影子爱人34247092
范文一：AP2EREBP 转录因子的结构与功能
中国农学通报第２２卷第２期２００６年２月
：／／ｚｎｔｂ．ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．
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ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ转录因子的结构与功能
韩志萍
１，２
，安利佳２，侯和胜
１
２
（１辽宁师范大学生命科学学院，大连１１６０２９；大连理工大学环境与生命学院，大连１１６０２３）
摘要：ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ是植物所特有的一类转录因子。ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ家族成员在结构上有共同的特点：每个成员都含有由６０个左右氨基酸组成的非常保守的ＤＮＡ结合域（即ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域）。含有发育以及多种生理生化反应ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域的转录因子在植物中广泛存在，并且参与植物的生长、
的信号转导，如：花器官形成、抗病、抗逆、激素响应（乙烯）等。在此，主要介绍了植物转录因子
ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ家族的结构及其功能的研究进展。
关键词：ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ家族；转录因子中图分类号：Ｑ８１
文献标识码：Ａ
ＴｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆＡＰ２／ＥＲＥＢＰＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒｓ
ＨａｎＺｈｉｐｉｎｇ１，２，ＡｎＬｉｊｉａ２，ＨｏｕＨｅｓｈｅｎｇ１
（１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬｉａｏｎｉｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ１１６０２９；
２
ＳｃｈｏｏｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ＆ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｉａｎ１１６０２３）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅＡＰ２／ＥＲＥＢＰｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓａｒｅｋｎｏｗｎｔｏｂｅｕｎｉｑｕｅｉｎｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｅｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｉｓ
ｆａｍｉｌｙｈａｖｅａｍｏｎｆｅａｔｕｒｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ａｌｌｔｈｅｍｅｍｂｅｒｓｃｏｎｔａｉｎｏｎｅｏｒｔｗｏｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓ（ｎａｍｅｌｙＡＰ２／ＥＲＥＢＰｄｏｍａｉｎ），ｗｈｉｃｈｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆａｂｏｕｔ６０ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＴｈｅＡＰ２／ＥＲＥＢＰｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｅｘｉｓｔｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｉｎｐｌａｎｔｓ，ａｎｄｔｈｅｙｉｎｖｏｌｖｅｉｎｇｒｏｗｔｈ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｉｎｍａｎｙｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ｆｏｒｉｎｓｔａｎｃｅ：ｆｌｏｒａｌｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｐａｔｈｏｇｅｎａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｏｒｈｏｒｍｏｎｅ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ）ｒｅｓｐｏｎｓｅａｎｄｓｏｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗ，ｗｅｍａｉｎｌｙｉｎｔｒｏｄｕｃｅｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡＰ２／ＥＲＥＢＰｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＡＰ２／ＥＲＥＢＰｆａｍｉｌｙ，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ转录因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ），又称反式作用因子，是指能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的ＤＮＡ结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录起始，或者参与决定基因在何种组织与何种发育阶段开始转录，或者参与基因应答外界环境因素所诱导的转录等［１，２］。典型的转录因子的功能域由ＤＮＡ结合域（ＤＮＡ—ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ）、转录调控域（ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ）、寡聚化位点（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓｉｔｅ）和核定位信号（ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ，ＮＬＳ）等四个功能域组成。转录因子通过这些功能区域与启动子顺式作用元件或与其它转录因子的功能区域相互作
基金项目：辽宁省科技基金项目“基因工程关键技术的研究”（２００１１０１００１）。
第一作者简介：韩志萍，女，１９８０年出生，满族，辽宁沈阳人，在读硕士研究生。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈａｎｚｈｉｐｉｎｇ２００３＠ｙａｈｏｏ．．。通信地址：１１６０２４大连理工大学西
用来调控基因的转录表达。植物体内存在大量的转录
因子，拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）仅含有２７０００个基因，其中就有５．９％的基因是编码转录因子的。根据其ＤＮＡ结合域的特点可以把转录因子分成若干个家族，如ＷＲＫＹ，ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ，ＭＹＢ，ｂＺＩＰ等。其中ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ转录因子家族是植物所特有的一类转录因子，在拟南芥中该家族至少有１４４个成员，近年来已经从多种植物中如：拟南芥［３］、烟草［４］、水稻［５］、玉米［６］、番茄［７］等分离出来。最近笔者又从野生葡萄（Ｖｉｔｉｓａｅｓｔｉｖａｌｉｓ）中分离出了ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ类转录因子（图１）。这类转录因子在植物的生长、发育以及多种生理生化反应的信号转导中发挥重要的作用。
山第８宿舍１１６室。
通讯作者：侯和胜，男，１９５５年出生，辽宁丹东人，博士学历，教授，从事植物生理与分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｅｓｈｅｎｇ＿ｈｏｕ＠１２６．。收稿日期：２００５－１１－０８，修回日期：２００５－１１－１６。
ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｌｅｔｉｎＶｏｌ．２２Ｎｏ．２２００６Ｆｅｂｒｕａｒｙ
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１
ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ
家族的结构１．１ＤＮＡ结合域
ＤＮＡ结合域是指转录因子识别顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸序列。相同类型转录因子ＤＮＡ结合域的氨基酸序列较为保守，所以这段氨基酸序列决定了转录因子的特异性。ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域最初是在拟南芥ＡＰＥＴＡＬＡ２［３］和烟草ＥＲＥＢＰ［４］中得到确认的。ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ家族成员在结构上有一个共同的特
点：各成员都至少含有一个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域（ＡＰ２／ＥＲＥＢＰｄｏｍａｉｎ）（图２）。ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域是一个由大约６０个氨基酸残基组成的非常保守的ＤＮＡ结合区，而且在其Ｎ－端部分存在一个碱性亲水区，含有３个反平行的β－折叠，这３个β－折叠在识别顺式作用元件中具有重要作用。每个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域有２个保守序列块（ｂｌｏｃｋ）：ＹＲＧ元件和ＲＡＤＹ元件。ＹＲＧ元件由１９￣２２个氨基酸残基组成，是极碱
性的，含有保守的ＹＲＧ氨基酸基序（ｍｏｔｉｆ）；ＲＡＹＤ元件含有４２￣４３个氨基酸，其中有一个由１８个氨基酸
残基组成的高度保守的核心序列，这一序列能够形成一个两亲性的α－螺旋，可能参与ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ转录因子与其它转录因子或ＤＮＡ的相互作用［８，９］。
根据ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域的数量，可以把ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ转录因子家族分成两个亚家族：亚家族Ⅰ－无花瓣基因２（ＡＰＥＴＡＬＡ２）：含有两个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域，如ＡＰＥＴＡＬＡ２、ＡＩＮＴＥＧＶＭＥＮＴＡ［１０］和ＧＬＯＯＳＹ１５［６］。这个亚家族的成员都含有一个保守的
ＷＥＡＲ／ＷＥＳＨ氨基酸序列基元，位于两个
ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域的ＹＲＧ元件中；另外，它们还具有含２５￣２６个氨基酸残基的接头区（ｌｉｎｋｅｒ）。该接头区位于两个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域之间。亚家族Ⅱ－乙烯应答元件结合蛋白ＥＲＥＢＰ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）：含有一个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域，如ＥＲＥＢＰｓ［４］、ＴＩＮＹ［１１］、ＣＢＦ１［１２］、Ｐｔｉｓ［７］、ＡｔＥＢＰ［１３］、ＤＲＥＢ１、ＤＲＥＢ２［１４］和Ｔｓｉ［１５］等。该亚家族成员都含有一个保守的由７个氨基酸残基组成的序列基元—ＷＡＡＥＩＲＤｂｏｘ［８］。
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另外，拟南芥ＲＡＶ１和ＲＡＶ２蛋白含有两个ＤＮＡ结合基序：一个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域和一个类似Ｂ３的结构域。ＲＡＶ１结合到双重识别序列上：ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域与ＣＡＡＣＡ基序结合，Ｂ３域与ＣＡＣＣＴＧ序列结合。ＲＡＶ１和ＲＡＶ２蛋白的ＤＮＡ结
合域与ＡＰ２亚家族和ＥＲＥＢＰ亚家族的ＤＮＡ结合域都不太相同，因此，ＲＡＶ１和ＲＡＶ２蛋白可被认为是ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ蛋白的第三个亚家族［１６］（表１）。１．２其它结构域
蛋白质的表达、翻译是在细胞核外进行的，而转录
是在核内完成的，因此转录因子在核外翻译、包装后，
需要在核定位信号的介导下定位到核内，进行转录调控。经过对部分ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ蛋白（如：Ｔｓｉ、ＤＲＥＢ１、ＤＲＥＢ２等）氨基酸序列的分析发现，在ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域之外，多在Ｎ－端区域有一段碱性的核定位信号－ＫＫＲＲ，与猿猴［肾］病毒４０的核定位信号相似，属于单基元核定位信号，调控转录因子进入细胞核。有一些ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ蛋白在Ｃ－端区域，如：ＡｈＤＲＥＢ［１７］、ｍａＤＲＥＢ［１８］、ＥＲＥＢＰ－３［１９］或者在Ｎ－端区域，如：ＯｓＤＲＥＢＬ［２０］、ＥＲＥＢＰ－１、ＥＲＥＢＰ－２、ＥＲＥＢＰ－４［１９］，还有酸性氨基酸区，被认为可能是转录激活域，对转录有激活作用。在ＡｔＥＲＦ５的Ｃ－端区，有保守的ＭＡＰ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ，促分裂原活化蛋白）激酶磷酸化位点－ＰＸＸＳＰＸＳＰ［２１］。ＭＡＰ激酶是一类保守的丝氨酸／苏氨酸类蛋白激酶，能引起植物细胞对内外刺激的生理生化反应。
２ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ蛋白与目标ＤＮＡ的结合２．１ＥＲＥＢＰ类蛋白与目标ＤＮＡ的结合
ＥＲＥＢＰ类转录因子亚家族中ＥＲＦ类蛋白能特异性地结合于ＧＣＣ盒（ＧＣＣ－ｂｏｘ）顺式作用元件上。ＧＣＣ盒存在于很多编码与致病有关（ｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｓｒｅｌａｔｅｄ，ＰＲ）蛋白质基因的启动子区域，乙烯常常诱导这些基因的表达。植物受到病源菌侵袭后，乙烯生物合成量迅速增加，然后乙烯通过ＧＣＣ盒激活一系列下游的ＰＲ基因（如：β－１，３葡聚糖酶、几丁质酶）。ＧＣＣ盒由１１个碱基组成，其核心序列为ＧＣＣＧＣＣ，因此而得名。系统的ＤＮＡ突变分析证明特异的氨基酸接触限制在ＧＣＣ盒的ＧＣＣＧＣＣ区段，而且第一个Ｇ，第四个Ｇ和第六个Ｃ的结合特异性最高，Ｇ１、Ｇ４和Ｃ６这三个位点的碱基发生替换可引起结合亲和性大幅降低，而ＧＣＣ盒中其它的碱基对于不同的蛋白其结合特性是不断变
化的［２２］。
ＥＲＦ蛋白是以单体的形式通过β－折叠结合到ＧＣＣ盒的大沟上的。ＭａｒｋＤ．Ａｌｌｅｎ等［２３］利用ＮＭＲ确定了拟南芥ＧＣＣ－ｂｏｘ结合域与其靶ＤＮＡ片段复合体的３Ｄ结构，该结合域由３个反平行的β－折叠和一个与β－折叠近似平行的α－螺旋组成。β－折叠中的精氨酸和色氨酸残基与大沟里９个连续碱基中的８个相接触，同时也与磷酸－糖骨架（ｂａｃｋｂｏｎｅ）结合。而α－螺旋只有一个残基结合到磷酸上，没有与碱基结合。锌指蛋白ＳＷ１５的第一个锌指的二级结构元件（ｅｌｅｍｅｎｔ）的排列与ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域的排列相同。不过，锌指是通过α－螺旋结合到ＤＮＡ上，而不是β－折叠。在ＡｔＥＲＦ中，Ｔｒｐ１５４和Ｔｒｐ１７２的芳香环分别与靶ＤＮＡ的Ｔ３、Ｔ４和Ｇ５、Ｇ６发生疏水性的相互作用，这些相互作用覆盖了保守的ＡＧＣＣＧＣＣ序列中的６个碱基，并且因此通过ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域对ＧＣＣ盒进行特异的识别。除了Ａｒｇ１５２之外，所有与碱基接触的Ａｒｇ和Ｔｒｐ残基还通过与磷酸的离子间相互作用或者与糖类之间疏水性的相互作用结合到磷酸－糖骨架上。
ＤＲＥＢ类蛋白特异地与ＣＲＴ／ＤＲＥ元件结合。在ｒｄ２９Ａ的启动子区确定了一个负责干旱、高盐和低温诱导表达的顺式作用元件－ＤＲＥ（ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｐｏｎ－ｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ）：ＴＡＣＣＧＡＣＡＴ。类似的顺式作用元件有ＣＲＴ（Ｃ－ｒｅｐｅａｔ）、ＬＴＲＥ（ｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅ－ｍｅｎｔ）等，在许多干旱和低温胁迫诱导基因的启动子区都有这一序列，并且都含有ＣＣＧＡＣ核心基序，把这一类顺式作用元件统称为ＣＲＴ／ＤＲＥ元件。ＹｏｈＳａｋｕｍａ等［２４］利用单碱基替换的ＤＲＥ序列为底物进行凝胶阻滞法（Ｇｅｌｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）证明了ＤＲＥ的核心序列是Ａ／ＧＣＣＧＡＣ，而且ＤＲＥ的第四个Ｃ，第五个Ｇ和第
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七个
Ｃ对于其与ＤＲＥＢ蛋白高度特异的相互作用是非常必要的。同时利用突变的ＤＲＥＢ蛋白进行凝胶漂移分析（Ｇｅｌｍｏｂｉｌｉｔｙｓｈｉｆｔａｓｓｙ），结果表明ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域内位于β－折叠上的保守的１４位缬氨酸和１９位谷氨酸，特别是缬氨酸，在与ＤＮＡ结合中有重要作用。ＱｉｎＦｅｎｇ等［１８］的实验再一次证明了这一点，他们对玉米ｍａＤＲＥＢ１蛋白１４位和１９位的氨基酸进行单点突变和双点突变试验，发现１４位的缬氨酸突变为丙氨酸后，ｍａＤＲＥＢ１几乎丧失了其转录激活的能力，１９位的谷氨酸突变为天冬氨酸后，ｍａＤＲＥＢ１的转录激活能力也受到很大影响。
２．２ＡＰ２亚家族与目标ＤＮＡ的结合
关于含有两个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域的ＡＰ２亚家族的ＤＮＡ结合特性要比含有一个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域的ＥＲＥＢＰ亚家族的ＤＮＡ结合特性研究得稍晚一些。Ｓｔａｃｉ等［１６］人对ＡＰ２亚家族成员ＡＮＴ与ＤＮＡ结合的研究是第一篇有关ＡＰ２亚家族蛋白ＤＮＡ结合性的报道。利用随机寡核苷酸体外选择方法（ｒａｎｄｏｍｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｉｎｖｉｔｒｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ），以ｃ－ｍｙｃｅｐｉ－ｔｏｐｅ－ｔａｇ为标记，确定了ＡＮＴ结合的最佳的ＤＮＡ序列：５’－ｇＣＡＣ（Ａ／Ｇ）Ｎ（Ａ／Ｔ）ＴｃＣＣ（ａ／ｇ）ＡＮＧ（ｃ／ｔ）－３’，这一序列要比含有一个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域的蛋白所识别的位点序列（ｓｉｔｅ）长，表明ＡＮＴ的两个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域都接触了ＤＮＡ，这两个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域对于ＡＮＴ结合ＤＮＡ是必需的。ＡＮＴ是以单体的形式与这些ＤＮＡ序列结合的。但是在高蛋白浓度时，也观察到了较高级的复合体。ＡＮＴ所识别的序列中ＣＣ（ａ／ｇ）ＡＮ基序与ＥＲＥＢＰ亚家族成员结合的ＣＲＴ／ＤＲＥ元件的核心序列ＣＣＧＡＣ相似。Ｓｔａｃｉ等提出，ＡＮＴ第一个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域与５’端的ｇＣＡＣ（Ａ／Ｇ）结合，而第二个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域则是与偏３’端的ｃＣＣ（ａ／ｇ）Ａ结合。每个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域可能都会如ＥＲＦ１的
ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域那样结合在ＤＮＡ的大沟里。两个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域之间的接头区跨越大沟间的距离。所有类似ＡＰ２蛋白中的接头区都是保守的，表明这一区段具有重要的功能，可能是定向两个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ结合域对ＤＮＡ的结合，或者其本身也会有选择地接触ＤＮＡ。
虽然ＡＮＴ（ＡＰ２ｓｕｂｆａｍｉｌｙ）和ＡｔＥＲＦ以及ＤＲＥＢ（ＥＲＥＢＰｓｕｂｆａｍｉｌｙ）所识别的ＤＮＡ序列有所差别，但是通过对比发现，它们所结合的ＤＮＡ序列中都含有类似的ＣＣＧ核心。这一核心序列可能对ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ蛋白与ＤＮＡ特异地结合有重要作用。３ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ蛋白的功能
３．１与植物发育有关的ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ蛋白
参与植物发育的ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ蛋白主要是ＡＰ２转录因子亚家族的成员。ＡＰ２亚家族的基因如ＡＰＥＴＡ－ＬＡ２（ＡＰ２）、ＡＩＮＴＥＧＵＭＥＮＴＡ（ＡＮＴ）和Ｇｌｏｓｓｙ１５主要在调节植物花序分生组织形成和调控细胞的生长发育中起作用，它们在有性和无性发育过程中都是有活性的。ＡＰ２主要参与花器官特性的特化，花分生组织特性的确立，对花分生组织不确定性（ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｃｙ）的抑制和胚珠与种皮的发育［８］。最近又发现ＡＰ２对种子质量（ｓｅｅｄｍａｓｓ）有调控作用［２５］。实验结果表明功能缺失的ａｐ２（ａｐ２－６、ａｐ２－７、ａｐ２－１１）突变体会引起种子大小和数量的增加。进一步研究发现，ａｐ２突变体引起种子发育期间己糖与蔗糖比例的改变，从而阐明了ＡＰ２通过其对糖代谢的影响来调控种子质量的可能性。拟南芥ＡＩＮＴＥＧＵＭＥＮＴ基因在不同花发育过程中发挥重要作用，包括胚珠发育、花器官的起始和发育以及花瓣的发育等。在转基因的拟南芥和烟草中，ＡＩＮＴＥＧＵＭＥＮＴＡ的异位表达可导致植物器官（包括种子）变大［２６］。
另外，属于ＥＲＥＢＰ亚家族的ＥＲＦ类蛋白也参与
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调节植物的生长、发育。ＨｕｉＳＨＥＮ等［２７］利用酵母单杂交方法从水稻ｃＤＮＡ表达文库中克隆了ＥＲＦ类蛋白－ＯｓＥＢＰ－８９基因。ＯｓＥＢＰ－８９不但在胚乳中表达，维管束韧皮部也有表达，而且在靠近ＲＳＴ（ｒｏｏｔａｎｄｓｔｅｍｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｒｅｇｉｏｎ）、茎节和居间分生组织部分表达水平比较高。由此推断ＯｓＥＢＰ－８９可能会在胚乳细胞和茎部组织的淀粉积累中发挥重要作用。
３．２参与对环境因子或胁迫应答的ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ蛋白
ＥＲＥＢＰ转录因子（如ＴＩＮＹ、ＣＢＦ１、Ｐｔｉｓ、ＡｔＥＢＰ、
［２８］
ＤＲＥＢ１、ＤＲＥＢ２）主要调节植物对激素（乙烯）、病原［１５］、低温、干旱及高盐［１４］等的分子应答反应（图３）。
杨酸、乙烯、茉莉酮酸甲酯和创伤等诱导，Ｊｅｏｎｇ等［１６］从
烟草中分离出编码一个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰＤＮＡ结合蛋白的基因－Ｔｓｉ１基因（Ｔｏｂａｃｃｏｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅ１）。Ｔｓｉ１基因特异地与ＧＣＣ盒和ＤＲＥ／ＣＲＴ元件结合，不过与ＧＣＣ盒结合的强度要比与ＤＲＥ／ＣＲＴ元件结合的强度大。在转基因烟草中，Ｔｓｉ１基因的超表达激活一些ＰＲ基因（ＰＲ１、ＰＲ２、ＰＲ３）的表达，提高了植株对盐胁迫和细菌的耐受能力。刘文奇等［３１］利用渗透调节蛋白基因启动子中含ＧＣＣ盒的序列，采用酵母单杂交的方法获得了一个ＥＲＦ类基因－ＯＰＢＰ１基因。经对转入ＯＰＢＰ１基因的烟草分析后发现增强ＯＰＢＰ１的表达能提高烟草的抗盐能力。
野生葡萄具有很高的抗病性和胁迫耐性。从葡萄Ｖ．ａｅｓｔｉｖａｌｉｓｖａｒ叶片组织的ｃＤＮＡ文库中，笔者筛选出４个编码ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ类转录因子的基因—ＶａＥＲＦ３ａ、ＶａＥＲＦ３ｂ、ＶａＥＲＦ４和ＶａＥＲＦ５，非胁迫条件下，在叶片、茎尖、花序及根部都有主动表达。这４个转录因子可能与葡萄植株的抗病性有关，笔者下一步研究目标就是探究其在胁迫和应答病源侵袭情况下的表达水平，以及通过超量表达和沉默来确定它们的功能。４展望
一个转录因子可同时激活多个功能基因的表达，导入或改良一个关键的转录因子，促使多个功能基因发挥作用，从而提高植株的综合品质，因此转录因子在植物分子育种中具有巨大的潜在价值和广阔的应用前景。ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ家族转录因子是植物特有的一类转录因子，参与植物多种基因的表达，能调节植物对病原、低温、干旱及高盐等的分子应答反应，提高作物对逆境胁迫的耐受作用。目前对ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ家族作用的分子机制还不是非常清楚，还需要进一步研究。随着人们对ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ转录因子认识的逐渐深入，ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ转录因子必将在植物分子改良中得到广泛的应用。
参考文献
崔凯荣，戴若兰．植物体细胞胚发生的分子生物学．北京：科学出版社，２０００．１７９
李洁．植物转录因子与基因调控．生物学通报，２００４，３９（３）：９￣１１ＪｏｆｕｋｕＫＤ，ＤｅｎｂｏｅｒＢＧＷ，ＶａｎｍｏｎｔａｇｕＭ，ｅｔａｌＣｏｎｔｒｏｌｏｆＡｒａ－ｂｉｄｏｐｓｉｓＦｌｏｗｅｒａｎｄＳｅｅｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｙｔｈｅＨｏｍｅｏｔｉｃＧｅｎｅＡＰＥＴＡＬＡ２．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１９９４，６（９）：１２１１￣１２２５４
Ｏｈｍｅ－Ｔａｋａｇｉ，ＳｈｉｎｓｈｉＨ．Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｔｈａｔｉｎｔｅｒａｃｔｗｉｔｈａｎｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１９９５，７（２）：１７３￣１８２５
ＷｅｉｇｅｌＤ．ＴｈｅＡＰＥＴＡＬＡ２ｄｏｍａｉｎｉｓｒｅｌａｔｅｄｔｏａｎｏｖｅｌｔｙｐｅｏｆＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１９９５，７（４）：３８８￣３８９
ＤＲＥＢ转录因子在植物抗逆响应中起关键作用，可激活一系列的抗逆功能基因的表达，提高植株的抗逆性。目前已从拟南芥、水稻、大豆等植物中分离出ＤＲＥＢ转录因子。拟南芥ｒｄ２９Ａ基因编码一种与ＬＥＡ蛋白相似的亲水性很强的蛋白，该基因的表达受干旱、高盐及低温的诱导。ｒｄ２９Ａ基因启动子区域中，有两个与上述环境胁迫应答有关的ＤＲＥ顺式作用元件（ＴＡＣＣＧＡＣＡＴ）［２９］。刘强等［１４］利用ｒｄ２９Ａ基因启动子的ＤＲＥ顺式作用元件和酵母单杂交方法从拟南芥中分离出５个ＤＲＥＢ转录因子。根据诱导条件将其分成两大类：低温诱导的ＤＲＥＢ１（ＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ１Ｂ、ＤＲＥＢ１Ｃ）和高盐和干旱诱导的ＤＲＥＢ２（ＤＲＥＢ２Ａ、ＤＲＥＢ２Ｂ）。在转入ＤＲＥＢ１Ａ基因的植株中，由于ＤＲＥＢ１Ａ的超表达，植株对干旱及低温的耐性大大增强。Ｓｈｅｎ等［１７］从经高盐浓度处理的盐生植物山菠菜（Ａｔｒｉｐｌｅｓｈｏｒｔｅｎｓｉｓ）中分离出编码ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ类蛋白的基因－ＡｈＤＲＥＢ１，转入到烟草中，结果ＡｈＤＲＥＢ１在烟草中的超表达明显地提高烟草的耐盐性。Ｃｈｅｎｊｉａｎｑｕａｎ等人［２０］用斑点杂交方法从水稻中克隆了一个ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ基因－ＯｓＤＲＥＢＬ，ＯｓＤＲＥＢＬ受低温诱导，而不受ＡＢＡ、高盐和干旱的诱导，是一种新的冷诱导的不依赖ＡＢＡ的ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ转录因子。ＣＢＦ３是一个重要的调节基因。Ｇｉｌｍｏｕｒ等［３０］研究发现ＣＢＦ３能引起脯氨酸以及可溶性糖如：蔗糖、棉白糖、葡萄糖和果糖的积累，提高植株对多种逆境的抗性（低温、干旱、高盐）。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析表明在ＣＢＦ３转基因植株中，脯氨酸合成的关键酶－吡咯５羧酸合成酶（Δ－ｐｙｒｒｏ－ｌｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，Ｐ５ＣＳ）的转录物水平比非转基因植株提高了４倍。
ＥＲＦ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ－ｅｌｅｍｅｎｔ－ｂｉｎｄｉｎｇｆａｃ－ｔｏｒ）是植物所特有的一类转录因子，属于ＥＲＥＢＰ亚家族，主要参与调节植物的生长、发育以及抗胁迫等过程。ＥＲＦｓ（烟草）、Ｐｔｉ４、Ｐｔｉ５、Ｐｔｉ６（番茄）、ＴＩＮＹ、ＡｔＥＢＰ（拟南芥）等都是编码该类蛋白的基因。通过盐胁迫、水
ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｌｅｔｉｎＶｏｌ．２２Ｎｏ．２２００６Ｆｅｂｒｕａｒｙ
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６
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３１ＬｉｕＷＱ，ＣｈｅｎＸＪ，ＸｕＸＨ，ｅｔａｌ．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎＥＲＦＴｒａｎ－ｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ，ＯＰＢＰ１ＧｅｎｅＥｎｈａｎｃｅｓＳａｌｔＴｏｌｅｒａｎｃｅｉｎＴｏｂａｃｃｏ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００２，２８（６）：４７３￣４７８
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致谢：感谢大连理工大学环境与生命科学院的苏乔老师和吴淞博士对本文的热情指导。
１９ＭａｓａｒｕＯｈｍｅ－ＴａｋａｇｉａｎｄＨｉｄｅａｋｉＳｈｉｎｓｈｉ．Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ＩｎｄｕｃｉｂｌｅＤＮＡＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎｓＴｈａｔＩｎｔｅｒａｃｔｗｉｔｈａｎＥｔｈｙｌｅｎｅ－ＲｅｓｐｏｎｓｉｖｅＥｌｅ－ｍｅｎｔ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１９９５，７（２）：１７３￣１８２
（责任编辑：回文广）
２０ＣｈｅｎＪＱ，ＤｏｎｇＹｉ，ＷａｎｇＹＪ，ｅｔａｌ．ＡｎＡＰ２／ＥＲＥＢＰ－ｔｙｐｅｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ｔｉｏｎ－ｆａｃｔｏｒｇｅｎｅｆｒｏｍｒｉｃｅｉｓｃｏｌｄ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅａｎｄｅｎｃｏｄｅｓａｎｕｃｌｅａｒ－ｌｏ－ｃａｌｉｚｅｄｐｒｏｔｅｉｎ．ＴｈｅｏｒＡｐｐｌＧｅｎｅｔ，２００３，１０７：９７２￣９７９
范文二：WRKY转录因子功能的多样化
文章编号 ：１００４－０３７４（２０１０）０４－０３４５－０７
ＷＲＫＹ转录因子功能的多样化
于延冲，乔 孟，刘振华，向凤宁＊
(山东大学生命科学学院植物细胞工程与种质创新教育部重点实验室，济南 250100)
摘 要：WRKY 是植物中一类重要的转录因子家族，其共同的特点是含有高度保守的核心氨基酸序列
WRKYGQK ，在C-末端有一个锌指结构。WRKY 受到病原菌、损伤、SA(salicylic acid) 等因子的诱导后表达，特异性识别(T)(T)TGAC(C/T)序列(W-box)，调节基因的表达而参与许多生理过程，如抗病、损伤、生长发育以及衰老等。该文主要介绍了WR KY 的结构特点及其功能的研究进展。关键词：W R K Y ；W -b ox ；转录因子中图分类号：Q943.2 文献标识码：A
Diversification function of WRKY transcription factor
YU Yan-chong, QIAO Meng, LIU Zhen-hua, XIANG Feng-ning*
(Plant Cell Engineering and Germplasm Innovation Key Lab of Ministry of Education, Life Sciences School of Shandong
University, Jinan 250100, China)
Abstract: WRKY is a superfamily of transcription factors existing abroad in plants, containing a conservedWRKYGQK domain and having a zinc finger motif. The expression of WRKY is induced by pathogen, wounding,SA, etc. WRKY proteins regulate target genes’ expression via binding the (T) (T) TGAC (C/T) sequence (W-box)located in their promoter regions. WRKY proteins involved in many physiological processes, such as resistance,wounding, development, senescence. In this article, we primarily interpret their structure and review the currentprogresses on their functions.
Key words: WRKY; W-box; transcription factor
经过长期的进化，植物形成了一系列用于调节自身的生长发育、抵御生物和非生物胁迫逆境的机制，并有着复杂的过程。转录因子(DREB、NAC 、WRKY 、MYB 等) 在这一系列的调控中起重要的作用。
WRKY 转录因子是近年来在植物中发现的一类重要转录因子，在模式植物拟南芥中有75个成员，由于其N-末端含有高度保守的WRKYGQK 氨基酸序列而得名。1994年，Ishiguro 和Nakamura [1]在甘薯中发现了第一个WRKY 转录因子SPF1，随后又相继在野燕麦(A v e n a f a t u a ; A B F 1, 2) [2]、欧芹(Petroselinum crispum; Pc WRKY1,2,3) [3]、拟南芥(Arabidopsis thaliana ; ZAP1) [4]等植物中被发现。WRKY 结构域特异性识别W-box 顺式作用元件，与
之结合后会启动相关基因的表达来应答调控相关生
理过程，W-box 多存在于抗病相关基因的启动子区域，因此，人们对于WRKY 研究最多的就是它们的抗病相关机制。随着研究的不断发展深入，人们发现，WRKY 不仅参与植物的抗病，而且在损伤、衰老、发育、代谢物质调节等发面也都起到了重要的作用。到目前为止，人们对WRKY 的认识还处于起步阶段，对于该家族的功能及其机理研究尚需
收稿日期：2009-09-30；修回日期：2010-01-08基金项目：国家重大科学研究计划项目(2007CB948203);国家自然科学基金项目(30970243；30771116); 教育部博士点基金(913111006); 山东省杰出青年基金(QJ200810)＊通讯作者：Tel ：0531-88363629；E-mail ：xfn0990@sdu.edu.cn
346生命科学第２２卷
进一步地深入，WRKY 家族受到愈来愈多的关注。而对植物起到调节作用。
１ ＷＲＫＹ的结构
WRKY 家族最显著的特点就是至少含有一段大约60个氨基酸的WRKY 保守结构域，在该结构域的N-端，几乎所有的成员都有WRKYGQK 这样的7肽，由此得名为WRKY 。此外，在该结构域的C-端有一个新型的锌指结构：C 2-H 2或者C 2-HC 。
根据WRKY 结构域的数量和锌指结构的组成可以将WRKY 家族分成3类：I 类有两个WRKY 结构域，且有C X 4-5CX 22-23H X 1H 的锌指结构，比如SPF1、ABF1、At ZAP1、Pc WRKY1等。该类WRKY 的两个结构域起主要作用的是C-端的WRKY 结构域，而N-端WRKY 结构域的作用尚不清楚。II 类只有一个WRKY 结构域，其锌指结构同I 类，也是CX 4-5CX 22-23HX 1H ，大多发现的WRKY 都属于该类，比如At WRKY1、At WRKY17、At WRKY18、ABF2、Pc WRKY3、Nt WIZZ 等。该类的WRKY 结构域与I 类的N-端WRKY 结构域的相似性更高。III 类只有一个WRKY 结构域，但锌指结构特殊(CX7CX 23HX 1C) ，比如Nt WRKY4、Nt WRKY5、At WRKY53、At WRKY70等。
WRKY 结构域除了含有上述的结构外，还有核定位序列NLS ，亮氨酸拉链LZs 以及富含丝氨酸-苏氨酸，富含谷氨酰胺域和富含脯氨酸域等结构[5]。
３ ＷＲＫＹ的多样化功能
作为近些年来发现的植物特异性重要转录因子，WRKY 家族参与植物的众多生理过程并且起到了关键作用，WRKY 转录因子家族是非组成型表达的，它们受到许多因子的诱导，比如SA 、病原诱导子、衰老、损伤、非生物胁迫(干旱、低温) 等。另外，植物某些器官的发育以及体内物质的代谢(糖) 也受到WRKY 的调控。WRKY 转录因子的表达具有迅速、短暂的特点，并且具有组织特异性[5]。到目前为止，部分WRKY 家族基因在抗病、损伤、衰老、生长发育以及非生物胁迫等方面的转录调控作用已被发现(表1) ，它们的多样化功能分述如下。
３．１ ＷＲＫＹ在植物防御应答过程中的作用
植物受到病原菌的侵害后会启动自身免疫应答系统来防卫。免疫应答是一个错综复杂的过程，涉及众多抗病相关基因的转录表达，WRKY 转录因子在这个过程中起到了重要的转录调节作用。
近来，已从分子遗传水平上证明了拟南芥的WRKY 是防御转录子和抗病的重要调节子。Dong 等[38]研究了72个拟南芥的WRKY 转录因子在植物抗病方面的作用，发现其中的49个会受到病原菌Pseudomonas syringae pv tomato (Pst ) 和SA 的诱导而产生表达变化，进而调节相关基因的表达来参与拟南芥的抗病过程。At WRKY70是SA 和JA(jasmonicacid) 调节的防御信号途径的一个重要成员，它受到SA 的诱导和JA 的抑制，从而激活SA 诱导基因，抑制JA 响应基因，进一步地参与防御反应。当过表达AtWRKY70时，会增加拟南芥对Pst 的抗性，反之，如果抑制其表达，就会增加拟南芥对E. c. carotovora 的敏感性[9]。另外，NPR1是SA 依赖的系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR) 的一个关键调节子，一部分WRKY 转录因子是它的转录靶目标[10]，还有一部分位于它的上游来调节其表达[11]。At WRKY70即位于NPR1的下游，部分的受其调控[9]。类似地，At WRKY62也受NPR1调控，它负调JA 响应基因的表达，这种调节需要内源的NPR1和SA 的参与[12]，At WRKY62的这种调节作用说明它很可能也是一个抗病转录因子。 Zheng等[13]研究发现，过表达AtWRKY33会增加拟南芥对致死寄生真菌Botrytis cinerea和Alternaria brassicicola的抗性，但是过表达的AtWRKY33株系中，PR1基因
２ Ｗ－Ｂｏｘ
保守的W RK Y 结构域能特异性识别(T ) (T ) TGAC(C/T)序列，该序列称为W-Box ，其中TGAC 是其不变的核心。实验表明，该核心只要有一个氨基酸发生改变，WRKY 的结合性就会迅速下降，甚至完全消失，说明该核心对于WRKY 结合的必要性。另外，这种结合还需要Zn 2+等2价阳离子的参与以及磷酸化的过程[6]，这与WKRY 中的锌指结构是一致的，实验表明，EDTA 、碱性磷脂酶[7]、蛋白激酶抑制剂星形包菌素等能够抑制这种结合。W-Box 主要位于抗病相关基因的启动子区域，而且数量有一个至多个不等，它们的位置相近，呈同向或者回文结构排列，这些都有利于WRKY 的结合。比如欧芹的Pc WRKY1，其启动子有3个W-Box ，它们位置靠近，且Wb 和Wc 呈回文排列，提高了WRKY 与其结合的性能[3]。
由上得知，WRKY 主要是通过特异性识别W-Box ，启动调节相关基因的表达来应答各种诱导刺激，从
第４期于延冲，等：WRKY 转录因子功能的多样化347
表１ 部分ＷＲＫＹ家族基因在各个方面的研究状况
Name Pathogen Senescence Development Abiotic stress Reference & defense & Metabolism Wound Cold Drought Salinity AtWRKY6 AtWRKY17 AtWRKY33 AtWRKY38 AtWRKY44 AtWRKY53 AtWRKY70 AtWRKY75 AtWRKY5 OsWRKY11 OsWRKY13 OsWRKY71 OsWRKY45 NtTIZZ NtWIZZ GaWRKY1 HvWRKY38 Sthp-64 TcWRKY53
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*表示目前该基因相关研究尚未见报道
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√√
[28,29][17,48][48,49][19][32,33][24-27][9-30][34]*[43][22][21,35,36][23][22][39][37][45][44][50]
的表达下调，并且更容易受到细菌病原菌的侵害，表明它是通过下调SA 调节的PR1基因使得植株更容易受到细菌病原菌侵害的。AtWRKY52/RRS1是一个非典型的TIR-NBS-LRR R 蛋白，它通过识别Ralstonia solanacearum的III 型响应子PopP2而对它的几个菌株具有抗性[14]。At WRKY18、At WRKY40、At WRKY60是三个结构上非常相近的WRKY 转录因子，Xu 等[15]研究表明，它们在调节病原抗性方面具有很重要的作用，功能上是部分冗余的，双突变体Atwrky18/Atwrky40和Atwrky18/Atwrky60以及三突变体Atwrky18/Atwrky40/Atwrky60对Pst ．DC3000具有更高的抗性，但是更易受到寄生真菌B.cinerea 的侵染；但是，Wang 等[10]研究表明At WRKY18是SAR 的一个重要调节子，而At WRKY40似乎不参与SAR 。At WRKY4、At WRKY11、At WRKY17、At WRKY27、At WRKY38和At WRKY62则是拟南芥抗病性的6个负调节转录因子，过表达AtWRKY4的株系受到Pst. DC3000的侵染后会表现出比野生型更为严重的萎黄病，而Atwrky4突变体萎黄的程度要远低于野生型[16]；At WRKY11功能缺失突变体会增加对Pst 的抗性，而在Atwrky11/Atwrky17双突变体中，这种抗性会增加[17]；At WRKY27功能缺失突变
体对青枯菌(Ralstonia solanacearum) 表现出极强的耐受能力[18]；At WRKY38和At WRKY62是通过与组蛋白去乙酰化酶19的互作来负调节拟南芥的基本防御[19]。不仅在拟南芥中有抗病相关的WRKY 转录因子，其他的物种，如烟草、水稻等都有相关的报道。Yoda 等[20]从烟草中克隆得到的TIZZ 就是一个WRKY 转录因子，它能引发细胞的超敏反应，但是该转录因子的特点是不受到SA 的诱导，说明它是一个不依赖S A 的防御转录因子。在水稻中，Os WRKY71受到SA 、MeJA(methyl jasmonate)、ACC (1-aminocyclo-propane-1-carboxylic acid)、病原侵染的诱导表达，Os WRKY71的过表达植株增加了对细菌病原菌Xanthomonas oryzae pv． oryzae (Xoo ) 13751的抗性，而且该植株中的Os NPR1和Os PR1b 都持续表达，说明Os WRKY71是位于Os NPR1上游的一个转录因子[21]。Qiu 等[22]研究证明Os WRKY13能够调节SA 和JA 依赖途径中上游或下游的防御基因的表达来增加水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性。Os WRKY45受到abscisic acid (ABA)以及各种非生物胁迫(盐、旱、冷和渗透) 的诱导而高表达，同时也会受到病原菌侵染的诱导，过表达该基因的水稻株系增强了对盐、干旱的耐受力，同时也增加了对
348生命科学第２２卷
Pst. DC3000的抗性[23]。
总之，WRKY 是植物防御反应中的一个重要转录因子家族，它们通过不同的信号途径正调或者负调植物抗病相关基因，从而表达对植物的自我防卫起到了很大作用(图1) 。
３．２ ＷＲＫＹ在植物衰老过程中的作用
衰老是植物的一个自然生理过程，在这个过程中有很多转录因子和相关基因参与，植物特异性转录因子WRKY 的部分成员也参与了这个过程并且具有很重要的作用。
At WRKY53是一个叶片衰老早期阶段表达的转录因子[24]。Miao 等[25]研究发现，At WRKY53过表达的株系显示出了加速叶片衰老的现象，相反，在RNAi 和插入突变的At WRKY53抑制表达株系中，叶片衰老的出现时间被相对延迟。这表明At WRKY53在调节叶片衰老方面具有重要的作用。Murray 等[26]研究表明，At WRKY53是一个抗病性相关的重要调控因子，其功能缺失突变体更易受到Pst 的感染，反而对青枯菌却表现出较强的耐受力[27]。这说明了该转录因子在抗病调控过程中具有双重性(正调控和负调控) 。At WRKY6是另外一个衰老相关的重要转录因子，通过分析幼叶、成熟叶、衰老叶中A t W R K Y 6的表达水平发现，在衰老的叶子中，AtWRKY6的表达水平远远高于前两者[28]。SIRK 是一个受体类似蛋白激酶，它的表达水平在衰老的叶子中会特异的升高，Robatzek 和Somssich [29]研究表明，SIRK 是At WRKY6的直接目标，在SIRK 基因
的启动子区域，有多个W-box ，At WRKY6通过结合这些W-box 来调节SIRK 的表达，进一步来调节叶片衰老。另外，At WRKY6还是一个病原相关的转录因子，在AtWRKY6过表达和敲出系中，PR1的表达水平分别上调和下调了。不仅如此，前面介绍过At WRKY70是一个重要的病原防御转录因子，近来的研究表明，其同时也是一个衰老的负调节因子，AtWRKY70的功能缺失突变体会加速由正常发育和黑暗条件引起的衰老现象[30]。由此表明，WRKY 家族的功能具有多元化的特征。在分析小麦旗叶衰老的芯片信息中发现，WRKY 家族基因明显的上调表达[31]，说明WRKY 转录因子在小麦旗叶衰老方面也具有重要的作用。
３．３ ＷＲＫＹ在植物发育及代谢中的作用
一些研究还表明，WRKY 转录因子家族在植物生长发育及物质代谢方面也起到了非常重要的作用。
在拟南芥中，TTG2(TRANSPARENT TESTA GLABRA2)/At WRKY44是研究得比较透彻的一个与表皮毛和种皮发育相关的转录因子，它也是第一个被发现的与形态发生有关的W R K Y 转录因子。TTG2主要在表皮毛、种皮和根尖中表达，TTG1主要与表皮毛的起始发生有关，通过pTTG2::GUS在ttg1突变体中TTG2表达很低，可以说明TTG2位于TTG1的下游，且与GL2共同来调节表皮毛的分枝。ttg2突变体的表皮毛数量减半，且大部分不分枝(野生型大都三分枝) 。另外，种皮中丹宁酸和植物胶的生产也受到TTG2的调节，但是前者的调节是TTG1依赖的，而后者则不依赖。TTG2还可能控制非毛细胞的发育[32]。Ishida 等[33]通过酵母单杂交实验发现，在根中，TTG2直接由R2R3 MYB转录因子调节，他们还发现在TTG2表达受抑制的植株中，GLABRA2(GL2) 的表达与野生型相比，明显地下调，而GL2的下调会导致不正常形态的根毛的形成。这些研究说明了TTG2在拟南芥形态发生中起到了很重要的作用。At WRKY75是一个受病原菌诱导表达的转录因子，一些芯片信息证明了它也参与到衰老过程中，但最近的研究又发现，At WRKY75通过负调节侧根和根毛的生长来调节根的发育[34]。
Z h a n g 等[35]研究发现水稻糊粉层细胞中的Os WRKY71是一个GA 信号途径的抑制因子，它能与GA(Gibberellin)诱导的转录激活子Os GAMYB 相互作用，结合到α-淀粉酶基因Amy32b
启动子区域的
图１ ＷＲＫＹ病原防御简图
第４期于延冲，等：WRKY 转录因子功能的多样化349
W-box 结合，抑制它的转录。进一步的实验证明，另外一个ABA 诱导的转录因子Os WRKY51，虽然它本身不能与Amy32b 的启动子区域结合，但是它可以通过与Os WRKY71相互作用来增强Os WRKY71与Amy32b 启动子区域的结合，从而增强对Amy32b 转录的抑制[36]。Ga WRKY1是棉花中一个代谢相关的转录因子，它通过调节棉花(+)-δ-杜松烯合酶-A (CAD1-A)的活性来进一步调节倍半萜烯类的生物合成[37]。SUSIBA2是大麦的一个WRKY 转录因子，它能与糖代谢途径顺式作用原件SURE 结合，并与异淀粉酶基因ISO1启动子区域的W-box 结合，参与淀粉合成的调节，说明WRKY 转录因子有可能参与了碳水化合物的合成代谢[38]。
WRKY 在植物发育代谢方面的研究尚未深入，有待进一步地探索。
３．４ ＷＲＫＹ在非生物胁迫中的作用
实验表明，W R KY 家族在非生物胁迫(如损伤、干旱、冷、盐等) 条件下，表达也会发生特异变化。这说明它们在这些过程中也具有重要的作用，增强了植物适应复杂多变环境的能力。
烟草的WIZZ 是一个WRKY 转录因子，它在机械损伤10 min左右，表达开始上升，到达30 min时间达到峰值，随后下降到正常水平[39]。烟草的WRKY3和WRKY6受到机械损伤和虫害特异信号的诱导表达，进而潜在地或持久性地提高JA 的水平来增强烟草的虫害特异性防御力[40]。这表明了WRKY 也参与了机械损伤的应答。而Rizhsky 等[41]发现烟草中的另外一个WRKY 转录因子在干旱和热激共同作用时会上调表达，但是单一的干旱或热激却不会改变它的表达。干旱方面，Pnueli 等[42]从沙漠豆类灌草植物中也克隆得到了干旱胁迫相关的WRKY 基因。Wu 等[43]研究发现，OsWRKY11受到热激和干旱胁迫的诱导，并且在HSP101启动子的驱动下会增加水稻对热激和干旱的耐受力。对于冷胁迫，Huang 和Duman [44]从小癫茄中克隆了一个热滞(抗冻) 蛋白(sthp -64) 基因，它在小癫茄中的表达是在很冷的11月和12月份，说明了它在抗冷方面具有重要的作用，通过蛋白序列分析发现它是一个WRKY 转录因子。另外，低温条件下，大麦的Hv WRKY38会通过非ABA 依赖的途径早期暂时上调表达，但是在冰冻条件和干旱的条件下，该转录因子却会持续地上调表达，表明了它在非生物胁迫调节方面的作用[45]。Hwang 等[46]在分析辣椒中的基因在冷胁迫条件下的表达特性时也发现Ca WRKY1受冷胁迫诱导
表达。最新的研究表明，Ca WRKY1作为病原防御的负调控因子受到病原侵染和SA 的强烈诱导，在病原刺激减弱的时间调节SAR 的关闭[50]。盐胁迫是非常重要的非生物胁迫，WRKY 也参与了这一重要胁迫，Jiang 和Deyholos [48]在分析拟南芥根受到NaCl 胁迫后的综合转录特征时发现他们分析的35个WRKY 转录因子，有18个上调了至少1.5倍。通过qRT-PCR(定量RT-PCR) 分析发现，AtWRKY17和AtWRKY33上调至少14倍，而AtWRKY25上调了22倍之多。后来进一步研究发现，Atwrky25/Atwrky33双突变体表现出适度的盐敏感性，可能与该家族其他基因的功能冗余有关[49]。我们的研究表明，经200 mMNaCl诱导，AtWRKY71表达迅速暂时提高，10 min开始响应，到3 h达到峰值(5~6倍) ，随后下降。除此以外，过表达AtWRKY71后，拟南芥由营养生长转入生殖生长的进程加快，说明了该基因在发育方面也有作用(待发表) 。最新研究发现，天蓝遏蓝菜的Tc WRKY53不仅受到NaCl 、干旱、冷及SA 的诱导，重要的是，把它转入烟草以后，发现转基因的烟草幼苗根的发育对山梨醇的耐受力下降了，无山梨醇条件下，转基因植株和非转基因植株根的长度相似，在5%的山梨醇条件下，转基因植株和非转基因植株根的长度比对照(无山梨醇) 短了分别79%和58%，在5%山梨醇条件下，转基因的植株根比非转基因植株根短了50%。这说明了Tc WRKY53负调节渗透胁迫[50]。
植物随时都会受到各种非生物胁迫的影响，它们自身进化了一套完整的系统来调节应答，WRKY 转录调节是其中的一中重要的方式，但是，WRKY 在非生物胁迫方面的研究有待拓宽深入。
４ 展望
WRKY 是植物特异的重要转录因子，它们参与了植物的众多生理过程并且发挥了重要的作用，通过现有的转基因、RNAi 、基因芯片、反向遗传学等技术，人们已经鉴定并验证了许多WRKY 转录因子的功能，它们主要与植物的抗逆、衰老、发育、代谢等有关，但是对它们的作用机理及其功能的研究还处于初步阶段。随着时代的发展，科技的进步，将会有越来越多的新生物技术的出现，因此，WRKY 家族的作用机理及其功能会被逐步地阐明。它们在抗逆方面的重要作用，将为我们创制抗逆作物新品系提供重要基因资源。
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范文三：植物抗病性相关的WRKY转录因子的结构功能
植物抗病性相关的 WRKY 转录因子的结构功能
1植物抗病相关转录因子
转录因子 (transcription factor , TF) 是指能够直接或间接与启动子核心序列 TATA 盒特异结合,并启动转录的一类调节蛋白,通过调节目的基因的转录效率 来调控植物的生理生化过程。转录因子包含转录激活因子和转录阻遏因子两种, 是基因表达的重要调节因子。根据 DNA 结合区域的不同,如螺旋.环.螺旋、 锌指结构、螺旋.转角.螺旋和亮氨酸拉链结构等等,植物的转录因子可划分成 多个家族,如 NAC 家族、 MYB 家族、 WRKY 家族等。
转录因子在植物的抗病过程中起重要的作用。近年研究发现, ERF 、 MYB 、 WRKY 等家族中许多转录因子参与调控植物 JA 、 ET 、 SA 及不同病原菌侵染的 信号转导途径。在 ERF 家族中, ERFl 和 ORA59是 JA/ET信号途径的激活调控 因子,且 ERFl 基因过表达可以激活植物抗病相关基因 PDF1.2和几丁质酶合成 基因 ChiB 的表达, 增加植物对灰葡萄孢的抗性; ERF2、 ERFl4过表达也使 PDF1.2的表达水平增加, 而 ERFl4是 PDF1.2的负调控因子, 这些研究表明 ERF 家族中 的多数基因对植物抗病起负调控作用。在 MYB 家族中, MYB30与植物磷脂酶 相互作用,是拟南芥抗细菌的正调控因子; MYB72是拟南芥根部关键的调节因 子, 根际有益的细菌可诱导 MYB72表达, 激发拟南芥产生抗病性。 WRKY 蛋白 是近年来发现的植物特有的一类转录因子家族,在拟南芥中有 74个家族成员, 在水稻中有多于 100个家族成员, 参与生长发育、 叶片衰老等, 但主要功能是协 助植物对抗各种生物或非生物胁迫。
2 WRKY转录因子概述
WRKY 转录因子最初是 Ishiguro 从甘薯中分离得到。其后在野燕麦、皱叶 欧芹、拟南芥、烟草、水稻、沙漠豆科植物、鸭茅草、大麦、棉花、油菜当中克 隆到 WRKY 基因。 截止目前已经在 20多种高等植物以及一些低等正和生物如肠 兰波鞭毛虫、粘液菌盘基网柄菌、绿藻中发现该基因。 WRKY 家族的基因具有 锌指结构位点及 W?b ox 保守区域, WRKY38和 WRKY62是拟南芥抗细菌的负调 控因子, WRKY62通过调控 SA 和 JA 信号途径调节植物的抗病性,该基因功能 缺失促进 JA 信号途径基因的表达, 过表达则抑制 SA 信号途径基因 PR1的表达, 但 WRKY48基因过表达却与其结果相反。 WRKYl8、 WRKY40和 WRKY60的 部分功能缺失突变体对丁香假单胞杆菌更加敏感, 进一步研究发现 wrkyl8wrky40和 wrkyl8wrky60双缺失突变体对细菌的敏感性增强。 WRKY 家族基因在水稻、 辣椒、 番茄等作物中也参与了植物的抗病信号转导途径, 具有调控植物抗病反应 的作用。随着分子生物学技术的发展,转录因子的 DNA 结合位点及其互作蛋白 的研究及进一步完善植物的抗病信号转导途径成为人们的研究热点。
2.1 WRKY蛋白结构特征
WRKY 转录因子是一段具有 60个高度保守氨基酸区域的锌指蛋白, 在氨基 末端 (N端 ) 具有 WRKYGQK7个绝对保守的氨基酸序列,该区域被视为 WRKY 结构域的核心序列, 而在羧基末端 (C端 ) 具有锌指结构。 WRKY 转录因子家族根 据其 WRKY 结构域数量和锌指结构特征的不同被分为三组,其中第一组通常含 有两个 WRKY 域,第二和第三组仅含有一个域。大多数 WRKY 蛋白中仍然含 有基本的核定位信号区。 WRKY 蛋白可专一识别 TTGACC /T(W-box)序列,与 之结合调节基因转录。 W-box 植物防卫相关反应基因中均出现, 且频率高于其他 类型基因。 NPRl 启动子区域含有 W-box ,且 WRKY 蛋白作用于 NPRl 的上游, 与其特异性结合, 进而在植物防卫反应中正向调控其表达:过量表达拟南芥基因 启动子中的 W-box , 可导致抗病反应、基础防卫反应、激发子反应和系统获得性 抗性中各相关基因表达上调。
2.2 WRKY转录因子的结合序列
WRKY 转录因了特异性结合的核苷酸序列为 (T)(T)TGAC(C/T) 片段 (即 w-盒, TGAC 是 w-盒当中的核心序列,其中任意一个碱基的突变都会导致结合能 力的减弱或者消失。当然也存在例外,如烟草当中的 NtWRKYl2序列,该基因 结合启动子当中的 SURE 元件,其结合的序列为 TTTTCCAC 。 Ciolkowski 等曾 对拟南芥中不同转录因子的结合选择性进行研究,发现 W-box 的邻近序列会影 响其所结合的转录因子种类, AtWRKYll 与 AtWRKY6对 W-box5’端有 G 碱基 的位点会表现 fn 很强亲和力。
2.3 WEKY转录因子的功能
2.3.1 参与植物抗病防卫反应
植物在受到病原物侵染之后,其植物体内会产生由特定信号蛋白和信号分 子组成信号传导途径,通过该途径激活防卫反应基因,从而抵抗病原物的侵染。 植物抗病反应通常有多种信号分子和信号传递途径参与,其中由 SA , JA 和 ET 三种内源信号途径被称为植物抗病防卫基本信号途径。
植物防卫反应基因是指在激发子的诱导下, 经信号传递激活表达防卫反应功 能的一类与植物抗病相关的基因。一些防卫反应基因也可以与 WRKY 转录因子 结合,如在皱叶欧芹中 PR-I,PR-2,PR-3,PR-10都可以与其 WRKYl 基因结合 (Rushton et al 1996; Eulgem et al, 1999) 。转录因子不仅可在植物抗病反应中起 正 调 控 作 用 , 也 可 起 负 调 控 作 用 。 如 AtWRKY48在 拟 南 芥 对 假 单 胞 菌 (Pseudomonas syringae)的防卫反应中起负调控作用。
2.3.2 WRKY转录因子在植物抗逆中的调控作用
植物在其长期的生长发育中会受到如损伤、 干旱、 高盐、 等一系列非生物因
素的胁迫, 其在长期的进化过程中形成了一系列应对上述胁迫的调控机制。 在植 物抗逆反应过程中,会有一系列相关基因被诱导或抑制表达。
Wu 等人曾发现 OsWRKYII 可与水稻热激蛋白基因 HSP 基因的启动子结合, 其过量表达可增加水稻对高温和干旱的抗性 (wu et al,2009) 。 脱落酸是植物抗逆 反 应 中 起 重 要 调 控 作 用 的 激 素 。 Xie 等 人 曾 发 现 水 稻 的 OsWRKY24与 OsWRKY54基因会抑制一个受脱落酸诱导表达基因的表达, 而 OsWRKY72则可 以诱导该基因的表达。
大部分与植物抗逆反应相关的转录因子都参与调控了植物对两种以上不同 逆境的反应,表明其在植物体内不止参与了一条抗逆信号传导途径。
2.3.3 WRKY转录因子在植物发育过程中的作用
WRKY 转录因子对环境刺激的反应具有快速、瞬时的特点,这就为其参与 信号转导途径,进行早期的基因表达调控提供了可能。 WRKY 转录因子便能快 速表达,并结合其下游防卫基因启动子中的 W-box 转录激活或抑制防卫基因, 最终开启或关闭植物自身防卫体系进行防卫应答反应 (李蕾 et161. , 2005) 。 WRKY 转录因子除了参与植物防卫反应之外, 还在植物发育过程中扮演着重要角色, 如 影响植物形态建成、叶片衰老等。
Miao 等报道 AtWRKy53转录因子与拟南芥衰老相关,用基因组 DNA 和重 组 WRKY53蛋白进行 pull down ,分离到了许多候选的靶基因,包括 WRKY 家 族的转录因子、 胁迫和防卫相关基因以及衰老有关的基因 (SAGs)等, 并且体内和 体外的实验验证了 WRKY 蛋白与这些基因启动子结合转录激活或抑制这些基因 的表达, (Miao et
2.3.4 WRYK转录因子在植物代谢过程中的作用
WRKY 转录因子还参与植物当中某些化合物合成以及代谢过程。其中最早 克隆的 SPFI 就属此类基因。该基因在蔗糖诱导淀粉酶基因的表达中起重要调控 作用(Ishigurol et al, 1994) 。在大麦中也发现有类似功能的转录调节因子 SUSIBA2,其与异淀粉酶基因 SOI 启动子区的 w-box 结合从而参与淀粉合成的 调节。
3. 展望
WRKY 转录因子作为植物应对外界生物与非生物胁迫中重要的响应蛋白 , 已经越来越多的引起了人们的关注。 从甘薯中发现第一个 WRKY 转录因子至 今 , 利用转录组学、 蛋白组学、 生物信息学、 遗传学等方法 ,WRKY 转录因子在植 物中的功能已经被慢慢发掘出来。 它不但参与了植物生长发育和新陈代谢过程 , 更重要的是它还参与了植物应对外界生物以及非生物的胁迫反应。 WRKY 转录 因子存在于防御信号途径的各个位置 , 一些早期的受体蛋白、 MAPK 级联、 SA 和
JA 等激素信号途径以及下游调控蛋白都可以和 WRKY 转录因子进行互作。 WRKY 转录因子是一类庞大的家族 , 已有研究表明在行使某个功能上 WRKY 转录因子存在着冗余 [36,41]。因此 , 进一步阐明 WRKY 转录因子在植物防御网 络中的调控与作用机理以及 WRKY 转录因子间的相互协调机理 , 将是今后的一 个重要研究方向。 同时 ,WRKY 作用机理的阐明 , 对于培育抗逆境作物品种具有重 要的理论与实践意义。
范文四：转录因子包括什么主要的功能结构域
转录因子包括什么主要的功能结构域,其主要的结构特点与功能是什么, 作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域:?DNA结合域(DNA binding domain)，多由60-100个氨基酸残基组成的几个亚区组成;?转录激活域(activating domain)，常由30-100氨基酸残基组成，这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，一酸性结构域最多见;?连接区，即连接上两个结构域的部分。不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域，但能通过转录激活域直接或间接作用与转录复合体而影响转录效率。
与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，与DNA结合的功能域常见有以几种:
?螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)及 螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH)
这类结构至少有两个α螺旋其间由短肽段形成的转角或环连接，两个这样的motif结构以二聚体形式相连，距离正好相当于DNA一个螺距(3.4nm),两个α螺旋刚好分别嵌入DNA的深沟。
?锌指(zinc finger) 其结构如图 所示，每个重复的“指”状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。整个蛋白质分子可有2-9个这样的锌指重复单位。每一个单位可以其指部伸入DNA双螺旋的深沟，接触5个核苷酸。例如与GC盒结合的转录因子SP1中就有连续的3个锌指重复结构。
?碱性-亮氨酸拉链(basic leucine zipper，bZIP) 这结构的特点是蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在α螺旋的同一个方向出现。两个相同的结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，这二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。在肝脏、小肠上皮、脂肪细胞和某些脑细胞中有称为C/EBP家族的一大类蛋白质能够与CAAT盒和病毒增强子结合，其特征就是能形成bZIP二聚体结构。
范文五：转录因子Pax4蛋白质转导功能的研究
?实验研究?
转录因子Pax4 蛋白质转导功能的研究
路君 张舒羽 卢大儒
【摘要】 目的 探讨胰腺相关转录因子 Pax4 是否具有蛋白质转导功能，及其进入
细胞后的生物学功能。方法 Ni 柱亲和层析纯化原核表达的含 His 标签的 Pax4 全长蛋
白质及一系列 Pax4 突变体与 EGFP 的融合蛋白。融合蛋白孵育的细胞，分别用于进胞检
测和 Pax4 转导后的功能检测。结果 外源纯化的 Pax4 蛋白能够转导进入 HELF 细胞。
Paired-EGFP 融合蛋白可以进入包括大鼠胰岛细胞在内的多种细胞。转导进入细胞的
Pax4 蛋白能够减少 TNFα 引发的胰岛细胞凋亡，增加胰岛细胞体外培养的存活率。结论
研究结果表明转录因子 Pax4 具有蛋白质转导功能，完整的 Paired 结构域是 Pax4 的蛋
白质转导结构域(PTD)，外源纯化的 Pax4 蛋白在转导入胰岛细胞有抑制细胞凋亡的作
用。
【关键词】 Pax4;Paired 结构域;蛋白质转导结构域;胰岛细胞
Pax4 protein can be transduced into mammalian cells LU Jun, ZHANG Shu-yu, LU Da-ru. State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Science, Fudan University,
Shanghai 200433, China
【 Abstract 】 Objective To examine whether the purified Pax4 protein can be transduced into cells, and to explore whether transduced Pax4 protein maintains its functional
effect as the endogenous Pax4. Methods We constructed His-tagged intact Pax4 and
several EGFP-tagged mutant Pax4 proteins. Each fusion protein was purified using a
ninitrilotriacetic acid column from a bacterial expression system. The internalization of the
protein was investigated by immunostaining and Western blot analysis. MTT and TUNEL
assay were performed to characterize the effect of Pax4 treatment on protecting islet cell
against apoptosis in culture. Results Pax4 protein was detected in HELF cells by Western
blot analysis using anti-6-histidine antibody. Paired-EGFP but not the other fusion proteins
can permeate into various cell types including pancreatic islets. Transduced Pax4 protein can
protect TNFα-induced apoptosis and prolonged islet cell survival in culture. Conclusion
These data suggest that Pax4 protein can permeate into HELF cells, the Paired Domain of
作者单位:200433 上海，复旦大学遗传工程国家重点实验室[路君(现在南京军区福州总医院福建省移植生物学
重点实验室)、 张舒羽、卢大儒]
Pax4 serves as a novel protein transduction domain (PTD), and Pax4 protein transduction could be a safe and valuable strategy for protecting islet cell in culture from apoptosis.
【Key words】 Pax4; Paired Domain; Protein transduction domain; Islet cell
Pax家族转录因子是组织发育和细胞分化中重要的调控因子，其参与调控细胞的
[1]增 殖、存活与迁移。Pax4的DNA结合域由Paired结构域和Homeo-like结构域构成，
[2]属于 Pax家族的第四亚家族。Pax4在胰岛祖细胞发生及β、δ细胞成熟过程中发挥重要的作 用。小鼠胚胎发育的第9.5天，Pax4开始在胰芽中表达，13.5,15 d时表达量最高，之 后逐渐减弱并特异性地出现在β细胞中。Pax4缺失的小鼠没有β细胞，并在出生后数天内 死亡，说明Pax4是胰腺发育过程中形成β细胞系必不可少的转录因子[3]。
近年来研究人员认为Pax4 可能是调控β细胞增殖与存活的关键因子。胰腺发育或胰 岛成熟后，Pax4 的功能异常都会引起细胞增殖减弱和β细胞数量逐渐减少，最终引发糖 尿病。胰高血糖素样肽(GLP-1)可以刺激小鼠及大鼠胰腺中β细胞增殖，能在葡
[4]萄糖存 在时促进人类胰岛中Pax4 的表达。在大鼠胰岛细胞中过表达Pax4(mPax4)能激活
c-Myc/Id2 增殖通路、促进抗凋亡基因Bcl-xL的表达。表达mPax4 的人类胰岛增殖增加，
[5]而且能够保护胰岛细胞使其免于细胞因子介导的凋亡。这些研究表明Pax4 的活化能够 促进细胞存活和分裂。
由于Pax4在胰腺内分泌发育和维持β细胞存活中的重要作用，因此Pax4成为近年来 胰岛分化、糖尿病治疗中新的研究热点。本研究通过原核表达、体外纯化的方法获得Pax4 及其突变体的重组蛋白质，探讨胰腺相关转录因子Pax4是否具有蛋白质转导功能，揭示 Pax4蛋白进入细胞后的生物学功能，为蛋白质转导技术在糖尿病治疗中的应用提供理论 基础。
1 材料与方法
1.1 全长Pax4及Pax4突变体与EGFP融合蛋白质原核表达载体的构建与表达 携带小
鼠Pax4全长cDNA序列的pPax4质粒由德国干细胞研究中心Matthias Austen 主管惠赠。PCR扩增的全长小鼠Pax4 cDNA，EcoR?和Hind?酶切回收后与pET-32a连接， 测序正确的质粒命名为p-Pax4。PCR扩增的绿色荧光蛋白(EGFP)序列经Hind?-Not? 酶切回收后与pET-28a连接，得到pEGFP1质粒。PCR扩增Pax4蛋白的各个结构域， EcoRI-HindIII 酶 切 回收后与 pEGFP1 连 接，鉴定正确后得到 pPaired-A-EGFP 、 pPaired-B-EGFP、pPaired-EGFP、p132–171-EGFP、pHomeo-EGFP和p245–349-EGFP。将 上述经测序鉴定正确的质粒分别转化BL21(DE3)感受态原核表达菌株，将阳性克隆菌 液以1:100稀释接种于LB液体培养基中，于37?，200 r/min培养4,5 h，使菌液OD600达到 0.8，加入0.7 mmol/L浓度IPTG，25?诱导12 h。离心收集菌体，超声破碎，以Ni-NTA
His?Band树脂纯化蛋白。纯化后的蛋白溶解于溶液A中(25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、 300 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA和150 mmol/L 咪唑)。
1.2 细胞培养与蛋白质转导
HELF(human embryonic lung fibroblast，人胚肺细胞)和HEK293 细胞用高
100 糖 DMEM完全培养基培养。培养液的配制方法:DMEM(高糖)+10,胎牛血清+IU/ml青 霉素+100 μg/ml链霉素;Min 6 细胞用DMEM(低糖)培养基培养，含 15,
56胎牛血清、 100 IU /ml青霉素、100 μg/ml链霉素及 5 μl/L β-巯基乙醇。以 1×10~1×10一个/孔将实验 用细胞接种至 24 孔板中，5,CO，37?孵箱内培养 24 h;分别加入不2
同浓度的纯化后 的各种融合蛋白质，在蛋白质加入后不同时间分别吸出培养液，PBS清洗后CCD荧光显微 镜下观察拍照。
1.3 Western-Blot杂交
蛋白质处理 HELF 细胞后，PBS 清洗 3 次后刮取细胞用于 SDS-PAGE 蛋白质电泳。采 用半干式转移法转膜，以小鼠抗 6 组氨酸单克隆抗体(anti-6-histidine)(1:2000) 与转导入细胞内的带有 6 His 标签的融合蛋白反应，4?孵育过夜，TBST 清洗后将膜与 HRP 标记的二抗反应 1 h，TBST 清洗后 ECL 试剂盒显色、拍照。以甘油醛-3-磷酸脱氢 酶(anti-GAPDH antibody)作为内参对照。
1.4 细胞免疫荧光
6接种 1×10细胞/孔的HELF细胞至 6 孔板中，5,CO ，37?孵箱内培养 24 h。外2
源 蛋白质处理后，PBS清洗 3 次，4,多聚甲醛室温固定，封闭液封闭。加小鼠 6 组氨酸一 抗(anti-6-histidine 1:500,1:1000)4?过夜，PBS清洗后加山羊抗小鼠的罗丹明荧 光标记二抗(Rhodamine-conjugated goat antimouse 1:100)，1 h后DAPI核
光显微镜下观察拍照。 染，CCD荧
MTT实验
收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于 96 孔板后培养 24 h。分别加入不同浓 度的Pax4或对照组TAT蛋白，每组设定 5 个复孔，培养 8 h。以 12 ng/ml浓度加入TNFα， 继续培养 12 h。加入含MTT(5 mg/ml)的新鲜DMEM低糖培养液，37?孵育 4 h。二甲基亚 砜溶解结晶物，在酶联免疫检测仪 492 nm处测量各孔的吸光值，计算细胞存活率。
TUNEL检测
单层培养的大鼠胰岛细胞铺于 6 孔板中培养 24 h，加入纯化的 Pax4 及 TAT 处理细 胞 4 d(纯化蛋白质在第 0 天和第 3 天加入)。PBS 清洗后 4,多聚甲醛固定，采用 Promega DeadEnd 比色法 TUNEL 系统检测试剂盒检测，DAPI 核染后 CCD 荧光显微镜拍照，计数统 计。
2 结果
2.1 全长Pax4及Pax4各突变体与EGFP融合蛋白原核表达载体的构建、鉴定
p-Pax4经EcoRI和Hind?酶切鉴定 (图1)。Pax4基因各突变体片段与pEGFP1连接， 由于连接片段较小，因此用EcoRI和XhoI酶切，酶切鉴定(图2)。
图1 pPax4 酶切电泳 图2 Pax4 各突变体与 EGFP 融合蛋白质原
核表达质粒酶切电泳
2.2 全长Pax4及各突变体融合蛋白质诱导、纯化及鉴定
-NTA柱纯化，SDS-PAGE分析(图3)证明已分别纯化得到全长Pax4目标蛋白质经Ni
蛋 白及较高纯度的各突变体与EGFP融合蛋白，蛋白质大小与预期相一致。
A、纯化的 Pax4 各突变体与 EGFP 的融合蛋白质 SDS-PAGE 电泳后经考马斯亮蓝染色，蛋白质分子量与预期
小一致;B、纯化的全长 Pax4 蛋白质
图3 Pax4 各突变体融合蛋白及全长 Pax4 SDS-PAGE 电泳分析
2.3 外源纯化Pax4的蛋白质转导功能 纯化的Pax4添加到HELF细胞培养液中至终浓
度100 nm，12 h后吸去培养液。细胞固
定后，用于细胞免疫荧光检测。以His标签抗体，利用抗原抗体反应，发红色荧光的罗 丹明特异地反应出外源纯化的Pax4蛋白在细胞内部的分布。蓝色是DAPI标记的细胞核。 图4A表明带有His标签的外源纯化蛋白质Pax4不需要依赖于其它转导肽介导，蛋白质分 子本身具有穿过细胞膜进入细胞的能力。为了观察外源纯化的Pax4在细胞核中是否有分 布，我们从转导后的细胞中分离了胞浆及胞核物质用于Western Blot检测。检测结果表 明在核抽提物中有少量外源Pax4蛋白存在(图4B)。
A、细胞免疫荧光检测。图中白色箭头所指的是 Pax4 可能存在于细胞核的位置。B、Western Blot 检
测
图 4 Pax4 蛋白质转导入 HELF 细胞
2.4 Pax4蛋白质转导结构域分析 为探索Pax4的蛋白质转导结构域，我们将Pax4基
因分为长度不同的6段，其中Paired
结构域还被拆分成PairedA和PairedB两部分，将这些基因片段与EGFP基因连接，表达纯 化出它们与EGFP的融合蛋白质。对照组EGFP蛋白质和6种融合蛋白质加入细胞4 h后，在 荧光显微镜下观察拍照，结果我们发现,只有Paired-EGFP融合蛋白质有非常明显的荧 光，Paired结构域进一步拆分的PairedA和PairedB融合蛋白质都不如完整Paired结构域 融合蛋白质的进细胞能力强，说明Pax4是依赖于完整的Paired结构域而进细胞的， Paired结构域是Pax4的蛋白质转导结构域，而非其它肽段(图5A)。Western Blot结果进 一步验证了Paired结构域的进胞能力(图5B)。
A(Pax4 各突变体与 EGFP 的融合蛋白质纯化后分别加入 HELF 细胞培养液中至终浓度 0.5 μm;4 h
后 CCD 荧光显微镜拍照。B、Paired-EGFP 处理 HELF 细胞 4h 后，抽提胞浆及核蛋白质，用于 Western Blot
检测。
图5 Pax4 各突变体融合蛋白质进入 HELF 细胞
2.5 Paired-EGFP融合蛋白质能够高效进入各种细胞系
0.5 μm的Paired-EGFP分别处理多种细胞系和原代分离培养的大鼠胰岛细胞，在
光显微镜下观察发现它能够普遍地进入这些细胞(图6)。图示中选取的是Paired-荧
EGFP 融合蛋白质进入HEK293、HELF、Min6及大鼠胰岛细胞的荧光照片。结果表明Paired-EGFP 可以高效进入这些细胞。
图6 Paired-EGFP 转导入不同的细胞系
2.6 Pax4抑制TNFα引发的胰岛细胞凋亡
为检测 Pax4 转导入胰岛细胞后，是否有抑制 TNFα 引发的胰岛细胞调亡的功能， 我们将 Pax4 处理的 Min6 细胞暴露在 TNFα 中，以 TAT 为对照组，进行 MTT 检测， 观察不同浓度蛋白质处理的 Min6 细胞在 TNFα 存在时的细胞存活率。缓冲液处理组中 观察到，12 ng/ml 的 TNFα 刺激 12 h 后，38,的 Min6 细胞出现凋亡，而预先以不同浓 度 Pax4 蛋白质(25,100 nm)处理的实验组，不同程度地抑制了 Min6 细胞的凋亡，使细 胞存活率增加至 96,(图 7)。TAT 组虽然也表现出一定剂量依赖的保护作用，但是其组 间差异不显著。通过 MTT 实验可以看出，转导入胰岛细胞的 Pax4 蛋白质可以减少 TNFα 引起的胰岛细胞凋亡，并且随着浓度的增加保护作用更为明显。
图7 Pax4 抑制 TNFα 引发的胰岛细胞凋亡
2.7 Pax4增加大鼠胰岛细胞体外培养的存活率 为评价Pax4对大鼠胰岛细胞存活的
影响，Pax4蛋白处理过的大鼠胰岛细胞被用于
TUNEL检测。大鼠胰岛细胞在用Pax4、TAT或缓冲液处理4 d(两次，第1、3天)，TUNEL检 测Pax4组细胞死亡率为7.8,，较之TAT组(19,)和缓冲液组(21,)有明显的下降(图 8)。
图8 Pax4 增加大鼠胰岛细胞体外培养的存活率
3 讨论
本研究发现了一类新的PTD-Pax家族转录因子的Paired结构域，Paired结构域能够 携带融合蛋白质或完整的Pax4进入细胞内。Paired-EGFP融合蛋白质能够进入包括Min6 和大鼠原代胰岛细胞在内的多种细胞，说明Paired PTD穿膜没有细胞特异性。全长Pax4 和EGFP标记的Paired 结构域能够高效地穿过细胞膜，表明Paired结构域也有携带其它 外源蛋白质穿膜的能力。
研究报道11,16个富含赖氨酸、精氨酸残基的小肽能够穿过细胞膜,它们中碱性
[6]氨 基酸残基较为集中且主要会形成两性α螺旋结构。一些更小的PTDs，通常也是
[7]碱性很 高的肽段，如8Lys、8Arg等 。而在Pax4蛋白质结构中，Pax4的DNA结合域由Paired结 构域和Homeo-like结构域组成，这两段序列中碱性氨基酸含量相对较高。Homeo家族蛋 白质在以往研究中曾被报道有蛋白质转导功能。但Pax4的Homeo-like结构域与Antp、 PDX-1等分子的Homeo-box结构域在序列上相似性并不是很高。Homeo-EGFP处理的细 胞几乎没有荧光信号，表明Homeo结构域不是Pax4的蛋白质转导结构域。在突变体融合 蛋白的进胞实验中，Paired-EGFP处理后的细胞荧光信号最强。当Pax4的Paired结构域拆 分为A和B两段后，PairedA-EGFP处理的细胞内荧光亮度比Paired-EGFP的要弱很多， PairedB-EGFP则几乎没有荧光信号。实验结果表明完整的Paired结构域结构是Paired穿 膜所必需的，它是Pax4的PTD，且无法将转导结构域限定在更小的氨基酸片段中。Pax4 的Paired结构域，包含128个氨基酸，碱性氨基酸含量为13,，且散在分布于整个结构域 中，没有明显的高度集中区域。因此，我们猜测Paired结构域穿过细胞膜可能依赖于它 的3D结构，在这个结构中碱性氨基酸残基可能分布于Paired的某一个面上，表现出一种 局部富集。
Pax家族成员是哺乳动物发育和维持成熟细胞功能中的调控因子。外源纯化的Pax4 转导入胰岛细胞后，能够起到与内源蛋白质类似的生物学功能，从而抑制胰岛细胞凋亡。 因此，体外纯化这些蛋白质，并利用它们自身的蛋白质转导活性使之进入目的细胞发挥 其转录调控功能，可以方便、安全地对这些蛋白质的功能进行体内或体外研究。
参 考 文 献
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(收稿日期:2009-05-04)
(本文编辑:蔡晓珍)
路君,张舒羽,卢大儒,等.转录因子 Pax4 蛋白质转导功能的研究[J/CD].中华细胞与干细胞移植:电子版,2009,1
(1):35-43.
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