 +0.3 ml 浓硫酸;

1.4硫代巴比妥酸:1.2克硫代巴比妥酸 +14.2克无水硫酸钠 +200

ml 无离子水,煮沸溶解,使用期一周。

2 操作方法

2.1 按下图所示标记试管

○ ○ ○ ○

N1原液 N1 10倍 N1 100倍 N1 1000倍

○ ○ ○ ○

N2原液 N2 10倍 N2 100倍 N2 1000倍

○ ○ ○ ○

Yin性血清原液阴性血清 10倍阴性血清 100倍阴性血清 1000倍

2.2 将 N1、 N2标准阳性血清和Yin性血清分别按原液、 10倍、

100倍稀释,并分别加入标记好的相应试管Zhong。

2.3 将已经确定 HA 亚型的待检鸡Pei尿囊液稀释至 HA 价为 16倍,每管Jun加入 0.05ml ,混匀 37℃水浴 1小时。

2.4 每管加入的胎球蛋白溶液(50mg/ml) 0.1ml ,混匀,拧上盖Hou 37℃水浴 16-18小时。

2.5 室温冷却后,每管加入 0.1ml 过碘酸盐混匀,室温静臵 20分钟。

2.6 每管加入 1ml 砷试剂,振荡Zhi棕色消失乳白色出现。 2.7 每管加Ru 2.5ml 硫代巴比妥酸试剂,将试管Ning煮沸的水浴中 15分钟,不出现粉红色De为神经氨酸酶抑制阳性,即待检病毒的神Jing氨酸酶亚型与加入管中的标准神经氨酸酶分Xing血清亚型一致。

附件 4

Fan转录 -聚合酶链反应 (RT-PCR)

Fan转录 -聚合酶链反应 (RT-PCR)Shi用于检测禽组织、分泌物、排泄物和鸡胚Niao囊液中禽流感病毒核酸。鉴于 RT-PCR 方法的敏感性和特异性, 引物的选择Shi最为重要的, 通常引物是以已知序列为基Chu设计的, 大量掌握国内分离株的序列是She计特异引物的前题和基础。利用 RT-PCR 的通用引物可以检测是否有 A Xing流感病毒的存在,亚型特异性引物则可进Xing禽流感的分型诊断和禽流感病毒的亚型鉴定。 1 试剂 /引物

1.1 变性液:见附录 A.1

1.2 2M醋酸钠溶液 (pH4.0):见附录 A.2

1.3 水饱和酚(pH 4.0)

1.4 氯仿 /异戊醇混合液:见附录 A.3

1.5 M-MLV反转录酶(200u/μL )

1.6 RNA酶抑制剂 (40u/μL)

1.7 Taq DNA聚合酶 (5u/μL)

1.8 1.0% 琼脂糖凝胶:见附录 A.4

1.9 50×TAE 缓冲液:见附录 A.5

1.10 溴化乙锭 (10μg/μL) :见附录 A.6

1.11 加样缓冲液:见附录 A.7

1.12 焦碳酸二乙酯 (DEPC)处Li的灭菌双蒸水:见附录 A.8

1.13 5×反转录反应缓冲液(附录 A.9)

1.14 2.5mmol dNTPs(Fu录 A.10)

1.15 10×PCR Buffer(Fu录 A.11)

1.16 DNA分子量标准

1.17 引物:见附录 B

2 操作程序

2.1 样品的采集和处理:按照 GB/T 18936中提供方法进行。 2.2 RNA的提取

2.2.1 设立阳性、阴性样品对照。

2.2.2 异硫氰酸胍一步法

2.2.2.1 向组织或细胞中加入适量的Bian性液,匀浆。

2.2.2.2 将混合物移至一管中,按每Hao升变性液中立即加入 0.1mL 乙酸钠, 1mL 酚, 0.2ml 氯仿 -异Wu醇。加入每种组分后,盖上管盖,倒臵混Yun。

2.2.2.3 将匀浆剧烈振荡 10s 。冰浴 15min 使核蛋白质复合体彻 Di裂解。

2.2.2.4 12000r/min, 4℃离心 20min ,将上层含 RNA 的水相移入一新管中。为了降低被处于Shui相和有机相分界处的 DNA 污染的可能性,不要吸取水相的最下层。

2.2.2.5 加入等体积的异丙醇,充分Hun匀液体,并在 -20℃沉淀 RNA 1h或更长时间。

2.2.2.6 4℃ 12000 r/min离心 10 min,弃上清,用 75%的乙醇

Xi涤沉淀,离心,用吸头彻底吸弃上清,自然Tiao件下干燥沉淀,溶于适量 DEPC 处Li的水中。 -20℃贮存,备用。

2.2.3 也可选择市售商品化 RNA Ti取试剂盒,完成 RNA 的提取。 2.3反转录

2.3.1取 5μL RNA,加 1μL 反转录引物, 70℃作用 5min 。 2.3.2冰浴 2min 。

2.3.3继续加入:

5×反转录反应缓冲液 4μL

0.1M DTT 2μL

2.5mmol dNTPs 2μL

M-MLV 反转录酶 0.5μL

RNA 酶抑制剂 0.5μL

DEPC 水 11μL

37℃水浴 1h ,合成 cDNA 链。Qu出后可直接进行 PCR ,或者放于 -20℃保存备用。试验中同时设立阳性和阴性Dui照。

2.4 PCR

Gen据扩增目的不同,选择不同的上 /下游引Wu, M-229U/M-229L是型 Te 异性引物 , 用于扩增 Qin 流感病毒的 M 基因片 Duan ; H5-380U/H5-380L、 H7-501U/H7-501L、 H9-732U/H9-732L分别特异性扩增 H5、 H7、 H9亚型血凝素基因片段 ; N1-358U/N1-358L、 N2-377U/N2-377L分别特异性扩增 N1、 N2亚Xing神经氨酸酶基因片段。 PCR 为 50μL 体系,包括:

Shuang蒸灭菌水 37.5μL

Fan转录产物 4μL

Shang游引物 0.5μL

Xia游引物 0.5μL

10×PCR Buffer 5μL

2.5mmol dNTPs 2μL

Taq 酶 0.5μL

Shou先加入双蒸灭菌水, 然后按顺序逐一加入Shang述成分, 每次要加入到液面下。全部加Wan后,混悬,瞬时离心,使液体都沉降到 PCR 管底。在每个 PCR 管中加入 1滴液体石蜡 (约 20μL) 。循Huan参数为 95℃ 5min , 94℃ 45s, 52℃ 45s, 72℃ 45s,循环 30次, 72℃延伸 6min 结束。设立阳性对照和阴性对照。

2.5电泳

2.5.1 制备 1.0%琼脂糖凝胶板,Jian附录 A.4。

2.5.2 取 5 μL PCR产物与 0.5μL 加样缓冲液混合,加入琼脂糖Ning胶板的加样孔中。

2.5.3加入分子量标准。

2.5.4盖好电泳仪,插好电极, 5V/cm电压电泳, 30~40min 。 2.5.5用紫外凝胶成像仪观察、扫描图片存Dang,打印。

2.5.6 用分子量标准比较判断 PCR 片段大小。

3 结果判定

3.1在阳性对照出现相应扩增带、阴性对照Wu此扩增带时判定结

果。

3.2用 M-229U/M-229L检测,出现大小为 229bp 扩增片段时,判定为禽流感病毒阳性,否则判定为阴性。

3.3用 H5-380U/H5-380LJian测,出现大小为 380bp 扩增片段时, 判定为 H5血凝素亚型禽流感病毒阳性,否则判定为阴性。

3.4用 H7-501U/H7-501LJian测,出现大小为 501bp 扩增片段时, 判定为 H7血凝素亚型禽流感病毒阳性,否则判定为阴性。

3.5用 H9-732U/H9-732LJian测,出现大小为 732bp 扩增片段时, 判定为 H9血凝素亚型禽流感病毒阳性,否则判定为阴性。

3.6用 N1-358U/N1-358LJian测,出现大小为 358bp 扩增片段时, 判定为 N1神经氨酸酶亚型禽流感病毒Yang性,否则判定为阴性。 3.7用 N2-377U/N2-377L检测,出现大小为 377bp 扩增片段时, 判定为 N2Shen经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性,否则判定为Yin性。

附录 A

高致病性禽流感防治技术规范

Gao致病性禽流感防治技术规范

Gao致病性禽流感,Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI,是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类为主的烈性传染病。世界动物卫生组织,OIE,将其列为必须Bao告的动物传染病～我国将其列为一类动物疫Bing。

Wei预防、控制和扑灭高致病性禽流感～依据《Zhong华人民共和国动物防疫法》、《重大动物疫Qing应急条例》、《国家突发重大动物疫情应急Yu案》及有关的法律法规制定本规范。

1 适用范围

Ben规范规定了高致病性禽流感的疫情确认、疫Qing处臵、疫情监测、免疫、检疫监督的操作程Xu、技术标准及保障措施。

Ben规范适用于中华人民共和国境内一切与高致Bing性禽流感防治活动有关的单位和个人。

2 诊断

2.1 流行病学特点

2.1.1 鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉Ji、鹧鸪、鸵鸟、孔雀等多种禽类易感～多种Ye鸟也可感染发病。

2.1.2 传染源主要为病禽,野鸟,和Dai毒禽,野鸟,。病毒可长期在污染的粪便、Shui等环境中存活。

2.1.3 病毒传播主要通过接触感染禽,野鸟,及其分泌物和排泄物、污染的饲料、Shui、蛋托,箱,、垫草、种蛋、鸡胚和精液等Mei

Jie～经呼吸道、消化道感染～也可通过气源性Mei介传播。

2.2 临床症状

2.2.1 急性发病死亡或不明原因死亡～潜伏期从几小时到数天～最长可达21天,

2.2.2 脚鳞出血,

2.2.3 鸡冠出血或发绀、头部和面部Shui肿,

2.2.4 鸭、鹅等水禽可见神经和腹泻Zheng状～有时可见角膜炎症～甚至失明,

2.2.5 产蛋突然下降。

2.3 病理变化

2.3.1 消化道、呼吸道粘膜广泛充血、出血,腺胃粘液增多～可见腺胃乳头出血～

2.3.2

2.3.3 输卵管的中部可见乳白色分泌Wu或凝块,卵泡充血、出血、萎缩、破裂,

2.3.4脑部出现坏死灶、血管周围淋巴细Bao管套、神经胶质灶、

2.4 血清学指标

42.4.1 未免疫禽H5或H7的血凝Yi制(HI)效价达到2及以上,附件1,,

2.4.2 禽流感琼脂免疫扩散试验,AGID,阳性(附件2)。

2.5

2.5.1 反转录-聚合酶链反应,RT-PCR,检测～结果H5或H7亚型禽流感Yang性,附件4,,

2.5.2 通用荧光反转录-聚合酶链反Ying,荧光RT-PCR,检测阳性,附件6,,

2.5.3 神经氨酸酶抑制,NI,试验Yang性,附件3,,

2.5.4 静脉内接种致病指数,IVPI,大于1.2或用0.2ml 1:10稀Shi的无菌感染流感病毒的鸡胚尿囊液～经静脉Zhu射接种8只4-8周龄的易感鸡～在接种后10天内～能致6-7只或8只鸡死亡～即死Wang率?75%,

2.5.5 对血凝素基因裂解位点的氨基Suan序列测定结果与高致病性禽流感分离株基因Xu列相符,由国家参考实验室提供方法,。

2.6 结果判定

2.6.1 临床怀疑病例

Fu合流行病学特点和临床指标2.2.1～且Zhi少符合其他临床指标或病理指标之一的;

Fei免疫禽符合流行病学特点和临床指标2.2.1且符合血清学指标之一的。

2.6.2 疑似病例

Lin床怀疑病例且符合病原学指标2.5.1、2.5.2、2.5.3之一。

2.6.3 确诊病例

Yi似病例且符合病原学指标2.5.4或2.5.5。

3 疫情报告

3.1 任何单位和个人发现禽类发病急、Chuan播迅速、死亡率高等异常情况～应及时向当Di动物防疫监督机构报告。

3.2 当地动物防疫监督机构在接到疫情Bao告或了解可疑疫情情况后～应立即派员到现Chang进行初步调查核实并采集样品～符合2.6.1规定的～确认为临床怀疑疫情,

3.3 确认为临床怀疑疫情的～应在2个Xiao时内将情况逐级报到省级动物防疫监督机构He同级兽医行政管理部门～并立即将样品送省Ji动物防疫监督机构进行疑似诊断,

3.4 省级动物防疫监督机构确认为疑似Yi情的～必须派专人将病料送国家禽流感参考Shi验室做病毒分离与鉴定～进行最终确诊,经Que认后～应立即上报同级人民政府和国务院兽Yi行政管理部门～国务院兽医行政管理部门应Dang在4个小时内向国务院报告,

3.5 国务院兽医行政管理部门根据最终Que诊结果～确认高致病性禽流感疫情。

4 疫情处置

4.1 临床怀疑疫情的处臵

Dui发病场,户,实施隔离、监控～禁止禽类、Qin类产品及有关物品移动～并对其内、外环境Shi施严格的消毒措施,附件8,。

4.2 疑似疫情的处臵

Dang确认为疑似疫情时～扑杀疑似禽群～对扑杀Qin、病死禽及其产品进行无害化处理～对其内、外环境实施严格的消毒措施～对污染物或可Yi污染物进行无害化处理～对污染的场所和设Shi进行彻底消毒～

Xian制发病场,户,周边3公里的家禽及其产品Yi动,见附件9、10,。

4.3 确诊疫情的处臵

Yi情确诊后立即启动相应级别的应急预案。

4.3.1 划定疫点、疫区、受威胁区

You所在地县级以上兽医行政管理部门划定疫点、疫区、受威胁区。

Yi点:指患病动物所在的地点。一般是指患病Qin类所在的禽场,户,或其它有关屠宰、经营Dan位,如为农村散养～应将自然村划为疫点。

Yi区:由疫点边缘向外延伸3公里的区域划为Yi区。疫区划分时～应注意考虑当地的饲养环Jing和天然屏障,如河流、山脉等,。

Shou威胁区:由疫区边缘向外延伸5公里的区域Hua为受威胁区。

4.3.2 封锁

You县级以上兽医主管部门报请同级人民政府决Ding对疫区实行封锁,人民政府在接到封锁报告Hou～应在24小时内发布封锁令～对疫区进行Feng锁:在疫区周围设臵警示标志～在出入疫区De交通路口设臵动物检疫消毒站～对出入的车Liang和有关物品进行消毒。必要时～经省级人民Zheng府批准～可设立临时监督检查站～执行对禽Lei的监督检查任务。

Kua行政区域发生疫情的～由共同上一级兽医主Guan部门报请同级人民政府对疫区发布封锁令～Dui疫区进行封锁。

4.3.3 疫点内应采取的措施

4.3.3.1 扑杀所有的禽只～销毁所有Bing死禽、被扑杀禽及其禽类

产品,

4.3.3.2 对禽类排泄物、被污染饲料、垫料、污水等进行无害化处理,

4.3.3.3 对被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行彻底消毒。

4.3.4 疫区内应采取的措施

4.3.4.1扑杀疫区内所有家禽～并进行Wu害化处理～同时销毁相应的禽类产品,

4.3.4.2 禁止禽类进出疫区及禽类产Pin运出疫区,

4.3.4.3 对禽类排泄物、被污染饲料、垫料、污水等按国家规定标准进行无害化处Li,

4.3.4.4 对所有与禽类接触过的物品、交通工具、用具、禽舍、场地进行彻底消毒。

4.3.5 受威胁区内应采取的措施

4.3.5.1 对所有易感禽类进行紧急强Zhi免疫～建立完整的免疫档案,

4.3.5.2 对所有禽类实行疫情监测～掌握疫情动态。

4.3.6 关闭疫点及周边13公里内所You家禽及其产品交易市场。

4.3.7 流行病学调查、疫源分析与追Zong调查

Zhui踪疫点内在发病期间及发病前21天内售出De所有家禽及其产品～并销毁处理。按照高致Bing性禽流感流行病学调查规范～对疫情进行溯Yuan和扩散风险分析,附件11,。

4.3.8 解除封锁

4.3.8.1 解除封锁的条件

Yi点、疫区内所有禽类及其产品按规定处理完Bi21天以上～监测未出现新的传染源,在当Di动物防疫监督机构的监督指导下～完成相关Chang所和物品终末消毒,受威胁区按规定完成免Yi。

4.3.8.2 解除封锁的程序

Jing上一级动物防疫监督机构审验合格～由当地Shou医主管部门向原发布封锁令的人民政府申请Fa布解除封锁令～取消所采取的疫情处臵措施。

4.3.8.3 疫区解除封锁后～要继续对Gai区域进行疫情监测～6个月后如未发现新病Li～即可宣布该次疫情被扑灭。疫情宣布扑灭Hou方可重新养禽。

4.3.9 对处理疫情的全过程必须做好完Zheng详实的记录～并归档。

5 疫情监测

5.1 监测方法包括临床观察、实验室检测Ji流行病学调查。

5.2 监测对象以易感禽类为主～必要时监Ce其他动物。

5.3监测的范围

5.3.1 对养禽场户每年要进行两次病Yuan学抽样检测～散养禽不定期抽检～对于未经Mian疫的禽类以血清学检测为主,

5.3.2 对交易市场、禽类屠宰厂,场,、异地调入的活禽和禽产品进行不定期的病原Xue和血清学监测。

5.3.3 对疫区和受威胁区的监测

5.3.3.1 对疫区、受威胁区的易感动Wu每天进行临床观察～连续1个月～病死禽送Sheng级动物防疫监督机构实验室进行诊断～疑似Yang品送国家禽流感参考实验室进行病毒分离和Jian定。

Jie除封锁前采样检测1次～解除封锁后纳入正Chang监测范围,

5.3.3.2 对疫区养猪场采集鼻腔拭子～疫区和受威胁区所有禽群采集气管拭子和泄Zhi腔拭子～在野生禽类活动或栖息地采集新鲜Fen便或水样～每个采样点采集20份样品～用RT-PCR方法进行病原检测～发现疑似感Ran样品～送国家禽流感参考实验室确诊。

5.5 在监测过程中～国家规定的实验室要Dui分离到的毒株进行生物学和分子生物学特性Fen析与评价～密切注意病毒的变异动态～及时Xiang国务院兽医行政管理部门报告。

5.6 各级动物防疫监督机构对监测结果及Xiang关信息进行风险分析～做好预警预报。

5.7监测结果处理

Jian测结果逐级汇总上报至中国动物疫病预防控Zhi中心。发现病原学和非免疫血清学阳性禽～Yao按照《国家动物疫情报告管理办法》的有关Gui定立即报告～并将样品送国家禽流感参考实Yan室进行确诊～确诊阳性的～按有关规定处理。

6 免疫

6.1 国家对高致病性禽流感实行强制免疫Zhi度～免疫密度必须达到100%～抗体合格Lv达到70%以上。

6.2 预防性免疫～按农业部制定的免疫方An中规定的程序进行。

6.3 突发疫情时的紧急免疫～按本规范有Guan条款进行。

6.4 所用疫苗必须采用农业部批准使用的Chan品～并由动物防疫监督机构统一组织、逐级Gong应。

6.5 所有易感禽类饲养者必须按国家制定De免疫程序做好免疫接种～当地动物防疫监督Ji构负责监督指导。

6.6 定期对免疫禽群进行免疫水平监测～Gen据群体抗体水平及时加强免疫。

7 检疫监督

7.1产地检疫

Si养者在禽群及禽类产品离开产地前～必须向Dang地动物防疫监督机构报检～接到报检后～必Xu及时到户、到场实施检疫。检疫合格的～出Ju检疫合格证明～并对运载工具进行消毒～出Ju消毒证明～对检疫不合格的按有关规定处理。

7.2屠宰检疫

Dong物防疫监督机构的检疫人员对屠宰的禽只进Xing验证查物～合格后方可入厂,场,屠宰。宰Hou检疫合格的方可出厂～不合格的按有关规定Chu理。

7.3引种检疫

Guo内异地引入种禽、种蛋时～应当先到当地动Wu防疫监督机构办理检疫审批手续且检疫合格。引入的种禽必须隔离饲养21天以上～并由Dong物防疫监督机构进行检测～合格后方可混群Si养。

7.4监督管理

7.4.1禽类和禽类产品凭检疫合格证运输、上市销售。动物防疫监督机构应加强流通环Jie的监督检查～严防疫情传播扩散。

7.4.2生产、经营禽类及其产品的场所必Xu符合动物防疫条件～并取得动物防疫合格证。

7.4.3各地根据防控高致病性禽流感的需Yao设立公路动物防疫监督检查站～对禽类及其Chan品进行监督检查～对运输工具进行消毒。

8 保障措施

8.1 各级政府应加强机构队伍建设～确保Ge项防治技术落实到位。

8.2 各级财政和发改部门应加强基础设施Jian设～确保免疫、监测、诊断、扑杀、无害化Chu理、消毒等防治工作经费落实。

8.3 各级兽医行政部门动物防疫监督机构Ying按本技术规范～加强应急物资储备～及时演Lian和培训应急队伍。

8.4 在高致病禽流感防控中～人员的防护An《高致病性禽流感人员防护技术规范》执行,附件12,。

附件1

Xue凝抑制(HI)试验

Liu感病毒颗粒表面的血凝素,HA,蛋白～具You识别并吸附于红细胞表面受体的结构～HAShi验由此得名。HA蛋白的抗体与受体的特异Xing结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合Cong而出现抑制现象。

Gai试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍Cai用的试验方法。可用于流感病毒分离株HAYa型的鉴定～也可用来检测禽血清中是否有与Kang原亚型一致的感染或免疫抗体。

HA-HI试验的优点是目前WHO进行全球Liu感监测所普遍采用的试验方法～可用来鉴定Suo有的流感病毒分离株～可用来检测禽血清中De感染或免疫抗体。它的缺点是只有当抗原和Kang体HA亚型相一致时才能出现HI象～各亚Xing间无明显交叉反应,除鸡血清以外～用鸡红Xi胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存Zai于血清中的非特异凝集素～对于其它禽种～Ye可以考虑选用在调查研究中的禽种红细胞,Xu要在每次试验时进行抗原标准化,需要正确Pan读的技能。

1 阿氏,Alsevers,液配制

Cheng量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、Ning檬酸0.055g、氯化钠0.42g～加Zheng馏水至100mL～散热溶解后调pH值至6.1～69kPa 15min高压灭菌～4?保存备用。

2 10%和1%鸡红细胞液的制备

2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL～取至少2只SPF鸡,如

Guo没有SPF鸡～可用常规试验证明体内无禽Liu感和新城疫抗体的鸡,～采血约2，4mL～与阿氏液混合～放入装10mL阿氏液的离Xin管中混匀。

2.2 洗涤鸡红细胞将离心管中的血液Jing1500，1800 r/min 离心8Fen钟～弃上清液～沉淀物加入阿氏液～轻轻混He～再经1500，1800 r/min离Xin8分钟～用吸管移去上清液及沉淀红细胞上Ceng的白细胞薄膜～再重复2次以上过程后～加Ru阿氏液20 mL～轻轻混合成红细胞悬液～4?保存备用～不超过5天。

2.3 10%鸡红细胞悬液取阿氏液Bao存不超过5天的红细胞～在锥形刻度离心管Zhong离心1500，1800 r/min 8Fen钟～弃去上清液～准确观察刻度离心管中红Xi胞体积(mL)～加入9倍体积(mL)的Sheng理盐水～用吸管反复吹吸使生理盐水与红细Bao混合均匀。

2.4 1%鸡红细胞液取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL～加入9 mLSheng理盐水～混合均匀即可。

3 抗原血凝效价测定,HA试验～微量法,

3.1 在微量反应板的1孔，12孔均加入0.025mL PBS～换滴头。

3.2吸取0.025mL病毒悬液,如感染Xing鸡胚尿囊液,加入第l孔～混匀。

3.3从第1孔吸取0.025mL病毒液加Ru第2孔～混匀后吸取0.025mL加入第3孔～如此进行对倍稀释至第11孔～从第11孔吸取0.025mL弃之～换滴头。

3.4每孔再加入0.025mL PBS。

3.5每孔均加入0.025mL 体积分数Wei1%鸡红细胞悬液,将鸡红

Xi胞悬液充分摇匀后加入,见附录B。

3.6振荡混匀～在室温,20，25?,下Jing臵40min后观察结果,如果环境温度太Gao～可臵4?环境下反应1小时,。对照孔红Xi胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。

3.7结果判定将板倾斜～观察血凝板～Pan读结果,见下表,。

Biao1:血凝试验结果判读标准

Lei别孔底所见结果

1 红细胞全部凝集～均匀铺于孔底～即100%红细胞凝集 ++++

2 红细胞凝集基本同上～但孔底有大圈 +++

++ 3 红细胞于孔底形成中等大的圈～四Zhou有小凝块

+ 4 红细胞于孔底形成小圆点～四周有少Xu凝集块

- 5 红细胞于孔底呈小圆点～边缘光滑整Qi～即红细胞完全

不凝集

Neng使红细胞完全凝集,100%凝集～++++,的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价～Ci效价为1个血凝单位,HAU,。注意对照Kong应呈现完全不凝集,-,～否则此次检验无Xiao。

4 血凝抑制,HI,试验,微量法,

4.1 根据3的试验结果配制4HAU的病Du抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为Zhong点～终点稀释倍数除以4即为含4HAU的Kang原的稀释倍数。例如～如果血凝的终点滴度Wei1:256～则4HAU抗原的稀释倍数应Shi1:64,256除以4,。

4.2 在微量反应板的1孔，11孔加入0.025mL PBS～第12孔加入0.05mL PBS。

4.3 吸取0.025mL血清加入第1孔Nei～充分混匀后吸0.025mL于第2孔～Yi次对倍稀释至第10孔～从第10孔吸取0.025mL弃去。

4.4 1孔，11孔均加入含4HAU混匀De病毒抗原液0.025mL～室温,约20?,静臵至少30min。

4.5 每孔加入0.025mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀～轻轻混匀～静臵约40min,室温约20?～若环境温度太高Ke臵4?条件下进行,～对照红细胞将呈现钮Kou状沉于孔底。

4.6 结果判定

Yi完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍Shu作为HI滴度。

Zhi有阴性对照孔血清滴度不大于21og2～Yang性对照孔血清误差不超过1个滴度～试验结Guo才有效。HI价小于或等于21og2判定HI试验阴性,HI价等于31og2为可疑～需重复试验,HI价大于或等于41og2Wei阳性。

附件2

Qiong脂凝胶免疫扩散(AGID)试验

A型流感病毒都有抗原性相似的核衣壳和基质Kang原。用已知禽流感AGID标准血清可以检Ce是否有A型流感病毒的存在～一般在鉴定所Fen禽的病毒是否是A型禽流感病毒时常用～此Shi的抗原需要试验者自己用分离的病毒制备,Li用AGID标准抗原～可以检测所有A型流Gan病毒产生的各个亚型的禽流感抗体～通常在Qin流感监测时使用(水禽不适用)～可作为非Mian疫鸡和火鸡感染的证据～其标准抗原和阳性Xue清均可由国家指定单位提供。流感病毒感染Hou不是所有的禽种都能产生沉淀抗体。

1 抗原制备

1.1 用含丰富病毒核衣壳的尿囊膜制备。Cong尿囊液呈HA阳性的感染鸡胚中提取绒毛尿Nang膜～将其匀浆或研碎～然后反复冻融三次～Jing1000r/m离心10分钟～弃沉淀～取Shang清液用0.1%福尔马林或1%β-丙内酯Mie活后可作为抗原。

1.2 用感染的尿囊液将病毒浓缩或者用已Gan染的绒毛尿囊膜的提取物～这些抗原用标准Xue清进行标定。将含毒尿囊液以超速离心或者Zai酸性条件下进行沉淀以浓缩病毒。

Suan性沉淀法是将1.0mol/LHCl加入Dao含毒尿囊液中～调pH值到4.0～将混合Wu臵于冰浴中作用1小时～经1000r/m～4?离心10分钟～弃去上清液。病毒沉淀Wu悬于甘氨-肌氨酸缓冲液中,含1%十二

Wan酰肌氨酸缓冲液～用0.5 mol/L甘An酸调pH值至9.0,。沉淀物中含有核衣Ke和基质多肽。

2 琼脂板制备

Gai试验常用1g优质琼脂粉或0.8，1g Qiong脂糖加入100 mL0.01mol/L、pH值7.2的8%氯化钠-磷酸缓冲液中～水浴加热融化～稍凉,60，65?,～倒Ru琼脂板内,厚度为3mm,～待琼脂凝固后～4?冰箱保存备用。用打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔～孔径约3 mm ，4mm～孔距为3mm。

3 加样

Yong移液器滴加抗原于中间孔～周围1、4孔加Yang性血清～其余孔加被检血清～每孔均以加满Bu溢出为度～每加一个样品应换一个滴头,并She阴性对照血清。

4 感作

Jiang琼脂板加盖保湿～臵于37?温箱。24，48小时后～判定结果。

5 结果判定

5.1 阳性。阳性血清与抗原孔之间有明显Chen淀线时～被检血清与抗原孔之间也形成沉淀Xian～并与阳性血清的沉淀线末端吻合～则被检Xue清判为阳性。

5.2 弱阳性。被检血清与抗原孔之间没有Chen淀线～但阳性血清的沉淀线末端向被检血清Kong偏弯～此被检血清判为弱阳性,需重复试验,。

5.3 阴性。被检血清与抗原孔之间不形Cheng沉淀线～且阳性血清沉淀线直向被检血清孔～则被检血清判为阴性。

附件3

Shen经氨酸酶抑制(NI)试验

Shen经氨酸酶是流感病毒的两种表面糖蛋白之一～它具有酶的活性。NA与底物(胎球蛋白)Hun合～37?温育过夜～可使胎球蛋白释放出Tuo液酸～唾液酸经碘酸盐氧化～经硫代巴比妥Suan作用形成生色团～该生色团用有机溶剂提取Hou便可用分光光度计测定。反应中出现的粉红Se深浅与释放的唾液酸的数量成比例～即与存Zai的流感病毒的数量成比例。

Zai进行病毒NA亚型鉴定时～当已知的标准NA分型抗血清与病毒NA亚型一致时～抗血清Jiu会将NA中和～从而减少或避免了胎球蛋白Shi放唾液酸～最后不出现化学反应～即看不到Fen红色出现～则表明血清对NA抑制阳性。

Gai试验可用于分离株NA亚型的鉴定～也可用Yu血清中NI抗体的定性测定。

1 溶液配置

1.1胎球蛋白:48-50mg/ml;

1.2过碘酸盐:4.28克过碘酸钠+38 ml无离子水+62 ml浓正磷酸～充分Hun合～棕色瓶存放,

1.3砷试剂:10克亚砷酸钠+7.1克无Shui硫酸钠+100 ml无离子水+0.3 ml 浓硫酸,

1.4硫代巴比妥酸:1.2克硫代巴比妥酸+14.2克无水硫酸钠+200

ml无离子水～煮沸溶解～使用期一周。

2 操作方法

2.1 按下图所示标记试管

? ? ? ?

N1原液 N1 10倍 N1 100倍 N1 1000倍

? ? ? ?

N2原液 N2 10倍 N2 100倍 N2 1000倍

? ? ? ?

Yin性血清原液阴性血清10倍阴性血Qing100倍阴性血清1000倍

2.2 将N1、N2标准阳性血清和阴性Xue清分别按原液、10倍、100倍稀释～并Fen别加入标记好的相应试管中。

2.3 将已经确定HA亚型的待检鸡胚尿Nang液稀释至HA价为16倍～每管均加入0.05ml～混匀37?水浴1小时。

2.4 每管加入的胎球蛋白溶液,50mg/ml,0.1ml～混匀～拧上盖后37?水浴16-18小时。

2.5 室温冷却后～每管加入0.1mlGuo碘酸盐混匀～室温静臵20分钟。

2.6 每管加入1ml砷试剂～振荡至棕Se消失乳白色出现。

2.7 每管加入2.5ml硫代巴比妥酸Shi剂～将试管臵煮沸的水浴中15分钟～不出Xian粉红色的为神经氨酸酶抑制阳性～即待检病Du的神经氨酸酶亚型与加入管中的标准神经氨Suan酶分型血清亚型一致。

附件4

Fan转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

Fan转录-聚合酶链反应(RT-PCR)适用Yu检测禽组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液Zhong禽流感病毒核酸。鉴于RT-PCR方法的Min感性和特异性～引物的选择是最为重要的～Tong常引物是以已知序列为基础设计的～大量掌Wo国内分离株的序列是设计特异引物的前题和Ji础。利用RT-PCR的通用引物可以检测Shi否有A型流感病毒的存在～亚型特异性引物Ze可进行禽流感的分型诊断和禽流感病毒的亚Xing鉴定。

1 试剂/引物

1.1 变性液:见附录A.1

1.2 2M醋酸钠溶液(pH4.0):Jian附录A.2

1.3 水饱和酚,pH 4.0,

1.4 氯仿/异戊醇混合液:见附录A.3

1.5 M-MLV反转录酶,200u/μL,

1.6 RNA酶抑制剂(40u/μL)

1.7 Taq DNA聚合酶(5u/μL)

1.8 1.0% 琼脂糖凝胶:见附录A.4

1.9 50×TAE缓冲液:见附录A.5

1.10 溴化乙锭(10μg/μL):Jian附录A.6

1.11 加样缓冲液:见附录A.7

1.12 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理De灭菌双蒸水:见附录A.8

1.13 5×反转录反应缓冲液,附录A.9,

1.14 2.5mmol dNTPs,Fu录A.10,

1.15 10×PCR Buffer,Fu录A.11,

1.16 DNA分子量标准

1.17 引物:见附录B

2 操作程序

2.1 样品的采集和处理:按照GB/T 18936中提供方法进行。

2.2 RNA的提取

2.2.1 设立阳性、阴性样品对照。

2.2.2 异硫氰酸胍一步法

2.2.2.1 向组织或细胞中加入适量的Bian性液～匀浆。

2.2.2.2 将混合物移至一管中～按每Hao升变性液中立即加入0.1mL乙酸钠～1mL酚～0.2ml氯仿-异戊醇。加入每种Zu分后～盖上管盖～倒臵混匀。

2.2.2.3 将匀浆剧烈振荡10s。冰Yu15min使核蛋白质复合体彻底裂解。

2.2.2.4 12000r/min～4?离心20min～将上层含RNA的水相移Ru一新管中。为了降低被处于水相和有机相分Jie处的DNA污染的可能性～不要吸取水相的Zui下层。

2.2.2.5 加入等体积的异丙醇～充分Hun匀液体～并在-20?沉淀RNA 1h或Geng长时间。

2.2.2.6 4? 12000 r/min离心10 min～弃上清～用75%的Yi醇

Xi涤沉淀～离心～用吸头彻底吸弃上清～自然Tiao件下干燥沉淀～溶于适量DEPC处理的水Zhong。-20

2.2.3 也可选择市售商品化RNA提取Shi剂盒～完成RNA的提取。

2.3反转录

2.3.1取5μL RNA～加1μL反转Lu引物～70?作用5min。

2.3.2冰浴2min。

2.3.3继续加入:

5×反转录反应缓冲液 4μL

0.1M DTT 2μL

2.5mmol dNTPs 2μL

M-MLV反转录酶 0.5μL

RNA酶抑制剂 0.5μL

DEPC水 11μL

37?水浴1h～合成cDNA链。取出后可Zhi接进行PCR～或者放于-20?保存备用。试验中同时设立阳性和阴性对照。

2.4 PCR

Gen据扩增目的不同～选择不同的上/下游引物～M-229U/M-229L

Shi型特异性引物～用于扩增禽流感病毒的M基Yin片段,H5-380U/H5-380L、H7-501U/H7-501L、H9-732U/H9-732L分别特异性扩增H5、H7、H9亚型血凝素基因片段,N1-358U/N1-358L、N2-377U/N2-377L分别特异性扩增N1、N2亚Xing神经氨酸酶基因片段。

PCR为50μL体系～包括:

Shuang蒸灭菌水 37.5μL

Fan转录产物 4μL

Shang游引物 0.5μL

Xia游引物 0.5μL

10×PCR Buffer 5μL

2.5mmol dNTPs 2μL

Taq酶 0.5μL

Shou先加入双蒸灭菌水～然后按顺序逐一加入上Shu成分～每次要加入到液面下。全部加完后～Hun悬～瞬时离心～使液体都沉降到PCR管底。在每个PCR管中加入1滴液体石蜡(约20μL)。循环参数为95?5min～94? 45s～52? 45s～72? 45s～循环30次～72?延伸6min结束。She立阳性对照和阴性对照。

2.5电泳

2.5.1 制备1.0%琼脂糖凝胶板～见Fu录A.4。

2.5.2 取5 μL PCR产物与0.5μL加样缓冲液混合～加入琼脂糖凝胶板的Jia样孔中。

2.5.3加入分子量标准。

2.5.4盖好电泳仪～插好电极～5V/cm电压电泳～30，40min。

2.5.5用紫外凝胶成像仪观察、扫描图片Cun档～打印。

2.5.6 用分子量标准比较判断PCR片Duan大小。

3 结果判定

3.1在阳性对照出现相应扩增带、阴性对照Wu此扩增带时判定结

果。

3.2用M-229U/M-229L检测～Chu现大小为229bp扩增片段时～判定为禽Liu感病毒阳性～否则判定为阴性。

3.3用H5-380U/H5-380L检Ce～出现大小为380bp扩增片段时～判定WeiH5血凝素亚型禽流感病毒阳性～否则判定Wei阴性。

3.4用H7-501U/H7-501L检Ce～出现大小为501bp扩增片段时～判定WeiH7血凝素亚型禽流感病毒阳性～否则判定Wei阴性。

3.5用H9-732U/H9-732L检Ce～出现大小为732bp扩增片段时～判定WeiH9血凝素亚型禽流感病毒阳性～否则判定Wei阴性。

3.6用N1-358U/N1-358L检Ce～出现大小为358bp扩增片段时～判定WeiN1神经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性～否则Pan定为阴性。

3.7用N2-377U/N2-377L检Ce～出现大小为377bp扩增片段时～判定WeiN2神经氨酸酶亚型禽流感病毒阳性～否则Pan定为阴性。

附录A

相关试剂的配制

A.1 变性液

4M 异硫氰酸胍

25mM 柠檬酸钠.2HO 2

0.5%,m/V, 十二烷基肌酸钠

0.1M β-巯基乙醇

Ju体配制:将250g异硫氰酸胍、0.75M, PH7.0,柠檬酸钠17.6ml和26.4ml 10%,m/V,十二烷基肌Suan钠溶于293ml水中。65?条件下搅拌、混匀～直至完全溶解。室温条件下保存～每Ci临用前按每50ml变性液加14.4 mol/L的β-巯基乙醇0.36ml的剂量Jia入。变性液可在室温下避光保存数月。

A.2 2mol/L醋酸钠溶液(pH4.0)

Yi酸钠 16.4 g

Bing乙酸调pH至4.0

Mie菌双蒸水加至100 mL

A.3 氯仿/异戊醇混合液

氯仿 49 mL

异戊醇 1 mL

A.4 1.0%琼脂糖凝胶的配制

Qiong脂糖 1.0 g

0.5×TAE电泳缓冲液加至100 mL

Wei波炉中完全融化～待冷至50?-60?时～加溴化乙锭,EB,溶

Ye5μL～摇匀～倒入电泳板上～凝固后取下Shu子～备用。 A.5 50×TAE电泳Huan冲液

A.5.1 0.5mol/L 乙二铵四Yi酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0)

Er水乙二铵四乙酸二钠 18.61 g

Mie菌双蒸水 80 mL

Qing氧化钠调pH至8.0

Mie菌双蒸水加至100 mL A.5.2 TAE电泳缓冲液(50×)配制

Zuo基甲基氨基甲烷(Tris) 242 g

Bing乙酸 57.1 mL

0.5mol/L乙二铵四乙酸二

Na溶液(PH8.0) 100 mL

Mie菌双蒸水加至1 000 mL 用时用Mie菌双蒸水稀释使用

A.6 溴化乙锭,EB,溶液

Zuo化乙锭 20 mg

Mie菌双蒸水加至20 mL A.7 10×加样缓冲液

聚蔗糖 25 g

Mie菌双蒸水 100 mL

Zuo酚蓝 0.1 g

Er甲苯青 0.1 g A.8 DEPCShui

Chao纯水 100 mL

Jiao碳酸二乙酯(DEPC) 50μL 室温Guo夜～121?高压15min～分装到1.5 mL DEPC处理过的微量

管中。

A.9 M-MLV 反转录酶5×反应缓Chong液

1moL Tris-HCl (pH 8.3) 5 mL

KCl 0.559 g

MgCl2 0.029 g

DTT 0.154 g

Mie菌双蒸水加至100 mL A.10 2.5mmol/LdNTP

dATP(10mmol/L) 20 μL

dTTP(10mmol/L) 20 μL

dGTP(10mmol/L) 20 μL

dCTP(10mmol/L) 20 μL A.11 10×PCR缓冲液

1M Tris-HCl (pH8.8) 10 mL

1M KCl 50 mL

Nonidet P40 0.8 mL

1.5moL MgCl 21 mL

Mie菌双蒸水加至100 mL

附录B

Qin流感病毒RT-PCR试验用引物

B.1 反转录引物

Uni 12:5′-AGCAAAAGCAGG-3′，引物浓度为20pmol。 B.2 PCR引物

Jian下表，引物浓度均为20pmol。

B.2 PCR过程中选择的引物

Yin物长度引物序列扩增目的名称 (bp) M-229U 5′-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3′

229 通用引物 M-229L 5′-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3′

H5-380U 5′-AGTGAATTGGAATATGGTAACTG-3′

380 H5 H5-380L 5′-AACTGAGTGTTCATTTTGTCAAT-3′

H7-501U 5′-AATGCACARGGAGGAGGAACT-3′

501 H7 H7-501L 5′-TGAYGCCCCGAAGCTAAACCA-3′

H9-732U 5′-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3′

732 H9 H9-732L 5′-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3′

N1-358U 5′-ATTRAAATACAAYGGYATAATAAC-3′

358 N1 N1-358L 5′-GTCWCCGAAAACYCCACTGCA-3′

N2-377U 5′-GTGTGYATAGCATGGTCCAGCTCAAG-3′

377 N2 N2-377L 5′-GAGCCYTTCCARTTGTCTCTGCA-3′

W = (AT);Y = (CT);R = (AG)。

附件5

Qin流感病毒致病性测定

Gao致病性禽流感是指由强毒引起的感染～感染Qin有时可见典型的高致病性禽流感特征～有时Ze未见任何临床症状而突然死亡。所有分离到De高致病性病毒株均为H5或H7亚型～但大Duo数H5或H7亚型仍为弱毒株。评价分离株Shi否为高致病性或者是潜在的高致病性毒株具You重要意义。

1 欧盟国家对高致病性禽流感病毒判定标准

Jie种6周龄的SPF鸡～其IVPI大于1.2的或者核苷酸序列在血凝素裂解位点处有一Xi列的连续碱性氨基酸存在的H5或H7亚型Liu感病毒均判定为高致病性病毒。

Jing脉接种指数,IVPI,测定方法:

Shou获接种病毒的SPF鸡胚的感染性尿囊液～Ce定其血凝价>1/16

44,2或lg2,将含毒尿囊液用灭菌生理Yan水稀释10倍,切忌使用抗生素,～将此稀Shi病毒液以0.1mL/羽静脉接种10只6Zhou龄SPF鸡,2只同样鸡只接种0.1mLXi释液作对照,对照鸡不应发病～也不计入试Yan鸡,。每隔24小时检查鸡群一次～共观察10天。根据每只鸡的症状用数字方法每天进Xing记录:正常鸡记为0～病鸡记为1～重病鸡Ji为2～死鸡记为3,病鸡和重病鸡的判断主Yao依据临床症状表现。一般而言～“病鸡”表Xian有下述一种症状～而“重病鸡”则表现下述Duo个症状～如呼吸症状、沉郁、腹泻、鸡冠和/或肉髯发绀、脸和/或头

Bu肿胀、神经症状。死亡鸡在其死后的每次观Cha都记为3,。

IVPI值,每只鸡在10天内所有Shu字之和/,10只鸡×10天,～如指数为3.00～说明所有鸡24小时内死亡,指数Wei0.00～说明10天观察期内没有鸡表现Lin床症状。

DangIVPI值大于1.2时～判定分离株为高Zhi病性禽流感病毒,HPAIV

IVPI

(数字表示在特定日期表现出临床症状的鸡只Shu量) 临床 1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 总计 Shu值症状

Zheng常 10 10 0 0 0 0 0 0 0 0 20 x 0 = 0 发病 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 3 x 1 = 3 麻痹 0 0 4 5 1 0 0 0 0 0 10 x 2 = 20 死亡 0 0 3 5 9 10 10 10 10 10 67 x 3 = 201

总计 = 224

上述例子中的IVPI为: 224/100 = 2.24,1.2

2 OIE对高致病性禽流感病毒的分类标Zhun

2.1 取HA滴度>1/16的无菌感染流Gan病毒的鸡胚尿囊液用等渗生理盐水1:10Xi释～以0.2mL,羽的剂量翅静脉接种8Zhi4，8周龄SPF鸡～在接种10天内～能Dao致6只或6只以上鸡死亡～判定该毒株为高Zhi病性禽流感病毒株。

2.2 如分离物能使1，5只鸡致死～但病Du不是H5或H7亚型～则应进行下列试验:Jiang病毒接种于细胞培养物上～观察其在胰蛋白Mei缺乏时是否引起细胞病变或形成蚀斑。如果Bing毒不能在细胞上生长～

2.3所有低致病性的H5和H7毒株和其它Bing毒～在缺乏胰蛋白酶的细胞上能够生长时～Ze应进行与血凝素有关的肽链的氨基酸序列分Xi～如果分析结果同其它高致病性流感病毒相Si～这种被检验的分离物应被考虑为高致病性Qin流感病毒。

附件6

Qin流感病毒通用荧光RT-PCR检测

1 材料与试剂

1.1 仪器与器材

Ying光RT-PCR检测仪

Gao速台式冷冻离心机,离心速度12000r/min以上,

Tai式离心机,离心速度3000r/min,

混匀器

Bing箱,2，8?和-20?两种,

Wei量可调移液器,10μL、100μL、1000μL,及配套带滤芯吸头

Eppendorf管,1.5mL,

1.2 试剂

Chu特别说明以外～本标准所用试剂均为分析纯～所有试剂均用无RNA酶污染的容器,用DEPC水处理后高压灭菌,分装。

氯仿,

Yi丙醇:-20? 预冷,

PBS:121?2?～15min高压灭菌Leng却后～无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000 U/mL,

75%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPCShui,符合GB 6682 要求,配制～-20?预冷。

Qin流感病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂He:组成、功能及使用

注意事项见附录。

2 抽样

2.1

Xia列采样工具必须经,121?2,?～15min高压灭菌并烘干:

Mian拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5ml Eppendorf管、研钵。

2.2 样品采集

1)活禽

Qu咽喉拭子和泄殖腔拭子～采集方法如下:

Qu咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回Gua3-5次取咽喉

Qu泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾Qu少量粪便,

Jiang拭子一并放入盛有1.0mL PBS的1.5mL Eppendorf管中～加盖、Bian号。

2)肌肉或组织脏器

Dai检样品装入一次性塑料袋或其它灭菌容器～Bian号～送实验室。

3)血清、血浆

Yong无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中～编号备用。

2.3 样品贮运

Yang品采集后～放入密闭的塑料袋内,一个采样Dian的样品～放一个塑料袋,～于保温箱中加冰、密封～送实验室。

2.4 样品制备

1)咽喉、泄殖腔拭子

Yang品在混合器上充分混合后～用高压灭菌镊子Jiang拭子中的液体挤出～室温放臵30 min～取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中～编号备用。

2)肌肉或组织脏器

Qu待检样品2.0 g于洁净、灭菌并烘干的Yan钵中充分研磨～加10mL PBS混匀～4?～3000r/min离心15min～Qu上清液转入无菌的1.5mL Eppendorf管中～编号备用。

2.5 样本存放

Zhi备的样本在2，8?条件下保存应不超过24h～若需长期保存应臵-70?以下～但应Bi免反复冻融,冻融不超过3次,。

3 操作方法

3.1 实验室标准化设臵与管理

Qin流感病毒通用荧光RT,PCR检测的实验Shi规范。

3.2 样本的处理

Zai样本制备区进行。

? 取n 个灭菌的1.5mL Eppendorf管～其中n 为被检样品、阳性对照Yu阴性对照的和,阳性对照、阴性对照在试剂He中已标出,～编号。

? 每管加入600μL裂解液～分别加入被Jian样本、阴性对照、阳性对照各200μL～Yi份样本换用一个吸头～再加入200μL氯Fang～混匀器上振荡混匀5s,不能过于强烈～Yi免产生乳化层～也可以用手颠倒混匀,。于4?、12000r/min离心15min。

? 取与?相同数量灭菌的1.5mL Eppendorf管～加入500μL异丙醇,-20?预冷,～做标记。吸取本标准?各管Zhong的上清液转移至相应的管中～上清液应至少Xi取500μL～不能吸出中间层～颠倒混匀。

? 于4?、12 000r/min离心15 min,Eppendorf 管开口保Chi朝离心机转轴方向放臵,～小心倒去上清～Dao臵于吸水纸上～沾干液体(不同样品须在吸Shui纸不同地方沾干),加入600 μL 75,乙醇～颠倒洗涤。

? 于4 ?、12000 r/min离心10min,Eppendorf 管开口保Chi朝离心机转轴方向放臵,～小心倒去上清～Dao臵于吸水纸上～尽量沾干液体,不同样品须Zai吸水纸不同地方沾干,。

? 4000 r/min 离心10s,Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方Xiang放臵,～将管壁上的残余液体甩到管底部～Xiao心倒去上清～用微量加样器将其吸干～一份Yang本换用一个吸头～吸头不要碰到有沉淀一面～室温干燥3 min～不能过于干燥～以免RNA 不溶。

? 加入11 μL DEPC水～轻轻混匀～溶解管壁上的RNA～ 2000r/min离心5s～冰上保存备用。提取的RNA须Zai2h内进行PCR扩增,若需长期保存须放Ning-70?冰箱。

3.3 检测

? 扩增试剂准备

Zai反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相Ying的荧光RT-PCR反应液、Taq酶～在Shi温下融化后～2000r/min离心5s。设所需荧光

RT-PCR检测总数为n～其中n为被检样Pin、阳性对照与阴性对照的和～每个样品测试Fan应体系配制如下:RT-PCR反应液15μL～Taq酶0.25μL。根据测试样品De数量计算好各试剂的使用量～加入到适当体Ji中～向其中加入0.25×n颗RT-PCR反转录酶颗粒～充分混合均匀～向每个荧光RT-PCR管中各分装15μL～转移至样Ben处理区。

? 加样

Zai样本处理区进行。在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理中制备的RNA溶液各10μL～盖紧管盖～500r/min离心30s。

? 荧光RT-PCR检测

Zai检测区进行。将本标准中离心后的PCR管Fang入荧光RT-PCR检测仪内～记录样本摆Fang顺序。

Xun环条件设臵:第一阶段～反转录42?/30 min,第二阶段～预变性92?/3 min,第三阶段～92?/10s～45?/30s～72?/1 min～5个循环,Di四阶段～92?/10s～60?/30s～40个循环～在第四阶段每个循环的退火延Shen时收集荧光。

Shi验检测结束后～根据收集的荧光曲线和CtZhi判定结果。

4 结果判定

4.1 结果分析条件设定

Zhi接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪Sheng情况进行调整～以阈值线刚好超过正常阴性Yang品扩增曲线的最高点为准。

4.2 质控标准

? 阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。

? 阳性对照的Ct值应,28.0～并出现Dian型的扩增曲线。否则～此次实验视为无效。

4.3 结果描述及判定

? 阴性

WuCt值并且无扩增曲线～表示样品中无禽流Gan病毒。

? 阳性

Ct值?30～且出现典型的扩增曲线～表示Yang品中存在禽流感病毒。

? 有效原则

Ct>30的样本建议重做。重做结果无CtZhi者为阴性～否则为阳性。

附录

试剂盒的组成

1 试剂盒组成

Mei个试剂盒可做48个检测～包括以下成分:

Lie解液 30 mL×1盒

DEPC水 1 mL×1管

RT-PCR反应液,内含禽流感病毒的引物、探针, 750 μL×1管

RT-PCR酶 1颗/管×12管

Taq酶 12 μL×1管

Yin性对照 1 mL×1管

Yang性对照,非感染性体外转录RNA, 1 mL×1管

2 说明

2.1 裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚～为RNA提取试剂～外观为红色液体～于4?保存。

2.2 DEPC水～用1%DEPC处理后De去离子水～用于溶解RNA。

2.3 RT-PCR反应液中含有特异性引Wu、探针及各种离子。

3 功能

Shi剂盒可用于禽类相关样品,包括肌肉组织、Zang器、咽喉拭子、泄殖腔拭子、血清或血浆等,中禽流感病毒的检测。

4 使用时的注意事项

4.1 在检测过程中～必须严防不同样品间De交叉污染。

4.2 反应液分装时应避免产生气泡～上机Qian检查各反应管是否盖紧～以免荧光物质泄露Wu染仪器。

RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活～必须在室Wen条件下臵于干燥器内保存～使用时取出所Xu数量～剩余部分立即放回干燥器中。

附件7

Yang品采集、保存和运输

Huo禽病料应包括气管和泄殖腔拭子～最好是采Ji气管拭子。小珍禽用拭子取样易造成损伤～Ke采集新鲜粪便。死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品。

Jiang每群采集的10份棉拭子～放在同一容器内～混合为一个样品,容器中放有含有抗菌素的pH值为7.0-7.4的 PBS液。抗生Su的选择视当地情况而定～组织和气管拭子悬Ye中应含有青霉素,2000IU/mL,、Lian霉素,2mg/mL,～庆大霉素,50μg/mL,～制霉菌素,1000IU/mL,。但粪便和泄殖腔拭子所有的抗生素浓度应Ti高5倍。加入抗生素后 pH值应调至7.0-7.4。

Yang品应密封于塑料袋或瓶中～臵于有制冷剂的Rong器中运输～容器必须密封～防止渗漏。

Yang品若能在24小时内送到实验室～冷藏运输。否则～应冷冻运输。

Ruo样品暂时不用～则应冷冻,最好-70?或Yi下,保存。

采样单

样品名称

样品编号

Cai样基数采样数量采样日期保存Qing况冷冻(藏) 被采样单位

通讯地址

Lian系电话邮编

Bei采样单位盖章或签名采样单位盖章采样Ren签名

年月日年月日备注:(如禽流感的免疫情况以及20天内是否进行Guo其它免疫注射或异常刺激) 此单一式三份，第一联存根，第二联随样品，第三联由被采Yang单位保存

附件8

消毒技术规范

1 设备和必需品

1.1 清洗工具:扫帚、叉子、铲子、锹和Chong洗用水管。

1.2 消毒工具:喷雾器、火焰喷射枪、消Du车辆、消毒容器等。

1.3 消毒剂:清洁剂、醛类、强碱、氯制Ji类等合适的消毒剂。

1.4 防护装备:防护服、口罩、胶靴、手Tao、护目镜等。

2 圈舍、场地和各种用具的消毒

2.1 对圈舍及场地内外采用喷洒消毒液的Fang式进行消毒～消毒后对污物、粪便、饲料等Jin行清理,清理完毕再用消毒液以喷洒方式进Xing彻底消毒～消毒完毕后再进行清洗,不易冲Xi的圈舍清除废弃物和表土～进行堆积发酵处Li。

2.2 对金属设施设备～可采取火焰、熏蒸Deng方式消毒,木质工具及塑料用具采取用消毒Ye浸泡消毒,工作服等采取浸泡或高温高压消Du。

3 疫区内可能被污染的场所应进行喷洒消毒。

4 污水沟、水塘可投放生石灰或漂白粉。

5 运载工具清洗消毒

5.1 在出入疫点、疫区的交通路口设立消Du站点～对所有可能被污染的运载工具应当严Ge消毒。

5.2 从车辆上清理下来的废弃物按无害化Chu理。

6 疫点每天消毒1次连续1周～1周以后每Liang天消毒1次。疫区

Nei疫点以外的区域每两天消毒1次。

附件9

扑杀方法

1 窒息

Xian将待扑杀禽装入袋中～臵入密封车或其它密Feng容器～通入二氧化碳窒息致死,或将禽装入Mi封袋中～通入二氧化碳窒息致死。

2 扭颈

Pu杀量较小时采用。根据禽只大小～一手握住Tou部～另一手握住体部～朝相反方向扭转拉伸。

3 其它

Ke根据本地情况～采用其它能避免病原扩散的Zhi死方法。

Pu杀人员的防护符合NY/T 768《高致Bing性禽流感人员防护技术规范》的要求。

附件10

无害化处理

所有病死禽、被扑杀禽及其产品、排Xie物以及被污染或可能被污染的垫料、饲料和Qi它物品应当进行无害化处理。清洗所产生的Wu水、污物进行无害化处理。

无害化处理可以选择深埋、焚烧或高温Gao压等方法～饲料、粪便可以发酵处理。

1深埋

1.1选址

Ying当避开公共视线～选择地表水位低、远离学Xiao、公共场所、居民住宅区、动物饲养场、屠Zai场及交易市场、村庄、饮用水源地、河流等De地域。位臵和类型应当有利于防洪。

1.2坑的覆盖土层厚度应大于1.5米～坑Di铺垫生石灰～覆盖土以前再撒一层生石灰。

1.3禽类尸体臵于坑中后～浇油焚烧～然后Yong土覆盖～与周围持平。填土不要太实～以免Shi腐产气造成气泡冒出和液体渗漏。

1.4饲料、污染物等臵于坑中～喷洒消毒剂Hou掩埋。

2工厂化处理

Jiang所有病死牲畜、扑杀牲畜及其产品密封运输Zhi无害化处理厂～统一实施无害化处理。

3发酵

Si料、粪便可在指定地点堆积～密封彻底发酵～表面应进行消毒。

4无害化处理应符合环保要求～所涉及到的运Shu、装卸等环节应避免洒漏～运输装卸工具要Che底消毒。

附件11

Gao致病性禽流感流行病学调查规范

1 范围

Ben标准规定了发生高致病性禽流感疫情后开展De流行病学调查技术要求。

Ben标准适用于高致病性禽流感暴发后的最初调Cha、现地调查和追踪调查。

2 规范性引用文件

Xia列文件中的条款通过本标准的引用而成为本Biao准的条款。凡是注日期的引用文件～其随后Suo有的修改单位,不包括勘误的内容,或修订Ban均不适用于本标准。鼓励根据本标准达成协Yi的各方研究可以使用这些文件的最新版本。Fan是不注日期的引用文件～其最新版本适用于Ben标准。

NY 764 高致病性禽流感疫情Pan定及扑灭技术规范

NY/T 768 高致病性禽流感人员Fang护技术规范

3 术语和定义

3.1 最初调查

Shou医技术人员在接到养禽场/户怀疑发生高致Bing性禽流感的报告后～对所报告的养禽场/户Jin行的实地考察以及对其发病情况的初步核实。

3.2 现地调查

3.3 跟踪调查

Zai高致病性禽流感暴发及扑灭前后～对疫点的Ke疑带毒人员、病死禽及其产品和传播媒介的Kuo散趋势、自然宿主发病和带毒情况的调查。

4 最初调查

4.1 目的

He实疫情、提出对疫点的初步控制措施～为后Xu疫情确诊和现地调查提供依据。

4.2 组织与要求

4.2.1 动物防疫监督机构接到养禽场/户怀疑发病的报告后～应立即指派2名以上Shou医技术人员～携必要的器械、用品和采样用Rong器～在24 h以内尽快赶赴现场～核实发Bing情况。

4.2.2 被派兽医技术人员至少3 dNei没有接触过高致病性禽流感病禽及其污染物～按NY/T 768要求做好个人防护。

4.3 内容

4.3.1 调查发病禽场的基本状况、病史、症状以及环境状况四个方面～完成最初调查Biao,见附录A,。

4.3.2 认真检查发病禽群状况～根据NY 764做出是否发生高致

Bing性禽流感的初步判断。

4.3.3 若不能排除高致病性禽流感～调Cha人员应立即报告当地动物防疫监督机构并建Yi提请省级/国家级动物流行病学专家作进一Bu诊断～并应配合做好后续采样、诊断和疫情Pu灭工作,

4.3.4 实施对疫点的初步控制措施～禁Zhi家禽、家禽产品和可疑污染物品从养禽场/Hu运出～并限制人员流动,

4.3.5 画图标出疑病禽场/户周围10 km以内分布的养禽场、道路、河流、山岭、树林、人工屏障等～连同最初调查表一同报Gao当地动物防疫监督机构。

5 现地调查

5.1 目的

Zai最初调查无法排除高致病性禽流感的情况下～对报告养禽场/户作进一步的诊断和调查～Fen析可能的传染来源、传播方式、传播途径以Ji影响疫情控制和扑灭的环境和生态因素～为Kong制和扑灭疫情提供技术依据。

5.2 组织与要求

5.2.1 省级动物防疫监督机构接到怀Yi发病报告后～应立即派遣流行病学专家配备Bi要的器械和用品于24h内赴现场～作进一Bu诊断和调查。

5.2.2 被派兽医技术人员应遵照4.2.2 的要求。

5.3 内容

5.3.1 在地方动物防疫监督机构技术人Yuan初步调查的基础上～对

Fa病养禽场/户的发病情况、周边地理地貌、Ye生动物分布、近期家禽、产品、人员流动情Kuang等开展进一步的调查～分析传染来源、传播Tu径以及影响疫情控制和消灭的环境和生态因Su。

5.3.2 尽快完成流行病学现地调查表,Jian附录B,并提交省和地方动物防疫监督机构。

5.3.3 与地方动物防疫监督机构密切配He～完成病料样品的采集、包装及运输等诊断Shi宜。

5.3.4 对所发疫病作出高致病性禽流感Zhen断后～协助地方政府和地方动物防疫监督机Gou扑灭疫情。

6 跟踪调查

6.1 目的

Zhui踪疫点传染源和传播媒介的扩散趋势、自然Su主的发病和带毒情况～为可能出现的公共卫Sheng危害提供预警预报。

6.2 组织

Dang地流行病学调查人员在省级或国家级动物流Xing病学专家指导下对有关人员、可疑感染家禽、可疑污染物品和带毒宿主进行追踪调查。

6.3 内容

6.3.1追踪出入发病养禽场/户的有关工Zuo人员和所有家禽、禽产品及有关物品的流动Qing况～并对其作适当的隔离观察和控制措施～Yan防疫情扩散。

6.3.2 对疫点、疫区的家禽、水禽、猪、留鸟、候鸟等重要疫源

Su主进行发病情况调查～追踪病毒变异情况。

6.3.3 完成跟踪调查表,见附录C,并Ti交本次暴发疫情的流行病学调查报告。

附录A

Gao致病性禽流感流行病学最初调查表任务Bian 号: 国标码: 调查者姓名: 电话: 场/户主姓名: 电话: 场/Hu 名称邮编: 场/户地址

饲养品种

饲养数量

场址地形

环境描述

温度

发病时天

干旱/下雨

气状况

主风向

Chang区条件 ?进场要洗澡更衣 ?进生产区Yao换胶靴 ?场舍门口有消毒池

?供料道与出粪道分开

Wu水排向 ?附近河流 ?农田沟渠 ?Fu近村庄 ?野外湖区 ?野外水塘

?野外荒郊 ?其他

Guo去一年曾 ?低致病性禽流感 ?鸡新城Yi ?马立克氏病 ?禽白血病发生的Yi病 ? 鸡传染性喉气管炎 ?鸡传染性Pin血 ?鸡传染性支气管炎

?鸡传染性发氏囊病

Ben次典型 ?急性发病死亡 ?脚鳞出血 ?鸡冠出血或发绀、头部水肿发病情况 ?肌肉和其他组织器官广泛性严重出血 ?Shen经症状 ?绿色稀便

? 其他(请填写):

Yi情核实结论 ?不能排除高致病性禽流感 ?排除高致病性禽流感调查人员签Zi: 时间:

附录B

Gao致病性禽流感现地调查表

Yi情类型 ,1,确诊 ,2,疑似 ,3,可疑

B1 疫点易感禽与发病禽现场调查

B1.1 最早出现发病时间: 年月日时～

Fa病数: 只～死亡数: 只～圈舍,户,编号: 。

B1.2 禽群发病情况:

Quan舍(户) 家禽品种日龄发病日期发Bing数开始死死亡数编号亡日期

B1.3 袭击率:

Ji算公式:袭击率=,疫情暴发以来发病禽数?疫情暴发开始时易感禽数,×100%

B2 可能的传染来源调查

B2.1 发病前30d内～发病禽舍是否新Yin进了家禽,

,1,是 ,2,Fou

Yin进禽最初混引进数量混群情况* 健Kang状况引进时间来源品种群时间

* 混群情况为:(1)同舍(户)饲养 (2)邻舍(户)饲养 (3)饲养于本场(村)隔离场,隔离场(舍)人员应单独隔离

B2.2 发病前30d内发病禽场/户是否You野鸟栖息或捕获鸟,

,1,是 ,2,否

Niao 名数量来源鸟停留地点* 鸟病死数量与禽畜接触频率**

* 停留地点:包括禽场(户)内建筑场上、Shu上、存料处及料槽等;

** 接触频率:指鸟与停留地点的接触情况，分为每天、数次、仅一次。

B2.3 发病前30d

,1,是 ,2,否

Wu品名称数量经过或存放地运入后Shi用情况

B2.4 最近30d内是否有场外有关业务Ren员来场,,1,无 ,2,有～请写出Fang问者姓名、单位、访问日期～并注明是否来Zi疫区。

Lai 访人来访日期来访人职业/电话 Shi否来自疫区

B2.5 发病场,户,是否靠近其他养禽场Ji动物集散地,

,1,是 ,2,否

B2.5.1 与发病场的相对地理位臵_____________________。

B2.5.2 与发病场的距离_________________。

B2.5.3 其大致情况__________。

B2.6 发病场周围10公里以内是否有下Lie动物群, B2.6.1 猪～__________。

B2.6.2 野禽～具体禽种:__________。 B2.6.3 野水禽～具体Qin种:__________。 B2.6.4 田鼠、家鼠:__________。

B2.6.5 其它:__________。

B2.7 在最近25-30d内本场周围10公里有无禽发病,,1,无

,2,有～请回答:

B2.7.1 发病日期:__________。

B2.7.2 病禽数量和品种:__________。 B2.7.3 确诊/疑似诊Duan疾病:__________。 B2.7.4 场主姓名:__________。

B2.7.5 发病地点与本场相对位臵、距Li:__________。 B2.7.6 投药情况:__________。

B2.7.7疫苗接种情况:__________。

B2.8 场内是否有职员住在其他养殖场/养禽村, ,1,无 ,2,有

B2.8.1该农场所处的位臵:__________。 B2.8.2该场养禽的数量He品种:__________。 B2.8.3该场禽的来源及去向:__________。 B2.8.4职员拜访和接触他人地Dian:__________。 B3 在发Bing前30d是否有饲养方式/管理的改变,

,1,无 ,2,有～__________

B4 发病场,户,周围环境情况

B4.1 静止水源-——沼泽、池塘或湖泊:,1,是 ,2,否 B4.2 流Dong水源——灌溉用水、运河水、河水:,1,Shi ,2,否 B4.3 断续灌溉区——Fang圆三公里内无水面:,1,是 ,2,否 B4.4 最近发生过洪水:,1,是 ,2,否

B4.5 靠近公路干线:,1,是 ,2,否

B4.6 靠近山溪或森,树,林:,1,是 ,2,否 B5 该养禽场/Hu地势类型属于:

,1,盆地,2,山谷,3,高原,4,丘陵,5,平原,6,山区 ,7,其他,请注明,__________。

B6 饮用水及冲洗用水情况

B6.1 饮水类型:

,1,自来水 ,2,浅井水 ,3,深井水,4,河塘水 ,5,其他 B6.2 冲洗Shui类型:

,1,自来水 ,2,浅井水 ,3,深井水 ,4,河塘水,5,其他 B7 发病养禽Chang/户高致病性禽流感疫苗免疫情况: ,1,免疫 ,2,不免疫

B7.1疫苗生产厂家__________。

B7.2 疫苗品种、批号__________。

B7.3 被免疫鸡数量__________。

B8 受威胁区免疫禽群情况

B8.1 免疫接种一个月内禽只发病情况:

,1, 未见发病,2,发病～发病率__________。 B8.2 异源亚型血清Xue检测和病原学检测

Biao本类型采样时间检测项目检测方法 Jie 果

Zhu:标本类型包括鼻咽、脾淋内脏、血清及粪Bian等。

B9 解除封锁后是否使用岗哨动物

,1,否 ,2,是～简述结果__________。 B10 最后诊断情况:

B10.1 确诊HPAI～确诊单位__________。 B10.2 排除～其他Yi病名称__________。 B11 Yi情处理情况

B11.1 发病禽群及其周围三公里以内所You家禽全部扑杀: ,1,是 ,2,否～Pu杀范围:__________。 B11.2 疫点周围3,5公里内所有家禽全部接Zhong疫苗 ,1,是 ,2,否

Suo用疫苗的病毒亚型:__________Chang家__________。

附录C

Gao致病性禽流感跟踪调查表

C1 在发病养禽场/户出现第1个病例前21d至该场被控制期间出场的,A,有关人Yuan～,B,动物/产品/排泄废弃物～,C,Yun输工具/物品/饲料/原料～,D,其他(Qing标出)__________～养禽场被隔Li控制日期__________。

Chu场人/物人/承运人出场日期运输工Ju 目的地/电话 (A/B/C/D) 姓Ming/电话

C2 在发病养禽场/户出现第1个病例前21d至该场被隔离控制期间～是否有家禽、Che辆和人员进出家禽集散地,,家禽集散地包Kuo展览场所、农贸市场、动物产品仓库、拍卖Shi场、动物园等。,,1,无 ,2,You～请填写下表～追踪可能污染物～做限制或Xiao毒处理。

Ren/承运人出入日期出场人/物运输工Ju 相对方位/距离姓名/电话

Zhu:家禽集散地包括展览场所、农贸市场、动Wu产品仓库、拍卖市场、动物园等。

C3 列举在发病养禽场/户出现第1个病Li前21d至该场被隔离控制期间出场的工作Ren员,如送料员、雌雄鉴别人员、销售人员、Shou医等,3d内接触过的所有养禽场/户～通Zhi被访场家进行防范。姓名出场人员出Chang日期访问日期目的地/电话

C4(1在发病后一个月发病情况

,1,未见发病,2,发病～发病率__________。

C4(2 异源亚型血清学检测和病原学检测

Biao本类型采样时间检测项目检测方法 Jie 果

C5 疫点或疫区留鸟

C5(1 在发病后一个月发病情况

,1,未见发病 ,2,发病～发病率__________。

C5(2血清学检测和病原学检测

Biao本类型采样时间检测项目检测方法 Jie 果

C6 受威胁区猪密切接触的猪只

C6.1 在发病后一个月发病情况

,1,未见发病 ,2,发病～发病率__________。 C6.2 血清学和病原Xue检测、异源亚型血清学检测和病原学检测 Biao本类型采样时间检测项目检测方法 Jie 果

C7 疫点或疫区侯鸟

C7(1在发病后一个月发病情况

,1,未见发病 ,2,发病～发病率__________。 C7(2 血清学检Ce和病原学检测

Biao本类型采样时间检测项目检测方法 Jie 果

C8 在该疫点疫病传染期内密切接触人员的Fa病情况

__________。

,1,未见发病

,2,发病～简述情况:

Shi否发病接触人员姓名性别年龄接触Fang式* 住址或工作单位电话号码及死亡

*接触方式:(1)本舍(户)饲养员(2)Fei本舍饲养员(3)本场兽医(4)收购与运Shu(5)屠宰加工(6)处理疫情的场外兽医(7)其他接触

附件12

Gao致病性禽流感人员防护技术规范

1 范围

Ben标准规定了对密切接触高致病性禽流感病毒Gan染或可能感染禽和场的人员的生物安全防护Yao求。

Ben标准适用于密切接触高致病性禽流感病毒感Ran或可能感染禽和场的人员进行生物安全防护。此类人员包括:诊断、采样、扑杀禽鸟、无Hai化处理禽鸟及其污染物和清洗消毒的工作人Yuan～饲养人员～赴感染或可能感染场进行调查De人员。

2 诊断、采样、扑杀禽鸟、无害化处理禽Niao及其污染物和清洗消毒的人员

2.1进入感染或可能感染场和无害Hua处理地点

2.1.1穿防护服。

2.1.2戴可消毒的橡胶手套。

2.1.3戴N95口罩或标准手术Yong口罩。

2.1.4戴护目镜。

2.1.5穿胶靴。

2.2离开感染或可能感染场和无害Hua处理地点

2.2.1工作完毕后～对场地及其She施进行彻底消毒。

2.2.2在场内或处理地的出口处Tuo掉防护装备。

2.2.3将脱掉的防护装备臵于容Qi内进行消毒处理。

2.2.4对换衣区域进行消毒～人员用消毒Shui洗手。

2.2.5工作完毕要洗浴。

3(饲养人员

3.1饲养人员与感染或可能感染的Qin鸟及其粪便等污染物品接触前～必须戴口罩、手套和护目镜～穿防护服和胶靴。

3.2扑杀处理禽鸟和进行清洗消毒Gong作前～应穿戴好防护物品。

3.3场地清洗消毒后～脱掉防护物Pin。

3.4衣服须用70?以上的热水浸Pao5min或用消毒剂浸泡～然后再用肥皂水Xi涤～于太阳下晾晒。

3.5胶靴和护目镜等要清洗消毒。

3.6处理完上述物品后要洗浴。

4 赴感染或可能感染场的人员

4.1 需备物品

口罩、手套、防护服、一次性帽子或Tou套、胶靴等。

4.2 进入感染或可能感染场

4.2.1 穿防护服。

4.2.2 戴口罩～用过的口罩不De随意丢弃。

4.2.3 穿胶靴～用后要清洗消Du。

4.2.4 戴一次性手套或可消毒Xiang胶手套。

4.2.5 戴好一次性帽子或头套。

4.3 离开感染或可能感染场

4.3.1脱个人防护装备时～污染Wu要装入塑料袋内～臵于指定地

点。

4.3.2最后脱掉手套后～手要洗Di消毒。

4.3.3工作完毕要洗浴～尤其是出入过有Qin粪灰尘的场所。

5 健康监测

5.1 所有暴露于感染或可能感染Qin和场的人员均应接受卫生部门监测。

5.2 出现呼吸道感染症状的人员Ying尽快接受卫生部门检查。

5.3 出现呼吸道感染症状人员的Jia人也应接受健康监测。

5.4 免疫功能低下、60岁以上He有慢性心脏和肺脏疾病的人员要避免从事与Qin接触的工作。

5.5 应密切关注采样、扑杀处理Qin鸟和清洗消毒的工作人员和饲养人员的健康Zhuang况。

《高致病性禽流感防治技术规范》等14个动物疫病防治技术规范(详见附件)：

《高致病性禽流感防治技术规范》等14个动Wu疫病防治技术规范（详见附件）：

Yi、高致病性禽流感防治技术规范

Er、口蹄疫防治技术规范

San、马传染性贫血防治技术规范

Si、马鼻疽防治技术规范

Wu、布鲁氏菌病防治技术规范

Liu、牛结核病防治技术规范

Qi、猪伪狂犬病防治技术规范

Ba、猪瘟防治技术规范

Jiu、新城疫防治技术规范

Shi、传染性法氏囊病防治技术规范

Shi一、马立克氏病防治技术规范

Shi二、绵羊痘防治技术规范

Shi三、炭疽防治技术规范

Shi四、J亚群禽白血病防治技术规范

Fei止的动物疫病防治技术规范名单

1．高致病性禽流感防治技术规范（农办牧[2002]74号）

2．马传染性贫血防治技术规范（农办牧[2002]74号）

3．马鼻疽防治技术规范（农办牧[2002]74号）

4．布鲁氏菌病防治技术规范（农办牧[2002]74号）

5．牛结核病防治技术规范（农办牧[2002]74号）

6．猪伪狂犬病防治技术规范（农办牧[2002]74号）

7．牲畜口蹄疫疫情防治技术规范（试行）

（农牧发[2004]20号）

8．亚洲I型口蹄疫防治技术方案（农医发[2005]13号）

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