眼睛只红了眼眶
范文一：胡萝卜的组织培养
胡萝卜的组织培养
（一） 组织培养 1． 准备
（1） 器具准备： ① 高压蒸汽灭菌锅： 培养基，接种工具，蒸馏水的消毒。
手持喷雾器： 装70%的酒精，用于外植体，接种工具，操作人员的消毒。 ② 超净工作台： 用于无菌操作。 ③ 设备：培养架，温度控制器，摇床，光照培养箱，烘干器，蒸馏水器，冰箱，电炉，天
平，温度计，酸度计，显微镜，分注器，移液器，磁力搅拌器， ④ 常用玻璃器具：量筒，培养皿，烧杯，50ml锥形瓶，容量瓶，广口瓶，滴管，移液管，
试管，酒精灯，玻璃棒， ⑤ 常用金属仪器：镊子，剪刀，解剖刀，解剖针，接种针，刀架 ⑥ 其他用品：滤纸，标签，消毒酒精棉球，封口用品
（2） 试剂：MS基本培养基
2,4-D：生长素类似物
NAA：生长素类似物
6-BA：细胞分裂素类似物
酒精（体积分数70%）：消毒
次氯酸钠（体积分数20%）：消毒
无菌水
A. MS基本培养基配方：上述4种储备液+30g蔗糖+8g琼脂+蒸馏水定容至1000mL
（pH5.6~5.8）
B. 分别向MS基本培养基中加入植物激素：（pH5.6~5.8） 诱导愈伤组织形成培养基：MS+0.5mg/L 6-BA+0.125 mg/L2,4-D 诱导分化芽的培养基：MS+1.0mg/L 6-BA + 0.1 mg/LNAA 诱导生根的培养基：MS+0.1 mg/L NAA
3.灭菌：灭菌后冷却置于常温下观察3天，检查灭菌是否彻底。
4.取材接种：
a．将萝卜洗净削皮切段，擦手消毒。
b．在超净工作台上将萝卜用酒精消毒30秒，用无菌水清洗两到三次，用次氯酸钠溶液处理30min，用无菌水清洗两到三次。
c．用无菌滤纸吸取水分，在培养皿上用无菌刀将萝卜切成1cm厚的横切片，选取有形成层
的部位，切取1cm2的小块。
d．将组织块接种到培养基上，封口。贴上标签，写明材料、日期、编号。
e．将培养基放在23-26°C的恒温箱培养。4天后观察材料污染情况，14天后，观察愈伤组织生长情况。
5观察记录：每天观察外植体的生长情况，记录愈伤组织的大小、质地、颜色等情况。
6转接，培养：培养一段时间后，将生长良好的愈伤组织转接到分化培养基上，培养一段时间后，胡萝卜的愈伤组织就可以诱导出试管苗。
（二）露地栽培
1．培育壮苗:添加一定数量的生长延缓剂（如矮壮素、PP333）同时打开瓶盖，持续一周。
2． 选用合适的培养基
3． 转栽试管苗:洗去附着在根系上的培养基
4． 移栽后的条件控制:保持空气湿度，遮挡强光，降低温度
5． 栽培
范文二：胡萝卜愈伤组织培养简易化的探究
胡萝卜愈伤组织培养简易化的探究
肖卫彬
(普宁市第一中学，广东 普宁 515347)
摘要:从外植体消毒、培养基制备、培养容器选择等环节对中学胡萝卜愈伤组织
培养实验进行简易化探究，结果表明:采用10% HO溶液与70%酒精两种消毒22
剂交叉使用，外植体消毒效果好，污染率仅为8.33%，且生长发育正常;采用回
收果酱瓶、自来水、食用蔗糖，并以20%马铃薯液代替MS培养基，在每升培养
液中加入500mg/L的6-BA 和500mg/L的NAA各1mL，可使胡萝卜愈伤组织诱
导率达到78.85%。改进后的胡萝卜愈伤组织培养实验简单、价廉、操作性强，
适于中学推广应用。
关键词:胡萝卜;愈伤组织;简化培养
An inquiry into the simplified callus culture of Daucus carota L.
Xiao Wei-bin
(Puning NO.1 Middle School,Puning Guangdong 515347,China)
Abstract: This essay is a simplified inquiry into the middle school experiment on the callus culture of Daucus carota L.,based on the steps such as method of explant
disinfection, culture medium preparation and how to choose culture vessels .The findings show the following things .The use of the two disinfectants,that is,10% hydrogen preoxide solution and 70% alcohol,can have a good effect on explant disinfection;the contamination rate is only 8.33%; the growth and development is normal .In the experiment we shoud use recycled jam bottles,tap water and cane sugar,substitute 20% patato extract for MS medium and add 1mL of 500mg/L 6-BA and 1mL of 500 mg/L NAA to per litre of culture solution; the induction rate of callus culture can reach 78.85% .The improved experiment on callus culture is simple and of a competitive price and has strong operability ;therefore it is proper for us to popularize and apply it in middle schools.
Key words: Daucus carota L.;Callus; Simplified culture
1
胡萝卜愈伤组织培养是高中生物选修3——《现代生物科技专题》开设的一个重要实验，其实验的成功与否，直接影响到下面根、芽分化实验的开展。
[1]目前，胡萝卜愈伤组织培养的技术已经十分成熟，但要让中学生亲自动手操作，揭开细胞工程神秘的面纱，还十分困难。究其原因，一是组织培养实验在以往中学教材根本没有涉及，很多老师还相当陌生，而且新教参提供的实验数据
[2]较为模糊，加上实验时间跨度大，让不少老师望而生畏;二是课本标准实验的操作及药品要求特别严格，在中学尤其是农村中学很难满足其实验要求，比如外植体的消毒，制作MS培养基的药品(特别是有机物)，培养瓶(锥形瓶)的包扎等等，导致中学胡萝卜愈伤组织培养实验的实际开出率和成功率极低。
笔者结合乡村中学的教学实际，从培养基配制、外植体消毒、培养容器选择等环节对中学胡萝卜愈伤组织培养实验进行简易化探究，为高中生物组织培养实验的推广提供实践参考。
1 材料和方法
1.1材料
新鲜的胡萝卜块根。
1.2试剂
10%HO，70%酒精，无菌自来水，500mg/L的6-BA，500mg/L的NAA。 22
1.3培养基的配制
3 马铃薯洗干净，去皮，去芽眼，切成大约1cm的小方块，在天平上称取200g。将所称马铃薯小块倒入锅中，加自来水1000mL，煮沸30min，用纱布(2-3层)过滤。滤液加入500mg/L的6-BA和500mg/L的NAA各 lmL，加水至1000mL，再加入食用蔗糖30g、琼脂6g。加热使琼脂完全溶解，调节溶液pH,6.0。趁热将溶液倒入果酱瓶中，每瓶40 mL左右。高压灭菌(121?，20min)后，冷却备用。
1.4方法
(1)接种前，用70%酒精擦拭超净工作台，将培养基和接种工具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯，照射20min，并同时送风。
(2)将胡萝卜用自来水充分洗净、擦干，置于超净工作台上。取70%酒精溶液擦拭胡萝卜表面，用已消毒小刀将其切成小段，切去外皮周围组织，切成小块
2
置于烧杯内，70%酒精浸洗2min，移入10% HO溶液处理15 min，无菌水冲洗22
3次，并吸干水分。
3(3)用无菌小刀把胡萝卜形成层部分切成lcm/块，接种于诱导培养基上，每瓶接种4个外植体，共接10瓶，26?、遮光培养，3次重复，每天记录胡萝卜切块产生愈伤组织的情况。
(4)统计方法
污染的材料数), 污染率(%，100总接种材料数
形成愈伤组织的材料数诱导率(%), ，100总接种材料数
2 结果与分析
2.1培养过程的污染情况
接种3天后，检出受污染的培养瓶，并根据细菌生长的特点判定污染源的来源。在三次培养的过程中，共接种外植体120个，分30瓶，其中，受污染材料数10个，共4瓶，污染率占8.33%(见表1)，其余培养瓶中的外植体色彩鲜红(图版?:1)，没有出现发黄，组织变软等现象。
表1 外植体污染率统计
接种瓶数接种的材料数污染的材料数
实验重复 污染率
(瓶) (个) (个)
1 10 40 5 12.50%
2 10 40 3 7.5%
3 10 40 2 5.00% 合计 30 120 10 8.33%
2.2 愈伤组织的诱导
本实验共有104个外植体接种成功，其中，能脱分化产生愈伤组织的有82个，诱导率达到78.85%(见表2)。
接种第6天，大多数外植体表面细胞(露出培养基部分)开始脱分化，出现
3
一些愈伤组织，数量比较少，细胞颜色较外植体浅;有的外植体体积开始胀大，颜色依然鲜艳(图版?:2-3)。接种第8天，脱分化形成的愈伤组织继续增大，颜色浅(图版?:4)。接种第15天，愈伤组织已经较多，不规则生长，可用于继代培养。
继代培养的愈伤组织分裂更加旺盛，在继代培养2周后形成1.5cm×1.5cm×1cm大小的一团组织(图版?:5)，一个月后组织达到3cm×3cm×2cm(图版?:6-7)。在形成的愈伤组织中，可发现有部分组织细胞在老化，颜色变暗;有的分裂能力很强，细胞颜色较浅。
表2 胡萝卜愈伤组织诱导率统计
实验重复 外植体数(个) 产生愈伤组织数(个) 诱导率
1 32 24 75.00%
2 36 28 77.78%
3 36 30 83.33%
合计 104 82 78.85%
3. 讨论
3.1 外植体消毒方法
[3] 无菌的外植体材料是植物组织培养成功的重要前提和根本保证。常用的消毒剂有很多，高中学校应根据自身的实际情况，选择合适的消毒方法。0.1%升汞是杀菌能力最好的消毒剂，但它是剧毒药品，不适宜高中学生使用。过氧化氢溶液是高中学校实验室常用化学药品，其消毒效果好，且该药剂在外植体表面容易去除，不损伤外植体。本实验采用10%HO溶液与70%酒精两种消毒剂交叉使22
用，污染率仅为8.33%，且清毒后胡萝卜外植体颜色鲜艳，没有出现发黄、组织变软等现象，说明这样消毒处理恰到好处。HO与酒精交叉消毒法，是否可以22
推广到其他外植体的消毒，有待进一步探究。
3.2 简法配制培养基
愈伤组织诱导的成功与否，除了培养材料本身的因素外，很大程度上取决于对培养基的选择。培养基由无机盐、碳源、维生素、生长调节物质、氨基酸、有
4
[3]机附加物等几大类物质组成。在中学尤其是农村中学要买齐有关的化学物品较困难，有的化学物品还特别昂贵，如烟酸、肌醇、氨基酸等。这就限制了高中阶段开展组织培养实验的探究。马铃薯营养丰富，价格便宜，取材容易。本实验为简化培养环节，采用20%的马铃薯培养液(加入一定量的糖、NAA和6-BA等)，代替复杂难求的MS培养基进行组织诱导，结果胡萝卜愈伤组织的诱导率达到78.85%。笔者认为，改进后的培养基价格便宜，配制方便，且愈伤组织的诱导率高，适合在中学尤其是农村中学推广。
3.3 培养瓶、水源、碳源和能源
通常用于植物组织培养的玻璃器皿有三角锥瓶等，但三角锥瓶价格较贵，易破损，封口操作繁琐。果酱瓶(或沙茶酱瓶)(图版:8)，其瓶口大，空间大，价格低廉，操作方便，容易获得。本实验以回收果酱瓶代替三角锥瓶，以自来水代替蒸馏水，以食用蔗糖代替分析纯蔗糖，一方面节约了实验的成本，另一方面也能培养学生低碳生活与节能环保的意识。
参考文献:
[1] 尹文兵，李丽娟，黄勤妮，等.胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研
究[J] . 山西师范大学学报(自然科学版) ,2004，18(2):71-76 [2] 陈淑仪.诱导胡萝卜愈伤组织实验的探究[J] .教学仪器与实验,2007，23
(12):12-13
[3] 潘瑞炽.植物组织培养(第三版)[M].广州:广东高等教育出版社，
2003.20-40
本文于2010年7月15日获“第三届全国中学理科实验教学与小学科学教研优秀论文”二等奖,并发表于国家级刊物《实验教学与仪器》2010年第12期
5
1 2
3 4
5 6
7
图版? 胡萝卜愈伤组织培养简易化的探究
6
范文三：胡萝卜的植物组织培养王晶.doc
胡萝卜的植物组织培养
摘要:
植物组织培养作为一个生物技术中最核心、最基础的技术。20世纪50年代末期胡萝卜第一次成功的通过组织培养得到完整的胡萝卜试管植株。半个世纪后依然很有研究价值。本文对胡萝卜的组织培养的简史、基本概念、基本操作、应用和前景进行了简单的介绍。 关键词:
愈伤组织、细胞全能性、脱分化、再分化、快繁、培养基、分生组织、消毒
Key words:
callus、cellulartotipotency、dedifferentiation、redifferentiation、rapidpropagation、 medium、meristem、sterilization
1胡萝卜的生态习性和种类
生态习性 伞形科(Apiaceae)草本植物;学名为Daucus carota，通常为一年生，根可食胡萝卜为半耐寒性蔬菜，发芽适宜温度为20?25?，生长适宜温度为昼18-23?，夜温13-18?，温度过高、过低均对生长不利。胡萝卜根系发达若生长前期水分过多，地上部分生长过旺，会影响肉质根膨大生长;若生长后期水分不足，则直根不能充分膨大，致使产量降低。
种类 胡萝卜的品种很多，按色泽可分为红、黄、白、紫等数种，我国栽培最多的是红、黄两种。按形状可分为圆锥形和圆柱形。
2胡萝卜的市场效益分析
一种十分重要的蔬菜植物。由于其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培。中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用。有治疗夜盲症、保护呼吸道和促进儿童生长等功能。此外还含较多的钙、磷、铁等矿物质。生食或熟食均可。还可腌制、酱渍、制干或作饲料。经济实惠价格低廉。
3胡萝卜的根部组织培养
早在20世纪初，许多科学家将胡萝卜植物细胞和组织作离体培养，为植物组织培养技术的发展奠定了基础。美国科学家斯蒂瓦特从40年代开始，用悬浮法培养野生胡萝卜的韧皮细胞，通过十多年的艰苦探索，终于培育出根、芽齐全的小植株，首次证实了植物细胞的全能性。德国植物生理学家Haberlandt首次进行了细胞培养实验。1934年，White培养番茄离体根尖成功。
1939年，Gautheret连续培养胡萝卜根形成层首次成功。White:烟草种间杂种的瘤组织，进行组培。 Nobecourt:胡萝卜进行组培，三人是植物组织的奠基人。
20世纪50年代末Saward等人从胡萝卜根的韧皮部取下一块组织，并将它置于液体培养基中进行培养，使它分化出愈伤组织，然后把从愈伤组织所得到的胚状体转移到固体培养基上继续培养，获得了完整的胡萝卜试管植株。同一基因型的不同外植体其愈伤组织的发生能力有明显差异，这与不同外植体的分化程度和脱分化能力不同有关。近年来的研究表明，以胡萝卜下胚轴为外植体出愈率要
[1,3,4]高于子叶和贮藏根。此外，杨宁等(1999)选取胡萝卜贮藏根的皮层、木质
[5]部及韧皮部为外植体，发现从韧皮部诱导出的愈伤组织有较好的生长效果。 4植物激素对胡萝卜根的影响
不同的激素种类、浓度及其组合对愈伤组织的诱导率有显著影响。在培养基中加入2,4-D,6-BA,BA,KT等，会影响胚性愈伤组织的发生。2,4-D的浓度从0.1,10.0 mg/L不等，6-BA的浓度从0.2,4.5mg/L不等，BA的浓度从0.5,1.0mg/L
[2,3,6]不等，KT的浓度从0.2,2.0mg/L不等。此外还有研究结果表明，2,4-D/KT比值是影响愈伤组织形成的关键因素，随着比值的增大，愈伤组织诱导率有逐渐
[7]升高的趋势。
5具体实验方案
洗涤。
培养瓶和其它器皿应先在清水中浸泡后，然后刷去瓶内污物，再用洗衣粉、洗洁净等洗涤。
洗净的器皿应不挂水珠，内外壁水膜均一，置于烘箱内烘干
.配制母液和激素。
根据MS培养基配方配制1到4号母液，将母液分装在4个溶液瓶中备用。注意铁盐要单独配。
将2,4-D，6-BA先用少量醇溶解再用水稀释至所需浓度。
.配制培养基。
将母液按比例混合，加入适量琼脂粉和蔗糖，加热搅拌至透明，调节pH值为5.8。 .分装灭菌。
在编好号的锥形瓶中加入不同浓度的激素溶液，然后将培养基趁热分装到锥形瓶中，每瓶25ml左右。用封口膜封好口，用高压灭菌锅灭菌121度20分钟灭菌。. 外植体准备和消毒。
从野外采集新鲜胡萝卜作为材料。
植物材料先刷洗然后冲洗，再用消毒液次氯酸钠进行表面灭菌，最后用蒸馏水清洗。
接种前准备及接种。
将接种所用器具先消毒，准备好无菌水，无菌滤纸，酒精喷壶，酒精灯等。接种操作人员和超净工作台用酒精消毒，晾干后进行接种操作。用消毒过的器械将外植体置于培养皿上，切取所需的外植体。将外植体接种于培养容器的培养基上，整个试验在超净工作台上进行，保持无菌～
原代培养
将接种好的锥形瓶至于暗环境下培养，外植体经过一段时间在培养基上生长后，会形成愈伤组织。
继代培养
将愈伤组织重新转移到新鲜培养基上的过程称为继代，愈伤组织将在不同的培养上(分化培养基)分化形成小芽或根，进而形成小苗。
分化培养基:培养基中含有较低浓度的生长素和较高浓度的细胞分裂素。 在分化培养基上，愈伤组织表面几层细胞中的某些细胞启动分裂，形成一些细胞团，进而分化成不同的器官原基。器官形成过程中一般先出现芽，后形成根。 移栽
经过锻炼的小苗，可以和一般植物一样进行大规模栽培
.参考文献
[1] 吴殿星 . 植物组织培养，上海:伤害交通大学出版社， 2004 [2] 郭勇，崔堂兵，谢秀祯 . 植物细胞培养技术与应用，北京:化学工业出版社， 2004
[3] 李浚明编译 . 植物组织培养教程，北京:北京农业大学出版社， 2002 [4] 高文远贾伟，药用植物大规模培养，化学工业出版社，2005 [5] 崔德才，徐培文 . 组织培养与工厂化育苗，北京:化学工业出版社， 2003 [6] 刘振祥，植物组织培养技术，化学工业出版社，2007
[7] 陈菁瑛，兰花组织培养与快速繁殖技术，中国农业出版社，2004
. 现代植物组织培养技术，兰州:甘肃科学技术出版社， 2003 [8] 曹孜义
[9] 刘庆昌 . 吴国良 . 植物细胞组织培养，北京:中国农业大学出版社， 2003 [10] 彭星元，植物组织培养技术，高等教育出版社，2006
[11] 刘青林 马伟 郑玉梅 ，花卉组织培养，中国农业出版社，2003 [12] 李浚明 朱登云，植物组织培养教程(第三版)，中国农业大学出版社，2005 [13] 王玉英，植物组织培养技术手册 ，金盾出版社，2006 [14] 梅家训，丁习武 . 组培快繁技术及应用，北京:中国农业出版社， 2003 [15] 曹春英，植物组织培养，中国农业出版社，2006
[16] 吴殿星，胡繁荣，植物组织培养，上海交通大学，2007
范文四：胡萝卜愈伤组织培养简易化的探究
胡萝卜愈伤组织培养简易化的探究
肖卫彬广东省普宁市第一中学(515347) 工作台，将培养基和接种工具放入超净工作台台面， 胡萝卜愈伤组织培养是高中生物选修3“现代生 打开超净工作台紫外灯，照射20 min，并同时送风。 物科技专题”开设的一个重要实验，其实验的成功与
否，直接影响到根、芽分化实验的开展。 (2)将胡萝卜用自来水充分洗净、擦干，置于超
目前，胡萝卜愈伤组织培养的技术已经十分成 净工作台上。取酒精溶液擦拭胡萝卜表面(用已消毒 小刀将其切成小段，切去外皮周围组织，切成小块置 熟，但要让中学生亲自动手操作(揭开细胞工程神秘 于烧杯内，并用体积分数为70,的酒精浸洗2 的面纱，还十分困难。究其原因，一是组织培养实验 min， 在以往的中学教材中根本没有涉及(很多教师对此 移入体积分数为10,的H:0:溶液中处理15 rain，
无菌水冲洗3次，并吸干水分。 用 还相当陌生，而且新教参提供的实验数据较为模糊， 加上实验时间跨度
(3)用无菌小刀把胡萝卜形成层部分切成lcmV大，让不少教师望而生畏;二是课 接种于诱导培养基上，每瓶接种4个外植体，共接块， 本标准实验的操作及药品要求特别严格，中学尤其 10瓶，放在26?的环境中遮光培养，重复3次。每种 是农村中学很难满足其实验要求(比如外植体的消 记录胡萝卜切块产生愈伤组织的情况。天 毒，制作MS培养基的药品(特别是有机物)，培养瓶
(锥形瓶)的包扎等等，导致中学胡萝卜愈伤组织培 养实验的实际开出率和成功率极低。 (4)统计方法。污染率-蒜器糙舢,;
笔者现结合乡村中学的教学实际(从培养基配 诱导率=幽髓籍瓣邋舢,。制、外植体消毒、培养容器选择等环节对中学胡萝卜 二、结果与分析 愈伤组织培养实验进行简易化探究。 1(培养过程的污染情况 一、材料和方法 接种3天后，检查出受污染的培养瓶(并根据 1(材料 菌生长的特点判定污染源的来源。在3次培养细 的过新鲜的胡萝卜块根。 程中，共接种外植体120个，分30瓶，其中，受污染 2(试剂 材料数10个，共4瓶，污染率占8(33,(表1)，其余 体积分数为10,的H。O:，体积分数为70,的酒 培养瓶中的外植体色彩鲜红，没有出现发黄、组织变 精，无菌自来水，质鼍浓度为500 mg,L的6一BA，质量 软等现象。 浓度为500 mg,L的NAA。 表1 外植体污染率统计 3(培养基的配制 马铃薯洗干净，去皮，去芽眼，切成大约l cm3
g。将所称马铃薯小块的 小方块，在天平上称取200 000 mL，煮沸30 rain，用纱锅中，加自来水l倒入 布(2—3 层)过滤。滤液加入质量浓度为500 mrCL的
6一BA和 质量浓度为500mg几的NAA各lmL，加 000mL， 再加入食用蔗糖30 g、琼脂6 g。 水至l 加热使琼脂完伞溶 解，调节溶液使其pH=6(0。趁热将溶液倒入果酱瓶 2(愈伤组织的诱导中，每瓶40 mL左右。高压灭菌(121?，20 min)后冷 该实验共有104个外植体接种成功，其中，能却备用。 4(方法 分化产生愈伤组织的有82个，诱导率达到脱 (表2)。 78(85, (1)接种前(用体积分数为70,的酒精擦拭超净 万方数据 ?38?
表2胡萝卜愈伤组织诱导率统计 用体积分数为10,的H20:溶液与体积分数为70,
的酒精2种消毒剂交叉使用(污染率仅为
8(33,(且 消毒后胡萝卜外植体颜色鲜艳，没有出
现发黄、组织 变软等现象，说明这样消毒处理恰到好 处。H:0:与酒 精交叉消毒法是否可以推广到其他
外植体的消毒， 有待进一步探究。2(简化配制培养基 愈伤组织诱导的成功与 否(除了培养材料本身的 接种第6天(大多数外植体表面细胞(露出培养 因素外，在很大程度上取决于对培养基的选 基由无机盐、碳源、维生素、生长调节 择。培养 基部分)开始脱分化，出现一些愈伤组织，数量比较 机附加物等几大类物质组物质、氨基酸、有 少(细胞颜色较外植体浅;有的外植体体积开始胀 要买齐有关的化成。在中学尤其是农村中学 大(颜色依然鲜艳。接种第8天，脱分化形成的愈伤
学物品较困难，有的化学物品还特 组织继续增大，颜色浅。接种第15天，愈伤组织已经
别昂贵，如烟酸、肌醇、氨基酸等，这就限制了高中阶 较
段开展组织培养实验的探究。马铃薯营养丰富，价格 多，不规则生长，可用于继代培养。
便宜，取材容易。该实验为简化培养环节，采用质量分 2周继代培养的愈伤组织分裂更加旺盛(在继代培养
cmxI(5 cmxl cm大小的一团组织，一 数为20,的马铃薯培养液(加入一定量的糖、NAA后形成1(5 crux3 crux2 cm。在形成的愈伤组 6-BA等)，代替复杂难求的MS培养基进行组和 个月后组织达到3 结果胡萝卜愈伤组织的诱导织诱导。 织中。可发现有部分组织细胞在老化，颜色变暗;有 为，改进后的培养基价格便率达到78(85,。笔者认 部分组织细胞分裂能力很强，颜色较浅。 宜(配制方便，且愈伤组织 三、讨论 的诱导率高，适合在中学尤其是农村中学推广。 1(外 3(培养瓶、水源、碳源和能源 无菌的外植体材植体消毒方法 通常用于植物组织培养的玻璃器皿有三角锥瓶 料是植物组织培养成功的重要
前提和根本保证。常用的消毒剂有很多，高中学校应 等，但三角锥瓶价格较贵，易破损，封口操作繁琐。而
果酱瓶(或沙茶酱瓶)瓶口大，空间大，价格低廉，操 根据自身的实际情况(选择合适的消毒方法。体积分
作方便，容易获得。该实验以回收果酱瓶代替三角锥 数为0(1,的升汞是杀菌能力最好的消毒剂，但它是
瓶，以自来水代替蒸馏水，以食用蔗糖代替分析纯蔗 剧毒药品，不适宜高中学生使用。过氧化氢溶液是高
糖，一方面节约了实验成本，另一方面也能培养学生 中学校实验室常用化学药品，其消毒效果好，且该药 低碳生活与节能环保的意识。 剂在外植体表面容易去除，不损伤外植体。该实验采
?槲台?
龙泉市教育局仪器站领导到瀑-Z-,J、学检查指导工作
本刊讯20lO年10月12日(浙江省龙泉市教 长陪同叶华弟站长一行实地察看了专用教搴，在每 育局仪器站叶华弟站长一行到瀑云小学检查指导 一个专用教室，他们都亲自动手参与检杏，并仔细 询问I『学校教师、学生专用教宅使用情况。察看工作。检查中，?i(华弟站长一行听取了瀑云小学朱 叶华弟站长一行对瀑云小学仪器的使用和管理，实 时， 承法校长有关学校图书窒、科学仪器室、微机室、音 验室和档案管理，实验课的教学给予了肯定，并指 乐教窀、“农远”工程教室等功能教事的建设汇报。 出在今后的教学中，要切实培养学生的实验能力， 朱承法校长说，目前学校资金有限，但是为了激发 尽量在多媒体教室上课(最大程度地利用好仪器设 学生学习兴趣，培养学生的动手、动口、动脑能力， 教育局领导的晕视关心 备，给学生创造实践机会。 提高学生的综合素质，促进学生令面发展，学校在 叶华弟站长一行对瀑云小学仪器使用工作感 下，多方筹措资金，建设了 图书室、科学仪器室、微机室、音乐教宅、“农远”工 到非常满意，同时勉励学校领导、教师继续管理好
使用好教学仪器设备，充分发挥好教学仪器设备的 程教室等功能教窜，指定专业人员管理，科学开没
育人功能。 (通讯员 许东宝) 课程，切实提高专用教室的使用率。随后，朱承法校万方数据 ?39?
范文五：胡萝卜组织培养
分类号_____________ 学号 01011147
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本科毕业论文(设计)
胡萝卜组织培养
摘要:植物细胞具有全能性，根据这个原理我们利用胡萝卜块根取韧皮部进行组织培养，将
胡萝卜根块接种于MS培养基上，生长一段时间形成愈伤组织，再利用MS培养基加植物激素
的方法对愈伤组织进行再分化我们得到胡萝卜在分化过程中的胚状体。我们分别观察了胡萝
卜在脱分化和再分化的各个时期的生长情况。
关键词:胡萝卜;组织培养;胚状体
Abstract: Totipotent plant cell, the method we use to take carrot root phloem tissue culture, the carrot root block inoculated on MS medium, callus growth period, and then use MS medium plus the phytohormone according to this principle more re-injured tissue differentiation we get the carrot in differentiation of embryoid bodies. We observed the carrot in dedifferentiation and re-differentiation of various periods of growth.
Key words: carrot; tissue culture; embryoid
目录
1绪论???????????????????????????????????.....1
1.1胡萝卜组织培养理论基
础???????????????...????????.1
1.2胡萝卜简介??????????????????????????????1
1.3胡萝卜组织培养研究史?????????????????????????1
1.4植物组织培养的应
用???????????????????????...??.1
2材料和方法???????????????????????????????.??2
2.1植物材料???????????????????????????????2
2.2主要的仪
器?????????????????????????????....2
2.3主要的药品??????????????????????????????2
2.4方法?????????????????????????????????3
2.4.1 MS培养基母液配制????????????????????????..3
2.4.2胡萝卜的愈伤组织诱导培养及继代增值培
养??????????????.4
2.4.3悬浮培
养?????????????????????????????.4
2.4.4器官分化培
养???????????????????????????.4
3实验结果??????????????????????????????????.4
3.1胡萝卜诱导形成愈伤组织????????????????????????4
3.2胡萝卜愈伤组织继代培养????????????????????????5
3.3愈伤组织悬浮培养???????????????????????????5
3.4胡萝卜愈伤组织器官分化培养??????????????????????6 4结果分析与讨论???????????????????????????????.7 致谢?????????????????????????????????????8 参考文献???????????????????????????????????9
1、 绪论
1.1胡萝卜组织培养理论基础
植物细胞全能性(totipotency)是指植物每一个细胞都含有该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传潜力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础[1]。
从二十世纪三十年代初期，植物组织培养逐渐发展起来形成一项生物技术。植物组织培养又称植物克隆,在无菌条件下,将植物的外植体(如叶、茎尖、花、根、未成熟的果实、种子等) 、组织(如花药组织、形成层、胚乳、皮层等) 、细胞(如体细胞、生殖细胞等) 、胚胎(如成熟和未成熟的胚) 、原生质体(如脱壁后仍具有生活力的原生质体)培养在特定的人工配制的培养基上,给予合适的培养条件,诱导产生愈伤组织、潜伏芽等,进而培育成完整的植株,这一过程统称为植物组织培养。根据培养对象和外植体来源的不同,又分为细胞培养、花药培养、胚培养、组织培养、茎尖培养、器官培养等类型[1-3]。植物组织培养作为一种有效的技术手段已在快速繁殖、脱毒、单倍体育种、种质资源保存、细胞突变体筛选等方面得到广泛的应用, 其应用领域还在不断拓展、延伸。
根据我国现在农业发展状况,积极发展组培业,在实际生产中将植物组织培养产业化，形成自己特色的生产格局, 逐步与国际市场接轨,在未来的国际竞争中创造属于我们自己的专利，从而为发展我国现代农业提供可靠的技术支撑。
1.2胡萝卜简介
胡萝卜(Daucus carrot)，又称甘荀，伞形目( Apiales)，胡萝卜属( Daucus)，二年生草本植物[14]。原产于亚洲西南部，最早演化于阿富汗，栽培历史在2000年以上。我国是元朝从西域引进，那时得名胡萝卜[4]。胡萝卜以肉质根块作为蔬菜食用，富含维生素、蔗糖、淀粉等，具有很高的营养价值。
1.3胡萝卜组织培养研究史
胡萝卜具营养价值高，适合于各种食谱，种植简单，生长力旺盛，产量高等优点，因很多的研究学者对胡萝卜的研究进程越来越关注。现阶段有关胡萝卜的研究越来越广泛，胡萝卜的植株再生，体细胞杂交，遗传转化，分子标记以及基因克隆等技术已非常成熟，为胡萝卜抗病虫害、提高产量作出了很大的贡献。对胡萝卜的研究始于1902年，那时德国的植物学家哈伯兰德就预言植物细胞具有全能性，每个植物细胞通过体外培养都具有发育成一颗完整植株的潜力。他也曾用植物叶片进行培养来证明这个预想，可是没有成功，但他提出的设想一直指引着许多植物学家去证实这个事实[5]。终于，在1983年法国科学家诺比考特和高特里特同时培养了胡萝卜块根，使得细胞增殖成功。之后，美国的植物学家怀特用烟草基段形成层进行组织培养和继代培养并获得成功，他们的研究为植物组织培养技术的发展奠定了良好的基础[6]。1948年，斯科等发现利用适当比例的生长素可以诱导并控制芽和根的形成。1956年，米勒又发现细胞分裂素可以促使芽发育。后来越来越多的学者开始研究胡萝卜的组织培养，现在此技术已非常成熟，在此基础上，我们利用胡萝卜块根进行组织培养。 1.4植物组织培养的应用
原生质体融合、单倍体育种以及胚和胚乳的培养都是采用植物组织培养的技术手段进行的。我国在小麦、烟草、橡胶、柏树、辣椒等植物的单倍体育种的工作处于领先地位。原生质体融合技术在植物育种上有着较广阔的应用前景，通过原生质体融合可以克服远缘杂交不亲和，获得属间甚至种间的杂交体细胞，产生新的植株品种，在生产上可产生巨大的经济和
社会效益。通过体细胞杂交技术已得到柑橘的抗病、抗高温和抗寒的杂交植株。采用胚和胚乳的组织培养方式可以获得3 倍体新品种，缩短了育种周期，如柑橘、葡萄、西瓜、枸杞等，培育3倍体植株有非常重要的意义，可以打破种子休眠、克服远缘杂交不亲和、加快植株生长速度、增加生物产[7-9]。由于受地理环境和季节的限制,依靠自然条件繁殖经济价值较高的植物和珍稀植物, 很难快速、高效的繁殖。通过组织培养这项生物技术将克服这些难题。特别是一些繁殖系数低而且不能用种子繁殖的名贵优植物品种来说,利用组织培养快速繁殖植物，意义尤为重大。
图一:胡萝卜组织培养模式图
2、材料和方法
2.1植物材料:胡萝卜块根
2.2主要的仪器
电子分析天平、普通天平、磁力搅拌器、冰箱、高压灭菌锅、100ml三角瓶、烧杯、容量瓶、各种型号的试剂瓶、标签、移液管、记号笔、注射器、封口塑料、电磁炉、酸度计、500ml搪瓷杯、25ml量筒、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管、pH试纸(5.4-7.0)、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、眼科手术剪、手术刀、橡皮圈、超净工作台冰箱、摇床等 2.3主要的药品
95%酒精、0.5mol?LNaOH、0.5mol? L HCL、配制MS培养基所需的各种无机物、有机物、蒸馏水、琼脂、蔗糖、无菌水、75,酒精、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、1mol/LNaClO、硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2、4-D、NAA(a-萘乙酸)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、弄盐酸、氢氧化钠、水解酪蛋白、氯化汞等。 2.4方法
2.4.1 ?MS培养基母液配制?
配制培养基前先要配制母液。母液由大量元素、微量元素、铁盐及有机物质组成。 ??? ?????????? ?????
类
别成分
?规定量扩大倍数称取量
(mg)母液体积
(mL)配1升培养基的吸取量(mL)大
量
元
素KNO3
NH4NO3
MgSO4?7H2O
KH2PO41900
1650
370
170?
?
1019000
16500
3700
1700?
?
1000?
?
100
微
量
元
素MnSO4?4H2O ZnSO4?7H2O H3BO3
KI
NaMoO4?2H2O CuSO4?5H2O CoCl2?6H2O22.30
8.6
6.2
0.83
0.25
0.025
0.025? ?
?
1002230 860
620
83
25
2.5
2.5?
?
?
1000?
?
?
10铁
盐Na2-EDTA
FeSO4?7H2O37.25
27.851003725
2785100010钙盐CaCl2?2H2O44010440010010有
机
物
质甘氨酸
盐酸硫胺素
盐酸吡哆素
烟酸
肌醇2.0
0.4
0.5
0.5
100??
50100
20
25
25
5000
?
500
?10(1) 大量元素母液(10倍液)
分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于800mL热的(60,80?)蒸馏水中。定容至1000mL后装入试剂瓶中，存放在4?冰箱内备用。
(2?) 微量元素母液(100倍液)
分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800mL重蒸水中，加水定容到1000mL。 (3) 铁盐母液(100倍液)
称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4?7H2O，溶于800mL重蒸水中，最后定溶到1000mL。
(4) 钙盐母液(10倍):
称取10倍用量的CaCl2?2H2O溶于80mL重蒸水中，最后定溶到100mL。 (5) 有机物质母液(50倍液)
分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400mL重蒸水中，定容至500mL装入棕色试剂瓶中，存放在冰箱中备用。
(6) 生长素
分别准确称取20mg2，4-D、IAA、NAA，先用2mL95,乙醇溶解，然后加水，定容至20mL，浓度为1mg/mL，放在冰箱内备用。
(7)细胞分裂素
准确称取20mg6-BA，先用2mL的1mol/LNaOH l溶解，然后加水，定容至20mL，浓度为1mg/mL，再放置冰箱内备用。
将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，标明各培养基母液的名称、浓缩倍数、配制日期，放在4?冰箱备用。
2.4.2 胡萝卜的愈伤组织诱导培养及继代增值培养
(1)培养基的配制
诱导培养基:MS基本培养基+2,4-D1.0mg/L+30mg/L蔗糖+7g/L琼脂(pH=5.8)。 继代培养基:MS基本培养基，0.1mg/L 6-BA，2mg/L NAA + 200mg/L水解酪蛋白+ 30mg/L蔗糖+7g/L琼脂(pH=5.8)。
按MS培养基的比例添加试剂配成MS基本培养基，然后按比例加入植物激素、蔗糖和琼脂，继代培养基需加入水解酪蛋白，然后定容，最后调溶液pH。
分装到三角瓶，封口，灭菌。待灭菌后室温凝固待用。
(2)胡萝卜块根的接种
用75,乙醇擦拭超净工作台，将消毒液、无菌水、烧杯、剪刀、镊子、培养皿、计时器、待用的诱导培养基放在超净台里，打开超净工作台紫外灯照射30min后，打开送风开关关闭紫外通风10min后再打开日光灯进行外植体的消毒和接种。将洗净的胡萝卜块根取韧皮部切成小块用75,乙醇浸泡30S后用含有吐温-20的0.1g/L氯化汞溶液浸泡10mn，再用无菌水洗涤四次，用无菌滤纸擦干后用无菌的镊子接种于诱导培养基中，贴标签放在光照培养箱中进行培养。
两周后，将接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体上长生的愈伤组织选择长势较好的取出，弄碎转接到愈伤组织继代培养基中，放在光照培养箱中进行培养。 2.4.3悬浮培养
悬浮培养基:MS基本培养基，0.1mg/L 6-BA，2mg/L NAA + 200mg/L水解酪蛋白+ 30mg/L蔗糖(pH=5.8)
选取生长较好，颜色浅黄的胡萝卜愈伤组织在超净台中用镊子捏碎，每500mg接种到一瓶悬浮培养基中，将接种的三角瓶置于摇床上进行培养，转速一定，25?。 2.4.4器官分化培养
芽诱导培养基:MS基本培养基+1.0mg/L6-BA+ 0.5mg/L2,4-D +30mg/L蔗糖+7g/L琼脂(pH=5.8)。根诱导培养基:MS基本培养基+0.1mg/L2,4-D+30mg/L蔗糖+7g/L琼脂(pH=5.8)[10-12]。
在超净台中将悬浮培养的两周后的愈伤组织分别接种到芽和根的诱导培养基中，将其放入光照培养箱进行培养。一个月后更换新的芽和根诱导的培养基再进行培养。
一个月后将芽分化组织用显微镜进行观察。
3、实验结果
3.1诱导胡萝卜块根形成愈伤组织
通过半个月的诱导培养胡萝卜块根形成愈伤组织，在胡萝卜块根表面形成黄绿色酥松细胞团(如图2)。
图2:胡萝卜诱导形成愈伤组织
3.2胡萝卜愈伤组织继代培养
通过继代培养胡萝卜愈伤组织进一步生长分化形成嫩黄色酥松组织团(如图3)。
图3:胡萝卜愈伤组织继代培养
3.3胡萝卜愈伤组织悬浮培养
胡萝卜愈伤组织悬浮培养形成均匀的嫩黄色颗粒状组织(如图4)。
图4:愈伤组织悬浮培养
3.4胡萝卜愈伤组织器官分化培养
图5:胡萝卜愈伤组织器官分化培养
图6:胡萝卜愈伤组织分化培养形成球形胚
图7:胡萝卜愈伤组织分化培养形成心形胚
图8胡萝卜愈伤组织分化培养形成鱼雷形胚
在器官分化培养过程中用显微镜观察出现的胡萝卜胚状体的三个时期分别为:球形胚、心形胚和鱼雷形胚，由于时间有限胡萝卜愈伤组织还没有形成再生植株(如图5-8)。 4、结果分析与讨论
我们通过对胡萝卜块根进行愈伤组织诱导培养，继代培养，悬浮培养以及器官分化培养得到胡萝卜愈伤组织，愈伤组织脱分化，从显微镜观察到的球形胚、心形胚和鱼雷形胚得知胡萝卜愈伤组织已经开始再分化，如果接下来再继续培养，我们会得到胡萝卜完整的再生植株。
激素的种类和浓度在愈伤组织诱导和再分化过程中起着重要作用。植物细胞具全能性，但对于特定的细胞或器官是否能发育成完整植株，合适的激素诱导起到关键性作用。培养基中添加的生长调节剂浓度和搭配合适可促进愈伤组织的诱导和分化，否则会产生负面影响[13-14]。
在胡萝卜愈伤组织培养过程中，我们还观察到某些愈伤组织变成紫色或白色，胡萝卜块根诱导的愈伤组织有多种类型, I 型愈伤组织:黄绿色, 结构疏松,易分散, 生长速度较快, 分化能力强,细胞多为圆形或椭圆形, 少数为长形, 这类愈伤组织相对较多; ?型愈伤组织: 黄褐色, 结构疏松, 极易分散, 分化能力较弱, 细胞多为长型; ?型愈伤组织: 黄色或略带
红色, 结构致密, 很难分散, 细胞多为圆形; IV 型愈伤组织: 紫色或略带白色(如图9), 结构致密, 很难分散, 分化能力较差。I型愈伤组织, 生长旺盛, 可不经过继代培养直接用于悬浮细胞系的建立; ?型愈伤组织在继代过程中容易变褐, 生长缓慢; ?型愈伤组织可用手术刀将其切成小块进行继代培养, 经过几次的继代培养后, 可得到分散性好的胚性愈伤组织, 从而用于悬浮细胞系的建立, 多数愈伤组织属于该类型; IV 型愈伤组织很难继续分裂生长和分化。另外还有一种致密颗粒性愈伤组织, 产生数量极少[15-22]。
图9:胡萝卜愈伤组织分化培养形成紫色组织
影响植物愈伤组织诱导的因素有很多，如光照、培养基种类与植物激素、外植体以及其它添加物如绿原酸和维生素等，这些因素的控制是一个错综复杂的过程，即使是同一因素对不同植物愈伤组织的诱导也有不同的效果，甚至同一植株的不同部位、同一部位不同的发育时期效果也不尽相同。胡萝卜愈伤组织的诱导国内外许多研究者有研究，但在这些研究中结果不尽一致，有的甚至相反。许多研究表明，诱导外植体脱分化和再分化关键在于生长素和细胞分裂素的比例。生长素在诱导外植体脱分化产生愈伤组织中起关键性作用，而细胞分裂素只是增加了愈伤组织的发生数量，其浓度过高反而产生相反的作用。合理使用植物激素有利于愈伤组织的快速增殖。
胡萝卜组织培养是植物组织培养技术的典型应用，植物组织培养在现代农业中发挥着越来越大的作用。胡萝卜组织培养技术在今后会有更加广泛的应用。
致谢
首先，非常感谢我的导师征荣老师，在征荣老师的指导下本论文才得以顺利完成。从开始实验方向的确定到实验的设计、实验的进行、论文的撰写与修改，征荣老师都下了很大的心血，这里真的非常感谢老师的指导。征荣老师工作认真、做事严谨、为人平易近人，老师的工作态度值得我学习。
其次，感谢林晓飞副教授在实验过程中的指导与意见。同时也感谢植物生理实验室所有师兄师姐对我的教导和帮助。
最后，感谢内蒙古大学生命科学学院对我的培养。
参考文献
[1]梁称福.植物组织培养研究进展与应用概况[J].经济林研究,2005,04:99-105. [2]王丽娟,田京伟,杨建雄,张军.植物组织培养的研究进展[J].河东学刊,1999,03:8-11. [3]郝玉华.我国植物组织培养的发展现状与前景展望[J].江苏农业科学,2008,04:20-23. [4]张娅,曾君祉,周志勇,陈毓荃,黄华樑.胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立[J].植物学通报,2005,S1:37-42.
[5]梁称福.植物组织培养研究进展与应用概况[J].经济林研究,2005,04:99-105. [6]莫德馨,郭玉华,孙静,耿慧莉.胡萝卜组织培养[J].教学仪器与实验,2010,07:42-43. [7]郑回勇,郑金贵,许明,刘峰,赵伊英.胡萝卜再生体系及高效遗传转化体系的建立[J].广西农业科学,2002,05:237-241.
[8]张唯,王伟,续晨,贲爱玲,张君艳,蔡小宁.胡萝卜幼苗根、茎、叶组织培养再生植株[J].安徽农业科学,2012,12:7013-7014..
王义强.植物组织培养的应用研究概述[J].江苏林业科技,2005,03:44-46. [9]李永欣,
[10]李凯.胡萝卜的组织培养实施方案——暨对学生课外活动指导和评价的建议[J].林区教学,2010,11:99-101.
[11]黄鸿枢.植物组织培养在现代农业中的应用前景和存在问题[A]..经济科技研究论集[C].:,2010:7.
[12]许凤芹,刘桂茹,杨学举.植物组织培养研究进展[J].河北农业科学,2005,01:99-103. [13]王丽娟,田京伟,杨建雄,张军.植物组织培养的研究进展[J].河东学刊,1999,03:8-11. [14]陈豫,胡伟,何磊.不同浓度激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响[J].江苏农业科学,2013,02:54-56.
[15]肖卫彬.胡萝卜愈伤组织培养简易化的探究[J].实验教学与仪器,2010,12:38-39. [16]李万德,杜桂,张剑.植物组织培养实验中存在的问题及其解决办法[J].湖北生态工程职业技术学院学报,2006,02:11-12.
[17]李聪聪,李艳提.植物组织培养概论[J].现代园艺,2013,20:142+144. [18]郝雪.“植物细胞全能性和组织培养方法”的教学设计[J].中学生物学,2011,09:27-28+48.
[19]王家麟.植物组织培养及其应用研究概况[J].黑龙江农业科学,2006,03:86-89. [20]Luchaklvskaya Y，Kishehenko O，Gerasymenko I，et al( High , level expression of human interferon alpha , 2b in transgenic carrot ( Daucus carota L( ) plants,J,( Plant Cell ,ep， 2011， 30( 3) : 407 , 415(
[21]Kumar G B，Ganapathi T ,，Bapat V A( Production of Hepatitis Bsurface Antigen
in recombinant plant systems: An update,J,( Biotechnol Prog， 2007， 23( 3) : 532 , 539(
[22]Imani J，Lorenz H，Kogel K H，et al( Transgenic carrots: Potential Source of Edible Vaccines,J,( J Verbr Iaebensm， 2007，2( 1) : 105(
