土壤稀释涂布平板法

范文一：土壤稀释涂布平板法

实验概要

分离、纯化及初步鉴定土壤中的拮抗植物病原菌的放线菌。

实验原理

土壤是微生物的“天然培养基”，也是最丰富的菌种资源库，我们可以从中分离出众多放线菌，尤其是可以从耕作土壤中筛选出拮抗植物病原菌的放线菌。

以耕作有武运粳和苏沪香粳的土壤为样品，应用稀释涂布平板法分离各种微生物。菌落计数后，通过菌落形态观察并挑取放线菌进行划线分离纯化，多次重复后得到单菌落。在进行放线菌形态等初步鉴定后，将纯化的菌株接入斜面传代保藏。最后，分离纯化的放线菌，初步鉴定其拮抗性。拮抗植物病原菌的放线菌的分离纯化在农业增产、作物种植等方面都有着重要的意义。

主要试剂

1. 培养基:

高氏1号培养基、马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基 2. 其他试剂:

银染液A液 B液(细菌鞭毛染色) 40%KOH 5%α-萘酚(V.P.实验)

主要设备

培养皿

试管

锥型瓶

接种环

移液管

震荡器

电炉

载玻片

超净工作台

恒温培养箱

高压蒸汽灭菌锅

显微镜等

实验材料

土样:

苏沪香粳1，2组

杨稻6号 93113，4组

武运粳5，6组

实验步骤

1. 稀释涂布平板法(Spread Plate Method)

稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养而进行微生物分离纯化的方法。

(1) 倒平板;

(2) 制备土壤稀释溶液连续不断稀释，得到不同稀释度的土壤溶液;

(3) 涂布分别吸取三种稀释度菌液，均匀涂于培养基表面;

(4) 培养;

(5) 划线分离，直到获得纯培养。

2. 平板菌落计数法

平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。

这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定(如杀虫菌剂)，生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。

对每个平板上的菌落计数，计算每克或每毫升土壤样品中含有细菌、放线菌的数量。公式如下: 菌体数量cfu/g(mL)土样== 同一稀释度重复的菌落平均数×稀释倍数

3. 平板划线分离法(Streak Plate Method)

平板划线分离培养法对混有多种菌的平皿，用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料,在无板表面进行平行划线和培养，使原来混杂在一起的菌种沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。

(1) 倒平板;

(2) 划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线，从而将样品在平板上进行稀释，形成单个菌落;

(3) 挑菌落同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。

4. 插片显微观察法(放线菌)

插片培养法是实验室观察放线菌形态的一种基本方法，其步骤是:挑取青铜小单孢菌(Micromonospora chalcea)的少量孢子丝，将菌丝块接种于高氏一号培养基的中间，然后，用小镊子夹起一块无菌的盖玻片，以45度角的角度斜插入培养基中，不要插入培养基太深，让菌丝爬上盖玻片;于37?下培养3,5天后，再用小镊子将盖玻片取出，显微镜下观察基内菌丝、气生菌丝和孢子丝的形状。 5. 斜面传代保藏法

斜面传代保藏法是指将菌种(细菌和酵母菌宜采用对数生长期细胞，放线菌和丝状真菌宜采用成熟的孢子)接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8?的冰箱中保藏。

保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种1次。酵母菌2个月，移种1次。细菌最好每月移种1次。

此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状;污染杂菌的机会亦较多。

6. 放线菌形态观察

(1) 放线菌菌落观察

放线菌的菌落质地致密，表面呈紧密的绒状，或坚实、干燥而多皱。由于基内菌丝长在培养基内，所以菌落与培养基结合较紧，不容易被挑起，或者被挑起后不容易破碎。当孢子丝形成大量孢子布满菌落表面时，使菌落呈絮状、粉末状或颗粒状，而与细菌菌落判然有别。此外，如用放大镜仔细观察，可以看见菌落周围有放射状菌丝。

(2) 放线菌主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖。其孢子丝成熟时，分化形成许多孢子，称为分生孢子。分生孢子常具色素，呈白、灰、黄、橙黄、红、蓝、绿等颜色。

范文二：平板划线法与稀释涂布平板法的区别

平板划线法与稀释涂布平板法的区别

一、平板划线分离法

由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。用途:一般多用于从菌种的纯化;

优点:可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;

缺点:不能计数;

二、稀释涂布平板法:

稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表一个细胞)，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些成品检定(如杀虫菌剂等)、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。

用途:一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。

优点:可以计数，可以观察菌落特征。

缺点:吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。

范文三：平板稀释法具体操作步骤

琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。

1.培养基制备

使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。

2.含药琼脂平板制备

根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。

3.接种物制备与接种

制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。

4.结果判断

将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。

如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。

范文四：【相异构想】平板划线法和稀释涂布平板法-李红云-高三案例3X

高三案例3:平板划线法和稀释涂布平板法

撰稿人李红云

【问题】平板划线法和稀释涂布平板法是常用的微生物接种方法，同时也用于微生物的分离和计数。

这两种方法存在一定的共性和差异性，学生比较容易混淆。【原因】1、欠缺实验操作体验，或欠缺理智的实验操作习惯。

2、不善于建构知识框架。

【措施】亲自进行实验操作，并通过模拟实验和绘图理解相关实验原理。

绘图模拟操作(可以借用黑板和彩色粉笔，观察彩色粉笔笔迹的深浅，说明菌液的稀释程度)，说明平板划线法和稀释涂布平板法的共性和差异性。

根据操作过程和模拟过程可知，平板划线操作中，只取一次菌种，但连续的划线，可以使菌种在培养基中逐步稀释，在划线的最后区域，能够得到单个细菌，培养后能得到单一菌落，因此，能达到接种细菌和纯化细菌的目的。但是，因为培养出的菌落不都是单一菌落，因此，不能进行细菌计数。

根据操作过程和模拟过程可知，稀释涂布平板法实际包括稀释菌种和涂布两个环节。只要取得适宜浓度的稀释菌液，就可以使菌种在培养基中完全分散成单个细菌，培养后得到的菌落全都是单一菌落，因此，不仅能达到接种细菌和纯化细菌的目的，因为培养出的菌落全都是单一菌落，也能进行细菌计数。

可见，稀释涂布平板法比平板划线法操作更复杂，功能也更完善。可以简单比较为:

方法接种分离(纯化) 计数平板划线法(划线法) 能能不能稀释涂布平板法(涂布法) 能能能

【检测】

生物—选修1:生物技术实践](15分) 1、新课标卷39.[

有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题:

(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即________和____________。

2、山东卷 34.(8分)(生物—生物技术实验)

研究发现柚皮精油和乳酸菌素(小分子蛋白质)均有抑菌作用，两者的提取及应用如图所示。

(2)筛选乳酸菌A时可选用平板划线法或____________接种。 3、(宁夏卷).【生物——选修1生物技术实践】(15分)

(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_______。 4、某学者欲研究被石油污染过的土壤中细菌数量，并从中筛选出能分解石油的细菌。下列操作错误的是

A(利用平板划线法对细菌进行计数

B(以石油为唯一碳源的培养基筛选

C(采用稀释涂布平板法分离菌种

D(称取和稀释土壤时应在火焰旁

【效果】

经过实验操作、模拟操作和绘图整理，学生不仅熟悉技术，更重要的是理解技术的原理，就可以自由迁移相关知识了。

范文五：涂布平板法

涂布平板法编辑词条

B 添加义项

涂布平板法英文名为spread plate method，由于将含菌材料现加到还较烫的培养基中再倒

平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平台法也会使一些严格好氧菌因被固定在

琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板

法。

1百科名片 3实验器材

2特征 4实验方法

百

科

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片

特

征

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验

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材

实

验

方

法

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百科名片折叠编辑本段

涂布平板法英文名为spread plate method，由于将含菌材料现加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平台法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。

特征折叠编辑本段

实验器材折叠编辑本段

1(活材料:苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌剂。

2(培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

3(器材:90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。

实验方法折叠编辑本段

1(样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液;再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液;再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液;以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。

用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。

2(平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。 (1)混合平板培养法将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中，再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中(由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换)。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50?的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。

(2)涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上(每个编号设三个重复)。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。

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