失她丶11559340
范文一：一方混凝土需要的水
一方混凝土需要的水，水泥，砂，石子
C20
水：175kg 水泥：343kg 砂：621kg 石子：1261kg
配合比为：0.51:1:1.81:3.68
C25
水：175kg 水泥：398kg 砂：566kg 石子：1261kg
配合比为：0.44:1:1.42:3.17
C30
水：175kg 水泥：461kg 砂：512kg 石子：1252kg
配合比为：0.38:1:1.11:2.72
给你个算法：1、每方混土所用的各个原材料重量加起来。2、用各种材料的表观密度计算。 一般来说每方混凝土是2350-2500之间吧，单位是公斤每立方米。不对的地方请指正。
C20混凝土的容重一般在立方米2250～2300kg
C30 每立方2.35 （总重---皮）除 2，35
范文二：混凝土搅拌站每一方混凝土的成本如何计算？
商品混凝土搅拌站每方混凝土的成本看你怎么算了，如果比较准确的计算方法是这样的，费用基本罗列如下：
1、原材料费用：水泥、砂、砂、碎石、粉煤灰、矿粉、外加剂等所有材料的费用，根据配合比和原材料单价，能够比较简单计算得出的；
2、运费：主要为各种车辆的油耗，包括搅拌车、泵车、装载车等等的费用，一般可以通过统计计算出来。根据经验，搅拌车（工地距离为20km左右）约为20元/方，泵车约为15～20元/方。
3、员工工资：一般商品混凝土单位员工的工资总额跟生产方量还是呈线性关系的，还要结合各地的工资水平和各个企业的情况而定了。
4、设备折旧：需要考虑的是折旧年限，比如是定5年收回成本，就是设备总额/五年预计产量，即为每方砼中设备折旧费用；
5、营销费用：包括所有在商品混凝土销售过程中营销部门产生的费用（餐饮、娱乐、回扣等等），该费用应该是控制在一个范围之内。
6、水电、通讯费用：包括生产过程中以及员工在单位生活、工作过程中产生的水、电、通讯费用，相对比较固定。
7、消耗品费用：商品混凝土企业某些消耗品的费用，例如泵车泵管、S阀等，搅拌车机油、机油滤清、空气滤清、轮胎消耗等（泵车、装载车同样有），搅拌机衬板、搅拌臂、机油等。
8、检测费用：主要是搅拌楼、地磅、试验设备的年检费用，检测站检测费用。
9、税收费用。
10、其他费用：包括办公消耗品（各类用纸、笔、电池、修正液……这个自己发挥想象吧），网络费用，GPS费用、ERP费用……
补充说明：
补充一、成本包括三部分
1、原材料，要根据配合比，算出每方混凝土的各种原材料用量，包括水泥、粉煤灰、矿粉、砂、石子、外加剂、水、其它掺合料等等，原材料的用量乘单价就是原材料成本；
2、人工费、机械费、水电费、维修费，这部分和生产规模有关系，工人和机械要相对固。月产量越高，分摊到每方混凝土的成本就越低；
3、建站的成本分摊，要把建站的费用分摊到每方混凝土里面，这个和建站规模、总的生产数量有关系，搅拌站生产的混凝土越多，建站成本就越低。
补充二、不管什么地区，计算方法都应该差不多
1、材料直接成本。水泥、砂、石子、掺加剂、水的用量根据配合比用量以及采购价格计算；
2、生产机械人工成本。一般机械人工费综合10～15元；
3、运输、输送成本。按照公里及输送方式算；
4、设备场地。场地费用摊销、设备投入折旧；
5、管理费用。管理人员工资摊销根据产量；
6、税收。营业税、企业所得税。
范文三：混凝土搅拌站每一方混凝土的成本如何计算
混凝土搅拌站每一方混凝土的成本如何计算
商砼搅拌站每方砼的成本看你怎么算了～如果比较准确的计算方法是这样的～费用基本罗列如下:
1、原材料费用:水泥、砂、砂、碎石、粉煤灰、矿粉、外加剂等所有材料的费用～这个根据配合比和原材料单价还是能够比较简单计算得出的,
2、运费:主要为各种车辆的油耗～主要包括搅拌车、泵车、装载车等等的费用～一般可以通过统计计算出来～给你一个参考数值～以前记得搅拌车,工地距离为20KM左右,为18，24元/方～泵车为15，20元/方～装载车记不得了～晕呀~
3、员工工资:一般商砼单位员工的工资总额跟生产方量还是呈线性关系的～这个就得看各地的工资水平和各个企业的情况而定了:
4、设备折旧:这些需要考虑的是折旧年限～比如老板是定5年收回成本～就是设备总额/五年预计产量～即为每方砼中设备折旧费用,
5、营销费用:包括所有在商砼销售过程中营销部门产生的费用,餐饮、娱乐、回扣等等,～这个费用应该是控制在一个范围之内,
6、水电、通讯费用:包括生产过程中以及员工在单位生活、工作过程中产生的水、电、通讯费用～相对来说也是比较固定:
7、消耗品费用:商砼企业某些消耗品的费用～例如泵车泵管、S阀等～搅拌车机油、机油滤清、空气滤清、轮胎消耗等,泵车、装载车同样有,～搅拌机衬板、搅拌臂、机油等,
8、检测费用:主要是搅拌楼、地磅、试验设备的年检费用～检测站检测费用,
9、税收费用:这个应该比较好理解,
10、其他费用:包括办公消耗品,各类用纸、笔、电池、修正液……这个自己发挥想象吧,～网络费用～GPS费用、ERP费用……
个人就粗略归纳这几类～希望大家补充
补充1:成本包括三部分:1、原材料～你要根据配合比～算出每方混凝土的各种原材料用量～包括水泥、粉煤灰、矿粉、砂、石子、外加剂、水、其它掺合料等等～原材料的用量乘单价就是原材料成本,2、人工费、机械费、水电费、维修费～这部分和你的生产规模有关系～工人和机械要相对固定～你的单班产量越高～分摊到每方混凝土的成本就越低,3、 建站的成本分摊～要把你建站的费用分摊到每方混凝土里面～这个和你的建站规模、总的生产数量有关系～你的搅拌站生产的混凝土越多～建站成本就越低。
补充2:不管什么地区～计算方法都应该差不多:
一、材料直接成本
水泥、砂、石子、掺加剂、水的用量根据配合比用量以及采
购价格计算
二、生产机械人工成本
一般机械人工费综合5，10元
三、运输、输送成本
按照公里及输送方式算
四、设备场地
场地费用摊销、设备投入折旧
五、管理费用
管理人员工资摊销根据产量
六、税收
营业税、企业所得税
下面是赠送的团队管理名言学习,
不需要的朋友可以编辑删除!!!谢谢!!!
1、沟通是管理的浓缩。
2、管理被人们称之为是一门综合艺术--“综合”是因为管理涉及基本原理、自我认知、智慧和领导力;“艺术”是因为管理是实践和应用。
3、管理得好的工厂,总是单调乏味,没有仸何激劢人心的事件发生。
4、管理工作中最重要的是:人正确的事,而不是正确的做事。
5、管理就是沟通、沟通再沟通。
6、管理就是界定企业的使命,并激励和组织人力资源去实现这个使命。界定使命是企业家的仸务,而激励不组织人力资源是领导力的范畴,二者的结合就是管理。7、管理是一种实践,其本质不在于“知”而在于“行”;其验证不在于逻辑,而在于成果;其唯一权威就是成就。
8、管理者的最基本能力:有效沟通。
9、合作是一切团队繁荣的根本。
10、将合适的人请上车,不合适的人请下车。
11、领导不是某个人坐在马上指挥他的部队,而是通过别人的成功来获得自己的成功。
12、企业的成功靠团队,而不是靠个人。
13、企业管理过去是沟通,现在是沟通,未来还是沟通。
14、赏善而不罚恶,则乱。罚恶而不赏善,亦乱。
15、赏识导致成功,抱怨导致失败。16、世界上没有两个人是完全相同的,但是我们期待每个人工作时,都拥有许多相同的特质。 17、首先是管好自己,对自己言行的管理,对自己形象的管理,然后再去影响别人,用言行带劢别人。18、首先要说的是,CEO要承担责仸,而不是“权力”。你不能用工作所具有的权力来界定工作,而只能用你对这项工作所产生的结果来界定。CEO要对组织的使命和行劢以及价值观和结果负责。
19、团队精神是从生活和教育中不断地培养规范出来的。研究发现,从小没有培养好团队精神,长大以后即使天天培训,效果并不是很理想。因为人的思想是从小造就的,小时候如果没有注意到,长大以后再重新培养团队精神其实是很困难的。
20、团队精神要从经理人自身做起,经理人更要带头遵守企业规定,让技术及素质较高的指导较差的,以团队的荣誉就是个人的骄傲启能启智,互利共生,互惠成长,不断地逐渐培养员工的团队意识和集体观念。
21、一家企业如果真的像一个团队,从领导开始就要严格地遵守这家企业的规章。整家企业如果是个团队,整个国家如果是个团队,那么自己的领导要身先士卒带头做好,自己先树立起这种规章的威严,再要求下面的人去遵守这种规章,这个才叫做团队。
22、已所不欲,勿斲于人。
23、卓有成效的管理者善于用人之长。
24、做企业没有奇迹而言的,凡是创造奇迹的,一定会被超过。企业不能跳跃,就一定是，循着，一个规律,一步一个脚印地走。
25、大成功靠团队,小成功靠个人。
26、不善于倾听不同的声音,是管理者最大的疏忽。
关于教师节的名人名言|教师节名人名言
1、一个人在学校里表面上的成绩,以及较高的名次,都是靠不住的,唯一的要点是你对于你所学的是否心里真正觉得很喜欢,是否真有浓厚的兴趣……--邹韬奋
2、教师是蜡烛,燃烧了自己,照亮了别人。--佚名
3、使学生对教师尊敬的惟一源泉在于教师的德和才。--爱因斯坦
4、三人行必有我师焉;择其善者而从之,其不善者而改之。--孔子
5、在我们的教育中,往往只是为着实用和实际的目的,过分强调单纯智育的态度,已经直接导致对伦理教育的损害。--爱因斯坦
6、举世不师,故道益离。--柳宗元
7、古之学者必严其师,师严然后道尊。--欧阳修
8、教师要以父母般的感情对待学生。--昆体良
9、机会对于不能利用它的人又有什么用呢？正如风只对于能利用它的人才是劢力。--西蒙
10、一日为师,终身为父。--关汉卿
11、要尊重儿童,不要急于对他作出戒好戒坏的评判。--卢梭
12、捧着一颗心来,不带半根草去。--陶行知
13、君子藏器于身,待时而劢。--佚名
14、教师不仅是知识的传播者,而且是模范。--布鲁纳
15、教师是人类灵魂的工程师。--斯大林
16、学者必求师,从师不可不谨也。--程颐
17、假定美德既知识,那么无可怀疑美德是由教育而来的。--苏格拉底
18、好花盛开,就该尽先摘,慎莫待美景难再,否则一瞬间,它就要凋零萎谢,落在尘埃。--莎士比亚
19、养体开智以外,又以德育为重。--康有为
20、无贵无贱,无长无少,道之所存,师之所存也。--韩愈
21、谁若是有一刹那的胆怯,也许就放走了并运在这一刹那间对他伸出来的香饵。--大仲马
22、学贵得师,亦贵得友。--唐甄
23、故欲改革国家,必先改革个人;如何改革个人？唯一斱法,厥为教育。--张伯苓
24、为学莫重于尊师。--谭嗣同
25、愚蠢的行劢,能使人陷于贫困;投合时机的行劢,却能令人致富。--克拉克
26、凡是教师缺乏爱的地斱,无论品格还是智慧都不能充分地戒自由地发展。--罗素
27、不愿向小孩学习的人,不配做小孩的先生。--陶行知
28、少年进步则国进步。--梁启超
29、弱者坐失良机,强者制造时机,没有时机,这是弱者最好的供词。--佚名 有关刻苦学习的格言
1、讷讷寡言者未必愚,喋喋利口者未必智。
2、勤奋不是嘴上说说而已,而是要实际行劢。
3、灵感不过是“顽强的劳劢而获得的奖赏”。
4、天才就是百分之九十九的汗水加百分之一的灵感。
5、勤奋和智慧是双胞胎,懒惰和愚蠢是亲兄弟。
6、学问渊博的人,懂了还要问;学问浅薄的人,不懂也不问。
7、人生在勤,不索何获。
8、学问勤中得。学然后知不足。
9、勤奋者废寝忘食,懒惰人总没有时间。
10、勤奋的人是时间的主人,懒惰的人是时间的奴隶。
11、山不厌高,水不厌深。骄傲是跌跤的前奏。
12、艺术的大道上荆棘丛生,这也是好事,常人望而却步,只有意志坚强的人例外。
13、成功,艰苦劳劢，正确斱法，少说空话。
14、骄傲来自浅薄,狂妄出于无知。骄傲是失败的开头,自满是智慧的尽头。
15、不听指点,多绕弯弯。不懂装懂,永世饭桶。
16、言过其实,终无大用。知识愈浅,自信愈深。
17、智慧源于勤奋,伟大出自平凡。
18、你想成为并福的人吗？但愿你首先学会吃得起苦。
19、自古以来学有建树的人,都离不开一个“苦”字。
20、天才绝不应鄙视勤奋。
21、试试并非受罪,问问并不吃亏。善于发问的人,知识丰富。
22、智者千虑,必有一失;愚者千虑,必有一得。
23、不要心平气和,不要容你自己昏睡!趁你还年轻,强壮、灵活,要永不疲倦地做好事。
24、说大话的人像爆竹,响一声就完了。鉴难明,始能照物;衡唯平,始能权物。
25、贵有恒何必三更眠五更起,最无益只怕一日曝十日寒。
26、刀钝石上磨,人笨人前学。以人为师能进步。
27、宽阔的河平静,博学的人谦虚。秀才不怕衣衫破,就怕肚子没有货。
范文四：多重PCR
第 27卷 第 10期
2005年 10月 武 汉 理 工 大 学 学 报 JOURNA L OF WUHAN UNIVERSIT Y OF TECHN OLOG Y Vol. 27 No. 10 Oct. 2005
多重 PCR — 一种高效快速的分子生物学技术
陈明洁 1, 方 倜 2, 柯 涛 1, 熊志勇 1, 何光源 1
(1. 华中科技大学中英 HUST 2RRes 作物基因工程与基因组学联合实验室 , 武汉 430074;
2. 武汉大学生命学院 , 武汉 430072)
摘 要 : 多重 PCR 是在一个反应体系中同时扩增多个目的片段的 PCR 技术 , 具有高特异性 、 高灵敏度 、 高效率 、 低成本 的特点 , 适合大量样本的分析与鉴定 。 简述了多重 PCR 的基本原理 , 综述了多重 PCR 在医学 、 遗传学 、 植物生物学 、 海洋 生物学等生命科学领域的应用现状 , 对目的片段选择 、 引物设计 、 复性温度和时间等 PCR , 并介绍 了其最新进展 。
关键词 : 多重 PCR ; 鉴定 ; 应用 ; 进展
中图分类号 : Q 819文献标志码 : A (2005) 1020033204
A of High
ff and Speed
EN M i ng 2jie 1, FA N G Ti 2, KE Tao 1, X ION G Zhi 2yong 1, H E Guang 2yuan 1
(1. China 2U K HUST 2RRes G enetic Engineering and G enomics Joint Laboratory , Huazhong University of
Science and Technology , Wuhan 430074, China ;2. College of Life Science , Wuhan University , Wuhan 430072, China ) Abstract : Multiplex PCR is a kind of PCR technique which amplifies more than one target DNA fragment in one reaction system at one time. It has advantages of high specificity , high sensitivity , high efficiency and low cost , which make it suitable for analyzing and characterizing samples in large quantities. In this article , the principle of multiplex PCR was briefly intro 2duced. Its practical applications in medicines , genetics , plant biology and ocean biology were expounded. Meanwhile , the tech 2nological factors , including the selection of target DNA fragment , primer design , annealing temperature and time were analyzed and the newly progress was presented.
K ey w ords : multiplex PCR ; characterization ; application ; progress
收稿日期 :2005207207.
基金项目 :国家 “ 973” 计划项目 (2002CB111301) 1
作者简介 :陈明洁 (19682) , 女 , 硕士 , 讲师 . E 2mail :chmj027@126. com
多聚酶链式反应 (PCR ) 是以 2段寡核苷酸为引物 , 由 DNA 聚合酶催化扩增位于 2段引物之间的 DNA 片段的一项分子生物学技术 。 该技术自 1983年建立以来 , 因其高灵敏度 、 高效率 、 高特异性的特点 , 已经成 为当前生命科学研究与相关领域中的主体与关键方法 。 技术本身也不断完善 , 目前已经发展了一系列相关 技术 , 如巢式 PCR 、 实时定量 PCR 、 差异显示 PCR 、 免疫 PCR 、 多重 PCR 等 。其中多重 PCR 因其高特异性 、 高效率 、 低成本的优势 , 迅速渗透至生命科学的各个领域 。
1 多重 PCR 技术的基本原理
多重 PCR (multiplex PCR ) 是在普通 PCR 的基础上加以改进 , 于一个 PCR 反应体系中加入多对特异性 引物 , 针对多个 DNA 模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的 PCR 技术 。 这一概念由 Chamberian
等 [1]率先于 1988年提出 。 由于多重 PCR 同时扩增多个目的基因 , 具有节省时间 、 降低成本 、 提高效率的优 点 , 特别是节省珍贵的实验样品 , 所以一经提出 , 即得到众多研究者的青睐 , 并且发展迅速 , 在生命科学的各 个领域 , 多重 PCR 已经成为一项成熟而重要的研究手段 。
2 多重 PCR 技术在生命科学研究中的应用
2. 1 医学研究与应用
疾病的快速准确的早期诊断一直是重要的研究课题 , 快速特异灵敏的诊断是高水平疗效的前提和保证 。 PCR 技术一经建立 , 就迅速应用于各种临床疾病的诊断 。 如今多重 PCR 已经成为这一领域的生力军 , 它结 合传统经典的检测手段 , 为疾病的快速灵敏特异的诊断和最佳治疗方案的确定展示了广阔的前景 。
1) 病原微生物的检测与鉴别 病原微生物因其繁殖力强 、 侵蚀性高 、 变异快的特点 , 极易造成疾病的大 流行 , 因此实现快速灵敏的分析鉴定 , 是控制传染病的首要选择 。 临床上传统的检测方法 , 如组织形态学 、 免 疫学和动物实验等 , 其最大的缺点是周期长 、 灵敏度低 。多重 PCR 灵敏快捷 , 适于大规模检测 , 能同时进行 多种病原微生物的鉴定 , 对于流行病的检测与预防 , 具有不可替代的作用 。
对于临床细菌的鉴定 , 多重 PCR 具有高度的特异性和敏感性 , 如快速鉴定肠出血性大肠埃希氏菌株 , 并 准确检测志贺样毒素产生的情况 ; 鉴别结核分枝杆菌复合体及非结核分枝杆菌 菌的 DNA 旋转酶 A 亚单位突变 [2]; 快速诊断沙眼衣原体 殖系统性传播疾病 ; PCR 。多重 PCR [3]。在人乳头瘤病毒 、 巨 细胞病毒 、 沙眼衣原体 、 单纯疱疹病毒 , 多重 PCR 、 在寄生虫病的监测与预防方面 , 多重 PCR 的应用也日 渐增多 , DNA 差异诊断 , 控制疟疾 、 绦虫病与囊尾蚴病 , 以及寄生虫 [4]。 多重 PCR 不仅高效灵敏地检测病原微生物 , 还常用于病原微生物的分子类型鉴定 和抗药性的研究 , 以利于更好的对症治疗 。 多重 PCR 成功鉴定了乙肝病毒 HBV 的 6种基因型 , 该方法比聚 合酶链反应 — — — 限制片断长度多态型分析法简捷 、 准确率高 , 且便于大量标本的应用 [5]。对于感染率高且 具有多重耐药性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 , 采用多重 PCR 同时检测耐药基因 mecA 和调控基因 f emA , 不但能够快速诊断 , 而且能同时鉴定葡萄球菌的耐药性与表型 [6]。
2) 基因诊断 基因诊断当属世界医学研究攻关课题 , 它不仅是最权威的医学诊断方法 , 而且还是医学基 础研究中的高新手段 。 多重 PCR 技术因其高效 、 快速 、 诊断量大 、 实用性强的特点 , 被竞相研究 。在优生学 上 , 基因诊断的意义非同寻常 。脊椎肌肉萎缩是常染色体上 SMN1基因纯合缺失所引起的一种隐性遗传 病 , 表型正常的基因携带者夫妇所育后代的患病几率高达 25%, 因此产前诊断十分重要 。 Malcov M 等 [7]建 立了多重巢式 PCR , 对 17周孕龄的孕妇进行羊水细胞检测 , 能同时扩增检测 SMN1基因的外显子 exon 7和 exon 8, 实现了产前准确诊断 。 基因诊断的另一个重要应用领域是法医学 。多重 PCR 技术可以用于个体鉴 定与亲子鉴定 。 线粒体基因组上广泛存在单核苷酸多态性 SN P , 据此可以进行个体鉴定 。 Vallone 等 [8]结合 多重 PCR 和毛细管电泳 , 设计特异性引物 , 同时扩增 11个特异区域 , 准确地进行个体鉴定 。 Schlenk 等根据 短串联重复序列 STR 位点和性别特异位点 , 建立了同时扩增 13个位点的多重 PCR 系统 , 所需模板 DNA 用 量可低至 120pg , 准确率达 99. 99%[9]。 此项技术已经成熟 , 德国 Serac 公司开发出的诊断试剂盒已经面市 。 在遗传性聋病诊断 、 Y 染色体微缺失分析等方面 , 多重 PCR 也已成为一个重要的分子诊断方法 。
3) 肿瘤的诊断与研究 多重 PCR 技术一经诞生 , 就成为癌症诊断和研究的重要手段 。 血管为肿瘤细胞 提供养分和氧气 , 清除废物 , 血管形成在肿瘤细胞的增殖与转移中十分关键 。血管内皮生长因子 V EGF 广 泛存在于众多肿瘤组织中 。 采用多重逆转录 PCR 已经鉴定出 V EGF A 、 V EGF B 、 V EGF C 和 V EGF D 等 4种血管内皮生长因子 , 证实在病变的甲状腺组织中它们均有表达 [10]。 此外 , 多重 PCR 广泛应用于多发性骨
髓瘤患者 IgH 及 TCRV γI J γ重排基因的检测 、 视网膜母细胞瘤基因杂合性突变的检测 、 细胞粘附因子的表
达研究 [11]等诸多方面 , 对于肿瘤的早期诊断 、 肿瘤的发展与治疗有着十分重要的意义 。
2. 2 遗传学研究
短的串联重复序列 (STR ) , 亦称微卫星 (micro satellite ) , 是由 1~6个碱基对作为核心单位 , 串联重复 4
3 武 汉 理 工 大 学 学 报 2005年 10月
排列而成的一类 DNA 序列 , 它在人类基因组中分布广泛 , 高度多态 , 并且呈孟德尔共显性遗传 , 因而已作为 一种新的遗传标志用于构建高分辨率的遗传连锁图以及复杂性相关基因定位等研究 。
在复杂性状的遗传研究中 , 常用的策略是对具有同种表型特征的不同人群进行常见微卫星位点的基因 分型和连锁分析 。况少青等 [12]建立了一种以 Taq Start TM 抗体为 Taq 酶保护剂 , 扩增多个微卫星位点的多 重 PCR 方法 , 该方法产量高 、 成本低 , 适用于人类基因组计划 , 尤其是基因作图 、 基因定位及人类进化等研 究 。 扩增多个微卫星位点的多重 PCR 不仅在人类遗传学研究中发挥着重要作用 , 而且在其他动物如小鼠 、 鸡 、 猪的遗传学研究方面 , 也是一种主要的研究手段 , 它为群体遗传学 、 医学遗传学 、 法医学及人类进化等研 究提供了广阔的应用前景 。 研究不同民族之间基因座差异 , 对于基因诊断与基因治疗具有重要意义 。邹浪 萍等 [13]采用多重 PCR 对我国汉族的 CSF1PO 、 TPOX 和 TH01基因座进行等位基因频率调查 。 该技术可简 捷地从同一 DNA 样品中迅速获得较多的基因座数据 , 是多态性研究的最佳方法 。
2. 3 植物生物学研究 高灵敏度、 高效率 、 高覆盖率的多重 PCR 是植物生物学研究的核心技术 , 应用十分普遍 。 随着转基因技 术的迅速发展 , 转基因生物种类越来越多 , 外源基因类型也日益增多 , 导致转基因食品的外源基因成分日渐 复杂 。 因此 , 开发快速准确 、 简便经济的检测方法 , 是一项重要而紧迫的任务 ui dA 和选择基因 bar 是转基因植物中常用的 2种标记基因 , 针对其特异性序列 , PCR 分析系统 , 该方法简单有效 , 灵敏度高 , 易于推广 [14]。 目前 , 、 品均已建立了有效可靠的多重 PCR 检测方法 。 , 、 种质纯度 鉴定 、 病虫害检测等方面 , 多重 PCR 也得到重视 , 在植物生物学的各个领 域 , 发挥着重要作用 。
2. 4 , , 而且外形相似 , 特别是幼体时期 , 要想从中获得具有重要经济价 值的目标物种 (garfish ) 、 双贝 (bivalve ) 等 , 单凭其形态学上的差异 , 几乎毫无可能 。研究发现 , 不 同种类浮游生物细胞色素氧化酶 I 的结构差异明显 , 据此 , 研究者通过设计特异性引物 , 采用多重 PCR 方法 进行分类鉴定 , 获得较好的效果 [15]。
对虾皮下和造血器官坏死杆状病毒 HHNBV 是引起太平洋沿岸各国养殖对虾暴发性死亡的主要病源 。 为了加强对 HHNBV 的诊断 、 预测和分子流行病学调查 , 夏春等根据 HHNBV 2XIA 靶基因序列设计了 4个 引物 (P1、 P2、 P3、 P4) , 采用了 5种引物组合形式 , 建立了多重 PCR 检测 HHNBV 方法 , 可从阳性感染的中国 对虾 fg 级 DNA 中定性检测出 HHNBV 。 该法能节省时间和资金 、 并能一次定性检出 HHNBV 感染 。既可 用于 HHNBV 的早期诊断 , 亦可在净化亲虾 、 防治对虾暴发性病毒病上起作用 [16]。
3 多重 PCR 的技术要素
由于多重 PCR 要求在同一反应体系中进行多个位点的特异性扩增 , 因而技术难度增大 , 一个理想的多 重 PCR 反应体系 , 并非单一 PCR 的简单混合 , 需要针对目标产物 , 进行全面分析 、 反复试验 , 建立适宜的反 应体系和反应条件 。 多重 PCR 的技术要素主要包括目的片段选择 、 引物设计 、 复性温度和时间 、 延伸温度和 时间 、 各反应成分的用量等 。 多重 PCR 的目标是多个目的片段的扩增 , 因此目的片段的选择是核心 。目的 片段必须具有高度特异性 , 才能保证基因检测的准确性 , 避免目的片段间的竞争性扩增 , 实现高效灵敏的扩 增反应 。 此外各个目的片段之间需具有明显的长度差异 , 以利于鉴别 。引物的设计是 PCR 反应成败的关 键 , 对多重 PCR 尤其重要 。 多重 PCR 包含多对引物 , 各个引物必须高度特异 , 避免非特异性扩增 ; 不同引物 对之间互补的碱基不能太多 , 否则引物之间相互缠绕 , 严重影响反应结果 。 复性温度与时间取决于引物的长 度 、 碱基组成及其浓度 , 还有目的片段的长度 。 在多重 PCR 反应中 , 不同目的片段 、 不同引物对所要求的复 性温度各不相同 , 这种差异是影响多重 PCR 特异性的较重要因素 。 综合各个解链温度 T m , 在 T m 值允许范 围内 , 选择较高的复性温度以减少引物和模板间的非特异性结合 , 确保 PCR 反应的特异性 。复性时间略微 延长 , 以使引物与模板之间完全结合 。 多重 PCR 延伸反应的时间要根据待扩增片段的长度而定 , 延伸时间 不宜过长 , 否则会导致非特异性扩增带的出现 。反应体系中各个反应成分也需要进行调整 , 适当增大模板 DNA 、 引物 、 聚合酶 、 dN TP 的用量 , 调整缓冲液组分 , 以获得最佳扩增效果 。总之 , 在单一 PCR 的基础上 , 遵
53第 27卷 第 10期 陈明洁 , 等 :多重 PCR — 一种高效快速的分子生物学技术
循引物组合的一般原则 , 适当调整反应条件 , 建立多重 PCR 反应体系并非难事 。
4 多重 PCR 的最新进展
鉴于多重 PCR 技术显示出的巨大商业价值和广阔应用前景 , 很多生物技术公司致力于多重 PCR 试剂 盒以及相关技术的开发 。 Q IA GEN 公司研制出适于多重 PCR 反应的新型缓冲系统 , 其主要特点是加入 N H 4+, 通过 N H 4+与 K +的平衡调节 , 扩大反应系统的最适复性温度范围 , 以适应多个基因的共同扩增 。 BioSource 已经研制出多重 PCR 试剂盒 , 可以直接用于相关基因的检测分析 。在基因诊断方面也已经有试 剂盒投入市场 。 随着分子生物学的迅速发展 , 结合不断涌现的新技术 , 多重 PCR 开发出更多更广泛的应用 。 如在硅玻璃芯片中完成系列核酸扩增反应的多重 PCR 生物芯片技术 、 AFL P 多重 PCR 、 多重逆转录 PCR 、 实 时多重 PCR 技术 、 巢式多重 PCR 、 荧光定量多重 PCR 等 , 以适应多种不同研究与应用的需要 [17,18]。借助多 重 PCR 技术 , 人类已经攻克了许多科学难题 , 取得了巨大突破 。 随着科学的发展 , 技术的进步 , 多重 PCR 必 将得到更快的发展 , 更好地造福于人类 。
参考文献
[1] Chamberian J S , G ibbs R A , Ranier J E , et al. Detection Screenin g of the Duchenne Muscular Locus via Multiplex
DNA Amplification[J].Nucl Acids Res , 1988,16:1141~1156.
[2] Cheng A F , Y ew W W. Multiplex PCR Amplimer Conformation in Fluoro 2
quinolone 2resistant Mycobacterium Tuberculosis , 2004, 48(2) :596~601.
[3] 王 宁 , 韩金祥 . 多重 PCR 中华实验和临床病毒学杂志 , 2003,17(1) :
50~54.
[4] Y amasaki H , of Taeniasis and Cysticercosis by Multiplex PCR[J].J Clin Microbiol ,
2004, 42[5] K irschberg O C , Repp R , et al. A Multiplex 2PCR to Identify Hepatitis B Virus 2genotypes A 2F[J].J Clin Virol ,
2004, 29(1) :39~43.
[6] 刘荣森 , 杨清宇 . 应用复合 PCR 方法鉴定口腔菌斑标本中的耐甲氧西林葡萄球菌属 [J].中华医院感染学杂志 , 2003,
13(1) :7~9.
[7] Malcov M , Schwartz T. Multiplex Nested PCR for Preim plantation G enetic Diagnosis of S pinal Muscular Atrophy[J].Fetal
Diagn Ther ,2004, 19(2) :199~206.
[8] Vallone P M , J ust R S. A Multi plex Allele 2specific Primer Extension Assay for Forensically Informative SNPs Distributed
Throughout the Mitochondrial G enome[J].Int J Legal Med , 2004, 118(3) :147~157.
[9] Schlenk J , Seidl S. Development of a 132locus PCR Multiplex System for Paternity Testing [J].Int J Legal Med , 2004,
118(1) :55~61.
[10] Tanaka K , Kurebayashi J , S onoo H , et al. Expression of Vascular Endothelial Growth Factor Family Messenger RNA in Dis 2
eased Thyroid Tissues[J].Surg Today , 2002, (32) :761~768.
[11] Chen Q. Promoter Methylation Regulates Cadherin Switching in Squamous Cell Carcinoma[J].Biochem Biophys Res Com 2
mun , 2004, 315(4) :850~856.
[12] 况少青 , 王建民 . 应用多重 PCR 进行微卫星荧光标记 2半自动基因组扫描 [J].中华医学遗传学杂志 , 1998,15(2) :
104~107.
[13] 邹浪萍 , 杨 燕 . 多重 PCR 检测 CSF1PO , TPOX 和 TH01基因座在中国汉族中的多态性 [J].遗传学报 ,1998,25(3) :
199~204.
[14] 陈明洁 , 刘 勇 , 涂知明 , 等 . 多重 PCR 法快速鉴定转基因小麦植株及后代 [J].华中科技大学学报 ,2004,32(9) :
105~107.
[15] Noell C J , Donnellan S , Foster R , et al. Molecular Discrimination of G arfish H yporhamphus (Beloniformes ) Larvae in S outh 2
ern Australian Waters[J].Mar Biotechnol ,2001, (3) :509~514.
[16] 夏 春 , 刘 津 . 多重 PCR 法检测对虾皮下和造血器官坏死杆状病毒 [J].病毒学报 , 2000, 16(3) :262~265.
[17] Al 2Khaldi S F , Villanueva D , Chizhikov V. Identification and Characterization of Clostridium Perfrin gens Using Single Tar 2
get DNA Microarray Chip [J].Int J Food Microbiol , 2004, 91(3) :289~296.
[18] 许俊泉 , 贺学忠 , 周玉祥 , 等 . 生物芯片技术的发展与应用 [J].科学通报 , 1999, 44(24) :2600~2607.
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3 武 汉 理 工 大 学 学 报 2005年 10月
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