爱好难啊
范文一：肺动脉平滑肌细胞传代培养步骤
肺动脉平滑肌细胞传代培养步骤
一 . 试剂及材料:
PBS 液、 0.25%胰酶、 10%FBS、原代培养的肺动脉平滑肌细胞
二 . 仪器:
离心机、显微镜、 1000ul 移液器、 1000ul 枪头、培养皿
三 . 操作步骤:
1. 吸弃原培养皿中的培养基,加入 PBS 液 2ml (60mm 培养皿) ,用枪头反复冲洗,弃 液。重复 3次;
2. 每个培养皿加入 0.25%的胰酶 500ul ,轻轻上下摇动培养皿,使胰酶与细胞充分接触 (消化约 2分钟) ;
3. 打开 10%FBS培养基管盖,将培养皿置于显微镜下,随时观察细胞消化情况;
4. 当大部分细胞变成圆形后,迅速加入 1ml10%FBS(注意混匀)终止消化。并有剪过 尖的枪头吹打培养皿的斑块区域 (尽量减少吹打次数, 以减少细胞损伤, 皿底不必太干净) ; 5. 将培养皿中的细胞悬液(包括气泡)移入 15ml 离心管, 1000rpm 离心 2分钟,吸弃 上清(注意不要吸到细胞) ;
6. 离心管中加入 3ml10%FBS,轻轻吹打混匀后平均分入 6个 35mm 培养皿中(0.5ml/皿) 。每个培养皿中补加 1ml 10%FBS;
7. 置于培养箱中培养即可。
范文二：细胞传代培养
细胞传代培养
一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂
1、细胞：贴壁细胞株
2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）
3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等
三、操作步骤
1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2、加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
附：消化液配制方法：
称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。胰酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02％。
范文三：细胞传代培养
细胞传代培养,消化法,
具体操作:
一. 传代前准备:
1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37?水浴锅内预热。
,酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 2.用75
3.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口:将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
二.胰蛋白酶消化;
1.加入消化液:小心吸出旧培养液，用PBS清洗(冲洗)，加入适量消化液(胰蛋白酶液)，注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37?。
2. 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 三.吹打分散细胞:
1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液，加入新培养液:弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
四.分装稀释细胞:
1.分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细
5胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×10/ml。最后要做好标记。
五.继续培养:
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25,时为一个，，占50,为，，，占75,时为，，，。
传代细胞培养注意事项:
1.严格的无菌操作
2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
附:EDTA(0.02,乙二胺四乙酸二钠)消化液配方:
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5,酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。
细胞的复苏
细胞复苏的原则,快速融化:必须将冻存在-196?液氮中的细胞快速融化至37?，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作
一. 实验前准备:
1.将水浴锅预热至37?
2.用75,酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 二(取出冻存管:
1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 三(迅速解冻:
1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
四.平衡离心:
用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min
五.制备细胞悬液:
1.吸弃上清液。
2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。
六.细胞计数: 5 细胞浓度以5×10/ml为宜。
七.培养细胞 将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37?和5,CO2的培养箱内2-4小时(或者24-48小时)后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。
初学者易犯错误:
1水浴锅未预热或者未预热到37?。
2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
细胞传代培养
一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂
1、细胞:贴壁细胞株
2、试剂:0.25,胰酶、1640培养基(含10,小牛血清)
3、仪器和器材:倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等
三、操作步骤
1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2、加入0.5—1ml 0.25,胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。
观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37?下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
附:消化液配制方法:
称取0.25克胰酶蛋白酶(活力为1:250)，加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4?保存，用前可在37?下回温。
胰酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02,。
实验:细胞的原代和传代培养
1.实验目的
初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。
2.实验原理
从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养;当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1:2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
3.实验用品
3.1 材料和标本 乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)
3.2 器材和仪器 手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。
2.3 试剂 含有5,小牛血清的MEM培养液、0.01mol,L PBS，0.25,胰蛋白酶一0.02,EDTA混合消化液、75,乙醇。
4.实验方法
4.1 原代细胞培养
4.1.1 原理
细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如:动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
4.1.2 操作
?(取材
用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75,乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。
?(切割
用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
?(消化、接种培养
吸取0.25,胰蛋白酶一0.02,EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37?水浴中消化8,10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5,10ml含5,小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
4.1.3 结果
细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
4.2 传代细胞培养
4.2.1 原理
体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3,6次。细胞传代后，一般经过三个阶段:游离期、指数增生期和停止期。
常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数,100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2,,0.5,，肿瘤细胞可达3,5,。细胞接种2,3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
4.2.2 操作
?(将长成单层的原代培养细胞或HeLa细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置5,10分钟。
?.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即
在超净台中将消化液倒掉，加入3,5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。
?(将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。
4.2.3 结果
一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2,4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。
4.3 器材及液体的准备和无菌操作的注意事项
4.3.1 器材和液体的准备
细胞培养用的玻璃器材，如:培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，120?，2小时干烤灭菌后备用;手术器材、瓶塞、配制好的PBS液用灭菌锅15磅，20分钟蒸气灭菌;MEM培养液、小牛血清、消化液用G6滤器负压抽滤后备用。
4.3.2 无菌操作中的注意事项
在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75,乙醇消毒。操作前20,30分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。
5(实验报告
(1).原代细胞和传代细胞培养有哪些区别? (2).总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。
细胞传代培养
一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂
1、细胞:贴壁细胞株
2、试剂:0.25,胰酶、1640培养基(含10,小牛血清)
3、仪器和器材:倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等 三、操作步骤
1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2、加入0.5—1ml 0.25,胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。
观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37?下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
附:消化液配制方法:
称取0.25克胰酶蛋白酶(活力为1:250)，加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4?保存，用前可在37?下回温。
胰酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02,。
细胞的冻存和复苏
一、原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在,130?以下的低温中能
减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的,5,0?，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
二、操作步骤
(一)冻存
1、消化细胞(同实验二)，将细胞悬液收集至离心管中。
2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。
3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。
4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 7、按下列顺序降温:室温?4?(20分钟)?冰箱冷冻室(30分钟)?低温冰箱(,30? 1小时)?气态氮(30分钟)?液氮。
注意:操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1,1.5月。
(二)复苏
、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37?的温水。 1
2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。 6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37?培养，第二天观察生长情况。 三、试剂和器材
器材:液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管、吸管、离心机等
试剂:0.25,胰酶、培养基、含保护剂的培养基(即冻存液) 附:冻存液配制:
培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4?下保存。
细胞计数及活力测定
一、原理
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
二、仪器、用品与试剂
1、仪器与用品:普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪(或分光光度计)
2、试剂:0.4,台盼兰，0.5,四甲基偶氮唑盐(MTT)、酸化异丙醇 3、材料:细胞悬液
三、操作步骤
(一)细胞计数
1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。
4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:
细胞数/ml,4大格细胞总数/ 4×10000
注意:镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
(二)细胞活力
1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。
2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。
3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。
、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。 4
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。
活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
(三)MTT法测细胞相对数和相对活力
活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。
l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。
2、沉淀加入0.5,1ml MTT，吹打成悬液。
3、37?下保温2小时。
4、加入4—5 ml酸化异丙醇(定容)。打匀。
5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。
注意:MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 附:1、0.4%台盼兰染液配制:
台盼兰0.4克加双蒸水至100 ml。
2、MTT配制:
MTT0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4?下保存。 3、酸化异丙醇配制:
异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。
动物细胞培养:细胞传代培养
实验目的 实验原理 实验材料、用品 实验步骤
实验结果 实验报告 注意事项 思考题
熟练掌握细胞的传代培养法。
传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。
***材料:培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75,酒精棉球，酒精灯，培养细胞。
***药品:培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25,胰蛋白酶，Hanks液。
***仪器(请参看仪器图库):C0培养箱，倒置:显微镜，超净台。 2
1(人无菌室之前用肥皂洗手，用75,酒精擦拭消毒双手。
2(倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37?下预热。
3(超净台台面应整洁，用0.1,新洁尔灭溶液擦净。
4(打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。
5(点燃酒精灯;取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮头;过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。
6(将培养用液瓶口用75,酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7(倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2—3 mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
8(每个大培养瓶加入1 mL胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。
9(加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7,10 mL,大瓶，3,5 mL,小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
10(对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。
1(试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤?
2(判断细胞健康的标准是什么?
1(传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。
2(每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准:健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。
3(如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。
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2. 问:请问word 中怎样让每一章用不同的页眉,怎么我现在只能用一个页眉，一改就全
部改了,
答:在插入分隔符里，选插入分节符，可以选连续的那个，然后下一页改页眉前，按一下“同前”钮，再做的改动就不影响前面的了。简言之，分节符使得它们独立了。这个工具栏上的“同前”按钮就显示在工具栏上，不过是图标的形式，把光标移到上面就显示出”同前“两个字来。
3. 问:如何合并两个WORD 文档，不同的页眉需要先写两个文件，然后合并，如何做,
答:页眉设置中，选择奇偶页不同与前不同等选项。
4. 问:WORD 编辑页眉设置，如何实现奇偶页不同 比如:单页浙江大学学位论文，这一个容易设;双页:(每章标题)，这一个有什么技巧啊,
答:插入节分隔符，与前节设置相同去掉，再设置奇偶页不同。
5. 问:怎样使WORD 文档只有第一页没有页眉，页脚,
答:页面设置,页眉和页脚，选首页不同，然后选中首页页眉中的小箭头，格式,边框和底纹，选择无，这个只要在“视图”――“页眉页脚”，其中的页面设置里，不要整个文档，就可以看到一个“同前”的标志，不选，前后的设置情况就不同了。
6. 问:如何从第三页起设置页眉,
答:在第二页末插入分节符，在第三页的页眉格式中去掉同前节，如果第一、二页还有页眉，把它设置成正文就可以了
?在新建文档中，菜单―视图―页脚―插入页码―页码格式―起始页码为0，确定;?菜单―文件―页面设置―版式―首页不同，确定;?将光标放到第一页末，菜单―文件―页面设置―版式―首页不同―应用于插入点之后，确定。第2 步与第三步差别在于第2 步应用于整篇文档，第3 步应用于插入点之后。这样，做两次首页不同以后，页码从第三页开始从1 编号，完成。
7. 问:WORD 页眉自动出现一根直线，请问怎么处理,
答:格式从“页眉”改为“清除格式”，就在“格式”快捷工具栏最左边;选中页眉文字和箭头，格式,边框和底纹,设置选无。
8. 问:页眉一般是---------，上面写上题目或者其它，想做的是把这根线变为双线，WORD 中修改页眉的那根线怎么改成双线的
答:按以下步骤操作去做:
?选中页眉的文字，包括最后面的箭头?格式,边框和底纹?选线性为双线的?在预览里，点击左下小方块，预览的图形会出现双线?确定?上面和下面自己可以设置，点击在预览周围的四个小方块，页眉线就可以在不同的位置。
9. 问:Word 中的脚注如何删除,把正文相应的符号删除，内容可以删除，但最后那个格式还在，应该怎么办,
答:步骤如下:1、切换到普通视图，菜单中“视图”――“脚注”，这时最下方出现了尾注的编辑栏。2、在尾注的下拉菜单中选择“尾注分隔符”，这时那条短横线出现了，选中它，
、再在下拉菜单中选择“尾注延续分隔符”，这是那条长横线出现了，选中它，删除。删除。3
4、切换回到页面视图。尾注和脚注应该都是一样的。
10. 问:Word 里面有没有自动断词得功能常常有得单词太长了，如果能设置下自动断词就好了
答:在工具―语言―断字―自动断字，勾上，word 还是很强大的。
11. 问:如何将word 文档里的繁体字改为简化字,
答:工具―语言―中文简繁转换。
12. 问:怎样微调WORD 表格线,WORD 表格上下竖线不能对齐，用鼠标拖动其中一条线，可是一拖就跑老远，想微调表格竖线让上下对齐，请问该怎么办,
答:选定上下两个单元格，然后指定其宽度就可以对齐了，再怎么拉都行pressAlt，打开绘图，其中有个调整坐标线，单击，将其中水平间距与垂直间距都调到最小值即可。打开绘图，然后在左下脚的绘图网格里设置，把水平和垂直间距设置得最小。
13. 问:怎样微调word 表格线,我的word 表格上下竖线不能对齐，用鼠标拖动其中一条线，可是一拖就跑老远，我想微调表格竖线让上下对齐，请问该怎么办,
答:可以如下操作:?按住ctl 键还是shift，你have a try?double click the line, try it )?打开绘图，设置一下网格(在左下角)。使水平和垂直都为最小，试一把～,?press Alt
14. 问:怎么把word 文档里已经有的分页符去掉,
答:先在工具―― 选项―― 视图―― 格式标记，选中全部，然后就能够看到分页符，delete 就ok了。
15. 问:Word 中下标的大小可以改的吗
答:格式―字体
16. 问:Word 里怎么自动生成目录啊
答:用“格式样式和格式”编辑文章中的小标题，然后插入-索引和目录
17. 问:Word 的文档结构图能否整个复制 论文要写目录了，不想再照着文档结构图输入一遍，有办法复制粘贴过来吗,
答:可以自动生成的，插入索引目录。
18. 问:做目录的时候有什么办法时右边的页码对齐,比如:1.1 标题..........11.2 标题...............2
答:画表格，然后把页码都放到一个格子里靠右或居中，然后让表格的线条消隐就可以了，打印出来就很整齐。
19. 问:怎样在word 中将所有大写字母转为小写,比如一句全大写的转为全小写的答:格式-更改大小写-小写
20. 问:在存盘的时候，出现了问题，症状如下:磁盘已满或打开文件过多，不能保存，另开新窗口重存也不管用。如何解决,
答:把word 文档全选，然后复制，然后关掉word，电脑提示你粘贴板上有东西，要不要用于别的程序，选是，然后，再重
新打开word，然后粘贴，然后，保存。
21. 问:WORD 中的表格一复制粘贴到PPT 中就散掉了，怎么把WORD 里面的表格原样粘贴到PPT 中,
答:1)比较好的方法是:先把表格单独存为一WORD 文件，然后插入,,对象，选由文件创建，然后选中上面的WORD 文件，确定;2)还可以先把表格copy 到excel 中，然后copy 到PPT 中，这个也是比较好的办法;3)可以先做成文本框，再粘贴过去;4)复制粘贴，但是在PPT 中不能粘在文本框里面;5)拷屏，做成图片，再弄到PPT 里面。
22. 问:有没有办法将PPT 的文字拷入WORD 里面,
答:另存就可以了。只要以.rtf 格式另存即可
23. 问:word 中图片的分栏如何处理,假如有:1 2 图3 4 这样的结构，我想实现:1 3 图(要横跨两栏)2 4 但是，试了半天总是:1 2 图3 4 怎么办呀,help～
答:设置图片格式――版式――高级――文字环绕――环绕方式选上下型――图片位置――对齐方式选居中――度量依据选页面，要先改文字环绕，然后才能改图片位置
24. 问:用word 写东西时字距老是变动，有时候自动隔得很开，有时候进入下一行的时侯，上一行的字距又自动变大了，这是为什么,怎么纠正啊,
答:是因为自动对齐的功能，格式――段落――对齐方式可以选。还有允许断字的功能如果
check 上，就不会出现你说的情况了。
25. 问:在使用WORD 的样式之后，如标题1、标题2 之类的，在这些样式前面总会出现一个黑黑的方块，虽然打印的时候看不到，但看着总是不舒服，有没有办法让它不要显示呢, 答:“视图”,,“显示段落标志”，把前面的勾去掉。其实这个很有用，可以便于知道哪个是标题段落
26. 问:文章第一页下面要写作者联系方式等。通常格式是一条短划线，下面是联系方式，基金支持等。这样的格式怎么做出来,就是注明页脚吗,
答:插入――脚注和尾注
27. 问:文字双栏，而有一张图片特别大，想通栏显示，应该怎么操作, 答:可以选择的内容，按双栏排。选择其他内容，按单栏排。
28. 问:Word 里面如何不显示回车换行符,
答:把视图-显示段落标记的勾去掉或工具-选项-视图-段落标记
29. 问:有没有方法把WORD 里的软回车一下子替换掉,识别出来的文字全带着软回车，能把他们一次全删掉吗,,
答:查找，替换，按CTRL+H;软回车好象是^l，在特殊字符里有
30. 问:在WORD 里的框框里怎么打勾,
答:画个文本框，文本框里写一个钩，然后拖过去;或者先在WORD 里插入符号“?”，然后选中“?”，到-》格式-》中文版式-》带圈字符-》选“?”
31. 问:还是不行，这样拷过去的框框字体是windings 的，而原来的是宋体的，两者有很大的区别。
答:根据模板新建专业型传真，里面有框，双击后打勾，copy 就ok
32. 问:Word 中怎么在一个英文字母上打对号,
答:透明方式插入图片对象，内容是一个?
33. 问:WORD 里怎么显示修订文档的状态,文档修订后，改后标记很多，但是在菜单里没有“显示修订最终状态”等，怎么调出来,
答:工具,自定义,命令,类别(工具),命令(修订),把“修订”等拖到工具栏上
34. 问:怎样把许多分开的word 文档合并成一个文档。我的论文是按照章节分开写的，但现在图书馆要提交电子版的学位论文，是一个文档的，我找了很多选项但好象不能合并，选择插入文件功能，可以加入内容，但文档中的页眉却插不进去，有谁有高见, 答:acrobat6 可以直接把多个文档打印成一个pdf 文档。可以提交pdf 格式的论文，先一个一个word 文档转换为pdf 格式的，然后在pdf 文档菜单的文件菜单中，选上作为pdf 格式打开，追加上就可。
35. 问:Word 里面要写方程式怎么办啊,
答:插入,对象,公式编辑器equation，如果没有公式编辑器Equation，要自己从光盘中安装，或者安装Mathtype 公式编辑器按右键把它拖出来,,插入,,命令,,自定义,,工具应该是倒过来
36. 问:想在WORD 里面表示矩阵，怎样才能画出那个很大的矩阵括号, 答:装公式编辑器mathtype 好了~:)
37. 问:Word 的公式编辑器怎么安装,
答:工具,自定义,插入,公式编辑器，把它拖到工具条上即可;或者安装OFFICE 后，再次安装，选增加功能吧，会有提示的
38. 问:Word2000 下调用公式编辑器的快捷键
答:点击菜单[工具]-[自定义]，点击对话框下方[键盘]，在[类别]里选择[插入]，在命令里选择[InsertEquation]，指定你的快捷方式
39. 问:WORD 中出现公式的行往往要比只有文字的行来得宽，如何把这些行改的跟只有文字的行一样宽,
答:段落行距设为固定值即可。这样会有一个问题，比如设置为18 磅，有些公式符号(特别是有下标的)不能全部显示打印稿可以显示。怎么解决这个问题,这个如何解决还需要考虑。
40. 问:我的文档就是公式多，应该怎么办,
答:公式多的时候，最好的消除这个问题的办法就是每打几个公式就要存盘，如果连续打太多，就会出现这个问题。出现问题的时候:?选中所有内容，ctrl，C?把WORD 所有文档关闭。
?最关键:出现一条信息，务必选择“是”?重新打开WORD 编辑器，?ctrl，V，粘贴?ctrl，S，存盘
41. 问:怎样在word 里面的公式编辑器中输入空格,
答:ctrl+shift+space
42. 问:如何使word 中公式全都小一号,一个一个选实在麻烦
答:在Mathtype公式编辑器中:首先，在Mathtype 中的菜单Size 中选define,定义所需的字号大小;再次，在Mathtype 中的菜单preferences 中的equation preference 的save to file 存贮所定义的字号文件;返回word 中:在Mathtype菜单中选Format equation1)在MathType preference file 中，选你刚才所定义的文件;2)在Range 中，选Whole document。最后，选OK，即OK了。
43. 问:如何将WORD 中的公式编缉拉到外面
答:工具,自定义,命令,插入,右边找公式编辑器，往上脱
44. 问:怎样可以去掉word 里面公式，或是图片上方总是出现的灰色的横条啊,以前没有的，不知道怎么跑出来了，看着怪晕糊的。。。。。
答:工具,选项-视图-域底纹，选不显示，或选取时显示，就可以了
45. 问:整个论文用一个WORD 文档，太大，不好编辑，一个地方有增删，后面那么长一个文档版面分布会变得乱七八糟，特别是图表之类的东东。想让每章的偶数页自动显示自己的章号和题目，WORD 里这个能够自动实现吗,
答:不要整个论文放一个WORD 文档，一章一个，然后每章就可以奇偶分开处理了
46. 问:论文按照章节写的，想把它们合并成一个文件，并保持原有的文件格式。采用了在文件末尾插入分节符的方法，但插入后有些文件的部分格式发生了变化，请问如何解决, 答:用主控文档的方法比较好，在大纲模式里设置的;采取插入文件的方式，格式有些变化
47. 问:WORD 里边怎么样显示行号,
答:在页面设置那里，板式选项，最下面有个行号选项
48. 问:Word 里面怎么插入半个空格,
答:先在word 的工具栏上，点中双箭头那个纽，就可以看到原先看不到的空格，然后再编辑一下这个空格的大小，比如小五或小四什么的。
49. 问:只要一回车，或是改变光标位置的任何操作，都会使上一行的)变成,，有人遇到过这个问题么,
答:是不是设置了自动替换啊，符号里的自动替换看看吧～
50. 问:WORD 有没有可以按单词的首字母进行排序,就是从A-Z 进行排 答:表格中的内容可以按照拼音排序，弄到excel 里，排序，再回来
51. 问:怎么在word 里面打R^2
答:先打R2，然后用鼠标选中2,同时按Ctrl，“shift”和+
52. 问:Word 中发现空格都是小圆点，是怎么回事情,每输入一个空格就出现一个小圆点，怎么把它消除掉啊,这个空格会打印出来吗,
答:不会打印出来，如果想不显示:工具,选项,视图格式标记中前面的勾去掉即可
53. 问:word 如何使两个表格能排在一起,我做的表格每一个都比较小，但是表格数比较多，我想两个表格排成一行，请问该怎么做,
答:试试在局部分栏，每个分栏中一个表格。
54. 问:为什么换机器打开WORD 文档排版变了,在一台机器上排好板的WORD 文档换在另一台机器打开就变了,页码都不对了，怪哉。
答:是默认的页面设置不一样吧，或者版本不同
55. 问:Word 里面插入表格的问题，同一表格前后两行被分在了不同的页上，想他们在同一页怎么做,
答:转换成图文框可能更容易排版一点，或者加个文本框
56. 问:怎么在word 里画坐标图在word 里有了坐标图，文字却加不加去怎么办 答:作图时直接将文字加上去;word 中的绘图工具条，文字环绕里面寻找合适的方案，把图放在文字的底层
57. 问:WORD 文件有密码，怎么办呢,
答:找破解软件，比如advanced_office_2000_password_recovery_pro_v1.03，但不一定好用。
58. 问:怎么给word 文档加密,
答:打开文档，另存为―工具―常规选项―打开、修改权限密码，保存
59. 问:Word 文件怎么转化为postscript 文件,
答:先转化为pdf，然后打印到文件，通过distiller 生成ps。
60. 问:Word 无法识别origin 中的汉字怎么办,用origin 做的图形中有汉字，copy 到word 中就成了问号，因此我不得不先用export 把图形变为jpg 文件才能解决这个问题，有没有方便的解决办法,
答:ORIGIN 里面的字体改成宋体或者仿宋
61. 问:请教怎么把Origin 中的图表拷贝到Word,
答:点origin 的Edit 菜单里的copy page 到word 里粘贴就行了
62. 问:把origin 的图复制粘贴到word，总有一大块的空白，这个空白有什么工具可以去掉吗,还有就是用word 自带的图表工具画图时，也是有一大块空白去不掉，这个可以解决吗,
答:右键选择图片工具栏，点裁减
63. 问:插入的图片为什么老是处于页面的顶端，想拖下来放到其他地方，却又自动跑到顶端去，就是拖不下来，请问该如何处理
答:改变图片的属性，就可以了。
64. 问:如何保证一幅图像固定在某一段的后面，另一段的前面，而不会因为前面段落的删减而位置改变,
答:右键点击图片,设置对象格式―版式―嵌入型
65. 问:如何把在WORD 里面图形工具画的图转化为jpg,
答:另存为html 格式，然后在html 文件对应的文件夹里找
66. 问:请问什么格式的图片插入word 最清晰,手头持有png 和tif 格式，复制粘贴到word 中模糊一片，请问转换成什么图片格式用于word 最清晰,什么方法(插入图片来自文件还是直接复制粘贴)对清晰度有否影响,
答:emf，eps 等矢量图最清晰，不会因为缩放损失分辨率，而jpeg，bmp 等点阵图就不行了。
67. 问:在WORD 中如何让图片的左、上、下边都是文本,
答:在分栏的数量为1的情况下实现。图片选中后右键，设置图片格式--版式-四周型就可以了
68. 问:jpg 文件插入word 文件以后怎么让文件变小,jpg 格式图片插到word文件以后文
件变的巨大，有什么方法可以让它小一点,最好能一张软盘放的下。
答:两个方法:?用photoshop 改变图片的分辨率，当然要看得清楚，然后插入word?word 有强大的压缩功能，把文档另存为比如:temp.doc，看看是不是小了很多。
69. 问:Matlab 仿真图片大家一般怎么弄到word 里面的相对横轴和纵轴修改一下的说 答:一般都是在Matlab 里面把所有的直接修改好了，然后再保存的时候用jpg 格式，在word 中间导入就好了
70. 问:如何向WORD 中的图片添加文本,想在图片上输入一些说明文字 答:插入文本框，将版式设成“悬浮”在WORD 的绘图工具里面有个自选图形，找到你要的括号，直接在页面上画就可以了。可以移动，大小也可以改。然后把他挪到文字边上，即可。一个小窍门就是用CTRL+箭头可以进行微调。如果你觉得经常需要对这些文字编辑，怕图形错位的话，可以将需要的文字打在一个文本框里，记得将文本框设置成透明无色的(这样就看不见文本框了)，然后将文本框和你的括号(或其他符号)组合成一个图形，就万无一失了
71. 问:AUTOCAD 的图拷贝到WORD 下如何处理
答:有几种办法:一是可以在WORD 中进行CAD 编辑的方法:将CAD 的背景设为白色，然后将CAD 窗口缩小，到你想复制的图形的大小，正好可以容纳就可以了，否则WORD 里面有很大的空白，然后，拷贝，选中所有的图形中的线条，右键。到WORD 中粘贴。二是，先转为wmf 文件，具体先将窗口缩小，如上，然后，按emport，选中线条，存储。WORD 中，插入，图形，来自, 文件，找到文件就可以插入了。
72. 问:文章用WORD 打开时，原有的公式全是红叉，以及WORD 中图变成red cross(红叉)怎么办,
答:基本上没有办法挽救回来了，只能重新插一遍图。据微软的技术支持所说，红叉是由于资源不够引起的。也就是说，如果你所编辑的文档过大，可能因为资源问题导致图片无法调入，从而显示红叉。可是实际情况是，有时候所编辑的文档并不大，可是还是出现红叉。这就可能是因为你设置了快速保存，在选项菜单中可以找到。这是由WORD 的文档结构所决定的。当你设置为快速保存时，每次保存的时候只是把你改动过的部分添加到文档尾部，并不重写文档本身，以达到快速的目的。所以，你会看到一个本来并不长的文档的实际大小可能有好几兆。当取消了快速保存后，文档长度将大大减小。还有一个减小红叉出现可能性的办法是把图片的属性中的浮动去掉。这样可能在编辑的时候有一定的困难，但是对于避免红叉的出现确实很灵。再说一句，一旦红叉出现了，应该是没有办法恢复的，只有再重新贴图。
73. 问:如果Word 突然定在那里了怎么办,
答:重新打开会回复，或者在word自身的templates 里面找到近期文件，重写的不用太多。
74. 问:如何解决word 说磁盘已满不让保存的问题,
答:有时候，当要保存一个文件时，Word 会弹出一个对话框说是磁盘空间已满，无法保存文件，可实际上磁盘上空间还很大。这是非常令人恼火的一件事情。这一信息最常见的原因是Temp 文件夹已经达到了一个文件夹中可以包含的最多文件数的上限。这时的解决方法很简单:在【资源管理器】中右击安装有Windows 系统的磁盘，在出现的快捷菜单中单击【属性】，将出现【属性】对话框，从【常规】选项卡中选择【磁盘清理】按钮，此时将出现【磁盘清理】对话框。执行磁盘清理完毕以后，Windows 会弹出一个新的对话框。在【要删除的文件】框中选中【临时文件】选项，然后选择【确定】。Windows 将删除临时文件。要人工删除临时文件，进入临时文件夹，删除任何旧的临时文件(临时文件以波浪号开始，以(tmp 扩展名结束)，返回Word，再次试着保存文件。如果此时还不能正确保存文档，可以采取以下的方法，步骤如下:(l)按Ctrl，A 选定整个文档。(2)按Ctrl，C 将整个文档复制到内存中。(3)关闭Word 程序。此时系统会提示:您将大量文本放在了'剪贴板'中，是否希望在退出Word 后这些文本仍可用于其他程序,。(4)选择【是】按钮。(5)重新打开Word 程序。(6)按Ctrl，V，将复制下来的文本粘贴到新文件中。注意:在删除临时文件时，可能会出现一个对话框，提示不能删除正在使用的文件。这是因为Windows 运行的时候，需要不断地用到一些临时文件。因而，在人工删除临时文件时，试着在开始时只删除几个文件，然后对桌面上的回收站进行清空。否则可能无法删除所有选择的文件。
范文四：细胞传代培养
细胞传代培养
XXX,YYY,ZZZ
(版权所有，仅限个人)
一、实验目的：
1、了解动物细胞传代培养的基本原理。
2、掌握动物细胞传代培养的基本操作，并对Hela细胞进行穿传代培养。
二、实验原理;
对于贴壁生长的细胞来讲，随着培养时间的延长，细胞分裂增殖，数量越来越大，逐渐会在培养瓶底壁形成一完整的细胞层，细胞之间因接触性抑制作用而停止生长，此时就需要对细胞进行传代。
（一）传代培养准备工作：
1、紫外灯照射灭菌：
实验进行前无菌室及无菌操作台紫外灯照射30分钟灭菌,关闭大灯15min后可进入
2、预热培养用液：
培养基、血清、胰酶使用前水浴加热至细胞生长温度
3、使用物品入台
肥皂洗手后，以75%酒精将手消毒至手腕处,所需培养基,血清,细胞,胰酶以75%酒精棉擦拭后放入操作台边缘.
4、开始实验：
酒精棉消毒手和手臂,(消毒后的手不可以再碰别的东西),进入操作台
（二）传代详细过程：
1、配制新培养液：
按照所需血清浓度配置新培养液，一般先加血清，再加培养基，然后将两者用5ml的移液管混匀。
2、吸出旧培养液：
消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量、不同细胞等诸多因素影响
3、1mL0.25％胰酶消化：
初次传代细胞的解离程度可以通过倒置显微镜下直接观察判断，一般以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度。
长期传代的细胞可以通过平日观察为参考，一般以观察到瓶底细胞出现针孔样缝隙为标准。
4、终止消化：
吸出胰酶，将3ml的新培养液加入瓶里终止消化。
5、扫描式吹打：
用移液管吸取培养瓶内液体，从瓶口开始，采用扫描式方法反复吹打瓶皿底壁。
6、确定再培养细胞密度：
确保细胞已经被全吹下来后，用移液管将细胞悬液轻轻混匀，然后吸出一定量的细胞悬液扔掉或是接种于新瓶中。
7、确定再培养细胞密度：
确保细胞已经被全吹下来后，用移液管将细胞悬液轻轻混匀，然后吸出一定量的细胞悬液扔掉或是接种于新瓶中。
8、补加培养液：
补加新培养液，使瓶内液体体积在4.5-5ml之间
三、实验操作：
以下是我通过学习对细胞传代培养操作步骤的介绍：
1、洗手：先用肥皂洗至肘部，再用75%酒精擦洗至肘部。洗完后，实验前不得接触任何物品。
2、将手伸进利用UV灭菌后超净工作台，玻璃窗不得大开。
3、将所有瓶样用具均用75%酒精擦拭外表面，注意要按一个方向从上往下擦。
4、然后将移液管和橡胶洗耳球（插式）过火：移液管左手持拿，且不得拿在刻度以下，尖端向上倾斜，先将钝端过火，然后缓缓过至尖端，一定要按这个方式过火，以便使其中的水汽逸出。可采用旋转一次过火，或每次一面多次过火，总之要使移液管每一寸都被火灼过。橡胶洗耳球可靠近火焰吹吸3-4次。然后将二者插紧，平架在平放的镊子上，备用。同样方法过火3支。
5、取一小瓶做配液瓶，瓶口瓶盖均过火。
6、将1640培养液瓶瓶口过火，然后左手持瓶，右手开盖，将瓶口以及瓶盖都过火，然后移取9mL于配液瓶中；同样过火，将TBD胎牛血清瓶过火，并移取1mL于配液瓶中，混匀，共10mL培养液，备用。
7、将旧瓶中的旧培养液全部吸出，注意移液管不得触及细胞贴壁面，只可将其触及底部，缓缓吸出。移取10mL备用培养液注入旧瓶中，吹打细胞。各方向，每点都要吹到，平均每点吹50次。吹好后，移取5mL于新瓶中。（新瓶事先用不含TBD的1640培养液润洗，便于细胞贴壁。）
8、盖好瓶盖放于37摄氏度培养箱中培养。大约3天即可长满瓶底，届时，可进行新一次分
9、以上只是某些情况下的大致操作，实际操作还需结合实际。另有很多注意事项，不一一列举。
四、实验现象;
要求：癌细胞浓度达到70%~80%
。
培养瓶Hela细胞镜检
五、小结：
通过本次实验，我了解了动物细胞传代培养的基本原理，掌握了动物细胞传代培养的基本操作，并对Hela细胞进行穿传代培养。在对实验操作的学习与掌握中进一步加深了对无菌操作重要性的认识。基本上达到了本次实验的目的与要求。
范文五：细胞传代培养
1细胞传代准备工作
1.1细胞传代所需培养液及试剂需提前放置于生物安全柜内预热至室温备用。
1.2细胞传代材料，滴管、移液管、培养器皿、计数板、橡皮乳头。
2细胞传代步骤
2.1人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2.2细胞传代前先在倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数观察。
2.3打开超净工作台的紫外灯照射台面30 min左右，关闭超净工作台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。
2.4超净工作台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。
2.5贴壁细胞的传代
2.5.1贴壁细胞用滴管或移液管吸去培养器皿中的旧培养液。
2.5.2酌情可用2～3 mL 0.02%EDTA溶液洗去残留的旧培养基。
2.5.3以25ml培养瓶为例，向瓶内加入1ml消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。
2.5.4在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后，应立即终至消化。
2.5.5吸除或倒掉消化液，加入少量的含血清的新鲜培养液，终至消化。
2.5.6用弯头滴管，吸取瓶内培养液，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液。
2.5.7计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液(7～10ml／大瓶，3～5 mL／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
2.6半悬浮细胞及悬浮细胞培养的传代
2.6.1半悬浮细胞先用滴管将细胞轻轻吹下来，把细胞悬浮液加入离心管离心（800～1000rpm, 5min），倒掉上清液。
2.6.2把细胞沉淀制成悬液，计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。
2.6.3悬浮细胞直接用滴管或移液管吸入离心管离心（800～1000rpm, 5min），倒掉上清液。
2.6.4把细胞沉淀制成悬液，计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。
2.6.5将培养器皿放回CO2培养箱培养（培养瓶培养需将瓶盖旋开半圈）。
2.6.6操作完毕，填写“细胞培养传代记录”。
3注意事项
3.1传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。
3.2每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。
3.3细胞培养传代吹打要轻柔不用用力过猛同时尽可能不要出现泡沫，这些都对细胞有损伤
一. 传代前准备：
1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3.正确摆放使用的器械，保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒精灯，注意火焰不能太小。
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。
6.取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
9稍微摇摇，然后从对侧倒掉培养液，用酒精棉球擦拭最后一滴，注意要靠近酒精灯。
二.胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，然后让其停止消化。
3.倒掉消化液加入培养液，弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液。注意要在对测加入培养液。
三.吹打分散细胞：
1.吹打制悬：用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心5分钟。
4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
四.分装稀释细胞：
1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml，最后要做好标记。
五.传代培养：
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。 六传代细胞培养注意事项：
1.严格的无菌操作
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。 附：0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)
配方：100ml PBS,0.25g胰酶
步骤：
1先配100mlPBS。
2 称胰酶0.25g。
3 加入PBS中，低速搅拌。
4 调PH7.4。
5 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完。
注意：低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活；对难消化的细胞，在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)
新手
细胞传代培养：
实验用品：75%酒精，酒精棉球，酒精灯，火柴，离心管（15ml）,离心机，吸管，胶帽，倒置显微镜，超净工作台，二氧化碳培养箱，25ml培养瓶（5个），培养瓶盖，大烧杯，镊子，D-Hanks液，胰酶（0.25%），RP1640培养基，小牛血清，滤膜，注射器，24孔板，计数板，盖玻片，记号笔，中性笔，白纸。
实验用品处理：
1、超净工作台：用75%酒精擦拭，放入2中所列物品后40分钟紫外照射。
2、二氧化碳培养箱：将内部托盘，托板，横架，竖架全部拆出来，75%酒精擦拭，放入超净台照射40分钟。箱内部用75%酒精擦拭，托盘内的水为蒸馏水1L加5克硫酸铜。
3、75%酒精，酒精棉球，酒精灯，火柴，大烧杯，滤膜，注射器，24孔板计数板（75%酒精擦拭后），盖玻片，记号笔，中性笔，白纸放到超净工作台内紫外照射40分钟。
4、离心管，胶帽，培养瓶盖115摄氏度高压15分钟，70摄氏度烘箱烤干。D-hanks液115摄氏度高压15分钟，放入超净台中。D-hanks工作液用前过滤。
5、培养瓶，镊子，吸管，121摄氏度高压20分钟，70摄氏度烘干。
6、RP-1640培养基先分装，90ml每瓶，然后使用之前75%酒精擦拭外表面，在二氧化碳培养箱中预热到37摄氏度。
7、胰酶从-20摄氏度拿到4摄氏度融化，，然后放到二氧化碳培养箱中几分钟，使温度达到最佳工作温度，胰酶用前过滤。
8、小牛血清10ml放到4摄氏度融化，然后加入到90ml培养基中，混匀，韩小牛血清培养基用前过滤。
9、离心机，倒置显微镜用75%酒精仔细擦拭，紫外照射40分钟。
细胞的传代培养：
1、倒掉瓶内旧培养液。（倒到大烧杯中，小心不要接触）
2、向25ml 培养瓶内加入lml胰酶消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后倒掉消化液后再加1-2ml新的消化液，轻轻摇动后，再倒掉大部分消化液，仅留少许进
行消化。（用吸管加消化液）
3、在倒置显微镜下对培养细胞进行观察，当细胞胞质回缩，胞间间隙增大时，加入含有血清的培养基终止消化。（用吸管加培养基）
4、用吸管吸去培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的部位应均匀，可按从上打下，从左到右的顺序进行，保证瓶底各个部位的细胞均能被吹到，此外吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。
5、将吹打后的细胞治愈倒置显微镜下观察，当发现原贴壁细胞均已悬浮于培养液中，成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止吹打。
6、收集细胞于离心管中，1000r/min离心3-5分钟，去除上清。（司徒镇强没有这一步）
7、细胞计数（计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液的细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。），按照1×105-1×106个细胞密度接种于新培养瓶或培养板中。
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