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范文一：含尿嘧啶DNA糖基化酶的聚合酶链反应检测血清HBVDNA
含尿嘧啶糖基化酶的 DN A
聚合酶链反应检测血清 HBV DN A
α 刘文恩 谭德明 张铮
() 附属湘雅医院传染科长 沙 410008
( ( ) 提 要 为探讨含 尿嘧啶 糖基化酶 试剂 抗污染 试剂, 2 ??dU T P DN A dU T P U D G PCR PCR PCR ) 抗 产物污染的能力及其在临床检测中的应用, 采用该试剂检测 204 份病毒性肝炎患者 ?dU T P U D GPCR
血清中 并与普通 试剂比较。结果显示: 抗污染 试剂有较强的抗污染能力, 至少可阻 , HBV DN A PCR PCR
( ) 止 100的 产物的污染。 该试剂与地戈辛素探针分子杂交所测结果的符合率 89132% 高于普通 ng PCR
()与分子杂交所测的符合率 81145% 。表明抗污染 试剂的应用有利于防止 产物的污染, 提 PCR PCR PCR
高 的准确性和特异性。PCR
3 尿嘧啶糖基化酶 关键词 聚合酶链反应; 乙型肝炎病毒;DN A
中国图书分类号 12373R
书进行。取 20标本处理液与等量血清标本混合, 置 Λl (DN A 聚合酶链反应 po lym e ra se ch a in re2 97? 13变性, 离心后取上清 10加于 反应管 m in Λl PCR ) 是目前检测血清 的敏, ac t io n PCR HBV DN A- 1 ( 中, 总反应体积为 50含 200?其中 , Λl Λm o lL dN T P 感方法之一, 其灵敏度比斑点杂交至少高 100由 取代, 10正、反 引 物 各 1, dT T P dU T P pm o l ΛlT aq 1 U ) 倍。由于其灵敏度高, 可合成丰富的 产 多聚酶 2和 10×缓冲液 5置 , 1, PCR DN A ΛlU D GPCR Λl
( ) 扩增仪 , 中, 经 37? 30DN A P e rk in E lm e rU SA m in 物, 待测标本即使有极微量的污染, 也会出现假 2, 3 预处理后, 94?变性 5, 接着 94? 1, 55? 1,m in m in m in 阳性。 为了提高 检测血清 PCR HBV DN A 72? 1, 共 35 次循环, 随后 72?延伸 5, 结束 m in m in 的可靠性, 作者应用抗污染 试剂检测血清 PCR 反应。 取 产物 10置 2% 琼脂糖凝胶中电 PCR PCR Λl 中 即 在 反 应 混 合 物 中 用 , HBV DN A PCR 泳, 溴乙啶染色后观察结果。 取代 同时加入尿嘧啶糖基 , dU T P dT T P DN A 113 地戈辛素2探针斑点杂交检测血清 HBV HBV () 化酶 , 破坏和清u rac il DN A g lyco sy la seU D G
应 用 地 戈 辛 素2标 志 和 检 测 药 盒 DN A HBV DN A 片段的污染, 试图探讨抗除含 的 dU T P DN A
() , 制备地戈辛素标 Bo eh r inge r M anbnh e im Ge rm any 污染 试剂的抗污染能力, 提高 的准 PCR PCR ( ) 记 的 全基因探针 本研究室制备, 待测标本取HBV 确性。 40经 变性后点样于硝酸纤维膜上, 经5Λl IN N aO H Λl
80?真空干燥 2, 使固定于纤维膜上, 按检测药 h DN A 1 材料与方法
盒说明书常规进行预杂交、杂交和免疫显色反应。显色 111 标本来源 收集附属湘雅医院传染科门诊送检 16后肉眼观察结果。h 的病毒性肝炎患者血清 204 份, 用 法测血清 EL ISA
() 感染标志物 华美生物工程公司的 试剂, HBV EL ISA 果2 结( 同时用长城生物工程公司的 试剂 批号, 101 -PCR R ) 961219 和 检测血清 。101- 970227R HBV DN A 211 抗 污 染 试 剂 的 抗 污 染 能 力 含PCR
112 抗污染 试剂检测血清 抗污染PCR HBV DN A 的 产物经 10 倍系列稀 dU T P HBV DN A PCR
试剂由珠海剑桥生物工程公司提供。 操作按说明PCR
( )释后, 作为污染源分别加至普通 和抗污染 267处可见明显扩增带 图 2。 结果表 当于 PCR bp
系统中, 观察其对 扩增结果的影响。 明抗污染 试剂至少可阻止 100产 PCR PCR PCR n g PCR
结果显示, 当加入污染源后严重干扰了 的物的污染。 PCR
- 4 特异性扩增, 当污染源稀释至 10时抗污染212 抗污染 试剂的敏感性 204 份血清 PCR
标本经抗污染 试剂检测, 发现 PCR 试剂能恢复特异性扩增的能力, 而普通PCR HBV DN A
阳性 76 份, 阴性 128 份, 与长城生物工程公司则不能, 表明抗污染 试剂有抗污染的 PCR PCR
() 能力 图 1。将含 产物回收定 检测 的 试剂比较, 差异无显著dU T P HBV PCR HBV DN A PCR
(( ) 量作 10 倍系列稀释 含量依次为 100P > 0. 05, 表 1。将 作 10 倍系性 DN A n g HBV DN A) () 至 10后加于含和不含的反应体 列稀释后 含量依次为 10210检测, p g U D G U D G DN A n g fg
() 抗污染 试剂的敏感性达 011图 3。系中进行 扩增。显示在含的反应管PCR p g PCR U D G
中未见扩增带, 而不含 的各反应管在相U D G
图 1 普通 PCR 及抗污染 PCR 检测血清 HBV DN P 的结果 1, 8: 普通 PCR 扩增带; 1′, 8′: 抗污染 PCR 扩增带; 1- 2- 8 和 1′: 不含污染源; 2, 8 及 2′, 8′: 污染源浓度依次分为: 10, 10A 1: HBV DN A 阳性 A 2 HBV DN A 阴性血清; : 标准分子量 图 2 抗污染 试剂抗污染能力 1, 5: 含′, 5′: 不含及 6′阴性对照; : 标准分 ; 1; 6 M PCR U D GU D GM 扩增的敏感性 子量 图 3HBV DN A PCR
, 8, . 1 ?1F igT h e re su lt s o f se rum HBV DN A de tec t io n by PCR w ith o r w itho u t dU T P U D G L ance s PCR w itho u tdU T P ?U D G; L ance s 1′, 8′, PCR w ith dU T P ?U D G; L ane s 1, 1′no co n tam ina t io n; L ane s 2, 8 2′, 8′co n ta ined ten2 - 2- 8 , 10; 101, , 2, fo ldSe r ia l d ilu t io n f rom o f du co n ta in ing DN A p lane A HBV DN A po sit ive se rum p lane A HBV ( ) DN A neg t ive se rum M : P GEM 23zf tH ae, F ig. 2 T h e ab ility in co n t ro l o f co n tam ina t io n o f PCR p ro duc t s w ith ?2?, 5, ; 1′, 5′: 6 6′, :1dU T P by PCR dU T P U D G L ane s w ith U D GL ane s no U D G L ane s and nega t ive co n t ro l M ( ) P GEM 23zf t?H ae, F ig. 3 T h e re su lt s o f sen sib ility o f HBV DN A am p lif ica t io n by PCR
抗污染 与普通 试剂检测血清 表 1PCR PCR 和 阳性血清中检出 16% 91HB eA g HBV DN A ( ) = 204的比较 HBV DN A n ( ) 65?71 , 和 抗 阳 性 血 清 HB sA g HB e HBV? ( ) 阳性例数P n 阴性例数 阳性率% ( ) 阳性率为 912% 776; 30 份 2? 阴DN A HBV m125 37抗污染 204 76 128 PCR性标本未检出 。 HBV DN A > 0. 05 40169 普通 204 83 121 PCR2 抗污染 及普通 与地戈辛素分子 表 2PCR PCR ?= 0. 51 ? 杂交检测血清 HBV DN A 符合率的比较 213 抗污染 试剂扩增的特异性 用地戈 PCR 分子杂交检测 阴阳符 符合率 辛标记的 探针将其中 178 份血清标本进 HBV n ( )结果 合例数 % 行斑点分子杂交, 54 份 阳性。 比较 HBV DN A + - ?抗污染 试剂与斑点分子杂交检测 PCR HBV 抗污染 178 159 + 52 17 PCR89132( 的 结 果, 两 者 检 测 的 符 合 率 89132% ,- 2 107 DN A ?178 145 + 48 27 普通 81145PCR) 159178高于普通 与斑点杂交检测结果 ?PCR - 6 97 ( ) 的符合率 81145% , 145?178, 经统计学处理,2 ?= 4. 4 P < 0.="" 05="" ?="" (="" )="" (="" )二者差异有显著性="" p="">< 0.="" 05表="" 2。="" 说明抗="">
污染 扩增有较高的特异性。 分析抗污染PCR 3 讨 论
: 一为标本之间的交叉污污染源有三DN A 感染标试剂检测 与血清 PCR HBV DN A HBV
() 染; 二为实验室环境质粒污染; 三为 扩增 志物 2检测之间的相互关系, PCR HBV m HB sA g
4 () 产物的携带污染2。 试剂的检出率。 以检 测率稍低于普通 ca r ryo ve r co n ta im in a t io n PCR
三种污染源中, 前两种可通过严格操作规程得 斑点杂交为判断标准, 抗污染 HBV DN A PCR
试剂检测 的符合率高于普通 以控制, 第三种则是污染的重要来源, 一旦发 HBV DN A PCR 生, 往往难以控制和清除。 防止 产物污染 试剂。本文还显示, 在抗污染 扩增阳性、普 PCR PCR 的技术主要有巢式 技术和 通 扩增阴性的 11 份标本中, 经斑点杂交 ?PCR dU T P U D G PCR
技术。后者是在 反应体系中以 取代检出 阳性 4 份; 而在抗污染 阴 PCR dU T P HBV DN A PCR
dT T P , 使产 物 片 段 中 均 含 有性、普通 阳性的 18 份标本中经斑点杂交 PCR DN APCR
。若 反应体系中含有 的 无一份阳性。故认为抗污染 试剂检测的特 dU T PPCR dU T P PCRPCR 产物的污染, 则在 ?反应体系中经 异性有明显提高, 其应用有利于防止 产物 dU T P U D G PCR 37?预处理阶段, 选择性地将含尿嘧啶的 的污染, 提高 的准确性和特异性, 使得 U D G PCR PCR
DN A 磷酸骨架上的尿嘧啶碱基裂解, 而对含正技术不失为研究和诊断感染的好方法。 HBV
常 胸腺嘧啶的模板 无破坏作用。 由于 DN A 参 考 文 献
不耐热, 该酶通过热变性失活也不影响新 U D G
陈渊卿, 严根宝, 蒲瑞莲, 等 1聚合酶链反应血清直接 1 DN A 扩增的 产物; 这样既防止了含 的PCR dU T P ( ) 法测定 HBV DN A 1 中华传染病杂志, 1990, 8 1: 6- 9 的扩产物的污染, 又不妨碍目的 PCR DN A2 Kw o rk S, H iguch i R. A vo id ing fa lse po sit ive s w ith PCR. 4 增。本文应用这一抗污染 系统检测血清 PCR , 1989, 327: 237- 238N a tu re
取得较满意的结果, 其抗 产物 HBV DN A PCR 3 K itch in PA , Szo tyo r i Z, F rom ho le C , et a l. A vo idance
. , 1990, 344: 201fa lse po sit ive sN a tu re 污染能力较强, 至少能阻止 100产物的n g PCR , , , 4 L o ngo M C M a rk SB e rn ige r JL et a l. U se o f u rac il DN A 污染。抗污染 试剂检测的敏感 PCR HBV DN A 2g lyco sy la se to co n t ro l ca r ryo ve r co n tam ina t io n in po ly2 性与普通 试剂相当, 可能由于使用 PCR dU T P. , 1990, 93: 125- 128m e ra se ch a in reac t io nGene 而令 合成难度增加, 也可能由于抗污染 DN A
的作用, 使检测的准确性增加, 导致抗污染试剂
Serum HBV D NA de tec ted by po lym era se cha in
?-rea c t ion w ith dUTP Ura c ilD NA g lyco sy la se
2L iu W en en T an D em in g Zh an g Zh en g
(), , , 410008D ep a r tm en t of I nf ectiou s D iseasesX iangy a H osp ita lH u nan M ed ica l U n iv ersity C h ang sh a
22 ?T h e ab ility o f PCR reagen t co n ta in in g dU T P u rac ilDN A g lyco sy la se fo r co n t ro llin g ca r ry
. 204 o ve r co n tam in a t io n o f PCR p ro du c t s w a s exp lo redA ll o f se ra tak en f rom h ep a t it is p a t ien t s
2?w e re u sed fo r HBV DN A de tec t io n b y PCR w ith PCR dU T P U D G reagen t in com p a r iso n w ith
. ?th a t w itho u t dU T P U D GT h e re su lt s show ed th a t it s eff ic ien cy o f co n t ro llin g co n tam in a t io n
. , 100. w a s ex ce llen tA t lea stco n tam in a t io n o f n g PCR p ro du c t s w a s go t r id o fT h e co r re spo n d in g
2?ra te o f HBV DN A de tec t io n b y PCR dU T P U D G in com b in a t io n w ith do t h yb r id iza t io n u sin g
( ) 289. 32% , 81. 45% d igo x in lab led HBV p ro b e w a s a s h igh a s h igh e r th an th a t o f PCR w itho u t
( )?P < 0.="" 05.="" 2?du="" t="" p="" u="" d="" g="" p="" lu="" s="" do="" t="" h="" yb="" r="" id="" iza="" t="" io="" n="" it="" su="" gge="" st="" s="" th="" a="" t="" pcr="" du="" t="" p="" u="" d="" g="" m="" e="" tho="" d="" co="" u="" ld="" p="" reven="" t="" pcr="" p="" ro="" du="" c="" t="" s="" f="" rom="" co="" n="" tam="" in="" a="" t="" in="" g="" an="" d="" in="" c="" rea="" se="" accu="" racy="" an="" d="" sp="" ec="" if="" ic="" ity="" o="" f="" pcr="" am="" p="" lif="" ica2="">
.t io n
32Key word s h ep a t it is B v iru s; po lym e ra se, ch a in reac t io n; U rac ilDN A g lyco sy la se
范文二：糖基化反应改善蛋白质功能特性的研究进展
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Lauber, Stephan M. Koza和Erin E. Chambers 沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德市) 应用优势 ■ 解析EPO N-联糖基化和O-联糖基化信息的两种简易策略 ■ 实现高度天线化游离N-糖和完整蛋白质糖型的前所未有的HILIC 分离 ■ 可兼容MS 的HILIC 能够详细研究样品成分■ 通过糖蛋白分离对ACQUITY UPLC? Glycoprotein BEH Amide糖蛋白分析专用柱(300?, 1.7 μm固定相)进行QC 测试，确保批次间重现性保持一致 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide, 300?糖蛋白分析专用柱(正在申请专利)糖蛋白性能测试标准品 GlycoWorks? Rapi Fluor-MS? N-糖分析试剂盒ACQUITY UPLC H-Class Bio系统Xevo ? G2-XS QTof质谱仪SYNAPT ? G2-S HDMS 关键词 ACQUITY UPLC H-Class Bio系统， BEH Amide 300?，糖基，糖基化蛋白质，糖基化，O-联，N-联，HILIC ，Rapi Fluor-MS 标记 简介 免疫球蛋白G (IgG )形态是许多蛋白质治疗药物的开发方向1。与此同时，各种重组人体激素和酶的问世也让许多高效的患者疗法得以实现。例如，促红细胞生成素(EPO ) α等刺激红细胞生成的治疗药物很早以前就被用于治疗贫血症。这一增加患者红细胞数的疗法最早由Epogen ?公司商品化，该产品于1989年经FDA 批准后在美国上市2。时至今日，随着生物制药行业的格局不断发展以及Epogen 专利过期 (2013年)3，EPO 药品成为了国际和国内生物仿制药市场的仿制对象。尽管促红细胞生成素α的一级结构相对较小，但它含有3个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点(图1) 4。由于糖基化的原因，尽管促红细胞生成素α的蛋白质质量仅为18 kDa，但其分子量却达到30～40 kDa。有趣的是，促红细胞生成素的糖基化与其功能和血清半衰期密切相关。有研究表明，其糖基谱图中有两个属性与其体内活性(包括天线化和唾液酸化作用)呈正相关关系5-7。因此，准确表征促红细胞生成素治疗药物的糖基化非常重要。此外，研究促红细胞生成素的糖基化还有另一项重要意义，那就是将详细的糖基分析作为开发有效的促红细胞生成素生物仿制药的重要途径。 图1. 重组人促红细胞生成素α (rhEPO )的序列和结构信息。 实验样品描述 将CHO 细胞表达的重组人促红细胞生成素α(PeproTech 、Rocky Hill、NJ )复溶于50 mM HEPES NaOH pH 7.9缓冲液中，得到浓度为2 mg/mL的溶液。 使用GlycoWorks Rapi Fluor-MS N-糖分析试剂盒从rhEPO 中释放 N-糖并对其进行Rapi Fluor-MS 标记，具体操作说明见维护和使用手册(部件号715004793)。进样90 μL Rapi Fluor-MS 标记的N-糖的SPE 洗脱物、100 μL二甲基甲酰胺和210 μL乙腈的 混合物。 为了分析O-糖基化，我们利用GlycoWorks Rapi Fluor-MS N-糖分析试剂盒维护和使用手册(部件号715004793)中所述的快速糖基释放技术对rhEPO 进行了N-糖基释放。 流动相A ： 50 mM甲酸铵，pH 4.4 (LC-MS 级；由100x 浓缩液制得，部件号186007081) 流动相B ： ACN(LC-MS 级) 流速 0.0 0.4 25 35.0 0.4 46 36.5 0.2 100 39.5 0.2 100 43.1 0.2 25 47.6 0.4 25 55.0 0.4 25 75 54 0 0 75 75 75 6 6 6 6 6 6 6 Rapi Fluor-MS 游离N-糖的MS 条件 MS 系统： Xevo G2-XS QTof 电离模式： ESI+ 分析仪模式： 分辨率(～40 K) 毛细管电压： 2.2 kV锥孔电压： 75 V 离子源温度： 120 °C 脱溶剂气温度： 500 °C 电离源补偿： 50 V 脱溶剂气流速： 600 L/h校准： 采集： Lockspray ： NaI ，1 μg/μL，100-2000 m/z700-2000 m/z，0.5 s扫描速率300 fmol/μL人血纤维蛋白肽B 的 方法条件(除非另有说明)色谱柱平衡 全新(之前未使用过的)ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide, 300?, 1.7 μm糖蛋白分析专用柱应通过两次或两次以上的连续进样和分离进行平衡，直至获得稳定一致的分析结果。更多信息请参阅色谱柱的维护和使用手册(部件号 720005408ZH )。 Rapi Fluor-MS 游离N-糖的LC 条件 LC 系统： 样品温度： 柱温： 流速： 进样体积： 色谱柱： ACQUITY UPLC H-Class Bio系统10 ?C分析柱60 ?C0.4 mL/min10 μL ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide, 300?, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm 糖蛋白分析专用柱(部件号176003702，配备糖蛋白性能测试标准品) 0.1%(v/v)甲酸溶液， 70:30水/乙腈(每90秒)数据管理： MassLynx?软件(4.1版) N-糖基释放rhEPO 的完整蛋白质HILIC 分析的LC 条件 LC 系统： 样品温度： 柱温： 流速： ACQUITY UPLC H-Class Bio系统10 ?C分析柱45 ?C0.2 mL/min (内源性荧光)，10 Hz 荧光检测条件： 激发波长265 nm/发射波长425 nm， 2 Hz 样品收集/样品瓶： 样品收集模块(部件号186007988) 聚丙烯材质12 x 32 mm螺纹口样品瓶，容积300 μL(部件号186002640) 荧光检测条件： 激发波长280 nm/发射波长320 nm 流动相A ： 含0.1%(v/v) TFA 的H 2O 流动相B ： 0.1%(v/v) TFA 的乙腈溶液 HILIC 进样体积： 1.3 μL(在不对色谱性能造成负面影响的 前提下，一根2.1 mm内径的HILIC 色谱柱 最多可承受约1 μL的水相进样。)色谱柱： ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide, 300?, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm糖蛋白分析专用柱 (部件号176003702，配备糖蛋白性能 测试标准品) 样品瓶： 聚丙烯材质12 x 32 mm螺纹口， 容积300 μL(部件号186002640) 梯度： 0.0 15.0 85.0 6 0.5 15.0 85.0 6 1.0 25.0 75.0 6 21.0 35.0 65.0 6 22.0 100.0 0.0 6 24.0 100.0 0.0 6 25.0 15.0 85.0 6 35.0 15.0 85.0 6 N-糖基释放rhEPO 的完整蛋白质HILIC 分析的MS 条件 MS 系统： SYNAPT G2-S HDMS 电离模式： ESI+ 分析仪模式： 分辨率(～20 K) 毛细管电压： 3.0 kV锥孔电压： 45 V 电离源补偿： 50 V离子源温度： 150 ?C脱溶剂气温度： 500 ?C脱溶剂气流速：800 L/h校准： NaI ，1 μg/μL，500-5000 m/z采集： 700-4800 m/z，1 s扫描速率 数据管理： MassLynx软件(4.1版) 本应用纪要展示了两种可用于详细研究重组人促红细胞生成素(rhEPO )的N-联糖基化和O-联糖基化的简易 策略。在本研究中，我们首先快速释放rhEPO 中的N-糖基，对其进行GlycoWorks Rapi Fluor-MS 标记，然后利用灵敏的荧光检测和质谱检测技术进行亲水作用色谱(HILIC )分析。在接下来的平行分析中，我们利用完整蛋白质的HILIC 分析甄别糖基释放的rhEPO ，以解析O-糖基化的相关信息。 结果与讨论 使用Rapi Fluor-MS 标记和HILIC 分析对rhEPO 进行游离N-糖分析 此前已有许多人对重组人促红细胞生成素(rhEPO )的糖基化进行过研究4-5, 8-13。之前的这些研究在很大程度上需要使用多项相关技术。本研究的目标是为EPO 分析建立两种简易的基于LC 的互补方法，分别用于获取N-糖基化和O-糖基化的相关信息。 借助采用新型糖基标记试剂Rapi Fluor-MS 的样品制备新策略，我们可轻松得到rhEPO 的N-糖谱图。该样品制备策略基于GlycoWorks Rapi Fluor-MS N-糖分析试剂盒，分析人员可快速释放N-糖并采用能提高荧光检测和电喷雾离子质谱(ESI-MS )检测灵敏度的标记物对其进行标记14。在之前 的应用纪要中，Rapi Fluor-MS 主要用于分析各种IgG 样品14-16，但除此之外，采用GlycoWorks Rapi Fluor-MS N-糖分析试剂盒的实验方案，即使面对rhEPO 等高度糖基化的蛋白质，分析人员同样能轻松完成样品制备。 经验证，Rapi Fluor-MS 标记的N-糖适用于进行亲水作用色谱(HILIC )分析。因此，Rapi Fluor-MS 的HILIC-荧光-MS 分析已成为了一种适用于蛋白质N-糖基化详细研究的强大工具14 。 为了实现上述目的，本研究利用HILIC 分析了由rhEPO 制备的Rapi Fluor-MS N-糖样品。我们选用了最近推出的大孔径酰胺色谱柱 — ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide, 300?, 1.7 ìm糖蛋白分析专用柱，以期达到最优的N-糖分离分析分离度。该色谱柱专为糖肽和糖蛋白等大分子的HILIC 分离而设计，而研究表明，其大孔径颗粒结构还能使高度支链化的三天线和四天线N-糖的峰容量增加10–20%17，因此该色谱柱也是对通常具有高度天线化结构的EPO N-糖进行HILIC 分析的理想选择。图2A 展示了得自0.4 μg rhEPO的Rapi Fluor-MS N-糖的HILIC 荧光和基峰强度(BPI ) MS谱图。虽然本次分析的样品量相对较少，但成功获得了高信噪比的谱图。 荧光检测的灵敏追踪有助于分析实现准确的相对定量。虽然我们可以观察到MS 灵敏度随着N-糖结构的增大而降低，但MS 谱图的信噪比仍然值得我们关注。而Rapi Fluor-MS 试剂和具有更高传输效率及灵敏度的新一代MS 仪器Xevo G2-XS QTof的结合，让这些特定数据的质量得到了保障。如图2B 中的质谱采集结果所示，该QTof 技术可达到前所未有的灵敏度和高质量数分辨率，图2B 在本研究中被用作指认N-糖物质的依据。 图2. rhEPO游离N-糖的HILIC 分析。RapiFluor-MS 标记的rhEPO 游离N-糖的(A )荧光谱图和(B )基峰强度(BPI )谱图。 使用ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide, 300?, 1.7 ìm, 2.1 x 150 mm糖蛋白分析专用柱分析来自0.4 ìg蛋白质的糖基获得色谱图。(C )四种N-糖物质的MS 谱图。根据Oxford Notation列出了N-糖指认结果。“+Ac”表示乙酰化，如之前曾有报道的唾液酸残基(Neu5Ac )的O-乙酰化8。 该分析方法所具备的色谱和质谱级灵敏度简化了N-糖指认过程，让分析人员能够轻松绘制rhEPO N-糖物质的N-糖谱图(图3)。 本研究分析所得的rhEPO N-糖谱图中主要包括具有不同N-乙酰乳糖胺延伸结构的四天线、四唾液酸化N-糖(FA4G4S4)，但同时该谱图中也包括一个对应二唾液酸化双天线N-糖(FA2G2S2)的高丰度峰。由于四天线与双天线N-糖的比率与EPO 的体内活性之间呈正相关性6，很明显该分析能为我们提供非常有价值的信息。通过该N-糖分析可轻松获得的其它信息还包括唾液酸化的程度以及乳糖胺延伸结构修饰的程度。总的来说，这些结果表明，采用相对比较简单的Rapi Fluor-MS N-糖制备方法及相应的HILIC-荧光-MS 分析确实能够获得信息量非常丰富的N- 糖谱图。 18.12FA2G2S22680.0155894.349232680.0258-3.822.24FA3G3S33336.24321113.092433336.2554-3.723.68FA4G4S4 + Ac4034.48131345.837234034.4898-2.124.15/24.60FA4G4S33701.37541234.796633701.3682.025.52FA4G4S43992.47081331.830933992.47090.025.7FA4G4Lac1S4 + Ac4399.61351467.542534399.60571.826.16/26.66FA4G4Lac1S34066.50761356.510434066.5094-0.427.34FA4G4Lac1S44357.60301090.409744357.6097-1.527.95FA4G4Lac2S34431.63971108.914344431.62812.628.97FA4G4Lac2S44722.73521181.690944722.73450.129.66FA4G4Lac3S34796.77191200.200444796.7725-0.130.50FA4G4Lac3S45087.86741272.97645087.8749-1.531.77 FA4G4Lac4S4 5452.9996 1364.256 4 5452.9949 0.9 图3. 为各种游离N-糖物质的鉴定提供依据的LC-MS 数据。“+Ac”表示乙酰化，如之前曾有报道的唾液酸残基(Neu5Ac )的 O-乙酰化8 。 利用大孔径酰胺HILIC 分离分析完整rhEPO 的O-糖基化 由于目前没有高度可靠的机制能够从对应蛋白质中释放出O-糖，因此O-糖的表征颇具挑战性。由于采用PNGase F进行糖基释放简便而高效，分析游离糖基成为了一种倍受青睐的N-糖表征方法。除了采用同类型的通用糖苷酶之外，分析人员还通过各种化学方法来释放O-糖，如利用碱性β消除18或肼解作用19等。但这些释放机制通常难以实施，而且常常会引入干扰(即所谓的“脱落产物”)。在本研究中，我们没有采用分析rhEPO 游离O-糖的策略，而是开发了另一种表征策略。我们设计了一套新的工作流程，该流程首先使用GlycoWorks Rapid PNGase F和1% RapiGest? SF表面活性剂对rhEPO 进行快速糖基释放，10分钟之后，我们获得了一份经N-糖基释放的完整rhEPO 样品，然后采用ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide糖蛋白分析专用柱通过HILIC 分离对其进行分析。图4展示了本次分析中使用内源性荧光检测和完整蛋白质HILIC 技术(在先前的研究中进行过介绍20)获得的色谱图。本研究分析的N-糖基释放rhEPO 分离得到了一系列(约10个)色谱峰。在线ESI-MS 提供了十分详细的信息，有助于我们将rhEPO 的蛋白形态准确分配给各个色谱峰。 结果显示，两个丰度最高的LC 峰分别具有18893.8和19185.3 Da的去卷积质量数，与分别具有三糖和四糖O-糖修饰结构的C 端精氨酸截断N-糖基释放rhEPO 一致。更具体地讲，我们观察到的较轻物质的质量数偏移代表了包括1个己糖、1个N-乙酰己糖胺和1个唾液酸结构的糖基修饰。同时，我们观察到的较重物质的质量数偏移则代表包括相同结构的糖基修饰，但多了一个N-乙酰-神经氨酸结构。 图4. N-糖基释放的完整rhEPO 的HILIC-荧光-MS 分析。(A )荧光色谱图，展示了O-糖的异质性和占据率。使用2.1 x 150 mm ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide, 300?, 1.7 ìm, 2.1 x 150 mm糖蛋白分析专用柱分析0.7 ìg蛋白质所得的色谱图。B )对应于rhEPO 的三种主要蛋白形态的解卷积质谱图。峰鉴定结果(此处标记的除外)如图5所示。 ( 对LC-MS 数据的进一步研究结果还表明，经过O-糖无糖基化的rhEPO 蛋白形态在约8.2 min的保留时间处洗脱。此外，这些LC-MS 数据还表明rhEPO 至少还有两种其它的O-联糖型，以及更多种C 端截断的蛋白形态(图5)。由此，我们可以看出该工作流程的确可用于快速分析rhEPO 的N-联糖基化，帮 助我们获取关于占据率和异质性的信息。3 N-糖基释放，–C-端DR 18123.618122.4-1.28.2N-糖基释放，–C-端R 18238.718237.4-1.39.3N-糖基释放，–C-端R +Hex1HexNAc1Neu5Ac1+Ac18937.3 18936.2-1.19.5 N-糖基释放，–C-端GDR +Hex1HexNAc1Neu5Ac118723.118722.3-0.8N-糖基释放，–C-端DR +Hex1HexNAc1Neu5Ac1 18780.118779.1-1.09.7N-糖基释放，–C-端R +Hex1HexNAc1Neu5Ac1 18895.218893.8-1.49.9N-糖基释放，–C-端R +Hex1HexNAc1Neu5Ac2+Ac19228.519227.3-1.210.0N-糖基释放，–C-端R +Hex1HexNAc1Neu5Ac1 + O18911.218910.0-1.210.2N-糖基释放，–C-端GDR +Hex1HexNAc1Neu5Ac219014.319013.7-0.610.5N-糖基释放，–C-端R +Hex1HexNAc1Neu5Ac2 19186.519185.3-1.210.8 N-糖基释放，–C-端R +Hex1HexNAc1Neu5Ac2 + O 19202.5 19201.2 -1.3 图5. 为各种N-糖基释放rhEPO 蛋白形态的鉴定提供依据的LC-MS 数据。“–C-端”表示rhEPO 的C-端截断；并标明了截断的不同残基。Hex 、HexNAc 和Neu5Ac 分别表示己糖、N-乙酰己糖胺和唾液酸结构。例如，Hex1HexNAc1NeuN5Ac1对应的是包含1个己糖、1个N-乙酰己糖胺和1个唾液酸结构的O-糖基化。“+O”表示增加一个氧原子造成的质量数偏移，例如氧化或者将Neu5Ac 替换为Neu5Gc8。作为丰度最高的rhEPO 序列变体(–C-端R )及其糖型的鉴定依据的数据以粗体突出显示。“+Ac”表示乙酰化，如之前曾有报道的唾液酸残基(Neu5Ac )的O-乙酰化8 。 结论 最近，糖基分析领域出现了几款基于可兼容亲水作用色谱(HILIC )的LC-MS 的强大工具。这些新型糖基分析工作流程的核心是专为大分子分离而设计的HILIC 色谱柱。借助ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide糖蛋白分析专用柱，分析人员能够在大分子游离N-糖的分离中实现更高的分离度。这种分析方法与Rapi Fluor-MS 标记联用时不仅能提高分离度，还能获得前所未有的灵敏度。我们在本研究中将该方法成功应用于详细研究重组人促红细胞生成素α(rhEPO )的N-糖基化。由于N-糖基化与EPO 的半衰期和活性有关，成功获取这类信息并达到前所未有的数据质量对于开发新型EPO 治疗剂有着无可估量的价值。EPO 还具有O-糖基化结构；该结构的占据率和异质性对于研究各种药物之间的兼容性也具有非常重要的意义。在本应用纪要中，我们概述了一个使用ACQUITY UPLC Glycoprotein BEH Amide糖蛋白分析专用柱的实验方案，该方案包括简单的样品制备步骤，然后通过随后的HILIC 分离分析完整rhEPO 上的O-糖基属性。概括地讲，重组人促红细胞生成素(rhEPO )分子此前由于其糖基化结构相对复杂，一直被视为糖基化表征的难题，而我们介绍的两种简易策略可用于详细研究rhEPO 的N-联糖基化和O-联糖基化。充分利用这些工具有助于我们加快新型生物仿制药的开发进程。 参考文献 1. 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糖/葡萄糖在体外共同孵育建立体外蛋白非酶糖基化反应体系，并将反应液分成空白组，对照组和药物组，在37℃孵厢中孵育7d，检测波长430nm测定各组荧光值。结果葛根、决明子等具有抑制蛋白质的非酶糖基化的作用。 关键词：非酶糖基化；晚期糖基化终末产物（AGEs）；葛根；决明子；百里香；罗布麻；杜仲；玉米；山茱萸中图分类号：R285.5 文献标志码：B 1528（2013）08-1764-03文章编号：1001-doi：10.3969/j．issn．1001-1528．2013．08．042 晚期糖基化终末产物（advancedglycationendproducts，简称AGEs）是在非酶条件下，蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生一组稳定的终末产物。大量研究表明，AGEs在糖尿病及其并发症、尿毒症、Alzheimer（阿尔次海默）病、白内障、脊髓侧索硬化症等疾病和衰老的发生发展过程中具有重要作用，尤其是在糖尿病中的发生过程中起着重要作用。AGEs分子之间可以通过交联形成大分子物质，沉积在包括脑在内的各种组织器官，从而 08-10收稿日期：2012-作者简介：杨 虹（1971—），女，副研究员，天然产物化学方向。Tel：13162653838，Email：hongyang@cn.nuskin.com 葛根、决明子等明显抑制晚期糖基化终末产物的形成。结论 导致脑组织以及其它器官的病变，也是糖尿病慢性并发症的发生机制之一 ［1-3］ 。 近年来，很多人致力于研究这种蛋白质非酶糖基化的抑制剂，而中药防治糖尿病已有悠久的历史，人们也开始寻找能抑制蛋白质非酶糖基化的中药提取物成分据相关文献 ［4-15］ ［10-14］ 。根 ，本实验选取了几种中药提取物，通过体 外蛋白质非酶糖基化反应，测定了它们对AGEs形成的抑制作用，说明这几种中药提取物中存在着对蛋白质非酶糖基化具有抑制作用的成分。 1764 第35卷第8期11.1 材料和方法试验材料 中成药 ChineseTraditionalPatentMedicineVol．35No．8 RSD为2.6%，结果说明该方法重复性好。 牛血清白蛋白（albuminbovine，BSA）： 2.2表2 7种中药提取物对AGEs形成的抑制作用 样品名称玉米提取物罗布麻提取物葛根提取物决明子提取物杜仲叶提取物百里香提取物山茱萸提取物 ·mL－1）质量浓度/（mg102.8 102.5100.8100.1100.2102.2112.6 见表2。 上海伯奥生物科技有限公司；盐酸氨基胍（Amino-guani-dinehydrochloride），纯度98%，购自Sigma-Aldrich公司；磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，AR级，上海凌峰化学试剂有限公司；D-果糖：BR级，国药集团化学试剂有限公司；D-（+）-葡萄糖：AR级，国药集团化学试剂有限公司。葛根、决明子等7种植物提取物均由本实验室提取。F96荧光分光光度计：棱光技术有限公司。1.21.2.1表1 中文名玉米须罗布麻葛根决明子杜仲叶百里香山茱萸 7种中药提取物对AGEs形成的影响（x±s，n=2） 抑制率/%25.977.089.190.670.886.430.6 方法样品制备 7种中药提取物均由本实验室分别按表7种中药提取物的制备 拉丁学名ZeamaysApocynumvenetumPuerarialobataCassiaobtusifoliaEucommiaulmoidesThymusvalgarisCornusofficinalis 溶剂80%乙醇H2O95%乙醇95%乙醇50%乙醇95%乙醇70%乙醇 提取物得率/%7.027.124.60.1829.016.051.3 ［15］ 1进行提取，制备。 由表2可知葛根、决明子、百里香、罗布麻等提取物对体外孵育AGEs的形成也有明显的抑制作用，其抑制率分别为89.1%、90.6%、86.4%、77.0%和70.8%。3 讨论 随着人们对糖尿病慢性并发症发病机制的深入研究，非酶糖基化在糖尿病慢性并发症的发生发展中的作用正越来越引起人们的广泛关注。AGEs的沉积使大分子物质发生交联而导致功能障碍，因此抑制AGEs的产生对治疗糖尿病有极其重要的意义。 蛋白质非酶糖基化即还原糖与游离氨基之间发生的非酶促反应，反应产物呈棕色，具有自发荧光，可用荧光分 1.2.2蛋白质糖基化反应体系的建立 ［16］ 参照Fari等和 光光度计测定荧光值来反应AGEs水平，该法是检测AGEs较经典的方法，灵敏度和重复性都较好。因此采用此方法，在430nm处测定荧光，以盐酸氨基胍作为阳性对照。盐酸氨基胍为（AG）公认的非酶糖基化反应试剂，抑制剂，抑制AGEs生成及交联，能够减少组织的AGEs沉积，阻断或延缓糖尿病相关的器官损害过程。 葛根、决明子、百里香、罗布麻、杜仲为常用中药，对体外孵育AGEs的形成也有明显的抑制作用，其抑制率分别为89.1%，90.6%，86.4%，77.0%和70.8%。其中葛根、决明子、百里香的抑制作用最强。因此进一步对这些中药中具有抑制蛋白质非酶糖基化的有效成分进行研究，对于糖尿病的防治有着重要意义。 Vinson等方法，将D-葡萄糖，D-果糖和BSA按一定比例 混合，溶于0.1mol/L的PBS（pH7.4）中，使其终质量浓度为BSA14mg/mL，过滤除菌，密封闭光，制成蛋白质糖基化反应液。样品分别用水，1%Tween80或DMSO配制成一定质量浓度，备用。1.2.3 方法重复性考察 取一定量含BSA14mg/mL的反 应液，共设12个平行管，分别向试管中加入终质量浓度为40mg/mL的盐酸氨基胍溶液，并设对照组（加同样体积PBS）和空白组（不含葡萄糖/果糖）。置37℃培养箱中孵育7d。糖基化产物孵育结束后，在430nm处检测荧光强度。1.2.4 样品对AGEs形成的作用 同上，取一定量含BSA 14mg/mL的反应液，每组设2个平行管，分别向各剂量组中加入终质量浓度为0.005mg/mL的样品溶液，并设对照组（加同样体积PBS）和空白组（不含葡萄糖/果糖）。置37℃培养箱中孵育7d。糖基化产物孵育结束后，在430nm处检测荧光强度。 根据所测数据计算抑制率：抑制率（%） =（1－F提取物/F对照组） ×100% 参考文献： ［1］［2］ 钱 华，王树朋，邓 新．晚期糖基化终末产物的研究进 248．展［J］．中国实用医药，2010，5（10）：247-方莲花，杜冠华，晚期糖基化终产物和抗动脉粥样硬化药．中国药学杂志，2007，42（11）：物发现策略［J］801-804． ［3］ 许良元，刘勇，张弓，等．晚期糖基化终末产物荧光测．光谱学与光谱分析，2010，量及其预校正技术研究［J］30（1）：230-232． ［4］ 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（复旦大学附属中山医院，上海200032） 摘要：目的 观察三藤制剂（雷公藤、红藤和鸡血藤）的3种不同提取工艺对MRL/lpr狼疮鼠24h尿蛋白、抗双链 MRL/lpr狼疮鼠40只，雌性，20周龄，按5 DNA抗体）及肾脏病理改变的影响。方法脱氧核糖核酸抗体（抗ds- 只1组随机分为8组，分别为高、低剂量的工艺1、2、3组和抗狼疮散水混悬液对照组及模型对照组，灌胃给药，每天1次，连续8周，灌胃容量0.1mL/10g体质量；分别于实验第0、第28和第56天留取小鼠的24h尿液、血清，以DNA抗体水平（ELISA方及56d时留取肾脏等，观察不同组别的24h尿蛋白定量（考马斯亮蓝染色法测定）、抗ds-法检测）及肾脏病理改变（HE染色，半定量分析）。结果 给药28d时，三藤制剂工艺3高剂量组干预前、后比较， 以及与模型组比较，24h尿蛋白明显下降（P＜0.05）；给药56d时，与模型组相比，工艺2和3的高、低剂量组均DNA抗体水平较模型组低（P＜0.05），以工艺3高剂量有明显下降（P＜0.05）。给药28d时，各药物干预组抗ds-组改善最为明显；给药56d时，工艺3高、低剂量组明显低于与模型组（P＜0.05）。与模型组比较，各干预组肾脏的病理改变均有不同程度的改善，以工艺3高剂量组的最为明显（P＜0.01）。结论以工艺3高剂量组最为明显。 关键词：MRL/lpr狼疮鼠；三藤制剂；蛋白尿；抗双链脱氧核糖核酸抗体；组织病理中图分类号：R285.5 文献标志码：B 1528（2013）08-1766-05文章编号：1001-三藤制剂的3种不同提取工艺提 取物在干预后，均能不同程度改善MRL/lpr狼疮鼠的血清抗ds－DNA抗体水平、蛋白尿量及肾脏的病理改变，其中 10-22收稿日期：2012-基金项目：上海市科委重大专项中药现代化资助课题（09dZ1970500）作者简介：王 强（1964—）男，硕士，硕士生导师，副教授，研究方向：结缔组织病的临床和基础研究。Tel：（021）64041990× 2587，E-mail：wang.qiang@zs-hospital.sh.cn *通信作者：杨春欣（1951—），男，副主任药师，研究方向：中药新药的研究与开发。Tel：（021）64041990×2181，E-mail：yang.chunxin@zs-hospital.sh.cn 1766 转载请注明出处范文大全网 » 含尿嘧啶DNA糖基化酶的聚合 T65U7B0 9 ;9680 =256980 =T9A0 M@N W g R9692>915=S # $969U9A5=W 565=72< 91b="" t650="7b0" b7="*" -="" ]!mhn=""> @S 02 9; W 1b<0 =297;7b92571="">< a5u9;012="" 9292a=""> ^::!’/4Z )iTJ, 4kZ BkZ ) :f :DEEGDKYXF R#FFEDH 012 54 A965>范文三：糖基化
范文四：EPO 糖基化表征
范文五：7种中药对蛋白质非酶糖基化反应的抑制作用_杨虹
