范文一：虎物种特异性鉴定的PCR方法研究_cropped

第 24 卷第 2 期 兽 类 学 报 Vol . 24 , No . 2

May , 2004 2004 年 5 月Acta Theriologica Sinica

虎物种特异性鉴定的 PCR 方法研究

华育帄 张 琼 徐艳春 郑 冬

( )东北林业大学野生动物资源学院 , 哈尔滨 , 150040

摘要 : 为了建立可对虎 DNA 进行特异性检测的 PCR 方法 , 应用在野外调查中获得的虎疑似样品和保护执法工作 中难以检查辨认的虎产品进行物种鉴定 , 从 Genbank 数据库下载 5 个虎亚种及其它 6 种猫科动物和 6 种鹿科动物

() 的 mtDNA 细胞色素 b 基因序列 , 并用 Wdnasis V215软件对上述不同动物的该基因碱基序列进行比较 。在此基

础上 , 综合考虑了设计引物的基本原 则 , 选 择 了 虎 与 其 它 动 物 碱 基 序 列 上 差 异 位 点 较 多 的 两 个 片 段 , 设 计 出() PCR 引物 引物 1 、2。用该对引物分别对从东北虎 、华南虎及 8 种猫科动物和 6 种非猫科动物的肌肉 、脏器组

) (织 、皮或毛发中提取的 DNA 进行 PCR 聚合酶链反应扩增 。结果表明 , 所设计的引物对虎 DNA 具有特异性 , 从而达到了对该物种进行特异性检测鉴定的目的 。

关键词 : 虎 ; PCR ; 物种特异性鉴定

() 文章编号 : 1000 - 1050 200402 - 0103 - 06 中图分类号 : Q751 文献标识码 : A

Study on the PCR Method Specif ic f or Tiger Identif ication

HUA Yuping ZHANG Qiong XU Yanchun ZHENG Dong

( )College of Wildlife Resources , Northeast Forestry University , Harbin , 150040

Abstract : For develpment a PCR specifically amplifying DNA of tiger species , which could be applied to tiger species identifica2 tion for doubtful samples or unable recognized products obtained in field investigation or forensic tests , mtDNA Cty b sequences of 5 tiger subspecies and 6 other cat species as well as 6 deer species were downloaded from Genbank , and compared by Wdnasis V 215 software . Considering the essential doctrine of designing PCR primers , two regions in which all tigers share an unique hyplo2

( ) type against other species were selected to design a pair of primers Primer 1 , 2to amplify a tiger Cty b fragment specifically.

( PCR tests were performed with DNAs extracted from muscle , visceral tissues , skins or hairs of Siberian tigers Panthera tigris al2

) ) ( taica, South2China tigers Panthera tigris amoyensisand 6 other feline species and 6 non2feline species using this primer set . The results indicated that the primers are specific to tiger DNA and identification of tiger species by this means is accurate , sens2i tive , reproducible and reliable .

( ) Key words : Tiger Panthera tigris; PCR ; Species specific identification

使 目前 , 中国境内野生虎的数量已十分稀少 。特 其产品经加工处理后失去了可辨认的形态特征 ,

1 别是华南虎已多年未在野外见到实体 虎产品的鉴定工作十分困难, 历史上曾经 。由此可见 , 为了更

有效地加强虎的保护工作 , 建立一种可以对虎 DNA 有虎分布的地区 , 目前是否还有虎存在 , 均难以断

进行特异性检测的准确性高 、实用性强的方法 , 从 定 。在虎的野外调查研究工作中 , 观察实体已非常

() (困难 , 痕迹 如卧迹 、足迹 、捕食等和粪便等观 分子水帄上对可疑来自于虎的样品 例如野外获得

) 察准确度直接依赖于痕迹或粪便的新鲜程度 , 而对 的疑为虎残余物的样品或难以检查辨认的虎产品

进行特异性检测鉴定 , 都是十分急需和必要的 。 毛发 、粪便等虎的残余物进行鉴定分析又缺少精确

的方法 。另一方面 , 面对虎产品的高额利润 , 还存 有关虎 DNA 的特异性检测研究 ,国内仅有方盛

3 国等 曾利用 DNA 指纹对华南虎 DNA 鉴定检测进在着非法猎杀及虎产品的非法贸易 。有些情况下 ,

( )3 方盛国 ,陈国富“浙江省华南虎踪迹发现及其基因鉴定”成果鉴定材料 未发表

( ) 基金项目 :黑龙江省自然科学基金资助项目 C 00 - 04

() 作者简介 :华育帄 1955 - ,男 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事野生动物疾病研究

收稿日期 :2002 - 06 - 18 ;修回日期 :2003 - 05 - 13

1 行过研究 。在国外 ,仅见于 Wetton等对虎骨 DNA根据 虎 与 其 它 多 种 猫 科 动 物 和 鹿 科 动 物 的

进行特异性检测的相关报道 。Wetton 等所采用的检 mtDNA 细胞色素 b 基因序列的差异 ,及引物设计有

5 测方法是用定量 PCR 扩增仪对扩增过程进行实时 关原则,设计合成了两对引物 , 即引物 1 、2 和 3 、监测 ,在特定解链温度下 ,目的产物的产生会有相应 4 。前一对为对虎 DNA 扩增的特异性引物 ,后一对 峰值记录下来 。检测中根据记录峰值对应的解链温 为 猫 科 动 物 DNA 扩 增 的 通 用 引 物 。同 时 , 按

6 度位置判断是否有虎 DNA 存在 。利用该方法 Wet2 Kocher方法合成引物 L14724 、H15149 ,作为各种动 ton 等人成功地检测了野外获得的材料 ,但该方法中 物 DNA 扩增的通用引物 。

11213 PCR 扩增条件使用的寡核苷酸引物来自于核 DNA ,对于不能获得

核 DNA 的材料则难以应用 , 而且 DNA 用量的要求 引物 1 、2 : 95 ? 5 min ; 94 ? 1 min , 68 ? 1 min ,也较高 。另外 ,实验中采用的 PCR 扩增仪和带荧光 72 ?2 min ,35 个循环 ; 72 ?延伸 10 min 。反应体系

μ标记的试剂价格昂贵 ,使该方法的应用在很大程度 为 25 l ,其中含有 Tris - HCl 10 mmol/ L ,p H 813 ; KCl

μ上受到限制 。本研究中通过筛选虎与其它动物在 50 mmol/ L ; MgCl115 mmol/ L ; 4 种 dNTP 200 mol/ 2

mtDNA Cty b 片段的 碱 基 差 异 合 成 特 异 引 物 , 经 过 L ; Tag DNA 聚合酶 015 ul ; 引物 410 pmol/ L ; 模板

PCR 扩 增 和 凝 胶 电 泳 , 达 到 了 特 异 性 检 测 鉴 定 虎 DNA 约 50,100 ng 。

DNA 的目的 , 并由此建立了一种灵敏 、特异 、简便 、 引物 3 、4 : 退火温度为 55 ?,40 个循环 ,其它条 快速 、稳定性好的虎 DNA 检测方法 。 件同引物 1 、2 。

引物 L14724 , H15149 :退火温度为 55 ?,35 个循 1 材料与方法 环 ,其它条件同引物 1 、2 。

111 材料 扩增 产 物 经 1 %的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 , EB 染 色

( ) 东北虎 Panthera tigris altaica 肌肉采自东北虎 后 ,进行结果判定 、分析 。

( ) ( ) 林园 ,美洲狮 Puma concolor、非洲狮 Felis leo肌肉 11214 样品盲测试验

( ) 采自 深 圳 动 物 园 , 云 猫 Puma marmorata 皮 、金 猫取猞猁 ,金猫 ,家猫 ,豹猫 ,云豹 ,非洲狮和非猫 ( ) ( ) Catopuma temmincki 皮 、云豹 Neof elis nebulosa 皮 、 科动物马鹿 ,猪以及东北虎的皮 、毛 、肌肉 ,华南虎的

( ) 非洲狮皮采自上海动物园 , 猞猁 L ynx lynx 、云豹 、 毛样品各 3 份进行盲测试验 。检测引物 1 ,2 是否对

( ) 金钱豹 Panthera pardus 的毛发采自哈尔滨动物园 , 虎 DNA 存在特异性 。

( ) 非洲狮 、华南虎 P1 t1 amoyensis 的毛发采自杭州动 11215 PCR 产物碱基序列比较分析 从东北虎肌肉物园 ,东北虎脱落毛发采自东北虎林园 。为确保样 中提取总 DNA ,按照引物 1 ,2 的 品来源明确可靠 ,所采集的各种动物的毛发样品均 μPCR 体系 、条件进行扩增 ,取 PCR 扩增产物 75 l ,加

直接取自于动物体表或单独饲养的笼舍中 。μ入 6l Loading Dye 混合均匀 ,点样 ,进行琼脂糖凝胶

( ) ( ) 家猫 Felis catus 肝 、马鹿 Cervus elaphus 肝采 电泳 ,1h 后切胶回收 。然后采用上海华舜生物工程 自哈尔滨动物园 ,牛 、羊 、鸡 、猪 、狗的肌肉采自市场 。 有限公司的 DNA 抽提纯化试剂盒 ,严格按照其操作

112 方法手册标准 纯 化 步 骤 纯 化 并 回 收 PCR 样 品 , 命 名 为

11211 总 DNA 的提取μμ Tiger 。取 2l 纯化液加入 015 l Loading Dye 混匀 ,3 按常规方法在新鲜肌肉或脏器组织样品中提 电泳 检 测 DNA 含 量 , 目 测 可 见 清 晰 条 带 时 , 送 至

( ) 取 DNA ;经 化 学 药 品 如 酒 精 等处 理 过 的 皮 肤 样 ( () Ta KaRa Biotechnology DalianCo1 ,Ltd1 大连宝生物

品 ,先置于去离子水中浸泡 1 d 左右 ,反复换水 ,取) 工程有限公司进行测序 。

出后用滤纸吸干 ,再按常规方法进行总 DNA 提取 ; Genbank 下载东北虎 、印支虎 、苏门达腊虎 、 从

从动物毛中提取总 DNA 主要参照公安部物证鉴定 孟加拉虎相应序列 ,运用 Wdnasis V215 软件 ,与测序 4 中心人的毛发提取方法进行 。 结果进行同源性比较 。

11212 引物的设计

2 期 华育帄等 :虎物种特异性鉴定的 PCR 方法研究 105

bp ,作为猫科动物 DNA 扩增的通用引物 ; 合成引物 2 实验结果 L14724 、H15149 , 作为各种动物 DNA 扩增的通用引 211 引物的设计与合成 物 ,扩 增 片 段 长 度 为 425 bp 。引 物 3 、4 和 引 物

根据 Genbank 所提供的虎及其它多种猫科动物 、H15149 分别用于检验 DNA 提取是否成功 。 L14724

和鹿科动 物 的 mtDNA 细 胞 色 素 b 基 因 序 列 , 并 用 引物序列如下 :

Wdnasis V215 软件进行相互之间的序列比较 。针对 Primer 1 5′- TTT ACG GTC ATG GCT ACA GCC - 3′ 在 361 bp,381 bp 和 565 bp,585 bp 两个区域发现 , Primer 2 5′- GAC TGC TGC TAG GGC TGA GAC - 3′虎与其它猫科动物 、鹿科动物的碱基序列有多个位 Primer 3 5′- ACG GAG CCT CCA TAT T - 3′

() 点不同 表 1 ,2,综合考虑设计引物的有关原则 ,设 Primer 4 5′- ATT CTT GAG GGG TTA TT - 3′计并合成了引物 1 、2 ,其扩增片段长度为 225 bp ; 同 L14724 5′- GATATGAAAAACCATCGTTG - 3′时 ,比较了多种猫科动物间的碱基序列差异 ,选择两 5′- CTCAGAATGATATTTGTCCTCA - 3′H15149

段保守序列设 计 了 引 物 3 、4 , 扩 增 片 段 长 度 为 378

表 1 不同动物 mtDNA 细胞色素 b 基因 361 bp,381 bp 序列比较

Table 1 Comparison of mtDNA Cty b 361 bp to 381 bp sequences in different animals

名 称 Species 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381

T T T A C G G T C A T G G C T A C A G C C 东北虎 P. t . altaica

印支虎 T T T A C G G T C A T G G C T A C A G C C P. t . corbetti 家 猫 Felis catus T T T A CA G T C A T AG C T A C A G CT

CATG T A T 非洲狮 Felis leo T T A CAG C T A C A G C C

云 豹 T T T A C G G T C A T G G C T A C A G C C N . nebulosa

雪 豹 P. uncia T CCC GA G T C A T G G C T A C A G C C 猞 猁 L . lynx T T A C G C C A G T TA T A A C A G C C C 豹 猫 F. bengalensis T T C G C CGG T C A T C A C A G C T A A 赤 鹿 C. elaphus T T T A C G C G T A T C A C A G C A A T A 梅花鹿 C. nippon T T T A C G T A T G C A C A G C A T A C A 驯 鹿 R . tarandus T T A C 水 鹿 H. inermis T T A C G T A T G C A C G C C A A A C GA 黄 麂 M . muntjsk T T T A C G C G T A T CA A A A C A G C C A

A C G C A G T T A T A C G A G C

表 2 不同动物 mtDNA 细胞色素 b 基因 565 bp,585 bp 序列比较

Table 1 Comparison of mtDNA Cty b 565 bp to 585 bp sequences in different animals

名 称 Species 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 577 578 579 580 581 582 583 584 585

东北虎 P. t . altaica G T C T C A G C C C T A G C A G C A G T C 印支虎 G T C T C A G C C C T A G C A G C A G T C P. t . corbetti T C T C A G C CT A G C A G C A G TATA家 猫 Felis catus

非洲狮 Felis leoA T C T C A G C C C T A G C A G C A G T C

AT C T C A G C TC T A G C A G C A G T C 云 豹 N . nebulosa

G T C T C A G C C C T A G C A G C A G T C 雪 豹 P. uncia

L . lynx G T C T C A G C C C T A G C A G C A G T C 猞 猁

豹 猫 G T C T C A G C C C T A G C A G C A G T C F. bengalensis

赤 鹿 C. elaphusT C C A G C C T G C A G T A G A C T A T A

A G T A G C A G C A C T T G C T A T A梅花鹿 C. nipponT C 驯 鹿 R . tarandus T C A G C C T G C A T G A T T A T A G T C 水 鹿 H. inermis T C A G C C T G C A G T A T G T T C A T G黄 麂 M . muntjsk A T T G A T T A T C A G C C T G C A G T C

212 从肌肉中提取 DNA 和扩增结果

从鹿 、鸡 、羊 、牛 、猪 、狗 、虎的肌肉中提取 DNA ,

并用通用引物 L14724 、H15149 进行扩增后 , 均得到

() 阳性产物 ,证明 DNA 提取成功 图 1。同时 ,使用特

异引物 1 、2 对上述 DNA 样品及东北虎肝和脾等另 4 图 3 通用引物 3 ,4 扩增结果 个组织样本 DNA 提取物进行扩增 。结果显示 ,仅有 Fig. 3 Amplify results of Primer 3 ,4 (虎的样品得到阳性扩增产物 ,其余物种均为阴性 图

) 2。此结果表明 ,引物 1 、2 为虎 DNA 的特异性扩增

引物 ,而且对来自于不同个体和不同组织的 DNA 具

有同样的扩增效果 。

图 4 特异性引物 1 ,2 扩增结果

Fig. 4 Amplify results of Primer 1 ,2

11 阴性对照 ;21 云豹皮 ;31 豹猫皮 ;41 家猫肌肉 ;51 猞猁皮 ;

61 金猫皮 ;71 非洲狮肌肉 ;81 东北虎肌肉 ;M :Marker

11Negative control ;21 Neofelis nebulosa skin ;31 Felis bengalensis Skin ; 图 1 通用引物 L14724 、H15149 扩增结果 41 Felis catus muscle ;51Lynx lynx skin ; Fig11 Amplify results of Primer L14724 , H15149 61 Felis temmincki skin ;71 Felis leo muscle ; 11 阴性对照 ;21 马鹿 ;31 鸡 ;41 羊 ;51 牛 ; 61 猪 ;71 狗 ;

81 东北虎 ;91 Marker81 Panthera tigris altaica muscle ;M :Marker 11Negative control ;21 Cervus elaphus ;31Chicken ; 214 从毛干中提取 DNA 和扩增结果41Sheep ;51Cattle ;61Pig ;71Dog ; 81 Panthera tigris altaica ;

91Marker 对猞猁 、云豹 、金钱豹 、非洲狮 、豹猫 、东北虎 、华

南虎脱落毛发进行 DNA 提取和扩增 。图 5 显示从

毛干中提取 DNA 成功 ,图 6 可证明引物 1 、2 仅对虎

特异 ,且不存在亚种间的差异 。

图 2 特异引物 1 ,2 扩增结果 Fig. 2 Amplify results of Primer 1 ,2

11 阴性对照 ;21 马鹿 ;31 鸡 ;41 羊 ;51 牛 ; 61 猪 ;71 狗 ;81 东北虎 1 肌肉 ;91 东北虎 2 肌肉 ;图 5 毛干中通用引物 3 ,4 扩增结果 101 东北虎 2 肝 ;11 . 东北虎 2 脾 ;121MarkerFig. 5 Amplify results of Primer 3 ,4 of hair 11Negative control ; 21 Cervus elaphus ; 31Chicken ;

41Sheep ; 51Cattle ;61Pig ;71Dog ;

81 Panthera tigris altaica1 muscle ;

91 Panthera tigris altaica 2 muscle ; 101 Panthera tigris

altaica 2 liver ; 111 Panthera tigris altaica 2 pleen ; 121Marker

213 从皮和肌肉中提取 DNA 和扩增结果

从云豹皮 、豹猫皮 、猞猁皮及金猫皮 ,家猫肌肉 、 图 6 毛干中特异性引物 1 ,2 扩增结果 非洲狮肌肉 、东北虎肌肉中提取 DNA , 分别用通用 Fig. 6 Amplify results of Primer 1 ,2 of hair

11 阴性对照 ;21 猞猁毛 ;31 豹猫毛 ;41 金钱豹毛 ;51 云豹毛 ; () () 引物 3 、4 图 3和特异引物 1 、2 图 4进行扩增 。从 61 非洲狮毛 ;71 华南虎毛 ;81 东北虎毛 ;91 东北虎肌肉 ; M :Marker 图 3 可见均得到阳性扩增产物 , 证明 DNA 提取 成 1 . Nigative control ;21Lynx lynx hair ;31 Felis benglensis hair ; 功 。而图 4 仅虎样品有阳性产物 ,其它猫科动物均 4 . Felis pardus hair ; 51 Neofelis nebulosa hair ;61 Felis leo hair ; 为阴性 ,进一步证明引物 1 、2 对虎 DNA 的特异性 。 71 Panthera tigris amoyensis hair ;81 Panthera tigris altaica hair ;

91 Panthera tigris altaica muscle ;M :Marker

2 期 华育帄等 :虎物种特异性鉴定的 PCR 方法研究 107

215 盲测试验结果 DNA 样品均在 225 bp 位置有阳性扩增产物形 虎的

( 成 ,而非虎其他物种样品 均 为 阴 性 图 7 - 1 , 2 , 3 ,取猞猁 ,金猫 ,家猫 ,豹猫 ,云豹 ,非洲狮 ,马鹿 ,

( ) ) 猪 8 种动物及华南虎 ,东北虎 毛 、皮 、肌肉各 3 份 4。从而肯定了引物 1 ,2 的特异性 。样品进行盲测实验 ,测定结果与事实一致 ,即来自于

图 7 - 2 M :Marker ;1 . 阴性对照 ;2 . 豹猫 ;3 . 非洲狮 ; 图 721 1 . 阴性对照 ;2 . 家猫 ;3 . 华南虎毛 ;4 . 豹猫 ;5 . 东北 4 . 东北虎肌肉 ;5 . 东北虎皮 ;6 . 猞猁 ;7 . 猪 ;8 . 家猫 ;9 . 云豹 ; 虎肌肉 ;6 . 东北虎皮 ;7 . 猞猁 ;8 . 金猫 ;9 . 华南虎毛 ;10 . 马鹿 10 . 金猫 Fig. 7 - 1 M :Marker ;1 . Negative control ;2 . Felis catus ; 3. Pan2 Fig. 7 - 2 M :Marker ;1 . Negative control ;2 . Felis bengalensis ; 3. Felis thera tigris amoyensis hair ;4 . Felis bengalensis ;5 . Panthera tigris altaica leo ;4 . Panthera tigris altaica muscle ; 5 . P. T. altaica skin ; 6 . Lynx muscle ; 6. Panthera tigris altaica skin ;7 . Lynx lynx ;8. Felis temmincki2 lynx ;7 . Pig ;8 . Felis catus ; 9. Neofelis nebulosa ; 10. Felis temmincki i ;9 . Panthera tigris amoyensis hair ;10 . Cervus elaphus

图 7 - 4 M :Marker ;1 . 阴性对照 ;2 . 云豹 ;3 . 东北虎毛 ;4 . 华南虎 图 7 - 3 M :Marker ;1 . 阴性对照 ;2 . 猞猁 ;3 . 东北虎皮 ;4 . 东北虎 毛 ;5 . 猪 ;6 . 非洲狮 ;7 . 云豹 ;8 . 东北虎毛 ;9 . 东北虎肌肉 ;10 马鹿 毛 ;5 . 猪 ;6 . 豹猫 ;7 . 非洲狮 ;8 . 马鹿 ;9 . 金猫 ;10 . 家猫 Fig. 7 - 4 M :Marker ;1 . Negative control ;2 . Neofelis nebulosa ; Fig. 7 - 3 M : Marker ; 1 . Negative control ; 2 . Lynx lynx ; 3 . Panthera 3 . Panthera tigris altaica hair ; 4 . P. t . amcyensis hair ; 5 . Pig ; 6 . Felis tigris altaica skin ;4 . P. t . altaica hair ;5 . Pig ;6 . Felis bengalensis ; leo ; 7 . Neofelis nebulosa ; 8 . Panthera tigris altaica hair ; 9 . Panthera 7 . Felis leo ; 8. Cervu selaphus ; 9. Felis tennuncki ;10 . Felis catus tigris altaica muscle ;10 . Cervus elaphus

216 PCR 产物碱基序列比较分析结果 NA 进 行 PCR 扩 增 的 特 异 性 , 而 且 从 虎 肌 肉 、脏

按上述 PCR 扩 增 方 法 , 获 得 符 合 测 序 要 求 的 器 、毛发和骨中提取的 DNA 样品 , 均得到了满意 PCR 产物 ,经测序后得到有效序列 198 bp 。从 Gen2 的扩增结果 。PCR 产物测序实验结果进一步证明 , bank 下载东北虎 、印支虎 、苏门达腊虎 、孟加拉虎相 引物设计合理 , 具有高度的特异性 。 应 Cty b 序列 ,运用 Wdnasis V215 软件 ,与测序结果 3 、4 是在比较了多种猫科动物 mtDNA 细胞色

素 b 基因碱基序列的基础上 , 选择两段保守序列合 进行比较 ,同源性 100 % 。

217 检测应用成的 , 作 为 猫 科 动 物 的 通 用 引 物 。引 物 L14724 、

2001 年 11 月 ,广东省潮州市查获一批虎骨酒 , H15149 是已知为多种动物 DNA 的通用扩增引物 , 为认定犯罪证据 ,潮州市警方将样品送到国家林业 该对引物与引物 3 、4 结合使用 , 作为扩增结果对

照 , 目的 是 用 来 确 认 样 品 DNA 提 取 的 成 功 与 否 , 局野生动植物检测中心 ,经笔者用本实验方法对骨

块中提取的 DNA 进行检测 ,证明该骨确为虎骨 ,与 避免由于 DNA 提 取 失 败 而 导 致 的 结 果 判 定 错 误 。

实验中发现 , 毛发 DNA 的提取有时尚存在着一定 此同时 ,犯罪嫌疑人也对做案事实供认不讳 。

的不稳定性 , 而且提取到的 DNA 量十分微少 , 难 3 讨论与结论 以用肉眼观察 、电泳谱带观察等常规方法进行判 311 引物的设计与合成 定 , 甚至在260 nm吸收值也难以测定 。因此 , 在毛

试验结果表明 , 引物 1 、2 具有对虎 Cty b mtD2发检测时 , 利用通用引物对提取物进行扩增 , 事先

一个有利的手段 。 对 DNA 提取结果测定 , 就显得非常必要 。

312 毛发 DNA 提取和用量的比较 毛发是较易获得

:参考文献 的检测材料 , 但毛发 DNA 的

提取较其它组织材料相对困难 , 如选材 、用量及提 1 尹峰 , 黄建华. 世 界 老 虎 的 现 状 及 致 威 因 素 J . 野 生 动 取方法不当等 , 均可导致 DNA 提取或 PCR 扩增的 () 物 , 1999 , 20 2: 26 - 27 . 失败 。因毛发中含有大量色素 、重金属等杂质 , 可 2 Wetton J H , Tsang C S F , Roney C A , Spriggs A C. An extremely 7 对 PCR 起抑制作用, 我们通过实验认为 : 选用 sensitive species2specific ARMS PCR test for the presence of tiger 白色或灰白色的毛作为实验材料效果较好 ; 用针毛 bone DNA J . Forensic Science international , 2002 , 126 : 137 还是绒毛对结果没有显著影响 ; 一次提取所需毛的 - 144 .

3 郑冬 , 孔谨 , 石绍业. 从动物毛中提取 DNA 研究初探 J . 用量控制在 015,017 mg 之间 , 提取效果最佳 。另 () 野生动物 , 1996 , 17 2: 24 - 26 . 外 , 不同动物由于毛的皮质和髓质相对比例不同 , 4 郑秀芬. 法医 DNA 分析 M . 北京 : 中国人民公安大学出 所需毛量应视具体情况而定 。对不同模板量进行比 版社 , 2002 . 53 .

较 , 表明 015,017 mg 的毛量在 100 体系中提取时 ( ) 5 北京 : 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术 第二版M .

中国协和医科大学出版社 , 1999 . 461 - 462 . μ 2l 模板量效果较好 。

Kocher T D , Thomas W K , Meyer A. Dynamics of mitochondrial 6 本研究所建立的对虎 DNA 进行特异性检测方 DNA evolution in animals : Amplification and sequencing with con2 法与已有的几种虎 DNA 检测方法相比 , 除具有同 served primers J . Proc Natl Acad Sci , USA , 1989 , 86 : 6190 - 样的高特异性 、灵敏性外 , 而且因其具有简便易 6200 . 行 、快速 、成本低等的特点而更具有实用性 。此方 ( ) 7 唐恩洁. PCR 影响因素初探 二模板 DNA 质量对 PCR 结 () 果的影响 J . 川北医学院学报 , 1997 , 12 2: 1 - 4 . 法为今后虎的野外调查研究和保护执法工作提供了

范文二：物质具有的专一性(特异性)

物质具有的专一性（特异性）

1、酶的专一性

酶具有专一性，即每一种酶只能催化一种化合物或一类化合物的化学反应。只作用于一个底物，而不作用于任何其他物质，这种专一性称为“绝对专一性”，例如脲酶只能催化尿素水解，而对尿素的各种衍生物(如尿素的甲基取代物或氯取代物) 不起作用。有些酶对底物的要求比上述绝对专一性略低一些，它的作用对象不只是一种底物，这种专一性称为“相对专一性”。

2、载体的专一性

物质以主动运输的方式进行跨膜运输时需要载体，不同物质需要的载体不同。

3、激素的专一性

激素作用之所以具有特异性是因为在它的靶细胞的细胞膜表面或胞浆内，存在着能够与该激素发生特异性结合的受体。

4、淋巴因子的专一性

由特定的效应T 细胞所产生的淋巴因子，具有转一性。

5、抗原（抗体）的专一性

一种抗原只能与相应的抗体或效应T 细胞发生特异性结合，这种特异性取决于抗原决定簇。同样，一种抗体也只能与相应的抗原发生特异性免疫反应。

6、tRNA 的专一性

每种tRNA 只能识别并转运一种氨基酸，这是因为在tRNA 的一端是携带氨基酸的部位，另一端有三个碱基，每个tRNA 的这三个碱基，都只能专一地与mRNA 上特定的三个碱基配对。

7、根瘤菌的专一性

根瘤菌与豆科植物互利共生，豆科植物为根瘤菌提供有机物，根瘤菌为豆科植物提供氮素营养。不同的根瘤菌，各自只能侵入特定种类的豆科植物。

8、限制酶的专一性

一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列, 并且只能在特定的切点上切割DNA 分子。

9、染色剂的专一性

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范文三：生物治疗的特异性与非特异性

生物反馈治疗技术发展至今，再加上电脑技术的发展，很多临床医生在治疗中追求大、新、全、省事。但这只是生物反馈治疗存在的一部分。根据经典的生物反馈技术来说，大（设备大）、新（电脑新）、全（信号全）并不能增加生物反馈治疗的效果，甚至也不能增加治疗所带来的效益（反而因为价格原因而很久才能收回成本），如果为了省事就更不可取，这是会“误人疾病”的。所有心身疾病的患者都伴随有各不相同的心理问题，生物反馈治疗是一种认知行为疗法，不仅要求患者通过对心身相关的重新认知来改变心身变化的过程，同时还要根据他的具体心理问题，进行一些言语的沟通与疏泄，而不是任何一种软件工程能解决的了的。所以经典的生物反馈治疗方法推崇的是四个字：“尽快降压（压力）”。 生物反馈的特异性是指：生物反馈治疗中利用一种生理信号学会控制相应的这种生理信息，这一信号就是特异的，这种反馈方式也就称之为特异性的反馈方式。比如：在生物反馈治疗中利用血压这一信号学习控制血压在正常的范围之内。这叫作生物反馈的特异性。

非特异性是指：虽然有些生理信息与某些身心疾病有相关性，但又没有直接的因果关系，但生物反馈治疗中却用这些生理信息来间接控制或改善某些疾病。我们还用高血压这个病来打比方，比如：利用肌电信号来学习放松，而放松后就能达到血压下降和被控制的目的。这个肌电信号在降低血压

的生物反馈训练中就是非特异信号，这个生物反馈的训练方式就叫做非特异性反馈方式。

生物反馈治疗中是特异性反馈方式更有效还是非特异性更有效呢？

这个问题应当以患者能够最快、最稳妥地学会利用生理信号控制自己心身相关的疾病来回答。一般来讲，利用非特异信号比利用特异信号反而更快、更稳妥。这是因为非特异信号与人的指挥调控及认知相关性更强。比如肌电信号，这个信号人人都会调控，人人都能掌握它的松与紧，而且很容易体验到它的松与紧是完全的不同，对心理、精神的紧张起到了非常有效的控制作用。同时，患者在体验心身放松的同时能很快与肌电信号的数字关联起来，及时认同自己心身的松驰与数字之间的对应关系，从而定量的指挥自己，这样就更“有的放矢”了。我们仍用高血压这个疾病来举例：患者利用肌电生物反馈仪学会了全身肌肉松驰的方法，当他额肌松驰到1μν以下，并保持20分钟以上，我们测量他的血压为130/80，让他一次次训练到这种放松状态时，他会记住：在额肌放松至1μν以下，保持二十分钟以上，他的血压就是130/80了。这个训练过程一般两到三次就掌握了，能指挥自己降压一般也就在一个疗程（十次为一疗程）内就学会了，如果把这个训练模式固化为患者的一种调控本领，也就需要三——四个疗程。而如果用特异性的反馈方式，比如用血压

信号来学习降低血压，虽然是很直接的，也有一部分人能够学会，但血压反馈仪必须使用充气装置，这个装置很影响正在放松的患者的控制回路，不断充气，不断打扰，这个操作系统就很不容易建立起来。而且即使用血压反馈仪也要使患者先学会放松全身肌张力。不只是血压信号，其它脑电、心率、呼吸等信号都一样，都是第一步要放松全身肌肉的。 皮温信号作为生物反馈信号也是主要利用它非特异的一面。人对温度的感觉十分敏锐，即使手脚凉的人也知道如何去感受温暖，所以指挥自己的手、脚或某个部位升温是容易学会的一件事，通过皮温生物反馈仪学习控制升温也就是学习控制交感神经的兴奋，与自我控制后达到的温度值有关联的血压值、心率值、脑电波、呼吸频率等生理信号也就得到控制了。另外，生物反馈治疗主要是针对心身疾病或亚健康问题，很多患者没有气质性病变，对于他们更是运用非特异的反馈方式就足以解决问题了。

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范文四：抗原的特异性

抗原的特异性

抗原特异性：抗原诱导的免疫应答及其与应答产物发生反应的专一性。

①抗原只能激活具有相应受体的淋巴细胞克隆，产生特异性抗体或致敏淋巴细胞 ②抗原只能与相应的抗体或致敏淋巴细胞结合并发生反应

抗原决定基(antigenic determinant) : 抗原分子中决定抗原特异性的基本结构或化学基团。又称表位(epitope)。 是抗原与TCR/BCR及抗体特异性结合的基本单位。抗原特异性的分子基础

抗原结合价(antigen valence)；一个抗原分子上能与相应抗体分子结合的表位数目

共同表位：存在于不同抗原物质上的相同或相似的表位。

交叉抗原（共同抗原）：带有共同表位的抗原

根据产生抗体是否依赖T细胞

胸腺依赖性抗原（thymus dependent antigen, TD-Ag）：种类:绝大多数蛋白质抗原及细胞抗原

特点:需要Th细胞辅助；诱导体液免疫和细胞免疫；可引起免疫记忆

胸腺非依赖性抗原（thymus independent antigen, TI-Ag）：种类:细菌脂多糖，肺炎菌荚膜多糖和聚合鞭毛素

特点：不需要Th细胞辅助; 诱导体液免疫,不能诱导细胞免疫;只产生IgM抗体; 无免疫记忆

范文五：2011年初级药师考试辅导：酶促反应具有高度的特异性

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酶的特异性是指酶对底物的选择性，有以下三种类型:

1.绝对特异性

酶只作用于特定结构的底物，生成一种特定结构的产物。如淀粉酶只作用淀粉。

2.相对特异性

酶可作用于一类化合物或一种化学键。例如磷酸酶可作用于所有含磷酸酯键的化合物。

3.立体异构特异性

一种产仅作用于立体异构体中的一种。例如L-乳酸脱氢酶只作用于L-乳酸，而对D-乳酸不起催物作用。

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