范文一：微生物检测步骤
微生物检测步骤
液体样品:
1、 打开紫外灯灭菌30min
2、 把所有做微生物的物品一并带入无菌室
3、 用酒精棉对手进行消毒、取出灭菌平皿并编号(根据本厂的菌
落数进行编号)以下样液的菌落数小于100 4、 用灭菌吸管吸取1ml灭菌盐水放入编号为“0”的平皿中 5、 用灭菌吸管分别吸取1ml样品放入编号为原液的两个平皿中
(若盛装样液的容器为桶装则应先把样液转入灭菌容器中再进
行取样)
6、 吸取样液1ml放入灭菌的9ml盐水中，摇匀后分别吸取1ml放
入编号为-1的两个平皿中
7、 点燃酒精灯，倒入温度在46?(不低于40?)的营养琼脂，摇
匀，带琼脂凝固后倒扣放置于温度为36??1?的培养箱中培
养48h?2h
8、 吸取样液10ml放于3支双料管中
9、 吸取样液1ml放于3支单料管中
10、 吸取样液0.1ml放于3支单料管中
11、 把8、9、10所得最终溶液摇匀放置于温度为36??1?的培养
箱中培养24h?1h
12、 观察7、11的结果并记录
固体样品:
1、 打开紫外灯灭菌30min
2、 把所有做微生物的物品一并带入无菌室
3、 用酒精棉对手进行消毒、取出灭菌平皿并编号(根据本厂的菌落数进行编号)《以下举例为产品菌落编号为“-1“、“-2”》 4、 用灭菌吸管从226ml盐水瓶中吸取1ml灭菌盐水放入编号为
“0”的平皿中
5、 称取磨碎或搅碎的样品25g放入225ml盐水瓶中，摇匀(此步
得到样品稀释10倍的溶液、即“-1”溶液)
6、 用灭菌吸管分别吸取1ml“-1”溶液放入编号为“-1”的两个平
皿中
7、 吸取“-1”溶液1ml放入灭菌的9ml盐水中，摇匀(此步得“-2”
溶液)
8、 分别吸取1ml“-2”溶液放入编号为“-2”的两个平皿中 9、 点燃酒精灯，倒入温度在46?(不低于40?)的营养琼脂，摇
匀，带琼脂凝固后倒扣放置于温度为36??1?的培养箱中培
养48h?2h
10、 吸取“-1”溶液10ml放于3支双料管中
11、 吸取“-1”溶液1ml放于3支单料管中
12、 吸取“-1”溶液0.1ml放于3支单料管中
13、 把8、9、10所得最终溶液摇匀放置于温度为36??1?的培养
箱中培养24h?1h
14、 观察7、11的结果并记录
注:?、倘若编号中有“-3“、”-4“、”-5“……….的现象则从“-2”溶液中吸取1ml放入1支9ml盐水管摇匀后即得“-3”溶液、从“-3”溶液中吸取1ml放入1支9ml盐水管摇匀后即得“-4”溶液、从“-4”溶液中吸取1ml放入1支9ml盐水管摇匀后即得“-5”溶液，以此类推
?、若11步骤最终有产气的现象则继续进行以下实验 平板分离试验:
A、 配制伊红美蓝琼脂:按照说明书根据需求量自行配置 B、 将配置好的琼脂进行灭菌(121?、15min-20min) C、 将冷却到46?(不低于40?)的灭菌琼脂倒入平皿中(铺满平
皿底部)
D、 待琼脂凝固后根据产气管数对平皿进行划分、倘若产气管数为
10ml双料1支、1ml单料1支、0.1ml单料一支则将平皿划分
成4个区域“?”分别在各自区域写上“0”、“10”、“1”、“0.1”
用灭菌的接种环分别在气管中蘸取少许液体后在对应的平皿记E、
号处划线(至少两条线、划线方式有两种一种“?”另一种“井”) F、 划线完毕后置于温度为36??1?的培养箱中培养24h?1h G、 观察“F”的结果
?、 “G”最终结果为划线处有肉眼可见金黄色菌则继续进行以下
实验
? 革兰色染色:
A、 从伊红美蓝平皿上选取可疑菌
B、 取一块干燥洁净的载玻片放置于试验台上，再表面滴1-2d灭菌
盐水
C、 用灭菌的接种环挑取少许可疑菌落于盐水表面，并涂匀 D、 盖上盖玻片(注:盖上盖玻片时不得有气泡产生) E、 用滤纸把表面的水吸干后置于酒精灯上干燥、固定(注:干燥
固定时应再酒精灯上方不停的摆动，防止细菌被烫死) F、 在载玻片一头滴入龙胆紫(结晶紫)，用滤纸从另一头吸，待溶
液完全铺满，计时1min-2min;用清水冲洗，直至染液洗净，
用滤纸吸干表面的水
G、 在载玻片一头滴入碘液，用滤纸从另一头吸，待溶液完全铺满，
计时1min-2min;用脱色液进行脱色直至紫色染液完全脱去(脱
色时间不宜超过30s)，用清水冲洗并用滤纸吸干表面的水 H、 在载玻片一头滴入沙黄染液，用滤纸从另一头吸，待溶液完全
铺满，计时2min-3min;用清水冲洗，直至染液洗净，用滤纸
吸干表面的水
I、 待玻片完全干燥后(自然条件下干燥)，在盖玻片表面滴一滴香
柏油
J、 用显微镜进行观察
? 复发酵(乳糖发酵试验)
A、 乳糖胆盐发酵管:按照说明书根据需求量自行配置，分装于
18*180mm的试管、每支10ml，每支管中放入小导管，盖上硅
胶塞并包扎后于115?灭菌15min-20min
B、 从伊红美蓝平皿上选取可疑菌
C、 用灭菌的接种环从伊红美兰琼脂中挑取少许可疑菌落于乳糖胆
盐发酵管中(根据伊红美蓝划分的区域选取相应的乳糖胆盐发
酵管的管数，若初发酵只有一支产气则选取乳糖发酵管的管数
为3支;管数最少为3支最多为9支)，摇匀后置于温度为36?
?1?的培养箱中培养24h?1h
?、倘若“J”的染色结果为革蓝色阴性无芽孢杆菌(细菌在显微镜下观察为紫红色、杆状)、“C”的结果为产气，则报告最终结果为大肠杆菌呈阳性。只有当“J”、“C”同时满足大肠杆菌才呈阳性，反之只有一条满足则不足以说明大肠杆菌呈阳性
范文二：微生物检测步骤
1.菌落总数操作步骤
1.1 检样稀释及培养
1.1.1以无菌操作,取样25 g放入225mL灭菌生理盐水或灭菌乳钵中，经充分振摇作成1：10均匀稀释液。
1.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做成1∶100的稀释液。
1.1.3 另取1mL灭菌吸管，按上条操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL火菌吸管。
1.1.4 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
1.1.5 稀释液移入平皿后，应及时将凉至45℃营养琼脂培养基 ，注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照
1.1.6 待琼脂凝固后，翻转平板(使平皿底朝上)，置36±1℃温箱内培养48±2h。 1.2 菌落计数方法
做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 1.3 菌落计数的报告 1.3.1 平板菌落数的选择
选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。
1.3.2 稀释度的选择
1.3.2.1 应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表1中例1)。
1.3.2.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字(见表中例2及3)。
1.3.2.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例4)。
1.3.2.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例5)。 1.3.2.5 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见表1中例6)。
1.3.2.6 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
1.3.2.7 若只有一个稀释度菌落在适宜计数范围内，计算平均值X 稀释倍数；作为结果；若两个连续稀释度的菌落都在适宜计数范围内时按公式计算：
2.大肠菌群测定步骤
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 操作步骤 2.1 检样稀释
2.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
2.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
2.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
2.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 2.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃ 温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 2.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃ 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 2.4复发酵实验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 2.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
注：1.本表采用3个稀释度[1mL(g)、0.1mL(g)、0.01mL(g)]，每稀释度3管。 2.表内所列检样量如改用[10mL(g)、1mL(g)、0.1mL(g)]，表内数字应相应降低10倍；如改用[0.1mL(g)、0.01mL(g)、0.001mL(g)]时，则表内数字应相应增10倍，其余类推。
3.商业无菌的检验方法
商业无菌的概念：
罐头食品的商业无菌是指罐头食品经过适度的热杀菌后，不含有致病的微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物，这种状态称作商业无菌。罐头食品的商业无菌的检验适用于各种密封容器包装的，包括玻璃瓶，金属罐，软包装，经过适度的热杀菌后达到商业无菌，在常温下能较长时间保存的罐头食品。 步骤：
3.1按取样步骤取样
3.2保温—将样品按照保温试验要求进行保温，保温过程中,每天检查,如有胖听或泄漏等现象,立即取出开罐检测。
罐头种类 温度，℃ 时间，d 低酸性罐头 36±1 10 酸性罐头 30±1 10 预定输往热带地区的低酸性罐头 55±1 5-7 3.3开罐：
取保温过的全部罐头,冷却到室温后,按无菌操作开罐检验。
3.3.1将样罐用温水和洗涤剂洗刷干净，用自来水冲洗后擦干。放入无菌室，以紫外光灯照射30min。
3.3.2将样罐移至超净工作台上，用75%酒精棉擦拭，并点燃灭菌（胖听罐不能烧），用灭菌器具开启。
3.3.3留样：开罐后，以无菌操作取出内容物10-20ml（g）移入灭菌容器内，保存于冰箱中，检验得出结论后可随之弃去。 3.4 PH测定：
取样品测PH值，看与标准是否有显著的差异。
3.5感官的检验：对产品的外观、色泽、状态和气味进行观察、嗅闻，鉴别食品有无腐败变质的迹象。 3.6涂片染色镜检 3.6.1涂片
对PH检查结果认为可疑的样品进行涂片染色镜检。用接种环挑取样品涂于载玻片上，待干后用火焰固定。 3.6.2染色镜检
用革兰氏染色法染色，镜检，至少观察5个视野，记录细菌的染色反应，形态特征以及每个视野的菌数。与同批的正常样品进行对比，判断是否有明显的微生物增殖现象。 3.7接种培养
3.7.1保温期间出现的胖听泄漏或开罐检查发现PH、感官质量异常，进一步镜检发现有异常数量细菌的样品，均应及时进行微生物接种培养。对需要接种培养的样品用灭菌移液管移出1ml内容物，分别接种培养，接种量为培养基的十分之一。要求在55℃培养基管，在接种前应在55℃水浴锅中预热至该温度，接种后立即放入55℃温箱培养。
3.7.2低酸性产品接种培养基、管数及培养条件见表1
培养基 管数 培养条件 时间(h) 疱肉培养基 2 30±1℃(厌氧) 96—120 疱肉培养基 2 30±1℃(厌氧) 24—72 溴甲酚紫葡萄糖肉汤(带导管) 2 30±1℃(厌氧) 96—120 溴甲酚紫葡萄糖肉汤(带导管) 2 30±1℃(厌氧) 24—72 3.7.3酸性产品接种培养基、管数及培养条件见表2
培养基 管数 培养条件 时间(h) 酸性肉汤 2 30±1℃55 1 (厌氧) 48 酸性肉汤 2 30±1℃30 1 (厌氧) 96 麦芽浸膏汤 2 30±1℃30 1 (厌氧) 96 3.8微生物培养检验程序及判定
3.8.1见GB4789.26—94罐头食品商业无菌的检验。
3.8 .2 对有微生物生长的酸性肉汤和麦芽浸膏汤管进行观察，并涂片染色镜检，按所发现的微生物类型判定。 3.9样品密封性检验
对确定有微生物繁殖的样罐均进行密封性检验以判定该样品是否泄漏。将已经洗净的空罐经35℃烘干，根据各单位的设备条件减压或加压试漏。 4.结果判定
4.1该批产品抽取样品经保温试验未胖听或泄漏；保温后开罐经感官检查、PH值测定或涂片镜检或接种培养，确证无微生物繁殖现象，则为商业无菌。
4.2该批产品抽取样品经保温试验有一罐及一罐以上发生胖听或泄漏；或保温后开罐，经感官检查、PH值测定或涂片镜检和接种培养，确证有微生物繁殖现象，则为非商业无菌。
（1）PH测定判定：PH计的精确度应在已知缓冲溶液的0.1PH单位之内。与同批中正常罐比，看是否有明显差异。一般PH增加0.5算作显著差异。
（2）染色镜检，判定是否有明显的微生物增值现象。根据实践结果，有百倍增长算明显的增殖。
范文三：微生物检测方法
-1992 、FDA《 细菌分析手册―需氧菌平板计数 》，或 15～300 个（如 ISO 4833 : 1991 《 微生物学 大肠杆菌菌落计数通用指南最大可能数技术》）等。
菌落计数前先观测菌落生长的情况，一般同一稀释度的平板上的菌落数应相近，不同稀释度平板上的菌落数则应与稀释倍数成反比。蔓延菌落的生长会抑制其他菌株的生长，或者会覆盖其他的小菌落，所以最好不要选择有蔓延菌落生长的平板作为计数平板，但如必须选择，应在记录中标记清楚。如片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘 2 以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限），若只有一条链可视为一个菌落，如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。当每个稀释度制备了两块平板时，用所选择的平板的算术平均值来计算原始样品中的微生物的含量。样品的菌落数等于每克或每毫升的cfu值除以稀释度。
报告方式：
空白对照实验：
2.2大肠菌群
大肠菌群或称总大肠菌群是指一群能在37℃条件下发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。符合这些条件的肠杆菌科细菌主要包括4个菌属：
埃希氏菌属，在此菌属中与人类生活密切相关的仅有一个种，
即大肠杆菌；
其次有柠檬酸杆菌属，其代表种有弗劳地枸橼酸杆菌；
克雷伯氏菌属，代表种为肺炎克雷伯氏菌；
肠杆菌属，代表种有阴沟杆菌和产气杆菌。
大肠菌群卫生学意义：
大肠菌群主要来源于人、畜粪便。大肠菌群是反映食品中是否存在粪便污染的指示菌，食品中有粪便污染，则可推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，同时也反映出被测食品对人体健康存在危害。大肠菌群检测已被广泛应用于食品卫生工作中。
检验的标准通常使用GB/T 4789.3-2003、SN 0168-92
检验中需了解和注意事项：
1. 挑选菌落
在实际工作中，为了提高大肠菌群的检出率，应当熟悉大肠菌群的菌落色泽和形态。在GB/T 4789.3-2003检验方法中规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽，检出率为最高；红色、粉色菌落检出率较低。
2. 发酵管的产气量
在日常工作中，有时在发酵倒管内有极微小的气泡（有时比小米粒还小），有时可遇到在初发酵时产酸未产气，但在液面及管壁却可以看到缓缓上浮的小气泡。这种情况大肠菌群的阳性检出率能达到30%-50%。所以不能忽视产气量少的，对未产气的乳糖发酵管如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能
有气体产生，而应作进一步试验。
3. 抑菌剂
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂可抑制样品中的—些杂菌，特别是G+的生长，而有利于大肠菌群的生长和挑选。
GB/T 4789.3-2003中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，SN 0168-92中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠（月桂基）作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。
2.3金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、土壤、水、饲料、食品、灰尘及人和动物的排泄物中都可以存在。因此，食品受污染的机会很多，是引起食品污染和细菌性食物中毒的一种重要细菌。由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒已成为世界性的卫生问题。
一. 生物学特性：
1. G+、需氧或兼性厌氧，通常在肉浸液肉汤及肉浸液琼脂或加入血液的培养基上生长良好。
2. 耐盐性强。10%-15%的氯化钠培养基中能生长。
3. 在血琼脂上，几乎所有的葡萄球菌可产生α、β、γ和δ溶血素（一种或一种以上）。多数致病菌株可产生透明溶血环，菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。
4. 葡萄球菌是无芽胞菌中抵抗力最强者，耐干燥可达数月，加
热 80℃ 30min 才被杀死。 5％石炭酸， 0.1%升汞 10～15 min
死亡。 l : 100000～200000 龙胆紫溶液能抑制其生长。对磺胺增
效剂、青霉素、红霉素等较敏感，但耐药菌株逐年增多。
葡萄球菌肠毒素具有耐热性，加热 100℃ 30min 不被破坏.
要使其完全破坏需煮沸2h，这是葡萄球菌肠毒素的特点
二. 毒素和酶
金黄色葡萄球菌的致病力决定于细菌产生的毒素和酶的能力。致
病性菌株产生的毒素和酶主要有下列几种：
1．血浆凝固酶：此酶由金黄色葡萄球菌产生，能使含抗凝剂的
人或兔血浆发生凝固。血浆凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄球菌的重要标志。
2．溶血毒素：多数致病性菌株均能产生，包括 α、β、γ和
δ溶血素，对人致病主要是α-溶血素。
3．杀白细胞素：能破坏人和家兔的中性粒细胞，抵抗吞噬细胞
的吞噬 。
4. 肠毒素：分 A 、B 、C 、D 、E 和 F 六个型别。耐热， 100 ℃
30min 不被破坏。金黄色葡萄球菌引起的食物中毒以 A 型为多见，其次是 B 、 C 型。
5．剥脱毒素：由噬菌体 l 群中某些金黄色葡萄球菌菌株产生。
对新生儿和免疫功能低下的成年人，可引起葡萄球菌烫伤样皮肤综合征。
三. 检验方法及鉴定
金黄色葡萄球菌检验方法主要有 GB/T4789.10-2003《食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》和SN0172-1992《出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法》。
3操作步骤
3. 1增菌培养法
3. 1.1.!检样处理:按无菌操作取检样25 g(mL)，加入225 mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。
3. 1.2增菌及分离培养:吸取5 mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50 mL培养基内，36℃士1℃培养24 h,转种血平板和Baird-Parker平板，36℃士1℃培养24 h，挑取血平板上金黄色(有时为白色)菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
3.1.3形态: 本菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5μm--1μm
3. l. 4在肉汤中呈混浊生长，在胰酪脉大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在Bird-Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2 mm---- 3 mm ,颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然
会遇到非脂肪溶解的类似菌落;但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。
3.1.5血浆凝固酶试验:吸取1，4新鲜兔血浆0. 5 mL，放入小试管中，再加人培养24 h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物o. 5 ml.，振荡摇匀，置36℃士1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6 h,如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。
3.2直接计数方法
3.2.1吸取上述1：10 混悬液，进行10倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度稀释液1 mL，分别加入三块Baird-Parker平板，每个平板接种量分别为0. 3 mL,0. 3 mI.,0.4 mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分多不易吸收，可将平板放在36℃士10C 1 h，等水分蒸发后反转平皿置36℃士1℃培养。
3.2.2在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种血平板，36℃士1 0C 24 h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。
3.2.3菌落计数:将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。
四． 鉴定试验
（1）血浆凝固酶试验：本试验是鉴定金黄色葡萄球菌致病性的重要试验．血浆凝固酶通常以兔血浆为最好，避免使用柠檬酸抗凝的血浆，以 EDTA 抗凝兔血浆为最好。取肉汤培养物0.3 mL同0.5 mL凝固
酶试验免血浆于8 mm X 100 mm试管内充分混合，置36士1℃培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h。以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性。试验中需同时做已知阳性和阴性对照。SN0172-1992中明确规定对可疑结果，应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验{如耐热核酸酶试验等}加以证实。
( 2 ）触酶试验：挑取菌落置于清洁玻片上，滴加3%H2O2 1～2滴，1min产生大量气泡为阳性。
( 3 ）甘露醇发酵试验：多数致病性葡萄球菌菌株发酵甘露醇。 ( 4 ）耐热核酸酶试验：方法在SN0172-1992中附录C。
( 5 ) SPA 的检测： SPA 能与免抗羊红细胞血清中的 IgG 的 Fc 段结合，使致敏羊红细胞发生凝集， A 蛋白的存在是金黄色葡萄球菌的特征。
( 6 ）新生霉素敏感试验：每片含 5μg ，抑菌环＞ 16mm 者为敏感，
五．肠毒素的测定 方法在GB/T4789.10-2003中。
当食品中检出金黄色葡萄球菌时，表明食品加工处理卫生条件较差，并不一定说明该食品导致了食物中毒。但当食品中未分离出金黄色葡萄球菌时，也不能证明食品中不存在葡萄球菌肠毒素。
2.4 沙门氏菌
沙门菌属分类属肠杆菌科，是肠杆菌科中最复杂的菌属，是一种重要的肠道致病菌，可从人和世界各地所有动物中分离得到，其致病性具有种系特异性，例如人是伤寒、副伤寒 A 、B 、
C 沙门菌的天
然宿主。有些专对动物致病，也有些对人和动物都能致病。沙门菌可致多种感染。
1生物学性状
形态染色 革兰阴性直杆菌，较细长，多具有周鞭毛，能运动，有时会出现无鞭毛的突变型。无芽胞，无荚膜。
1.1培养特性 兼性厌氧，最适生长温度 35 一 37℃，最适生长pH 6.8一 7.8,本菌属对营养的要求不高，在普通营养琼脂上生长的菌落为圆形、光滑、湿润、半透明、边缘整齐的菌落，
有时出现粗糙型的菌落。有些能产生硫化氢的菌株，在 SS琼脂上形成中心黑色的菌落。在亚硫酸铋琼脂上，不同沙门氏菌可形成如下三种不同的菌落，
在亚硫酸铋琼脂上，不同沙门氏菌可形成如下三种不同的菌落：深黑色菌落，大小为2mm，扁平的菌落，并有向周围扩散的灰褐色晕环，如伤寒沙门氏菌往往形成这样的菌落；灰黑色至灰褐色的菌落，大小为2mm～3mm，圆形、光滑、湿润、突起，周围有向外扩散的灰褐色晕环，多数沙门氏菌属于此类型；浅灰色菌落，一般较大，直径为2mm～4mm，突起黏液状，有向周围扩散或无扩散的灰色晕环。 在HE琼脂上，沙门氏菌培养24h后，可形成两种不同的菌落。一类菌落大小为2mm～3mm，绿色至蓝绿色，中央有黑色沉淀物。另一类菌落大小为2mm，绿色至蓝绿色，无黑心。
亚利桑那沙门氏菌，因为发酵乳糖，可形成橙黄色，带有黑心的菌落，直径为2mm。 在XLD琼脂（木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂）上，沙门氏菌培养24h后，大多数沙门氏菌形成浅粉色，大小为2mm，光滑、湿润、边缘整齐。而发酵乳糖的亚利桑那沙门氏菌形成带有黑心的黄色菌落。 在DHL-琼脂（胆硫乳琼脂）上，沙门氏菌培养24h后，产生硫化氢的沙门氏菌可形成带有黑心的菌落大小为2mm～3mm，圆形、突起、湿润、边缘整齐。不产生硫化氢的沙门氏菌，菌落中心无黑色沉淀物。亚利桑那沙门氏菌，因发酵乳糖和产生硫化氢，形成红色带黑心的菌落。
1.2生化反应
不发酵乳糖、蔗糖，对葡萄糖、麦芽糖和甘露醇发酵，除伤寒 沙门氏菌不产气外，其它沙门氏菌均产酸产气。
TSI上典型的沙门氏菌培养物显示斜面碱性（红色）或不变色和底部酸性（黄色），伴随着产气和（约90%情况下）硫化氢产生（K/A + +）；当分离到乳糖阳性的沙门氏菌时，TSI的斜面是黄色的。因此，沙门氏菌培养物的初步确认并不能仅仅根据TSI琼脂实验的结果，还要再接种尿素琼脂或赖氨酸脱羧酶培养基。
尿素琼脂如果反应为阳性，尿素分解释放氨，其颜色由粉红变成玫瑰红，最后变成深樱红色。 赖氨酸脱羧酶培养基阳性反应为紫色，阴性反应为黄色。
对初步反应可疑为沙门氏菌属的TSI培养物进行生化试验。生化结果符合沙门氏菌属特性的进行血清学试验。
2.血清学特性
2.1抗原构造 本菌属的抗原结构主要有 3 种，即菌体（ O ）抗原、鞭毛（ H ）抗原及表面抗原（ Vi 抗原等）。根据O 抗原、H 抗原双相抗原及Vi抗原的不同，可将沙门氏菌分为近 3000 种血清型。
( l ) O抗原：为多糖一类脂蛋白质复合物，具耐热性，能耐受 100℃ 2.5 h。O抗原共有 58 种，以阿拉伯数字顺序排列，现已排至第 67（其中有 9 种被删除）。每个沙门菌的血清型可含一种或多种O抗原。凡含共同抗原成分的血清型归为－个群，每个群以 0 加上阿拉伯数字及括号中大写的 26 个英文字母（A～Z）顺序编排，则可将沙门氏菌属分成A～Z 、051～063、O65～O67 42个群，引起人类疾病的沙门氏菌大多数在A～E群。 0 抗原是分群的依据。其刺激机体产生的抗体以Ig M 为主,与相应的抗血清反应时呈颗粒状凝集。
( 2 ) H 抗原为不稳定的蛋白质抗原，加热或用乙醇处理均被破坏。有两个相，第一相特异性较高称特异相，用小写英文字母 a 、 b 、
C 表示，沙门菌 H 抗原直至 z , Z 以后 z 加阿拉伯数字表示，如 21 、 22 、 23 ． · · … 265 。第二相抗原为沙门菌所共有，称非特异，直接用 1、2、3 表示。同时有第一相和第二相 H 抗原的细菌称双相菌，仅有一相者用相称单相菌。 H 抗原是定型的依据。其刺激机体产生的抗体以 IgG 为主，与相应的抗血清呈絮状反应。
( 3 ）表面抗原：在沙门菌属中已被证实的表面抗原有 Vi 抗原、 M 抗原和 S抗原三种：
l ) Vi 抗原：是一种不耐热的酸性多糖聚合物，加热 60℃30 分
钟或经石炭酸处理即被破坏，经人工培养基传代后也易丧失。新分离的伤寒及副伤寒丙沙门菌常带有此抗原。 Vi 抗原位于菌体的最表层，有抗吞噬及保护细菌免受相应抗体和补体的溶菌作用。 Vi 抗原存在时可阻止 0 抗原与相应抗体发生凝集，故在沙门菌血清学鉴定时应加以注意，需事先加热破坏 Vi 抗原之后， O抗原才得以与相应的 O 抗血清发生凝集。带 Vi 抗原的沙门菌亦可用 Vi 噬菌体进行分型，有助于流行病学调查和追踪传染源。
2 ) M 抗原：又称粘液抗原。多种沙门菌均可产生 M 抗原。 M 抗原有免疫原性，但各菌种之间无特异性，不能用于血清学分型。 M 抗原存在时亦可阻止 O 抗原与相应抗体发生凝集，同样可用加热的方法加以破坏。
3 ) S 抗原：过去认为 S 抗原是一种 O抗原，与O 抗原的区别是 S抗原可被 lmol / l的盐酸所破坏，故与O抗原不同，仍属表面抗原。
2.2抗原变异 沙门菌属在一定条件下可发生变异，主要表现为： ( 1 ) S一 R 变异：自临床标本初次分离的菌株一般都是光滑型，经人工培养、传代后可逐渐变成粗糙型菌落。此时菌体表面的特异多糖抗原丧失，在生理盐水中可出现自凝。
（2） H-O变异：是指有鞭毛的沙门菌失去鞭毛的变异。
( 3 ）位相变异：具有双相 H 抗原的沙门菌变成只有其中某一相 H 抗原的单相菌，称位相变异在沙门菌血清学分型时，如遇到单相菌，特别是只有第Ⅱ相（非特异相）抗原时，需反复分离和诱导出第Ⅰ相
（特异相）抗原方可作出鉴定。
( 4 ) V-W变异：是指沙门菌失去 Vi抗原的变异。初次分离得到的具有 Vi 抗原、O不凝集的沙门菌称 V 型菌； Vi 抗原部分丧失，既可与O抗血清发生凝集又可与 Vi 抗血清凝集者称 VW 型菌； Vi 抗原完全丧失，与0抗血清发生凝集而与 Vi 抗血清不凝集者称 W 型菌。 V-W 变异的过程是 V 型菌经人工培养，逐渐丧失部分 Vi抗原而成为 VW 型菌，进而丧失全部 Vi抗原而成为 W 型菌。
3．检验方法：按照GB/T4789.4-2003 SN0170-1992进行检验。
2.5 大肠埃希氏菌
大肠杆菌是肠道的正常菌群。在一定条件下可引起肠道外感染，一部分血清型的大肠杆菌致病性强，引起腹泻，与人类疾病有关的大肠杆菌统称为致泻大肠杆菌。包括肠产毒素性大肠杆菌（ETEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠集聚性粘附大肠杆菌（EAggEC）。
肠出血性大肠杆菌（EHEC）引起散发或暴发性出血性结肠炎，主要血清型是O157:H7 ，EHEC O157:H7的一个显著性特征是产生志贺样毒
素（Vero toxin,VT），是EHEC的主要致病因子。EHEC O157:H7不发酵
或迟缓发酵山梨醇。在山梨醇麦康凯琼脂平板上菌落呈无色半透明。绝大多数O157:H7大肠杆菌不具有葡萄糖醛酸酶，不能水解4-甲基伞
形酮-β-D葡萄糖醛酸苷（MUG），不能产生荧光。
肠产毒素性大肠杆菌（ETEC）能产生不耐热肠毒素（LT）和耐热
肠毒素（ST）。
卫生学意义：检出大肠杆菌，即意味着直接或间接地被粪便污染， 卫生学上被用于饮水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标；由于大肠杆菌在外界存活时间与一些肠道致病菌相近，它的检出也可能预示着某些肠道致病菌（沙门菌、志贺氏菌）的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。
2．5．1 形态与结构 革兰阴性直短杆状，多数有鞭毛，能运动，某些菌株尤其是引起肠外感染的菌株有荚膜（微荚膜）和周身菌毛。
2．5．2 培养和生化反应 兼性厌氧，营养要求不高，在普通营养琼脂上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落,在血琼脂上某些菌株可产生β-溶血，在肠道选择培养基上可发酵乳糖，形成有色菌落。
大肠杆菌能发酵乳糖、葡萄糖等多种糖类产酸产气，典型的大肠杆菌的吲哚、甲基红、V -P 、枸椽酸盐（I MViC ）的生化试验结果为 + + - -，在三糖铁琼脂（TSI）上斜面和底层均产酸、产气， H2 S 阴性（ A/A + -），不分解尿素。大肠杆菌一般不产生硫化氢，但近来发现产硫化氢的菌株，应引起注意。
大肠杆菌的血清学反应，往往是对经分离、鉴定、确证为大肠杆菌的进一步分型。
根据O 抗原、H 抗原及K抗原的不同进行大肠杆菌血清学分型。 表示大肠杆菌血清型的方式按O；K；H 排列。
检验方法：GB/T4789.6-2003；SN0169-92。
志贺菌属
志贺菌属与沙门菌属一样，是主要的肠道病原菌之一，是引起人类细菌性痢疾的病原体。在伯杰手册（ 1984 ）中将志贺菌属分为 4 个血清群（种） : A 群为痢疾志贺菌, B 群为福氏志贺菌, C 群为鲍氏志贺菌, D 群为宋内志贺菌）而沿用至今。
生物学性状 1 ．形态结构和染色革兰阴性杆菌，菌体短小，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。
2.培养和生化反应
发酵葡萄糖产酸不产气，大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。不分解尿素，不产生H2S。TSI：(K/A - -)
2. 检验方法: 按照GB/T4789.5-2003标准检验。
三.生物安全基本知识
3.1生物安全柜的使用
（1）生物安全柜必须在运行正常时才能使用。
（2） 生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板。
（3） 生物安全柜内应尽量少放置器材或样品，不能影响后部压力排
风系统的气流循环。
（4） 生物安全柜内不能使用酒精灯，否则燃烧产生的热量会干扰气
流并可能损坏过滤器。允许使用微型电加热器，但最好使用一次性无菌接种环。
（5） 所有工作必须在工作台面的中后部进行，并能够通过玻璃观察
挡板看到。
（6） 尽量减少操作者身后的人员流动。
（7） 操作者不应反复移出和伸进手臂以免干扰气流 。
（8） 不要使实验记录本、移液管以及其他物品阻挡空气格栅，因为
这将干扰气体流动，引起物品的潜在污染和操作者的暴露。
（9） 工作完成后以及每天下班前，应使用适当的消毒剂对生物安全
柜的表面进行擦拭。
(10)在生物安全柜内的工作开始前和结束后，安全柜的风机应至少运行15min。
(11)在生物安全柜内操作时，不能进行文字工作。
3.2 移液管和移液辅助器的使用
1、应使用移液辅助器，严禁用口吸取。
2、所有移液管应带有棉塞以减少移液器具的污染。
3、不能向含有感染性物质的溶液中吹入气体。
4、感染性物质不能使用移液管反复吹吸混合。
5、不能将液体从移液管内用力吹出。
6、刻度对应（Mark-to-mark）移液管不需要排出最后一滴液体，因此最好使用这种移液管。
7、污染的移液管应该完全浸泡在盛有适当消毒液的防碎容器中。移液管应当在消毒剂中浸泡适当时间后再进行处理。
8、盛放废弃移液管的容器不能放在外面，应当放在生物安全柜内。
9、有固定皮下注射针头的注射器不能够用于移液。
10、在打开隔膜封口的瓶子时，应使用可以使用移液管的工具，而避免使用皮下注射针头和注射器。
11、为了避免感染性物质从移液管中滴出而扩散，在工作台面应当放置一块浸有消毒液的布或吸有消毒液的纸，使用后将其按感染性废弃物处理。
3.3废弃物处理
污染物处理的首要原则是所有感染性材料必须在实验室内清除污染，最有效和彻底的清除污染方法通常为高压灭菌或焚烧。
（1）所有含有微生物的污染材料（有潜在感染性）、污染的非可燃的废物（玻璃或锐利器具）在丢弃前必须放置在防渗漏的容器中高压灭菌。
（2）所有的液体废物在排入下水道前必须经过消毒处理。
（3）任何高温灭菌后重复使用的污染材料不应事先清洗，所有的清洗、修复工作必须在高压灭菌或消毒后进行。
（4）盛放锐器的一次性容器绝对不能丢弃于垃圾场。
（5）应在每个工作台上放置盛放废弃物的容器、盘子或广口瓶，最好是不易破损的容器（如塑料制品）。盛放废弃物的容器在重新使用前应高压灭菌并清洗。
3.4 感染性物质防护技术
（1）为了避免接种物洒落，微生物接种环的直径应为2mm~3mm并完全封闭，柄的长度应小于6cm以减小抖动。
（2）使用封闭式微型电加热器消毒接种环，以避免在酒精灯的明火上加热所引起的感染性物质爆溅。最好使用不需要再进行消毒的一次性接种环。
（3）在所有可能产生潜在感染性物质喷溅的操作过程中，操作人员应将面部、口和眼遮住或采取其他防护措施。
（4）鉴定可疑微生物时，个人防护设备应与生物安全柜及其他设施同时使用。
（5）在每一阶段工作结束后，必须采用适当的消毒剂清除工作区的污染。
3.5 微生物实验室容器破碎及感染性物质溢出的应急处理
当发生容器破碎感染性或潜在感染性物质溢出时，应采用下列溢出清除规程：
1、戴手套，穿防护服，必要时需进行脸和眼睛防护。
2、用布或纸巾覆盖并吸收溢出物。
3、向纸巾上倾倒适当的消毒剂，并立即覆盖周围区域（通常可以使用5%漂白剂溶液）.
4、使用消毒剂时，从溢出区域的外围开始，朝向中心进行处理。
5、消毒剂作用适当时间后（例如30 min），将所处理物质清理掉。如果含有碎玻璃或其他锐器，则要使用簸箕或硬的厚纸板来收集处理过的物品，并将它们置于可防刺透的容器中以待处理。
6、对溢出区域再次清洁并消毒（如有必要，重复第2～5步）。
7、将污染材料置于防漏、防穿透的废弃物处理容器中高压灭菌。
8、在成功消毒后，通知主管部门目前溢出区域的清除污染工作已经完成。
范文四：FDA微生物检测方法
FDA微生物检测方法
菌落总数测定——菌落总数的概念
?菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。
菌落总数测定——卫生学意义
?判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。
?及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。 ?通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
FDA BAM 菌落总数测定流程
检样xg/mL+9xml
选择2~3个连续适宜稀释度
各取1mL分别加入灭菌平皿内
每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）
35 ℃ 48 ± 2h
菌落计数
FDA BAM 菌落计数方法
?选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下： N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d ?所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为65*100* 1/d。
?无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。
?最终结果保留前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。
?
菌落总数测定几点说明
?由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。
?鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colony forming units，CFU）报告。
菌落总数测定几点要求
?每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min，主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。
?检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。
?检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4 ℃放置，以便在计数检样时用作对照。
大肠菌群的定义
?大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 ?大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌的定义
?大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。
?大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。
?与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。
卫生学意义
?大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。
?食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
?大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
大肠杆菌的生物学特性
基本形态：
此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。
培养特性：
?大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。
大肠菌群及大肠杆菌测定
——MPN法检验流程（FDA BAM）
检样50g+450ml稀释液
选择
3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，
每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST
肉汤并加有导管），
每管接种1mL
± 2h
报告阴性 接种BGLB肉汤管 接种EC肉汤
44.5±0.5 ℃
（水浴培养）
24 ± 2h ~48 ± 2h 查MPN表报告结果 产气管接种EMB平板（35℃、18~24h） （大肠菌群） 从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA
斜 面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定，
接种LST复检产气
查MPN表报告结果（大肠杆菌）
大肠菌群测定——MPN法检验几点说明
MPN检索表：
MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
?初发酵和证实试验：
1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。
2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。
?产气量与倒管：
在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：
中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽 ?
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
?EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；
?高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；
?大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；
?该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。
大肠杆菌测定——革兰氏染色
基本步骤：
?将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染
?滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗； 1min，水洗；
?滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；
?滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。
?结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
大肠杆菌测定——生化鉴定
（表略）
金黄色葡萄球菌——概述
根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)和腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)，其中金葡多为致病性菌，表葡偶尔致病。
?金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常见的病原菌。可引起局部化脓性感染，如疖、痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面的感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾盂肾炎、心包炎等多系统的化脓性感染；还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。 ?
金黄色葡萄球菌——生物学特性
金黄色葡萄球菌呈球形，直径0.8μm左右，排列成葡萄串状 ，无芽孢，无荚膜。
金黄色葡萄球菌——生长特性
?金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长。
金黄色葡萄球菌检验——方法适用性
?MPN法：适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金黄色葡萄球菌的食品。
?直接平板计数法：适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于10/g（ml）的食品。
?增菌培养法：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。
金黄色葡萄球菌检验——直接平板计数法
（FDA BAM &ISO）
检样（稀释液）
选择2~3个连续适宜稀释度
吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分别涂布于
3块90mmBaird-Parker平板上（做平行试验）
35℃ ，45~48 h
报告
FDA BAM 金黄色葡萄球菌检验——MPN法
检样（稀释液）
选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，
每个稀释度接种三管10% NaCl TSB肉汤，
每管接种1mL
35℃ ，48 ±2 h
从生长的管中接种1环划线于 Baird-Parker平板上
35℃ ，48 h
确证试验
报告
FDA BAM 金黄色葡萄球菌确证试验
1.凝固酶试验
?方法：从平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到TSB/BHI肉汤中，置35℃培养18-24h。取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆充分混合，置35℃培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h。试验中需同时做已知阳性和阴性对照。
?结果判定：以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。部分凝固（2+和3+）的必须进行生化鉴定加以证实。
FDA BAM金黄色葡萄球菌确证试验
2.革兰氏染色
?对所有的可疑培养物都要进行革兰氏染色。
3.生化鉴定
?过氧化氢酶试验
?葡萄糖厌氧利用试验
?甘露醇厌氧利用试验
?金葡溶菌酶敏感性试验
?耐热核酸酶试验（辅助）
沙门氏菌属简介
?1880年E. Berth首先发现伤寒沙门氏菌，1885年Salmon与Smith又分离出猪霍乱沙门氏菌，以后取Salmon氏之名为本菌属之名。
?沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2000多个血清型，我国已发现血清型近200个。
沙门氏菌属——生物学特性
形态特征：
革兰氏阴性，大小为1~3×0.4~0.9μm的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。
培养特性：
?沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10-42 ℃都可生长，最适生长温度为37℃，最适pH为6.8~7.8。 ?营养琼脂平板上：35~37℃培养18~24h，其菌落大小一般为2~3mm，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。
?血平板上：中等大小的灰白色菌落。
沙门氏菌属的抗原
?菌体抗原（O抗原）
?表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原
?鞭毛抗原（H抗原）
?纤毛抗原
FDA BAM沙门氏菌检验流程
前增菌 25g样+225mL乳糖肉汤 （肉制品、肉副产品、动物产品）匀质2min，室温放置60 ±5min
选择性增菌
0.1ml+10mlMM（RV） 1ml+10mlTTB
42℃、24h
（水浴培养） 35℃、水浴培养
分离培养 划线接种 选择性培养基（BS、XLD、HE）
35℃、24~48h（BS生化鉴定 每个平板挑取至少2个可疑菌（包括典型和非典型各2个）
接种TSI三糖铁、LIA赖氨酸铁高层斜面（LIA高层深4cm）
（松盖以保持有氧条件防止产生过多H2S）
35℃、24±2h
弃去 （+） 尿素酶试验 （—） 卫矛醇、 氰化钾、丙二酸钠、吲哚试验
血清学 ——沙门氏菌的分类
报告结果
沙门氏菌检验选择性分离培养
XLD琼脂：
FDA BAM——典型菌落：粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的具光泽的黑色中心或几乎为全部黑色的菌落。
——非典型菌落：黄色带或不带黑色中心。
沙门氏菌检验选择性分离培养
BS琼脂：
FDA BAM——典型菌落：产硫化氢菌落黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有晕环效应；
——非典型菌落：有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养基不变色。
沙门氏菌检验选择性分离培养
HE琼脂：
FDA BAM——典型菌落：兰绿色至兰色，多数菌株产硫化氢，菌落带或不带黑色,中心或几乎全黑色。
——非典型菌落：乳糖阳性的菌株为黄色中心黑色或全黑色。
沙门氏菌检验生化鉴定
TSI：
典型反应：斜面产碱（K）：红色；底部产酸（A）：黄色；产H2S：黑色（少数不产）
沙门氏菌检验——几点注意
?冷冻样品解冻需在45℃以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2-8℃，18小时内软化。
–为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。 ?进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。
–测试中应同时接种阳性对照菌株。
李斯特菌属简介
?《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版中，李斯特菌属有7个种：单核细胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英诺克李斯特氏菌（L. innocua） 、西尔李斯特氏菌（L. seeligeri） 、威尔斯李斯特氏菌（L. welshimeri） 、绵羊李斯特氏菌（L. ivanovvi） 、格氏李斯特氏菌（L. grayi） 、默氏李斯特氏菌（L. murrayi） 。
?单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起动物的感染，也可引起人的感染。
单核细胞增生李斯特氏菌——生物学特性
形态特征：
革兰氏阳性短杆菌，大小为0.4~0.5×0.5~2μm， 两端钝圆，常两两相串成弯曲及V形，偶尔有球状、双球状、短链状，但很少有长链状，兼性厌氧、无芽孢，一般不形成荚膜。该菌有4根周毛和1根端毛，周毛易脱落。20℃培养后可见到很多鞭毛。
培养特性：
生长温度为2~42℃（冷藏不能阻止该菌的生长），最适生长温度为35~37℃。20~25 ℃培养有动力，37 ℃培养动力消失；在显微镜下观察该菌新鲜的室温肉汤培养物可见翻筋斗运动。 ?在pH3.8~4.4仍能生长，在pH中性至弱碱性（9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在6.5%NaCl肉汤中也能良好生长。
?血平板上：菌落通常不大呈灰白色，刺种血平板可产生窄小的β溶血环。 ?
FDA BAM单核细胞增生李斯特氏菌检验流程 检样25g
增菌
EB225mL
℃ 4h
℃ 44h
选择性分离培养 接种和 PALCAM
35℃ 24-48h
生化鉴定 过氧化氢酶试验
革兰氏染色 溶血试验
单核细胞增生李斯特氏菌——溶血试验
制备5~7%羊血琼脂平板。
?挑取TSAYE平板上的典型菌落刺种血平板，刺种时避免接触到平板底部和使琼脂破裂，同时接种阳性（单核细胞增生李斯特氏菌）和阴性（英诺克李斯特氏菌）对照。 ?单增呈现狭窄、清晰、明亮的β-溶血； ?西尔李氏菌出现弱的溶血现象；
?绵羊李氏菌通常呈宽的、轮廓清晰的β-溶血； ?英诺克李氏菌不产生溶血现象。
单核细胞增生李斯特氏菌——协同溶血试验（CAMP）
?方法：在羊血琼脂平板上平行接种β-溶血金黄色葡萄球菌（S.aureus）和马红球菌(R.equi),在它们中间垂直划线接种可疑菌，与两线相近但不相交，在30℃培养24h-48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。 ?结果：靠近金黄色葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，绵羊李斯特氏菌在马红血球附近的溶血增强。
?
FDA李斯特氏菌属的区别
几种常用稀释缓冲液介绍 ?磷酸盐缓冲液
储备液的制备：称取34g磷酸二氢钾溶解于500ml蒸馏水中，用1NNaOH 溶液调整pH值为7.2，再用蒸馏水稀释至1000ml，121℃高压灭菌 15min，于冰箱中储存。
稀释液的制备：取1.25ml储备液，用蒸馏水稀释至1000ml，定量分 装，121℃高压灭菌15min备用。 ?
称取8.5gNaCl溶解于1000ml蒸馏水中，定量分装，121℃高压灭菌 15min备用。 ?
称取1g蛋白胨溶解于1000ml蒸馏水中，定量分装，121℃高压灭菌 15min备用。蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释 过程中使检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。 ?无菌水
范文五：微生物检测方法-USP
非无菌产品微生物检查：微生物计数检查
简介：
下述方法能够对在有氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌进行定量计数。 该检查主要是为了确定某种物质或剂型是否符合既定的微生物质量标准。当以此为目的时，按照下面给出的规定进行，包括所需的样品数量以及按照下文规定的要求对结果进行描述。
此方法不适用于用活微生物作为活性成分的产品。
若使用了其他的微生物程序，包括自动方法，则应提供其等同于药典方法的证明。
一般程序
为了避免外来微生物的影响，必须在设定的条件下进行微生物检查。为避免此污染所采取的预防措施必须不影响所要进行检查的微生物。
如果待测样品具有抗微生物活性，则在可能的情况下，移除或中和这种抗微生物活性。如果因此而是用了钝化剂，则必须证明其有效性及对微生物无毒性。 如果在处理样品时使用了表面活性剂，必须证明其对微生物无毒性及与证明其所使用的钝化剂的兼容性。
计数方法
用薄膜过滤法和平皿计数法。最大机率法（MPN）一般来说最不准确的微生物计数方法。但是对于生物负荷非常小的确定的产品来说可能是最适合的方法。
对检查方法的选择是基于像产品的本质和微生物的限度这样一些因素。所选择的方法必须能够用足够的样品来判断出其是否符合标准规定。必须证明所选择的方法的适用性。
生长促进试验、计数方法的适用性和阴性对照
一般原则
必须证明检测方法能够从携带微生物的样品中检测出此微生物。如果在检测
过程中有了改变或会影响检测结果的产品的改变，则必须证明其适用性。
测试菌株的准备
用标准化的测试菌株的稳定混悬液或用下述规定的方法准备测试菌株。使用菌种培养维护技术（菌种系统），以使从原始主菌株中移除的用于接种的微生物不大于5个片段。按照表1中所描述的方法分别对细菌和真菌的测试菌株进行培养。
用PH 7.0 的氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH 7.2 磷酸盐缓冲液来配制测试混悬液；制备A. brasiliensis 孢子混悬液，可加入0.05%的聚山梨酯80。在2小时内使用该混悬液或如果在2°－8°储存则在24小时内使用。作为一种替代的方法，可以配制并稀释植物细胞A. brasiliensis或B. subtilis de 新鲜混悬液，配制一份孢子的稳定混悬液，然后用适量的此孢子混悬液进行接种。此稳定的孢子混悬液可在2°－8°在验证过的一段时间内保存。
阴性对照
为了确认检测条件，用稀释剂代替样品溶液进行阴性对照。阴性对照必须没有微生物生长。在检测“产品检测”项下描述的产品时也需要进行阴性对照，阴性对照失败需进行调查。
培养基生长促进
对每一批准备好的培养基和每一批由脱水培养基或原料制成的培养基进行检测。在大豆酪蛋白消化肉汤和大豆酪蛋白消化琼脂部分/培养皿上接种表1中规定的少量微生物（不大于100CFU），每种培养基使用单独的部分/培养皿。在沙氏葡萄糖琼脂培养皿中接种表1中规定的少量微生物（不大于100CFU），每种培养基使用单独的部分/培养皿。根据表1中的规定进行培养。
表1.检测微生物的准备和使用
对于固体培养基，由一个大于2的因子和由标准化接种物计算值得到的增长必须相同。对于新制备的接种物，微生物的生长情况应该和之前一批经过检测并验证的培养基的情况相比较。如果与之前一批经过检测并验证的培养基的情况相比较，微生物的生长情况是明显可见的，那么液体培养基亦适用。
产品中计数方法的适用性
制备样品
制备样品的方法取决于待测品的物理性质。如果以下程序均不能达到令人满意的效果，则应开发其他替代的程序。
水溶性待测样品：在PH7.0的氯化钠-蛋白胨溶液、PH7.2的磷酸盐缓冲液或大
豆酪蛋白消化肉汤中溶解或稀释（通常准备1：10的稀释液）待测样品，将PH值调节至6-8。如果需要进一步稀释，应使用相同的稀释剂。
不溶于水的非脂肪性样品：在PH7.2磷酸盐缓冲液，PH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液或大豆酪蛋白酶消化肉汤中制备待测品混悬液（通常按1：10稀释），可加入例如1g/L的聚山梨酯这一类表面活性剂来帮助亲水性差的物质形成悬液。如果需要调节PH到6-8。如果需要，可用同样的稀释剂进一步稀释。
脂肪性产品：用经过除菌过滤后的肉豆蔻酸异丙酯溶解样品，或将样品与最小需要量的无菌聚山梨酯80或其他加热后的无菌的无抑制性的表面活性剂混合，如果需要加热，温度应不超过40°，对特殊的产品，应不超过45°。小心混合，如果需要在水浴中保持此温度。加入足够量的用预热过的稀释剂进行1:10稀释后的待测样品。小心混合，直至形成乳状液。用含有适量无菌聚山梨酯80或其他非抑制性的表面活性剂的稀释剂进行连续的十倍稀释。
气溶胶中的液体或固体：在无菌条件下将待测样品转移至薄膜过滤器或无菌的容器中以进行进一步的取样。使用全部或者每个容器中计算出的剂量作为样品。 透皮贴剂：移除透皮贴剂的保护层，将其放置在无菌的玻璃或塑料盘中，有粘性的一面向上，用一层能透气的盖住透皮贴剂的粘性表面以防其粘在一起，然后将贴剂转移到适量的含有像聚山梨酯80和/或卵磷脂等钝化剂的稀释剂中，大力振摇至少30分钟。
接种和稀释
向按上述方法制备的样品及对照中（无待测样品）加入适量的微生物混悬液以得到不大于100CFU的接种物。接种物的体积应不大于稀释的待测样品的体积的1%。
为了证明待测样品中可接受的微生物的回收率，必须用样品的最低可能稀释因子进行检测。如果由于抗微生物活性或者溶解性差而无法用样品的最低可能稀释因子进行检测，则必须寻求其他合适的方案。若不能避免对样品生长的抑制，在中和、稀释或过滤后应加入等分的微生物混悬液。
中和/移除抗微生物活性
按照“接种和稀释”的规定进行稀释的样品中微生物的回收率及按照“产品中微生物的回收率”进行培养，与对照中微生物的回收率进行比较：如果生长被抑制（由于因子大于2而降低），则变更该计数检测方法的程序以保障结果的有效性。变更的程序可包括，例如： （1） 增加稀释剂或培养基的体积；
（2） 将特定的或一般的中和剂混入稀释剂中； （3） 薄膜过滤；上述措施结合。
中和剂：中和剂用中和样品中的抗微生物活性（见表1）。最好在灭菌前将其加入到所使用的稀释剂或培养基中。如果使用了中和剂，必须做一个有中和剂无样品的空白来证明中和剂的有效性及其对微生物无毒性。
表2. 干扰物质的中和剂/方法
如果没有合适的中和方法，可以假设已接种微生物的分离失败是由于产品的微生物活性。这些信息表明样品不容易被给出的微生物污染。但是，有可能这种产品只抑制了一些在此指定的微生物，但不抑制一些不包含在测试菌株内或不具有代表性的微生物。因此，使用与微生物生长和规定的可接受标准相兼容的最大稀释因子进行检测。
产品中微生物的回收率
对列出的每种微生物，应分别进行试验。只对加入测试菌株的微生物进行计数。 薄膜过滤：使用标称孔径不大于0.45μm，这种过滤器材质的选择是基于细菌保留效率不被待测样品的组分影响这样的理念。对列出的所有微生物，使用一个薄膜过滤器。
将按照“样品的准备”、“培养和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法制备的适量样品（大约1g样品，如果测定的CFU较多的话，可减少样品数量）移入到薄膜过滤器内，立即过滤，用适量的稀释剂冲洗薄膜过滤器。 测定需气菌总数（TAMC）时，将薄膜过滤器移到大豆酪蛋白消化琼脂表面上。测定霉菌及酵母菌总数（TYMC）时，将薄膜过滤器移到沙氏葡萄糖琼脂表面上。按表1的规定进行培养，然后计数。
平皿计数法：平皿计数法对每中培养基至少用2个培养皿进行培养，结果取其平均数。
注皿法：用直径为9cm的皮氏培养皿，加入1ml按照“样品的准备”、“培养和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法制备的样品及15-20ml大豆酪蛋白消化琼脂或沙氏葡萄糖琼脂，这两种培养基均在不大于45°的条件下保存。如果使用更大的皮氏培养皿，琼脂培养基的数量也要相应的增加。对每种表1中列出的微生物，至少分别需要2个皮氏培养皿。
按照表1中的规定进行培养，用每个培养基计算的平均值，计算原始接种物中的CFU数。
表面分布法：用直径为9cm的皮氏培养皿，在45°时向每个培养基中加入15-20ml大豆酪蛋白消化琼脂或沙氏葡萄糖琼脂，使其凝固。如果使用更大的皮氏培养皿，琼脂培养基的数量也要相应的增加。干燥培养基，例如在层流柜中会培养器中。对每种表1中列出的微生物，至少分别需要2个皮氏培养皿。将经过测量的不少于0.1ml的按照“样品的准备”、“培养和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法制备的样品分布在培养基表面。按照“注皿法”的规定进行培养基计数。
最大机率法（MPN）：最大机率法的精确性和准确度均小于薄膜过滤法和平皿计数法。霉菌的计数结果尤为不可靠。由于这种原因，在没有其他可靠的方法情
况下，则在TAMC计数中可使用最大机率法。如果对使用这种方法给出了合理说明，则按照以下规定进行。
按照“样品的准备”、“培养和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法，对样品连续进行3次10倍稀释。对每个等级的稀释， 1g或1ml等分3份分别接种到3个盛有9-10ml大豆酪蛋白酶消化肉汤的试管中。如果需要，可向培养基中加入像聚山梨酯80一类的表面活性剂，或如抗微生物剂一类的钝化剂。因此，进行三个等级的稀释，共需要接种9支试管。
在30-35℃的条件下培养所有试管，不超过3天。若由于产品的性质导致测试结果的难以辨别或不确定，则在相同的肉汤或大豆酪蛋白酶消化琼脂进行传代培养，在相同温度及相同的条件下培养1-2天，并以传代培养的结果作为检测结果。根据表3，确定待测样品每克或每毫升中微生物最大几率值。
表3. 微生物最大几率值
结果和说明
当核实薄膜过滤法和平皿计数法的适用性时，样品中测试微生物的平均值通过一个大于2的因子后，应与按照“接种和稀释”项下的要求所做的对照的值一致。当核实最大机率法的适用性时，接种物的计算值必须在对照所得结果的95%置信区间内。
如果用上述的任一方法对微生物进行检测，检测结果无法达到规定的标准，可以使用与标准最接近的方法和实验条件来检测样品。
样品的检测 样品使用量
除另有规定外，取10g或10ml待测样品。对于气溶胶中的固体或液体，取10个单位容量。对于透皮贴剂，取10剂。
对于下述活性物质使用的样品量会减少：每个单位剂量（如片、粒、支）小于或等于1mg，或每克或每ml（对于某些无法用单位剂量来衡量的制剂）中药物活性物质的含量小于 1mg。在上述情况中，所使用的待测样品量应不少于10个单位剂量或取用10g或10ml样品。
对于用作活性成分的物质，如果样品量已被限制或批量很小（例如小于1000ml或1000g），测试取样量应为批量的1%，除非另有规定或给出合理的理由或是被批准可以使用更少用量的样品。
对于批量少于200个实体的样品（例如用作临床试验的产品），样品量可以减少至2个单位，如果批量少于100个实体，样品量可减少至1个单位。
对未包装的物料或已包装制剂以最小包装单位随机抽取样品。为得到规定的取样量，混合足够数量的最小包装单元来取得样品。
样品检测 薄膜过滤
使用可以移动到培养基内的过滤器。根据“生长促进试验和计数方法的适用性”的描述选择合适的处理样品的方法，将适量的样品分别移入两个薄膜过滤器中，立即过滤。用的适宜的程序清洗过滤器。
测定TAMC时，将一个薄膜过滤器移到大豆酪蛋白消化琼脂的表面。测定TYMC
时，将另一个薄膜移到沙氏葡萄糖琼脂表面。盛有大豆酪蛋白消化琼脂的培养皿在30°-35°培养3-5天，盛有沙氏葡萄糖琼脂的培养皿在20°-25°培养5-7天。计算每克或每ml样品中的CFU数。
此处有一段有关透皮贴剂的检测方法没有翻译出。
平皿计数法
注皿法：根据“生长促进试验和计数方法的适用性”的描述选择合适的处理样品的方法，对每种培养基的每个稀释等级至少准备两个皮氏培养皿。盛有大豆酪蛋白消化琼脂的培养皿在30°-35°培养3-5天，盛有沙氏葡萄糖琼脂的培养皿在20°-25°培养5-7天。根据需要稀释的等级以及TAMC需要显示的最大菌落数为250、TYMC需要显示的最大菌落数为50等来选择培养皿。用每个培养基的算数平均值来计算每克或每ml样品中的CFU数。
表面分布法：根据“生长促进试验和计数方法的适用性”的描述选择合适的处理样品的方法，对每种培养基的每个稀释等级至少准备两个皮氏培养皿。按照“注皿法”项下的描述进行培养和计算CFU数。
最大机率法：
根据“生长促进试验和计数方法的适用性”的描述选择合适的处理样品的方法。所有试管均在30°-35°培养3-5天。如果需要的话用适宜的程序进行传代培养。 记录每个稀释等级的试管中微生物的生长情况。根据表3来确定每克或每ml样品中微生物的最可能数量。
结果说明
大豆酪蛋白酶消化琼脂中的CFU数就视为需气菌总数（TAMC）；若在此培养基中检测到真菌的菌落，则也视为TAMC的一部分。沙氏葡萄糖琼脂中的CFU数就视为酵母菌/霉菌总数（TYMC）；若在此培养基中检测到细菌的菌落，则也视为TYMC的一部分。当由于细菌的生长致使TYMC超出了可接受标准时，就需要用到含有抗生素的沙氏葡萄糖琼脂。用MPN方法计算出的值为TAMC。
微生物质量可接受标准描述如下：
—101CFU：最大可接受值=20； —102CFU：最大可接受值=200； —103CFU：最大可接受值=2000，等等。
推荐使用的溶液及培养基会在控制菌的检测中列出。
非无菌产品微生物检测：控制菌的检测
简介
下述的检测方法是用来限制或确定没有按所描述的条件可检测到的控制菌存在。
这些方法最初是用来确定一种物质或剂型是否符合既定的微生物质量标准。当用作此种目的时，请按下述说明程序进行，包括需要的样品数及按照下述的要求对检测结果进行说明。
其他的微生物程序包括自动的方法，有可能会被用到，这需要证明这些方法等效于药典的方法。
一般程序
按照“非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述对样品进行处理。如果待测样品有抗菌活性，需要按照“非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”的要求除去或中和这种抗菌活性。
如果在准备样品时使用了表面活性剂，那么就需要按照“非非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”.的要求证明这些表面活性剂对微生物是没有毒性的，以及他们与所使用的钝化剂是可以兼容的。
培养基的生长促进和抑制特性、检测的适用性及阴性控制
必须证明使用的检测方法能够从待测样品中检测出微生物的存在。如果检测方法有改变或引入了会影响检测结果的样品，则需要证明方法的适用性。
检测菌株的准备
使用下述的标准化的检测菌株。使用菌种培养保养技术（菌种系统），以使用于培养的微生物从原始主菌种中移除的片段不大于5个片段，。 需氧微生物
用大豆酪蛋白消化肉汤或大豆酪蛋白消化琼脂分别培养每种检测菌株，在 30°-35°培养18-24小时。用沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤在20°-25°单独培养白色念珠菌菌株2-3天。
用PH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH7.2的磷酸盐缓冲液制备检测混悬液。在2小时内使用该混悬液，如果在2-8℃贮存的话，在24小时内使用。 梭状芽孢杆菌
用产芽胞梭状芽胞杆菌，例如ATCC11437(NBRC14293，NCIMB12343，CIP100651)或ATCC19404(NCTC532或 CIP79.3)或NBRC14293。在30°-35°无氧条件下，用梭状芽胞杆菌强化培养基培养梭状芽孢杆菌检测菌株24-48小时。作为一个可供选择的方法，准备及稀释一个新的用作接种的稳定的Cl.sporogenes植物细胞混悬液。在验证过的周期内这个稳定的混悬液可以在2°-8°保存。
阴性对照
为了证实检测条件，用选定的稀释剂代替样品进行阴性对照，阴性对照必须无微生物生长。在检测“样品检测”项下描述的样品时也需要进行阴性对照。失败的阴性对照需要进行调查。
培养基的生长促进和抑制特性
测试每一批现成的培养基及每一批用脱水培养基或原料制成的培养基。照表1的描述来验证相关培养基的特性。
表1. 培养基生长促进、抑制及指示特性 表2.6.13.1—培养基生长促进、抑制及指示特性
液体培养基促生长特性试验
用适当的培养基接种少量的（不超过100CFU）适当的微生物，在规定温度下培养，培养时间不大于规定的最短培养时间。清晰可见的微生物的生长情况应与先前试验所观察到的结果及已批准批次的培养基得到的结果是一致的。 固体培养基促生长特性试验：
用表面分布法（非无菌产品微生物检查：微生物计数检查中的平皿计数法），每个培养基接种少量的（不超过100CFU）适当的微生物，在规定温度下培养，培养时间不大于规定的最短培养时间。清晰可见的微生物的生长情况应与先前用已批准批次的培养基试验所观察到的结果是一致的。 液体或固体培养基生长抑制特性试验：
用适当的培养基接种至少100CFU适当的微生物，在规定的温度下培养，培养时间不少于规定的最长培养时间，应观察不到所测试的微生物的生长情况。 指示特性试验：
用表面展开法用适当的培养基接种少量（不超过100CFU）适当的微生物，在规定的温度下培养在规定范围内的一段时间，菌落的外观及指示反应应与先前用已批准批次的培养基试验得到的结果是一致的。
检测方法的适用性
按照“样品检测”项下所描述的相应方法对样品进行处理，混合时在规定的生长培养基内加入测试菌株，分别培养每个测试菌株。在已接种的测试准备时加入不多于100CFU的微生物。
按照“样品检测”项下的相应内容进行试验，培养时间为规定的最短培养时间。
控制菌必须用“样品检测”项下描述的指示反应来进行检测。
任何抗菌性都导致需要对检测程序进行修改（见非无菌产品微生物检查：微生物计数检查中中和/移除抗微生物活性项下的规定）。
如果用规定的方法无法中和待测样品的抗菌活性，那就假设这种微生物在样品中不存在。
样品检测
耐胆汁的革兰氏阴性菌
样品准备和预培养：照“非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”中所述，取不少于1g的被检测样品进行1:10的稀释，用大豆酪蛋白消化肉汤为稀释剂，混合并在
20°-25°培养一段时间至使细菌复活，但不致繁殖（通常为2小时，但不大于5小时）。
不存在的检测：除另有规定外，取按“样品准备和预培养”处理后相当于1g样品的体积，接种到肠道菌浓缩肉汤-莫塞尔中。在30°-35°培养24-48小时。用紫红胆盐葡萄糖琼脂在30°-35°传代培养18-24小时。
如果没有菌落生长表示产品符合试验标准。 定量检查
选择和传代培养：将适量按“样品准备和预培养”所述制备样品和/或分别将含有0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml及0.001ml）待测样品的稀释溶液接种到肠道菌浓缩肉汤-莫塞尔，在30°-35°培养24-48小时。再用紫红胆盐葡萄
糖琼脂在30°-35°传代培养18-24小时。
说明：有菌落生长为阳性结果。记录显示阳性结果的最小样品数量及显示阴性结果的最大样品数量，根据表2确定细菌的可能数量。 表2. 结果说明
大肠埃希菌
样品准备和预培养：照“非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述，取不少于1g的被检测样品进行1：10的稀释，取10ml或相当于1g或1ml的数量接种到适量的（照“检测方法适用性”项下的描述确定）的大豆酪蛋白消化肉汤上，混合，在30°-35°培养18-24h。
选择和继代培养：振摇容器，将1ml大豆酪蛋白消化肉汤加入到100ml 麦康基肉汤中，在42°-44°培养24-48h。再用盛有麦康基琼脂的培养皿在30°-35°传代培养18-72小时。
说明：有菌落生长表示有大肠埃希菌存在的可能，这可以通过鉴别试验确定。如果没有菌落生长或鉴别试验呈阴性表示产品符合试验标准。
沙门氏菌
样品准备和预培养：照“非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述，取不少于10g或10ml的样品接种到一定数量（根据 “检测方法适用性”项下的描述确定）的大豆酪蛋白消化肉汤上，混合，在30°-35°培养18-24h。
选择和继代培养：将0.1ml大豆酪蛋白消化肉汤到10ml绿沙门氏菌浓缩肉
汤中，在30°-35°培养18-24h。用戊醛糖、赖氨酸和脱氧胆酸琼脂在30°- 35°传代培养18-48h。
说明：发育良好的、有或没有黑色中心的红色菌落都表示沙门氏菌存在的可能性，这可以通过鉴别试验确定。
如果所描述的这种类型的菌落不存在或鉴别试验呈阴性，表示产品符合试验标准。
绿脓杆菌
样品准备和预培养：照非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述，取不少于1g的被检测样品进行1：10的稀释，取10ml或相当于1g或1ml的数量接种到一定数量（根据 “检测方法适用性”项下的描述确定）的大豆酪蛋白消化肉汤上，混合。当检测透皮贴剂时，用无菌过滤膜过滤相当于1剂待测样品容量的样品（见非无菌产品微生物检查：微生物计数检查中制备样品项下透皮贴剂的描述），接种到100ml大豆酪蛋白消化肉汤上，在30°-35°培养18-24h。
选择和继代培养：用溴棕三甲铵琼脂在30°-35°传代培养18-72h。 说明：有菌落生长表示有绿脓杆菌存在的可能性，这可以通过鉴别试验确定。 如果没有所描述的菌落生长或核实性的鉴别试验呈阴性，表示产品符合试验标准。
金黄色葡萄球菌
样品准备和预培养：照“非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述，取不少于1g的被检测样品进行1：10的稀释，取10ml或相当于1g或1ml的数量接种到一定数量（根据 “检测方法适用性”项下的描述确定）的大豆酪蛋白消化肉汤上，混匀。当检测透皮贴剂时，用无菌过滤膜过滤相当于1剂待测样品容量的样品（见非无菌产品微生物检查：微生物计数检查中制备样品项下透皮贴剂的描述），接种到100ml大豆酪蛋白消化肉汤上，在30°-35°培养18-24h。
选择和继代培养：用甘露醇盐琼脂在30°-35°传代培养18-72h。 说明：如果有被黄色区域包围的黄色或白色菌落生长则表示有金黄色葡萄球菌存在的可能性，通过鉴别试验确定。
如果没有所描述的菌落生长或核实性的鉴别试验呈阴性，表示产品符合试验标准。
梭状芽胞杆菌
样品准备和预培养：照“非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述，取不少于2g或2ml的被检测样品进行1：10的稀释(最小总体积为20ml)，将样品分为2份，每份最少应为10ml。一份在80℃加热 10分钟后迅速冷却，一份不加热。
选择和继代培养：两份样品各取10ml或相当于1g或1ml的数量接种到一定数量（根据 “检测方法适用性”项下的描述确定）的梭状芽胞杆菌强化培养基上。在无氧条件下以30°-35°培养48h。培养结束后，用哥伦比亚琼脂在无氧条件下以30°-35°传代培养48-72h。
说明：出现无氧生长的对过氧化氢酶显阴性反应的杆状菌（有或无内孢子）表示有梭状芽胞杆菌存在。通过鉴别试验确定。
如果没有所描述的菌落生长或核实性的鉴别试验呈阴性，表示产品符合试验标准。
白色念珠菌
样品准备和预培养：照“非无菌产品微生物检查：微生物计数检查”所述，取10ml或不少于相当于1g或1ml样品量的样品接种到100ml沙氏葡萄糖肉汤上，，混合，在30°-35°培养3-5天。
选择和继代培养：用沙氏葡萄糖琼脂在30°-35°传代培养24-48h。 说明：出现白色菌落表示有白色念珠菌存在的可能，这通过鉴别试验确定。 如果没有所描述的菌落生长或核实性的鉴别试验呈阴性，表示产品符合试验标准。
推荐的溶液和培养基
注：该部分给出了一些信息
以下溶液和培养基在检测药典对其规定的微生物污染时是令人满意的。在证明其适用性后也可以使用其他的培养基。
备用缓冲溶液：取34g磷酸二氢钾，置1000ml 容量瓶中，用500ml纯化水
溶解，用氢氧化钠调节PH至7.2±0.2，再加纯化水至刻度线，混匀。分装于适宜的容器中，灭菌。在2-8℃存放。
PH为7.2的磷酸盐缓冲液：用备用缓冲溶液与纯化水混合（体积比1：800 ），灭菌。
以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。
调节PH值，使其灭菌后在25°时PH值为7.3±0.2。以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。
调节PH值，使其灭菌后在25°时PH值为7.3±0.2。以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。
调节PH值，使其灭菌后在25°时PH值为5.6±0.2。以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。
调节PH值，使其灭菌后在25°时
PH值为5.6±0.2。以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。
调节PH值，使其灭菌后在25°时PH值为5.6±0.2。以验证过的周期在高压蒸
气灭菌器灭菌。
调节PH值，使其加热后在25°时PH值为7.2±0.2。100℃加热30分钟，然后立即冷却。
调节PH值，使其加热后在25°时PH值为7.4±0.2。加热至沸腾，不能用高压釜加热。
调节PH值，使其灭菌后在25°时PH值为7.3±0.2。以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。
调节PH值，使其灭菌后在25°时PH值为7.1±0.2。煮沸1分钟并不断振摇，然后以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。
溶解，缓缓加热，不超过115℃以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。使其在
加热及灭菌后在25°时PH值为5.2±0.2。
调节PH值，使其加热后在25°时PH值为7.4±0.2。加热至沸腾，冷却到 50°，倒入皮氏培养皿中。不能用高压釜加热。
加热至沸腾，保持沸腾1分钟并不断振摇。调节PH值，使其灭菌后在25°时PH值为7.2±0.2。以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。
加热至沸腾，保持沸腾1分钟并不断振摇。调节PH值，使其灭菌后在25°时PH值为7.4±0.2。以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。
使琼脂水合化，加热至沸腾并不断搅拌使其溶解。如果需要，调节PH值，使其灭菌后在25°时PH值为6.8±0.2。以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。
使琼脂水合化，加热至沸腾并不断搅拌使其溶解。如果需要，调节PH值，使其灭菌后在25°时PH值为7.3±0.2。以验证过的周期在高压蒸气灭菌器灭菌。冷却至45°-50°，如果需要，加相当于20mg庆大霉素的硫酸庆大霉素，并倒入皮氏培养皿。
