段界撸神
范文一：肝病患者谷胱甘肽巯基转移酶P1的研究
肝病患者谷胱甘肽巯基转移酶P1的研究
分类号:
单位代码:
密级: 公开
学 号:
博士学位论文
论文题目:肝病患者谷胱甘肽巯基
转移酶的研究名
作者 姓 李涛
学院 名 称
山东大学医学院
专业 名 称 内科学消化系病
指导 教 师 王凯教授
合作导师??
年月日原创性声明
本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。
论文作者签名:
期:‖/支
论文作者签名:查函
姐.一
关于学位论文使用授权的声明
本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论 文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。
保密论文在解密后应遵守此规定
论文作者签名:邋导师签名:比日山东大学博士学位论文 目 录
中文摘要
英文摘要
符号说明?
中文正文第一部分患者的甲基化与氧化损伤状态的研究? 前言?.. 刖 舌?..
材料和方法..
结 果讨论?..
结论附图表参考文献..
中文正文第二部分肝癌患者与慢乙肝患者外周血中的表达水平的比
较??.
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讨 论结论附图表参考文献?.
附件英文第一部分.
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发表论文及主要成绩 山东大学博士学位论文
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肝病患者谷胱甘肽巯基转移酶的研究
’
博士研究生:李涛
业:
专 内科学消化系病
导 师: 王凯教授
中文摘要慢加急性肝衰竭 ,是指在慢性肝
病基础上,短期内发生急性肝功能失代偿的主要临床表现。常见的病因包括 感染因素:嗜肝或非嗜肝病毒、乙型肝炎显性或隐性或丙型肝炎再活动; 非感染因素:有饮酒史、肝毒性药物中草药、手术以及自身免疫性肝病等。 在我国,慢加急性肝衰竭主要发生于慢性乙型病毒性肝炎 , 基础上。同时,乙肝病毒 ,感染又是原发性肝癌
,最主要的致病因素,的发生发展的分
子机制涉及癌基因、抑癌基因、生长因子、转移相关基因及其受体等多个环
节,
抑癌基因的表达降低参与了的发生。
谷胱甘肽巯基转移酶
,是人体
内生物转化最重要的相代谢酶之一,是细胞抗氧化损伤、抗癌变的主要解毒
酶。
属于谷胱甘肽巯基转移酶 ,家族,
该家族是还原型谷胱甘肽
,发挥对抗脂质过氧
化、保护肝细胞膜、清除氧自由基和促进肝脏合成功能等作用时必需的一 组催化酶。基因启动子区发生甲基化时,会使的表达降低,对肝脏 的保护作用降低,可能会加重氧化损伤对肝功能的损害。
本论文通过检测患者外周血中的启动子区甲基化情况和氧化损山东大学博
士学位论文
伤状态以及肝癌患者的蛋白和表达情况,来研究在和
发生中所发挥的作用。
中文摘要第一部分
谷胱甘肽巯基转移酶启动子区甲基化与慢加急性肝衰竭患者 氧化损伤的相关性研究
肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害,导致其合成、解毒、排泄和生物 转化等功能发生严重障碍或失代偿,出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、 腹水等为主要表现的一组临床症候群。根据病理组织学特征和病情发展速度,
肝衰竭可被分为四类:急性肝衰竭 ,、亚急性肝
衰竭 ,、慢加急性肝衰竭
,和慢性肝衰竭 ,。慢加急性肝
衰竭是指在慢性肝病基础上,短期内发生急性肝功能失代偿的主要临床表
现。
常见的病因包括感染因素:嗜肝或非嗜肝病毒、乙型肝炎显性或隐性或丙 型肝炎再活动;非感染因素:有饮酒史、肝毒性药物中草药、手术以及自 身免疫性肝病等。在我国,慢加急性肝衰竭主要发生于慢性乙型病毒性肝炎 ,患者。除病毒性肝炎外,常见的肝衰竭病因还有
妊娠急性脂肪肝、药物性肝病和酒精性肝病。
?
谷胱甘肽巯基转移酶 ,是人体
内生物转化最重要的相代谢酶之一,是细胞抗氧化损伤、抗癌变的主要解毒 酶。属于谷胱甘肽巯基转移酶家族,该家族是还原型谷胱甘 肽发挥对抗脂质过氧化、保护肝细胞膜、清除氧自由基和促进肝 脏合成功能等作用时必需的一组催化酶。基因启动子区发生甲基化时, 会使的表达降低,对肝脏的保护作用降低,可能会加重氧化损伤对肝功 能的损害。基因启动子甲基化在各种肿瘤中研究较多,如肝癌,前列腺 癌等。但慢加急性肝衰竭患者中是否存在启动子区甲基化的情况及其与 氧化损伤的相关性尚未有研究。
目的
山东大学博士学位论文
在本研究中,我们致力于分析乙肝病毒感染相关的患者的基因 启动子区甲基化状态和氧化损伤水平,并与慢性乙型病毒性肝炎患者进行比
较,
观察甲基化是否的发生及氧化损伤水平具有相关性以及评价它们 的相关性。
方法
.收集例正常人、例患者和例患者外周血,密度梯度离
心法分离外周血单个核细胞和血清,用试剂盒提取单个核细胞中的基因组。 .甲基化修饰试剂盒处理将分子中的未甲基化的胞嘧啶 转变为尿嘧啶。甲基化特异性.法检测外周血中基因
启动子区的甲基化情况。采用文献的引物并采用其条件,凝胶电泳检测所得 产物。
,
.采用逆转录实时荧光定量.
.的方法来检测患者和患者外周血中的的表达水平。采用酶联免疫吸附法 ,
来测定
患者和患者血清中的丙二醛和还原型谷胱甘肽含量,其 中,的血清水平含量代表氧化损伤的水平,的水平代表患者血清的抗 氧化损伤水平。
睦田
::木
例患者中有例,例患者中有例.%,检测到甲
基化,差别有统计学意义.,.,提示甲基化可能参与患者 进展为。患者外周血单个核细胞中的 表达水平较
患者的表达水平明显降低.。患者甲基化组的
表达水平较非甲基化组明显降低.。患者中甲基化组和非 甲基化组之间的临床指标如、、之间没有统计学差异., 但甲基化组的水平明显高于非甲基化组.。患者血清中的 .?.
水平较患者的水平明显升高.?.
/ /,
.,患者血清中的的水平较患者的水平明显降低..山东大学博士学位论文
..
/,.。患者中甲基化组的水平也.士.
明显高于非甲基化组..
/ /,.,两组
患者的水平没有统计学上的差异。患者中甲基化组和非甲基化 .土.,
组之间的病情程度积分没有显著差,.:.
.。水平与积分之间存在正相关.,.,即氧化损伤 程度与患者的病情严重程度成正相关。
结论
基因启动子区的异常甲基化参与了氧化损伤对患者的肝功 能损害,并且氧化损伤程度与患者的病情严重程度成正相关。 关键词
慢加急性肝衰竭;;甲基化;氧化损伤
中文摘要第二部分
肝癌患者与慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中的表达水
平和氧化损伤状态的比较
,感染与急慢性肝炎、肝硬化和原发性
乙型肝炎病毒
,
肝细胞癌的发生和发展密切相关。我国的原发性肝癌
主要发生于慢性乙型病毒性肝炎 ,的基础上。肝
癌的发生发展的分子机制涉及癌基因、抑癌基因、生长因子、转移相关基因及其
受体等多个环节。既往多项研究显示肝癌的发生与某些抑癌基因的启动子区甲基
化相关,如凋亡相关基因、基因、肝细胞生长因子激活剂抑制因子等,这些
基因启动子区的甲基化会导致抑癌基因的表达减少,从而促进肝癌的发生和进
展。
谷胱甘肽巯基转移酶是人体内生物转化最重要的相代谢酶之
一,是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。以往的研究表明多种肿瘤患者体内
的表达水平存在明显异常。例如,在前列腺癌、胃癌以及肝细胞肝癌中
研究者发现存在的启动子区甲基化,由基因启动子区甲基化导致的表达
量减少可能参与了上述肿瘤的发生,但蛋白表达水平的改变以及肝癌患
山东大学博士学位论文
者的氧化损伤状态研究较少。
目的
在本研究中,我们致力于分析乙肝病毒相关的肝癌患者的蛋白表达水 平、表达水平以及氧化损伤状态,并与慢性乙型病毒性肝炎患者进行比较, 观察的表达水平以及氧化损伤状态是否与肝癌的发生具有相关性。 方法
我们首次采用流式细胞仪检测的方法来测定例乙肝病毒相关肝癌 患者和例患者以及名健康对照者外周血中的的表达水平。采用逆 转录实时荧光定量 ,?的方
法来检测患者和患者外周血中的的表达水平。采用酶联免疫吸附法 ,来测定
患者和患
者血清中的丙二醛和黄嘌呤氧化酶,还原型谷胱甘肽以及谷 胱甘肽巯基转移酶含量,其中,和的血清水平含量代表氧化损伤 的水平,和的水平代表患者血清的抗氧化损伤水平。
钴甲
;口代
乙肝病毒相关的患者外周血中的蛋白表达水平较患者水平 明显降低阳性百分率..% ..%,.;平均荧光强度
..
..,.。与蛋白表达水平的变化相似,患者
外周血单个核细胞中的的表达水平较患者的表达水平明显降 .中位数:.;范围:.?.;.。
低中位数:.;范围:..
患者血清中的和水平较患者的水平明显升高.. / .. /.:. .士./,
/,.;
.,患者血清中的和的水平较患者的水平明显降低 .士. .士.
.士.
/ /,.;.士.肛/ /,
.。
结论
患者的的蛋白和表达水平较患者明显降低,表 达水平的变化可能参与了患者从至的进展,患者的氧化损伤水平山东大学博
士学位论文
较明显升高,的表达水平降低可能与肝癌的氧化损伤水平较高相关。
关键词
肝癌;:流式细胞仪;氧化损伤
山东大学博士学位论文
英文摘要? .
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符号说明
缩略语 英文名称 中文名称乙型肝炎病毒 慢性乙型肝炎
.
慢加急性肝衰竭肝细胞肝癌
丙氨酸氨基转移酶天冬氨酸转氨酶 总胆红素.
酶联免疫吸附试验
流式细胞仪
’
实时荧光定量
谷胱甘肽巯基转移酶
急性肝衰竭活性氧丙二醛终末期肝病评分模型 黄嘌呤氧化酶还原型谷胱甘
肽
. 谷胱甘肽巯基转移酶磷酸盐缓冲液 人类免疫缺陷病毒 丙型肝炎病毒 甲胎蛋白甲基化转移酶
山东大学博士学位论文
中文正文第一部分
谷胱甘肽巯基转移酶启动子区甲基化与慢加急性肝衰竭患者
氧化损伤的相关性研究
刖昌
乙型肝炎病毒 ,感染可引起人类急慢性肝炎,与肝硬
化和肝细胞癌的发生和发展密切相关。全球大约有亿人感染过,我国是乙 型肝炎的高发区,在全球.亿携带者中约有万在我国,其中发展为慢 性乙型病毒性肝炎 ,的患者大约有万,每年约有
万人死于感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌【】。 肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害,导致其合成、解毒、排泄和生物转 化等功能发生严重障碍或失代偿,出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、
腹水
等为主要表现的一组临床症候群。根据病理组织学特征和病情发展速度,肝
衰竭
可被分为四类:急性肝衰竭
,、亚急性肝衰竭,、慢加急性肝衰竭
,和慢性肝衰竭 ,。慢加急性肝衰
竭是指在慢性肝病基础上,短期内发生急性肝功能失代偿的主要临床表现。
在我
国感染仍是的主要原因,近期一项由解放军医院肝衰竭诊疗与研究中 心所做的包含例急性、亚急性、慢加急性肝衰竭患者的回顾性研究显示, 年及年中感染所导致的慢加急性肝衰竭所占比例分别为.%和.%, 其次为酒精性因素心。感染导致的发病机制尚未完全清楚。目前,越来 越多的研究表明氧化损伤参与的发生和进晟紫。细胞及其他炎症 细胞尤其是中性粒细胞的活化会导致自由基和活性氧 , 的生成增多,从而导致一系列的炎症反应,以及钙离子的集聚、微循环的破
坏和某些可引起凋亡和坏死的细胞因子的产生畸。以上反应会导致肝细胞的
损害
并可使丙二醛的产生增多,后者是脂质氧化的终产物,常被用作血清中氧 化损伤水平的指标盯。
在肝细胞抗氧化损伤过程中,还原型谷胱甘肽发挥了重要作用。 参与的抗氧化损伤包括清除超氧自由基和:。发挥这些作用时需要谷胱甘肽
山东大学博士学位论文
巯基转移酶的参与嘲。谷觥甘肽巯基转移酶 ,
是一个有个家族成员的相反应酶家族,,,,
,,,和。
它们可催化与活性氧、过氧化物等一系列细胞毒性物质,保护细胞免受氧化 损伤?。其中属于?亚家族的,是目前家族中研究较多的成员。 既往有研究显示血清?阳性的患者的活性较血清?阴性患者
的活性明显降低。这一结果提示可能是感染后活性降低,使肝细胞遭 受氧化损伤导致肝功能的损害引。更有研究指出,基因启动子区甲基化会 导致蛋白表达水平降低,这种现象可能参与了这一过程引。另一项近期的 研究指出,乙型肝炎病毒中的蛋白,尤其是基因型的蛋白可能通过 基因启动子区甲基化导致的蛋白表达水平降低副。其他学者的研究也表明, 在相关的肝癌患者中存在甲基化导致的的表达下降氐。基于以 上的研究结果,我们推贝基因启动子甲基化可能也于在慢加急性肝衰竭患 者氧化损伤导致的肝功能损害。
综上,本研究的主要目的是检测慢加急性肝衰竭患者和慢性乙型病毒性病毒
性肝炎患者的启动子区的甲基化状态以及外周血血浆中的氧化损伤水平, 以了解是否与的发病存在关联。
材料与方法
一、临床资料
本课题包含年月至年月间在山东大学齐鲁医院和北京佑安医 院就诊和治疗的例感染相关的患者,例二相关的急性肝衰竭, 例患者,以及例健康对照。相关性慢加急性肝衰竭的诊断标准参考既往 的文献 ,具体包含以下条件如下:超过个月的慢性乙型病毒性肝炎病史: 血浆总胆红素升高超过倍以上,即?.地/:凝血酶原活
动度弋%;近期出现的度以上的肝性脑病。相关性慢加急性肝衰竭 的排除标准包括既往的酗酒史、静脉药物滥用史、妊娠、抗氧化药物的应用
史、
干扰素应用史、合并丙型肝炎病毒或者人类免疫缺陷病毒的感染以 及已知的其他肝脏疾病史如自身免疫性肝病、代谢性肝病等。相关性慢加急 性肝衰竭患者的病情严重程度采用积分即 山东大学博士学位论文 , 。慢性乙型病毒性肝炎的诊断标准为:阳性慢性乙
型肝炎血清、和阳性,抗一阴性,血清持续或反复
升高,或肝组织学检查有肝炎病变。阴性慢性乙型肝炎血清和 阳性,持续阴性,抗阳性或阴性,血清持续或反复异常,
或肝组织学检查有肝炎病变 。所有研究对象的一般临床资料如年龄、性别
等和
实验室检查结果女、、和等均在入院第二天于本院实验室检测后
获得。
本课题研究经山东大学齐鲁医院伦理委员会审核通过,在采集病史及静脉血
等相关资料前每一例患者都签署了知情同意书。 二、实验试剂及仪器
、主要试剂
山东大学博士学位论文
三、溶液配置
.溶液
山东大学博士学位论文
称取 、. 、. 和. ,溶于蒸馏水
中,用调节溶液的值至.,最后加蒸馏水定容至即可。在× 高压下蒸气灭菌至少分钟,保存于室温或冰箱中。 .液
称取 .到容
碱、冰醋酸.、./
量为的烧杯然后加入的去离子水,充分搅拌溶解。加入.的醋酸, 充分混匀,加去离子水定容至,室温保存。工作液为 液稀释为× 作为电泳缓冲液。
四、相关分析软件
..://硼研..
..统计分析软件
.,,,
五、方法
.血清采集和基因组的提取
采集患者外周血后经离心分离血清,采集后的的血清储存在低温冰箱,温度 为.?,用来检测血浆中的水平来反映患者的氧化损伤的程度。采用 ,,,来提取外周血,提取步
骤严格按照厂家提供的说明书。具体提取步骤如下: 吸取蛋白酶至.离心管底。
将“标本加入离心管。
将
加入样本中,脉冲式震荡 充分混匀。
水浴?分钟。
短暂离心。
将无水乙醇加入管中,脉冲式震荡充分混匀,简短离心。 将吸附管套入离心管,将上一步的上层液体小心移入吸附柱中,不可触碰 吸附柱的边缘,盖紧盖子,离,转分钟,丢弃离心管及离心液。 将吸附柱套入另一个干净的离心管,小心打开吸附柱的盖儿,加入 ,盖紧盖子,离心转分钟,丢弃离心管及离心液。将吸附柱套 入以干净离心管。
小心打开吸附柱盖儿,加入 ,盖紧盖子,离?心转,分
山东大学博士学位论文
钟。
将离心柱套入另干净离心管后,丢掉先前离心管的离心液,离一险
转,分钟。
将吸附柱套入另一干净.离心管,丢掉先前收集管及离心液,将离心管 底部的外周血储存在?备用。
.甲基化特异性法?检测外周血中启动子区的甲基化情 况
相关性慢加急性肝衰竭外周血单个核细胞的启动子区的甲基化 状态采用甲基化特异性法进行检测。具体步骤如下: .基因组修饰采用 试剂盒。
?
试剂准备
将无水乙醇加入至 试剂盒
厂家所提供的液中,室温保存,作为最终洗液。
配置%乙醇:每个样本需要肛肛肛“。
操作步骤:
?加.
到一瓶,涡旋震荡约分钟,至透明。: 至此溶液,此时 为//混合液,轻轻涡旋。
?加
//混合液至肛 样本?,涡旋,然后水浴。
分钟后,再次水浴?,分钟。
?将柱连接到收集管,的至柱中,将第二步的样本加到含的柱中, 离心,转,秒,拿掉离心柱,将收集管内的液体倒掉,重新将离心柱连
接到收集管。
?将 离心柱,离心转秒。
至.
肛 %乙醇,混匀。每份样本需混合液加肛 与 乙醇的混合液至离心柱,室温放置分钟,离心转秒。 %乙醇至离心柱,离转秒,去掉离心柱,倒掉收集管内 的液体,将柱连接到收集管,力 %乙醇至柱中,离一心转秒。 ?将柱放入.
管, 至离心柱过滤管,离一心转秒。洗脱山东大学博士学位论文 已修饰的。
?一?保存最多两个月。
注意事项:
力入时,混匀要至清澈透明。
?//混合液,避光保存至。,最多周,下次使用时,室温解冻,震 荡混匀分钟。
?每瓶能转化个样本。
?水浴时,先?分钟,后?分钟。
?离心时,可适当延长时间但要小于分钟。
?保证%乙醇的使用,勿使用其他浓度。
?保证的加入两次使用;与%乙醇混合时,的量要足够。 ?,,的正确使用。
.
基因启动子区甲基化特异性的检测 以重亚硫酸盐修饰好的作为反应底物,分别采用甲基化特异性和非甲基
化特异性的引物作为引物。具体见表. 甲基化特异性的反应体系包括: 反应体系:
反应体系 试剂浓度 体积“ 终浓度 三蒸水
上游引物 .
/ ./
下游引物 .
/
./
.
.
底物
总体积
反应条件:
????
?
;
?;
?
醋
山东大学博士学位论文
:
?
;;
?
产物鉴定:反应结束后,取? 反应产物,在.% 上进行电泳鉴定.
配制.%的胶进行电泳
溶液混合,放于微波
称取.琼脂糖放于锥形瓶中,再量取的. 炉中煮沸,至溶液清彻透明为止,大约需分秒。 核酸染料,摇匀。
冷却到?左右时加
组装好制胶器,并调至水平。将胶倒于制胶器中,插好齿状梳。待分钟胶
冷却凝固后,放于倒好电泳缓冲液的电泳槽中进行点样。 样品溶液,加
取 × ,混合均匀后进行点样。每排点样 。
孔要点一个 的
点完后,调电泳仪各参数进行电泳::;;;:,典型的 实验结果见图。
.血清标本的制备抽取研究对象清晨空腹外周血,注入含抗凝剂的试管中,取
全血后,低温离心机转/分钟,离心分钟,分离血浆于管中,做 好标记,保存于一。冰箱中。测定前,将标本置于室温复融。 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
取新鲜外周血,抗凝,离心分钟,分离上层血浆。加入
等体积的生理盐水对倍稀释。
另取支的尖底离心管,加入/稀释血体积的平衡至室温的淋巴细胞 分离液。
将加好分离液的离心管倾斜约度,用吸管将对倍稀释的血液沿管壁缓慢 加入稀释血与分离液的比例为:,使二者形成明显的分界。 在天平上配平后,上水平离心机,,离一分钟。
离心后可见离心管内分成层,依次为?血浆和生理盐水层淡黄色;?单个 核细胞层薄薄的白膜状,较多时呈浑浊云雾状;?淋巴细胞分离液层;?红细 山东大学博士学位论文
胞和粒细胞层。用吸管小心吸取血浆层与分离液层之间的白膜层,转入一新
的尖
底离心管中。
往装有白膜的尖底离心管中加生理盐水至,混匀,上水平离心机,, 离心分钟。
弃上清,利用回流的液体弹起细胞,加生理盐水至,混匀,上水平离心 机,,离心分钟,以洗去混杂的血小板。
弃上清,利用回流的液体弹起细胞,加生理盐水至,混匀,上水平离心 机,,离心分钟,再洗一次。
弃上清,加入生理盐水悬浮沉淀,混匀,转入.的管中,取少许进 行细胞计数,约,,离心分钟后弃上清储存于一冰箱,备用。 .法提取细胞总
,
密度梯度离心法分离的外周血单个核细胞约,加入 反复吹打至液体澄清且无细胞团块。
上下颠倒混匀,将匀浆常温放置分钟。
每管加入.氯仿,盖上盖子,颠倒混匀剧摇分钟。室温放置分钟。 ,。,离心分钟,离心后分层。
将上层水相的/转移到另一新的.的管中,加入与水相等体积预冷 的异丙醇,上下颠倒混匀,?冰上静置分钟。
,。,离心分钟,离心后可见胶状沉淀在管底或管壁上。 弃上清缓慢倒扣,吸水纸上吸干,每管加入预冷的%乙醇 高压后 的水 无水乙醇,漩涡混匀样品。
,。,离心分钟,弃上清,超净工作台开风机干燥约~分钟不 能完全干燥,防止难溶。
加入 水溶解沉淀,反复吹打几次。
蛋白核酸测定仪测定量后,立即用于逆转录。
附:蛋白核酸测定仪定量
打开机器,连接分钟,打开已存文件
两个槽分别用 水清洗三遍。
调基线。山东大学博士学位论文
到波长。
、 水,自动调零。
两个槽分别加入
加样:往 的槽中加入 样品。
输入,读取,蛋白,测出/,当比值..?. 可认为提取的足以逆转录。
取出样品,用水清洗三遍,加下一样品。 逆转录
取一个管,按下列顺序依次加样: 试剂 加入量
×
】/浓度
无核酶水 卜
在超净台里,冰上操作,戴口罩帽子,以免酶污染。在漩涡混匀器中混
匀秒,瞬时离心,然后在仪里?时,?分钟,后降至?。
此反应产物即为反转录的,储存于一?。 表达量的检测
.实时荧光定量多周血单个核细胞中 实时荧光定量检测外周血单个核细胞中的 的表达,以
为内参,所用引物为:
上游:;
下游:、。
反应总体积为 /的上下游引物,×
,包括.
的底物。
.,,,,.
具体反应条件为:
。??。:
。童
日 。山东大学博士学位论文
?
?
?
实验结果以与一的比值作统计分析。
.酶联免疫法法检测血清中水平
应用技术检测慢加急性肝衰竭患者和慢性乙型病毒性肝炎患者及正
常对照血清中的浓度。试剂盒购于 公司,最低检测 限度
。检测按公司说明书进行操作,具体如下: .标本:抗凝外周血,离心留取血清用于检测?冻存血清按一次 用量分装,避免反复冻溶,检测前血清样本做:稀释。 .检测前准备工作:
提前分钟从冰箱中取出试剂盒,以平衡至室温。 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释:。未用完的放回。
标准品稀释:检测前用 作为稀释液稀释 标准液,稀
/
释成
/的还原型。
用新鲜配制的/的还原型稀释,的?标准液,得到
.
/的?。
标准品的稀释
加入标准品/标本稀释液.至冻干标准品中,待彻底溶解后,静置分钟 混匀浓度为/。然后根据需要进行稀释。标准曲线使用以下浓度:、 、、、.、.、./,稀释的标准品不得重复使用。
.操作步骤:
将待检测标本用
液稀释
/。每一例待测样本和
标准品均需检测两次或者三次。
将
的/的待测样本或还原型标准品加入至板
中。在孵箱孵育至少时或者过夜。
使用×液对每个加样孔进行清洗,至少两遍。清洗完毕后,将孔板 倒置于吸水纸上,以去除多余的液。山东大学博士学位论文 将 的分析用稀释液加入每个孔中,并在震荡器上室温下孵育.小时。
使用
的清洗液清洗每个孔三遍,每次清洗完之后要彻底甩干清洗液。 清洗完毕后,将板倒置于吸水纸上,以去除多余的清洗液。 将
稀释后的抗抗体加入到每个孔中,在震荡器上室温下孵育 小时。参照第五步的方法清洗遍。
将
稀释后的二抗加入到每一个孔中,在震荡器上室温下孵育小时。 参照第五步的方法清洗遍。
将底物稀释液加热至室温。将
的底物稀释液加入到每个孔中,包括空白对
照孔。在震荡器上室温下孵育半小时。
将
的终止液加入到每个孔中以终止反应,并立即检测实验结果。 用
作为吸收波长检测每个孔的吸光度,使用还原型标准液作为 空白对照。
结果判断:
每个标准品和标本的值应减去零孔的值。
绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标,值作纵坐标,以平滑线连接各 标准品的坐标点。通过标本的值可在标准曲线上查出其浓度。 .酶联免疫法法检测血清中水平
.
试剂盒组成及试剂配制
酶标板:一块孔
标准品冻干品:瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至.,盖好后静置
分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为/,然后做系列倍比
/,.
稀释,分别配制成 /, /,. /,. /,. /,样品稀释液直接作为空白孔/。
样品稀释液:,一瓶。
检测稀释液:,一瓶。
检测稀释液:,一瓶。
,一瓶。临用前以检测稀释液:稀释,充分混匀, 检测溶液:
稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制,实际配制时应多配制
.?..。山东大学博士学位论文
,一瓶。临用前以检测稀释液:稀释。稀释方法 检测溶液:
同检测溶液。
底物溶液:,一瓶。
浓洗涤液:,一瓶。使用时每瓶用蒸馏水稀释倍。 终止液:,一瓶。
覆膜:张。
操作步骤
实验开始前,各试剂均应平衡至室温,试剂不能直接在溶解;试剂或 样品配制时,均需充分混匀,混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量,
如
样品浓度过高时,应对样品进行稀释,以使稀释后的样品符合试剂盒的检测
范围,
计算时再乘以相应的稀释倍数。
加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空孑样品稀释液 , 余孔分别加标准品或待测样品 ,注意不要有气泡。加样时将样品加于酶标 板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。为保证实验结果有效性,每次实验
前
请使用新的标准品溶液。
立即在每个孔中加入检测溶液工作液 在使用前半小时内配制, 酶标板加上覆膜,温育小时。
弃去孔内液体,甩干,洗板次,每次浸泡卜分钟,大约 /每孔, 甩干也可轻拍将孔内液体拍干。
每孔加检测溶液工作液使用前配制 ,加上覆膜,温育
分钟。
弃去孔内液体,甩干,洗板次,方法同步骤。
每孑底物溶液 ,酶标板加上覆膜避光显色反应时间控制在 ?分钟,当标准品的前?孔梯度不明显,后?孔有明显的梯度蓝色时, 即可终止。
每孑终止液 ,终止反应,此时蓝色立即转黄色。终止液的加入顺序 应尽量与底物液的加入顺序相同。
立即用酶标仪在波长测量各孔的光密度..值。
.统计分析
山东大学博士学位论文
.
我们使用
.,,,对实验结果进行统计分
检测慢加急性肝衰竭患者和慢性乙型肝炎
析。采用卡方检验.
患者之间的启动子区甲基化状态的区别。各组患者包括慢加急性肝衰 竭患者和慢性乙型肝炎患者之间,启动子区甲基化组和非甲基化组之间 的实验室检查指标和血清中的水平以及各组的积分之间的不同采用 进行分析。.定为差异有
独立样本的检验
统计学意义。
结
果
.基本临床资料
本研究共包含例乙肝病毒相关性患者,例肝炎患者,例非乙 肝病毒相关性急性肝衰竭患者和例正常对照。乙肝病毒相关性患者组和 患者之间的性别、年龄等一般临床资料并无统计学差异.,.,
而两组之间的、、和水平存统计学意义上的差异.,见 表。例患者中有例患者实验室检测项目较全,可计算积分。 .患者组和患者组的启动子区甲基化检测结果
例乙肝相关性患者组中有例.%存在启动子区甲基
化,而在例患者中仅有例.%患者存在启动子区的甲基化, 两者之间的差别具有统计学意义 .,.,典型的甲基化特异性实 验结果见图。在例非乙肝病毒相关的肝衰竭患者和例正常对照中均未发现 启动子区的甲基化。
.患者启动子区甲基化组和非甲基化组实验室检查指标之间的差 别
患者启动子区甲基化组和非甲基化组之间的、和
指标没有统计学意义上的差别.,两组之间的水平有明显的差异, 甲基化组的水平明显高于非甲基化组的水平.,详见表。 .患者和患者的外周血 水平的检测
患者外周血单个核细胞中的 表达水平较患者的表 达水平明显降低.。患者甲基化组的 表达水平
较非甲基化组明显降低.,见图。山东大学博士学位论文 .患者和患者的外周血水平和水平
患者的水平明显高于肝炎患者.. /
..
/,.,患者的水平明显低于肝炎患者
..
..
/ /,.。患者甲基化组的水平明..
显高于非甲基化组.?.
/ /,.,两组
.?.
患者的水平的差异没有统计学意义.?. / /,
.,详见图.。
.氧化损伤指标和患者积分之间的关系
患者启动子区甲基化组的积分..和非甲基化
组..的积分没有统计学意义上的差别.图。
的血清水平与患者的之间存在关联仁.,.。
讨论
既往有多项研究表明启动子区甲基化与多种肿瘤的发生相关,如原发 性肝癌、肺癌、前列腺癌等【。】,而启动子区甲基化与肝衰竭发生的关系 尚未有研究。在本研究中,我们首次在患者中发现了启动子区的甲 基化。我们在例患者中发现有例发生了甲基化,在例患者中有 例发生甲基化。因此,我们认为感染可导致细胞基因组甲基化,与我们的研 究结果一致,等发现,感染的细胞株基因都发生了高甲基化, 因此可诱导基因启动子区甲基化】。我们的研究结果进一步支持了新近 其他学者提出的关于长期的慢性感染可导致某些基因启动子区局部的甲基 化】。众所周知,基因启动子区甲基化是由甲基化转移酶催化完成,后者包括
等。有研究报告指
甲基化转移酶,,
出,、 和表达与人体的各种组织中,比如外周血单个核细胞 和肝组织中【。因此,我们推可能通过增加、和
的活性导致启动子区的甲基化。近期的一项研究也表明表达的 蛋白能够上调细胞周期蛋白,后者可以激活细胞周期,并激活的表达 【】。更有等在肝硬化患者的血浆中发现了启动子区甲基化【。基于 以上的研究结果,我们认为甲基化的发生并不是短期的而是在长期的病毒感
染背
景下发生的,可能参与了从肝炎到肝硬化以致肝癌的发生。因此,甲基化可能
也
山东大学博士学位论文
参与了从慢性乙型肝炎到慢加急性肝衰竭的发生。
到目前为止,有很多方法来检测特定基因的启动子区甲基化,如甲基化特异 性.、实时荧光定量甲基化特异性和基因芯片等。其中
.是最常用和最简便的方法。例如,等利用.可以在
的外周血单个核细胞的中检.的经过重亚硫酸盐修饰的甲基化的。.是一项特
异性、敏感性和可操作性均较强的检测
启动子区甲基化的方法。其他研究者也发现在用.检测前列腺癌 体液中患者较实时荧光定量要敏感.% .%】。因此,采用
.检测患者中的启动子区甲基化情况可能有助于临床医生分 辨出患者中那些可能进展为慢加急性肝衰竭患者的个体。 众所周知,是一种抗氧化损伤的酶,参与维持了机体内氧化还原状态
的平衡,启动子区的甲基化导致的表达减少可能会导致氧化损伤引起的肝 /
基因多态性会影响到慢性阻
损害加重【】。既往也有研究者提出
塞性肺疾病患者机体的氧化还原状态。氧化损伤可对肝细胞造成不同程度的
损
害,国外研究较多的是氧化损伤与丙肝病毒 ,对肝脏的损
害较多。有研究表明,慢性丙肝炎患者血浆和肝组织中的氧化产物如脂质过
氧化
物增加而抗氧化损伤的能力降低【。与感染类似,感染也可通过氧化 损伤对肝细胞造成损害。女等对慢性感染患者研究发现可通过干扰 线粒体膜电位来破坏线粒体的功能,从而激活转运体,导致产生增多。 失衡的氧化损伤会对肝细胞的蛋白质、脂肪和等都具有损害作用,如肝细 胞膜上的脂类,细胞内重要的蛋白质和酶类等。根据以上的发现,我们推测 启动子区甲基化导致的表达水平降低与感染可能使患者的氧化 损伤加重,参与了的发生。
我们的研究结果也表明存在基因启动子区甲基化的慢加急性肝衰竭 患者比例要高于慢性乙型病毒性肝炎患者的比例,并且患者的血清水 平要高于患者,在患者发生启动子区甲基化组的水平也明
显高于非甲基化组。在本研究中,我们采用终末期肝病模型 . ,积分来评价患者的病情严重程度。积分
越高说明患者的病情越重。积分是由前瞻性分析统计资料所得,不
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受有无腹水、肝性脑病等主观因素影响,目前广泛应用于肝衰竭、肝癌患者
的病
情评价。我们研究发现患者中甲基化组和非甲基化组的并没有统计 学上的差别,因此我们推贝启动子区的甲基化可能并不影响患者的 病情严重程度,但这一结果也可能是由我们有限的病例数目造成的。在我们
以后
的研究工作中我们会在更多的研究人群中采用实时荧光定量进一步检测肝 组织和中的表达情况。
我们研究发现的表达水平与患者的积分存在正相关
.,.。这一结果提示的病情严重程度可能随着氧化损伤的加剧 而进一步加重。众所周知,是脂质过氧化代谢产物,可使肝细胞的膜的结 构发生改变,增加肝细胞的通透性。常作为肝细胞膜脂质过氧化程度的指 标,同时也可反映肝细胞受损程度。结合我们的研究结果,我们认为的血 清水平可在一定程度上反映患者的病情严重程度。我们的这一研究结果也 表明氧化损伤在的发病中起着重要作用。在乙型病毒性肝炎中,由外周血 多形核细胞氧化酶持续产生的活性氧自由基加剧的氧化损伤可导致 病毒性肝炎的逐步加重从而导致的产生。根据我们的研究结果,可能 不仅仅使等氧化损伤因子的产生增多,也可能通过降低抗氧化损伤物质的表 达,如我们本研究所涉及的基因启动子区甲基化导致的减少,从而导致肝 细胞的坏死或凋亡。基于以上的分析,我们推测基因启动子区甲基化会加 重脂质氧化对的损害,对患者应用抗氧化药物可能有助于治疗。
患者病死率较高,据文献报道可达%。目前,国外主要采用肝移
植手术治疗和,但在我国由于受到供体短缺、手术操作水平和治疗费
用以及免疫排斥反应,在我国尚不能普及。我国目前治疗和时,临床
也采用人工肝支持系统治疗,该治疗方法的常用技术是血浆置换。该治疗手段主
要是为肝细胞再生提供适合的内环境,清除炎症介质并补充血浆、白蛋白等营养
物质。在肝衰竭晚期,由于肝细胞大量坏死,失去再生能力,人工肝支持系统效
果有限【吲。一些中草药在我国肝衰竭治疗中也发挥了有益作用,如大黄、乌梅
等具有清热泻火、逐瘀通经,减少血氨生成,酸化肠道,减少氨的吸收,副作用
较岁。根据我国实际情况,因经济原因或者供体短缺而不能施行肝移植的
患者,考虑可在常规药物基础上加用抗氧化损伤药物进行治疗,例如临床
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常用的抗氧化损伤药物还原型谷胱甘肽以及一些具有抗氧化作用的中成药如齐
墩果酸。还原型谷胱甘肽可提供活性巯基与机体的自由基结合,促进自由基的排
泄,还可活化等其他抗氧化酶,减少肝组织内过氧化物物质的产生【引。但受
限于我们的病例研究数目较少和患者种族单一,这一结论仍需进一步的研究
结论
.是一项特异性、敏感性和可操作性均较强的检测患者外周 血单个核细胞中启动子区甲基化的方法。患者的启动子区 甲基化可加重氧化损伤对肝脏的损害,氧化损伤指标血清水平与患 者的病情严重程度相关。山东大学博士学位论文
附图表
表
表.甲基化特异性所用的引物
:上游引物序列;:下游引物序列.
表
表.乙肝病毒相关性慢加急性肝衰竭患者和慢乙肝患者实验室检查结果 实验室检查指标 患者组 患者组值
:丙氨酸氨基转移酶:天门冬氨酸氨基转移酶:凝血酶原活动度: 总胆红素
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表
表.乙肝病毒相关性慢加急性肝衰竭中甲基化组和非甲基化组相关资料 :丙氨酸氨基转移酶:天门冬氨酸氨基转移酶:凝血酶原活动度: 总胆红素
图 一
一
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图.法检测基因启动子区甲基化状态
:正常对照:慢性乙型病毒性肝炎患者:慢加急性肝衰竭患者,:阴性对
照:启动子区甲基化组.:启动子区非甲基化组.山东大学博士学位论文
图
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图.实时荧光定量法检测各组患者外周血中的 的表达 :正常对照:慢性乙型病毒性肝炎患者:感染相关性患 者:甲基化组:非甲基化组。
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图
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图.感染相关性患者慢加急性肝衰竭患者基因启动子区甲基化组和非
甲基化组患者的积分
:感染相关性患者山东大学博士学位论文
参考文献
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】刘晓燕.例急性、亚急性、慢加急性肝衰竭病因特点分析。临床医学工
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范文二：谷胱甘肽S_转移酶综述
】GlutathioneS-transferease
1GSTs分型
GSTs(EC2.5.1.18)是广泛存在于各种生物体
内的由多个基因编码的、具有多种功能的一组同工酶，分子量为23～29KDa。有膜结合和胞液两种形式，以胞液GSTs为主。依据酶活性、序列、基序和结构特征，膜结合GSTs(如微粒体GSTs)现归于类花生酸类物质和谷胱甘肽代谢的膜相关蛋白(MembraneAssociatedProteinsinEicosanoidandGlut-athionemetabolism,MAPEG)的一个新的超家族[1]。
表1GSTs的一些分类标准分类标准类别
、、、一级结构比较
、、、、
三级结构：活性中心、、、
、
/
/
(theta)、(Zeta)等型(表1)[3]，、
其中前五型是胞液GSTs，同型的亚单位间才可以形成同或异二聚体。
目前还没有根据序列相似性对GSTs分型的明确标准，通常公认氨基酸序列相似性大于60%为同型GSTs，低于30%则为不同型[2]。2GSTs的基本结构与功能2.1
结构
至今报道的所有可溶性GSTs都有相似的三级结构（图1）。GSTs是一种球状二聚体蛋白，每个亚基有一个酶催化中心，分子量介于23～29KDa，由200至240个氨基酸组成。每个亚基的多肽链形成两个结构域。
?￠?￠
图1
GSTs
三级结构
收稿日期：2006－04－25
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11
成螺旋，是GSH结合位点(G位点)，是重要的灭活酶，致癌物质的代谢
而且存在一个相当保守的酪氨酸残基
(Try)，该Try-5和平衡状态是致癌的关键。的-OH与GSH的硫醇化阴离子形成氢键来稳定之，自Sato等首次在大鼠胎盘中纯化得到GST-从而在催化反应中起重要作用。值得一提的是，
-
末端伸展与
-乙基谷胱甘肽成型片，并显示有显著的谷胱甘肽依赖的硫醇转移酶的活性[4]
。其余氨基酸以5或
6股-末端氨基酸结构域，
是亲电子物质即底物结合位点(H位点)。
在不同型GSTs
间差别较大，如型GSTs包含5个型GSTs包含6个-
末端氨基酸结构域的差异可以解释、
12
的表达是除癌前病
变细胞结节中其他几种生化指标（如
-GT）表达外的又一种变化，并认为是一种新的、更准确并优于
既能在组织中检测到又可在血清
中检测到，而其它许多肿瘤标志物只能在组织中检
测到。并且检测血清中的GST-表达与肿瘤的关系的研究的深入，它很有可能成为肿瘤而不只是肝癌的标志物。3.2GSTs的多态性与肿瘤的关系
GSTs基因家族是一个巨大的超基因家族，就表型而言，每一类同工酶中又包括很多亚型；就基因型而言，每一类都有很多不同基因位点。到目前为止，GSTs的4种基因，即GSTM1，GSTM3，GSTP1和GSTT1已证实具有多态性，基因的多态性可引起酶活性的改变，导致对潜在致癌物代谢能力的差异，
这种差异是构成个体肿瘤易感性的遗传基础之一［9-11］
。
3.3GSTs与肿瘤细胞耐药性的关系
自从Wang等首次报道GSTs同工酶的异常表达与肿瘤细胞的耐药性有关以来，越来越多的研究表明了此现象的普遍性，即GSTs可代谢抗癌药物。其中GST-的过量表达与肿瘤耐药性
有关[12]。其机理可能与这些抗肿瘤药物具有亲电子特性有关。GST-活性的肿瘤组织，如果采取非
GST-
-转移酶(
GSTs)融合表达系
统很好地满足了这些条件，因而越来越多地被运用于基因工程研究。
日本血吸虫蛋白抗原Sj26(Schistosomajaponicu，26ku)具有谷胱甘肽
7989766/7989866/7989877-0431/电话2006.06◢吉林畜牧兽医
pGEX质粒广泛用于外源基因表达载体的构建。外源基因可插入pGEX质粒GSTs基因的3'端酶切位点，表达载体在大肠杆菌中表达的外源蛋白，其N端含有GSTs片段，因而表达产物可以根据GSTs的性质进行检测和纯化，而且GSTs部分还可以用凝血因子X切除，获得单一的外源基因表达产物。它的主要优点是，在很多情况下所表达的融合蛋白是可溶性的，而且表达量通常也很高。GSTs融合蛋白能与亲和介质上的谷胱甘肽结合，再用还原性谷胱甘肽竞争GSTs上的结合位点将融合蛋白洗脱下来，从而达到纯化的目的。5GSTs与肝脏的关系
GSTs分布较广，在肝脏中含量最高，约占肝脏可溶性蛋白的5％，当肝组织受损伤时将会迅速释放到血液中，因此，外周血中此酶含量和活性的变化，将在一定程度上反映肝脏功能和损伤变化。
该酶的半衰期只有60min，而转氨酶的半衰期长达48h。据Abachi报道，在急性肝炎时GSTs明显升高，且较ALT（丙氨酸转氨酶）和AST（天门冬氨酸转氨酶）提前出现。当肝损害急性期已过，血中GSTs就迅速恢复正常，而ALT的活性可能维持较长时间。因此GSTs测定对于早期肝损伤比测ALT更有一定优越性[13]。
从实验测得的常见肝病患者结果来看，急性黄疸性肝炎、重症肝炎及慢性活动性肝炎所测的GSTs活性明显的高于正常对照组。肝硬化组由于急性期早过，而且它是慢性疾病并向弥漫性伴有结节增生方向发展，因此GSTs活性不高，与正常组无明显差别。非肝脏疾病患者，除个别增加外，其余均在正常范围内，从结果分析看，GSTs活性测定，对于肝脏疾病的早期诊断及疗效的观察，它是一项较为敏感的重要指标[13]。6
GSTs与寄生虫的关系
参考文献：
[1]
JakobssonPJ,MorgensternR,ManciniJ,etal.CommonstructuralfeaturesofMAPEG-awidespreadsuperfamilyofmembraneassociatedproteinswithhighlydivergentfunc-tionsineicosanoidandglutathionemetabolism[J].ProteinSci,1999,8(3):689–692.
SheehanD,MeadeG,FoleyVM,etal.Structure,functionandevolutionofglutathionethansferases:implicationsforclas-sificationofnon-mammalianmembersofanancientenzymesuperfamily[J].BiochemJ,2001,360(Pt1):1–16.
BoardPG,CogganM,ChelvanayagamG,etal.Identification,char-acterization,andcrystalstructureoftheOmegaclassglutathionetransferases[J].JBiolChem,2000,275(32):24798–24806.
GirardiniJ,AmiranteA,ZemzoumiK,etal.CharacterizationofanomegaclassglutathioneS-transferasefromSchis-tosomamansoniwithglutaredoxin-likedehydroascorbatereductaseandthioltransferaseactivities[J].EurJBiochem.2002,269(22):5512–5521.
陈丽君.谷胱甘肽S-转移酶基因家族的研究进展[J].皖南医学院学报,2003，（2）：22144–146.
聂立红.谷胱甘肽硫-转移酶研究进展[J].中国病理生理杂志,2000,16（11）：1240–1243.
段沁江.谷胱甘肽S-转移酶与肝病变研究的新进展[J].国外医学卫生学分册,1995,22（1）：8–11.郭桂芳.谷胱苷肽S-转移酶-
[2]
[3]
[4]
[5][6][7][8][9]
[10]
[11]
[12]
血吸虫生活史各期中以虫卵所致的损害最为严重，虫卵沉着于肝、肺等组织，并释放可溶性虫卵抗原(SEA)，刺激各种淋巴因子的大量产生，引起机体Ⅳ型变态反应。形成虫卵肉芽肿、门静脉高压等一系列病理反应，对机体造成损害。血吸虫GSTs蛋白作为疫苗除可诱导较强的免疫保护外，还可有效减少成虫数量和产卵数，一些复合型的疫苗蛋白如Sm14-3-3或Sj14-3-3与GST组成融合蛋白可激
15］
发机体23%～32%的补体介导的细胞毒作用［14，，调节细胞因子的分泌，使致炎因子的分泌减少而使IL-10和IgG1升高，从而减轻Ⅳ型变态反应[16]，使得虫卵肉芽肿的病理损害程度有所减轻。
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[13][14]
[15]
[16]
13
范文三：乙型肝炎病毒表面抗原前S区和谷胱甘肽巯基转移酶融合…
乙型肝炎病毒表面抗原前S区和谷胱甘肽
巯基转移酶融合…
lg年9月
生物化学与生物物理
A册AB100HIM10Ae}BIOPHYSICASINICA VO1.26.No.5
Sepf.,1994
乙型肝炎病毒表面抗原前S区和
谷胱甘肽巯基转移酶融合基因
在大肠杆菌中的表达
.刘惠童俞贤明,-——————,———一,
(中国科学院上海生物化学研究所.200o31)
摘要
.1e)
R72'i}
我们构建了备胱甘肽巯基转移酶(GZT)和完整的或部分缺失的乙型肝炎病毒表面抗原前
8区的融台基因,并在太肠杆菌中进行了表达.融台蛋白的产量随着前S区长度的增加而迅
速降低而且融合蛋白的前S区有严重的降解,主要降解位点在preS1区的a.a.75和preS2
区的a.a.130和a.a.165左右.利用蛋白降解酶系缺陷型菌株进行的研究表明,这种降解酶
存在于多个大脑杆菌株中而且和大肠杆菌中的两个主要的蛋白降解酶系Lon和htpR无关.
具有重要生物学功能的前8区肽段(preSla.a1-65)因含有阻止分泌的滞留顾序而无法
在哺乳动物细胞和酵母中大量表达但滞留顺序的存在并没有影响含有这一肽段的融合蛋白
在大肪杆菌中的表达和产物的纯化.G8融合表达系统产量高,纯化快速简便.用这一方法大
量表达并得到的这—肽段不仅是研究乙型肝炎病毒的分子生物学的重要材料,而且可以作为
新一代乙型肝炎疫苗的主要组成成分.
关键询乙型肝炎病毒;表面抗原;GST融台蛋白:擀白酶降解位点, 乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原基因(8基因)分为前8区(preS区)和8区两部分, 编码3个有共同羧端而氮端不同的表面抗原蛋白,即主蛋白(s),中蛋白(瑚,带preS2 区)和大蛋白(LS,带preSl-pref~区).其中8蛋白是现有的血源和基因工程疫苗的有 效成分.
近年来对表面抗原蛋白(HBsAg)前8区结构和功能的研究显示,这一区域有多个抗
原决定簇相应于前8区的合成肽段能保护黑猩猩免受HBV的感.有人预测新的 一
代乙型肝炎疫苗将包括前g区和8区.它将比现有的疫苗有更强的免疫原性,而且还
有可能用于慢性乙型肝炎病人和?BV携带者的治疗.前8区还带有和肝细胞受体结合
位点,M8特别是LS蛋白又在病毒颗粒的组装中起着十分重要的作用一,因而大量表
达M8和LS蛋白将对研究前8区的这些性质有重要意义.8蛋白在大肠杆菌中表达水
本文1093年r月19日收到,修改稿1993年0月7日收到.
美国国立卫生研究院PublicHeM~hSezviceG:rmu~OA-0TI75和OA2龆蜡部分资助 ?华束师范大学生物系研究生,现通讯地址:中科院上}每生物工程研究中心(2oo233).
514生物化学与生物物理26卷
平低下而且不能形成HBsAg颗粒,它在哺乳动物细胞和酵母中表达量高,而且形成易分
泌的HBsAg颗粒.但LS蛋白在哺乳动物细胞中以膜结合蛋白存在,难以分泌和提纯.
它在酵母中表达水平低下,纯化困难.只有当大部分前8区缺失后所得的HBsAg蛋白
形成的颗粒和分泌的性质才接近于8蛋白,但它们在哺乳动物细胞中的表达水平仍比8
蛋白低.
本文报遭了利用一种新的大肠杆菌融台表达系统——谷胱甘肽巯基转移酶(GSTj系
统来表达完整的或部分缺失的?BV表面抗原前8区和GST的融台蛋白,并研究了它们
的性质.
材料和方法
一
材料
G~epharose4B和谷胱甘肽为Pharmacia公司产品,兔抗HBsAg-preS1(a.a,21— 47)抗血清由A.R,Neura~h提供,抗兔/gG的碱性磷酸酯酶标记的山羊抗体和蛋白酶
抑制荆PMSF是Borhingerl~annheim公司产品.限制性内切酶,连接酶,x—gal和 IPTG分别为New~nglandBioLab和Sigma公司产品,DNA序列测定采用美国USB 公司的试剂盒.
大肠杆菌菌株T(~-I,J1VI109和DH5"的基因型见"分子克隆"一书.其他菌株: 0AG627(8O1船)la.()crp(am)pho(alm)sup0"rpslmaC(am)
0AG6298oia2Ion一p一TnlO
由O.Gross提供.
融合蛋白表达质粒pG~EX一8X(Pharmacia)由P.Lamber~提供.在GST编码区后
ATGGSTpreSipreS2有编码蛋白因子x8识别位点的序列和用于 sT_f1互二二二二二_.
隆外源基因的多酶切位点(7)...
GsT
——
,1
1
1
l
a
9l65
~7
V///////A~,J"
l7l
,
船台蛋白表达质粒的构建
….V///////~.……i-5IJZLI,b?『l,4^^l惮且膏南f GST-f4v///////AJ~ps9oo,p88o6,,和扩o
'
,pS302pS312pS308
……增得到.所用的一对POR引物分别在扩增 GST_I5二二]_—.片段的5,端和端弓【入Bam?工和]~coRI 啪
!一!殳B胝amtt经I
————
三一切点之间,使鹋T和preS的编码区处在同V///////~:蓁法 Fig.1Codingregions0ftheGSTP8和完整或部分缺失的前S区的融台蛋白表达
士1l臼i.n:3ene目intheeypressonpl.m_d质粒(图1). POR扩增的前S区片段经DNA序列测定未发现有碱基缺失或突变.
5期乙型肝炎病毒表面抗原前8区和谷胱甘肽巯基转移酶融合基因在大肠杆菌中的表达515
2.融合蛋白在大肠杆茵中的表达和亲和层析法纯化经融合蛋白表达质:粒转化 的大肠杆菌在LB培养液中过夜培养后,按1:1O比例接入2xYT培养液中,.c剧烈振
荡培养3小时,加入IPTG(0.5mmol/L)后继续剧烈振荡培养2小时.细菌经冷却,离心
沉淀并用NETN缓冲液(20mlno1/LTris-tt01pH8.0,:[00mmo1/LNa01,lmmo1/L
EDTA,0.5为NP-4O)多次洗涤后,悬浮在含蛋白酶抑制剂PMSF的NETN缓冲液中,
在冰浴中用超声波破碎.离心后所得上清液可直接用于融合蛋白的纯化或在一70.c保
存备用.
在破碎细胞的上清液中加入适量G-Sepharose4B,在室温下旋转混合90分钟.离 心弃上清液并用NETN缓冲液多次洗涤后,取少量G-Sepkarose4B加入蛋白电泳上样
液,煮沸4分钟后离心取上清液用SDS-PAGE电泳检测蛋白产物.其余G-Sepharose4B
装柱后用谷胱甘肽溶液(5mlnol/L谷胱甘肽,50mmol/LTri?pit8.O)洗脱融合 蛋白.洗脱液用0en%ricon一80离心浓缩并去除谷胱甘肽,然后用Folin-酚法测定蛋白
浓度后一7O.a保存.
3.纯他的釉合蛋白的印渍法检测纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE电泳,通过 夹心法电印渍(60V,6,8小时),将融合蛋白从PAGE腔上转移到硝酸纤维索纸(NO纸)
上.NO纸置于1,舀脱脂奶粉溶液中4~C过夜,洗涤后依次加兔抗preSl(a.a.m-47)
抗
血清(1:1000稀释),碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG的抗体及碱性磷酸酯酶的底物
BIOP/NBT作用.显色反应时阐长短视条带深浅而定.待蓝色条带显示清晰后,用蒸馏承
洗去反应底物终止反应.
结果
一
,GST—preS融合蛋白在大肠杆菌TG-1株中的表选
我们构建的6个GST—preS融台蛋白表达质粒在大肠杆菌株TG一1中表达产物用
SDS—PAGE测得的分子量与计算值十分接近.分子量较小的GST-f5和G8T—f6蛋白的
产量在每升培养液中可达5N:[0mg,和GST蛋白表达水平相当.而GST-f~[和GST-f2
蛋白的产量则明显低得多.在这几个纯化产物中均有一条相应于GST分子量大小的条
带(图2A).
前日区在大肠杆菌株IH一1中有严重降解.GST-f~[和GST-f2蛋白的主要降解产 物分子量和GST—f5蛋白相同,由此推算preS1区的一个主要僵白降解酶作用位点在a.
a75左右.仪含preS1区aa1N65的GST-f5蛋白并没有明显的降解,说明在这个区 域内并无大肠杆菌蛋白降解酶主要作用位点.GST—f8蛋白的纯化产物中有一条降解蛋
白条带分子量只比GST-f3略小,根据GST—f2和GST-f8蛋白在SDS—PAGE上的迁移
率和分子量推算这一个蛋白降解酶作用位点在preS2区的aa.165左右.GST-f8蛋白
的主要降解产物分子量也和GST-f5相近,由此估算在aa.180左右也有一个蛋白降解
酶作用位点.GST-f4蛋白虽然不含有~reSl区的蛋白降解酶作用位点,但从它的主要蛋
白降解产物的分子量来估算,它在preS2区近a.a.1骝处或者在preS]和preS2区域
的
交界处有一个蛋白降解酶作用位点.GST-f6纯化产物中有多条蛋白条带,它们的分
子量
61B生物化学与生物物理26卷
嚣羹鏊嚣?i
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Fig.2AThee弛gg衄ofc}ST-
preSfusionproteinsinTG-1 refaslen?r0七eiD自WerBD口ri自edfro1=. 3mlcoilculturesbyaffinityohroma-
t.o~aphy.resolvsd叻12%8D8-PAGE aDtaj?eJithCoomas~i8brillian~ 议L0dyeThearrOwBindiea抽eintae~ GST+Dre8fusionDr0】?8.
仅比GST略大,说现在proS2区的近氨端处有多个 蛋白降解酶作用位点.图身B是前日区蛋白降解酶 作用主要位点的示意图.
二,纯化的融合蛋白的蛋白印渍法检测
亲和层析纯化的GST—preS融合蛋白的印溃法 检测显示GST—preS融合蛋白和部分降解但仍带有 preSl区氨端部分的融台蛋白能显出特异性的蓝色 条带,而作为负对照的GST蛋白和GST-f6蛋白 (不含preS1区)则不能显色f图8),这和图2A蛋白 电泳结果相符.而融台蛋白纯化产物中和GST蛋
白分子量相同的条带也不能显色,说明它就是GST
蛋白.dST蛋白的产生可能是在GST和前8编码
区融台时引入了一个大肠杆菌蛋白酶作用位点.
峭.
Fig.2BAschematicmuqti.?ofth.majorcleavage sitesJntheHBVp8regionin口.co~,i
一Fig.4Expressionof恤eGST-fl??te
缸di曲nt.c目扭ain日
Therim自ncwp~rformed"
describedinFig,2A.
三,GST-preS融台蛋白在不同的大肠杆菌株中的表达我们在不同的大册杆菌 株中袭选了GST—f1融合蛋白,如图4所示.在JM109,DH5a,TG一1,0AG627和 CAG6~9等基因型存较太差别的菌株中表达的GST—f1融合蛋白降解产物大致相同,
说明在这些菌株中都有作用于前区的蛋白降解酶.在大肠杆菌株0AG629(1on,htpR一)
5期乙型肝炎病毒表面抗原前S区和谷胱甘肽巯基转移酶融合基因在大肠杆菌中的表达517
中GST—f1蛋白的降解情况和其它菌株相比也投有明显的不同.我们还在这几个菌株中
分别表达了GST—f2和GST—f6融合蛋白,所观察到的结果也和GST—fl相同,即这些融
合蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解的产物相同(结果未示).以上结果说明图2A所示的前s
区降解并不限于我们所用的T(]-I菌株.
讨论
根据Smith等人的报道,和GST融合的外源蛋白分子量在200~800个氨基酸时, GST融合蛋白产量和GST蛋白产量比较接近.只有当外源蛋白长度超过400个氨
基酸
时,融合蛋白产量才会明显下降[.GST-fl蛋白中前日区长度仅为174个氨基酸,但和
GST—f4(前8区长83个氨基酸)和GST-f5(前s区长76个氨基酸)蛋白相比,在TG-J 株中(图2i)和其它菌株中产量要低得多.我们认为有可能是因为GST-fl和GST—f2
蛋白所共有的preS1区羧端二分之一肽段(8.8.66~i19)对大肠杆菌有毒性从而抑制了
这些蛋白的表达或者因为加长的部分是亲水的前日区千扰了GST肽链的折叠,从而使融
合蛋白更容易降解.
虽然HBs2gpreS2区在酵母中的蛋白酶敏感位点已有报道[,但本文是首次报道 HB~Ag前8区在大肠杆菌中蛋白降解酶的作用位点.这种降解作用存在于多个基因型
不同的菌株中而且和大肠杆菌的主要蛋白降解酶系Lon和h古pR无关[.我们正在大肠
杆菌的其它蛋白降解酶缺陷型菌株中表达GST-preS融合蛋白,寻求克服前8区降解的
途径.
我们的结果还表明preS1区a.a.1,75中没有主要的大肠杆菌蛋白降解酶作用位 点,而且含这一区域的GST融合蛋白GST—f5的表达和纯化不受preS1区中滞留顺序
(a.8.9,19)的影响.而这一阻止分泌的滞留顺序严重影响了古preS1区的HBsAg在
哺乳动物细胞或酵母细胞中的表达和纯化[,由于preS1的近氨端的区域是前s区结构
和功能研究的重点部位,在大肠杆菌中表达这一区域的肽段可以为进一步研究HBV的
分子生物学提供重要的材料.
1%ura~h等人提出,用化学合成古肝细胞受体结台区的preS1区的肽段(8.8.9l, 47),然后用共价或非共价的方式交联到基因工程疫苗中的目和M8蛋白上去,用为新一
代的复合疫苗.但化学合成多肽价格昂贵,而且大量合成时肽段长度也有限制.用GST
融合蛋白表达系统表达前日区,如前日区(a.8.1~65),具有表达量高,亲和层析法一步
纯化即可达纯度9o为以上等优点.表达产物纯化后经蛋白酶Thrombin或蛋白因子
切去GST部分后,再经一步纯化即能得到较纯的前8区的肽段.这为大量获得preS1肽
段用以研制新型乙型肝炎疫苗开辟了一个新的途径.
我们正在用BALb/a和a57BL/6小鼠进行免疫实验,观察未经切除GST部分的 融台蛋白GST—f5和8蛋白共同使用时,是否对S蛋白也有免疫协同作用,即GST—f5蛋
白能否减少8蛋白的用量并促使抗日抗体较早出现.用GST-f5蛋白免疫BiLb/0小鼠
后已筛选到高滴度的抗preS1(a.8.21~7)的单抗(杨海林等,待发表结果).这说明以 融台蛋白形式存在的前8肽段也具有免疫原性.
518生物化学与生物物理26卷
参考文献
Tiolhis.Pet..TheHepatitisBVirus.脓坩.1985,317,489. Neura~l,A.R.d1.,Imnlunoi-89pOn日etohepatitisBvirusdeterminantscodedby七h0p确gene.
,?cn,198.5.SS,185.
Thornton,
目.B.et..Proteettonofehimp:nzee~fromhepatitisBvlrtl8infectionafterimmunizatiol
withsynthetic.pcp七id郫:identificationofprol~tiveepit.pinth.preSregion.?0.1989,89.467.
Neura~Ja,A.R.f.,Identificationandchemicalsynthesisofahostcellr*ceptorbindingsite0n
hepatitisBvirus.0日1986?柏,429.
Veda,?.f..Threeenvelop~proteinsofhep~tltisBvirus:hrgeS,middlsSandm~jorSproteins neededfortheformatisnofD3?ep~rticles.P打02.1991,05(7).8521.
俞贤明等:一十能分泌出哺乳动物绁胞的ttBV表面抗原大蛋白.中国科学B
辑,1991(6),633.
吕mi,D.B.andJohnson,?..,Single-steppurificationofpolypep~idesinEssharichi~c眦
a8fusions
withutethioneS-,ran8r铀e.口砷.1988.盯,91..
0abszon.T,.,AllswhepatitisBvaCCineeontein~ngprsBtandproS2epitope~from删咖D
?
州Vacsir~s,1990.如.199.
Got~e.sman.S..(9~netics0fpr.e0ly【日in酆_硇cgJi...Gem#.,1989,28.163.
NeuraLh,A.R.et面.,]:Iep%~itlsBviru日surfaceantigenr?
BBAg)a8carrierforsyntheticpeptld~
havinganattachedhydxophobie饥il_Molecular"Imvm~ology,1989.蛐(1),53.
ExpressioninEeolioftheChimericGenesinWhichthePreS
CodingRegionoftheSurfaceAntigenofHepatitisBVirus
WasFusedtoaGlutathioneS—-TransferaseGene
LIUHut.LIZai-PingandYUXian—Ming
(shasghai%iD删Avadem~a8协io,200031)
ABSTBAaT
Fusiongenesinwhichthecodingregionsofthein%actOTpartiallydeleted preSregionofthesurfaceantigen(HBsAg)ofhepatitisBvirus(HBV)wasfused 协aglutathioneS--transferase(dsT)gonewereconstructedandexpressedin. .0.Theyioldofthefusionproteinsdeclinedrapidlya8thelengthof也eHBsAg
prossegmentincreased.Moreover,theprosregionofthefusionproteinsdegraded markedly,andthemajorcleavagesiteswereestimatedIsbearounda.a.75ofthe preS1regionanda.a.I30anda.8.1硝intheproS2region.Theresearchconducted
withaproteinase-deficientstrainrevealedthattheproteinasesresponsibleforthe
proteo]ysisin拈epreSregionexistedinseveral.co硌strainsandwerenot
relatedtothetwomajorproteindegradalionsystems,LonandhtpR.The advantageoftheGSTfusionsystemwdiscussed.
KEYWORDS:HepatitisBVin~s;SurfaceAntigen;GSTfusionprotein; 团融er0^缸00ZProteinasecleavagesite
????……
范文四：谷胱甘肽S转移酶,GSTs,ELISA试剂盒
谷胱甘肽
S 转移酶 ,GSTs,ELISA 试剂盒
Ratmatrixmetalloproteinase7,MMP-7ELISA
谷胱甘肽 S 转移酶 ,GSTs,ELISA 试剂盒
实验内容与方法
1.在微量反应板每孔加入待检标本 50μl,设阳性、阴性对照各 2孔,每孔加入阳性(或阴性)对 照各 1滴,并设空白对照 1孔。 2.每孔加入酶结合物 1滴(空白对照除外),充分混匀,封板,置 37℃孵育 30分钟。
3.弃去孔内液体,洗涤液注满各孔,静置 5秒,甩干,重复 5次后拍干。
4.每孔加显色剂 a 液、 b 液各 1滴,充分混匀,封板,置 37℃孵育 15分钟。
5.每孔加终止液 1滴,充分混匀。
6.用酶标仪读数,取波长 450nm ,先用空白孔校零,然后读取各孔 od 值。
ELISA kit has the following features:
1. Strong specificity. Antigen and antibody immune response is the exclusive reaction, on the basis of the immune response and immune enzyme technology, the detection of antigen (antibody) or the object is, use of antibodies in addition to the marked enzyme, with ordinary antibody immune response characteristics, there is no much difference.
2. High sensitivity. Because antibodies coupling on the enzyme, therefore, with the help of the enzyme and substrate color reaction, shows the combination of antigen and antibody, greatly improving the detection sensitivity, close to the standards of testing immunoradiometric assay.
3. Easy to save sample. After most of the enzyme reaction shows non-ferrous products is stable, thus conducive to the preservation of the sample.
4. The result is easy to observe. Can be observed with the naked eye, with the result of detection and microscopy are available, and can also use spectrophotometer colorimetric determination, can also be used a microscope. This is because some enzyme reaction products can cause changes in the electron density, that cause the detected object's display. 谷胱甘肽 S 转移酶
5. Can be quantitatively determined. Antigenic substance in solution, enzyme adsorption technology was used to colorimetric determination, according to the change of optical density value, can be quantitative. Cell
spectrophotometer is expected to use within the organization on antigen for quantitative determination of the immune enzyme technology.
6. Can measure the sample mass. There are thousands of samples such as the need for detection, immune enzyme technology can be finished in a short time.
7. Simple instruments and reagents. For immune not technology, do not need a fluorescence microscope, also do not need special instruments, measurement of the radioactive instruments and reagents are used in general instruments and reagents, general laboratory and production units are easy to buy谷胱甘肽 S 转移酶
Kit is divided into two kinds of specifications of 48 t / 96 t, the standard curve of each experiment generally set up seven different concentrations, plus a blank hole, standard curve in all eight holes. Therefore, a 48 t kit can be used to measure up to 40 samples (do not repeat and once finished), a 96 t kit can be used to measure 88 samples at most (do not repeat and once finished). Can be based on the actual sample size and the experiment plan to choose the appropriate product specification.谷胱甘肽 S 转移酶
Colorimetric determination of conducted by enzyme standard instrument. Some colleagues might think, since by enzyme standard instrument, so at this time can be everything is all right, actually otherwise, because of the contemporary advanced enzyme standard instrument, there are more functions, improper use, the results will be hard to understand. Such as using the enzyme colorimetric determination after the instrument, there are a lot of negative determine the absorbance of away L value is negative; Or the determination of greatly increase the rate of false positives and so on. This is mainly not correctly understand and use the enzyme caused by the instrument.
In addition, before joining the substrate began to color reaction, good is to check the validity of the substrate solution first, the fluid in both of A and B can be add 1 drop of clean empty plate holes or eppendorf tube, observe whether there is A color, if yes, then the substrate was bad. .opd as substrates, match after should be colored, otherwise can't use. TMB as substrate, the whole process of chromogenic reaction without light, the.opd as substrate, the need to avoid light. About the TMB and the.opd chromogenic reaction characteristics and attention points in front of the reference related chapters content. After the completion of the color reaction, adding acid termination reaction, oscillation after blending for the colorimetric determination or judge the results to the naked eye.
范文五：植物的谷胱甘肽转移酶家族
重／ｋ－－ｕｋ学院学报一ＪｏｕＲＮ札ｏＦ２００４年第ｓ期．．ｔｌ穸２０卷叫ｏ。５。２００４ｃＨｏＮＧＱ小Ｇ
ＴＨＲＥＥＧｏＲＧＥｓ
ｕＮⅣＥＲｓＩＴＹ—Ｊ＿盈雹置圈
ＶｏＬ２０．
植物的谷胱甘肽转移酶家族
胡廷章
（重庆三峡学院生物系，重庆万州４０４０００）
摘要：植物的谷胱甘肽转移酶（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，ＧＳＴｓ：ＥＣ２．５．ｉ．１８）是一
个大家族；根据蛋白同源性和基因组织结构，植物ＧＳＴ分为叭＜、ｆ、０、九五类；ＧＳＴ主要在胞液
中表达，是由约２６ｋＤａ亚基组成的同源二聚体或异源二聚体，形成疏水的５０ｋＤａ的蛋白；在不同组织和不同的环境条件下，基因表达差异很大。ＧＳＴ在植物的初级代谢和二级代谢、胁迫耐受、细胞信号等方面行使功能．
关键词：植物；谷胱甘肽转移酶；ＧＳＴ基因；基因表达；ＧＳＴ功能中图分类号：Ｑ８１４文献标识码：Ａ文章编号：ｉ００９－８１３５（２００４）０５—０１２１—０４
二十世纪六十年代，在动物中第一次发现ＧＳＴ，这些酶在代谢和解除药物毒性中起着重要作用【１１。在１９７０年，第一次在玉米中发现ＧＳＴ，该酶能催化氯．Ｓ．三嗪阿特拉津与ＧＳＨ结合，从而保护作物免受氯．Ｓ一三嗪阿特拉津除草剂的损害【２ｌ。从此以后，在动物、植物、真菌中不断发现新的具ＧＳＴ活性的相应酶或基因序列【Ｉ＇３】。ＧＳＴ在植物体中具有多种多样的功能。一些ＧＳＴ的表达具有组织特异性，还有些ＧＳＴ基因的
表达受生物因素和非生物因素的诱掣４１。因此，研究ＧＳＴ对探讨植物的生长、发育以及植物对环境胁迫的
反应机理等方面都具有重要的意义，为改良植物品质、提高植物抗逆性提供依据。
１
ＧＳＴ的分类和命名
根据氨基酸序列、底物专一性以及免疫交叉反应的特征，动物ＧＳＴ可分为ａ、队兀、芎、ａ、０六类【１，３－６１。
在二十世纪八十年代，随着玉米中解除除草剂毒性的ＧＳＴ的纯化和基因克隆，发现植物ＧＳＴ基因的序列与相应的哺乳动物的ＧＳＴ基因的序列存在明显差异１７，８１。自此以后，许多ＧＳＴ和ＧＳＴ类似序列被从植物中克隆，最初建立的分类系统包括０、Ｔ、芎三类，随着人们对植物ＧＳＴ基因家族的理解，最初的分类系统得到不断改进和完善，为了更好理解高等植物ＧＳＴ组织，人们利用拟南芥的全基因组序列研究ＧＳＴ家族，根据蛋白同源性和基因组织结构，植物ＧＳＴ分为叭＜、ｔ、０、九五类／９．ｔｏ］，毛和０在动物和植物中都存在，但Ｔ和巾是植物特异性的【４】。
在蛋白质水平，ＧＳＴ的复杂性又因ＧＳＴ是由相同或不相同的亚基组成的二聚体而进一步复杂化【４】。为了避免混乱，人们建立了ＧＳＴ的系统命名体系。以拟南芥ＧＳＴ为例来说明ＧＳＴ的系统命名。如ＡｔＧＳＴＵｌ．２，ＧＳＴ前的两个斜体字母是指ＧＳＴ的生物来源，Ａｔ代表Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ：ＧＳＴ后的单字母表示ＧＳＴ的类型，其中，Ｆ表示ｐｈｉ，Ｕ表示ｔａｕ，Ｔ表示ｔｈｅｔａ，Ｚ表示ｚｅｔａ，Ｌ表示ｌａｍｂｄａ：两个数字代表亚基的组成，如Ｕ１．２是由Ｕ１和Ｕ２组成的异源二聚体：至于亚基的编号方式，在象拟南芥这样的有机体中，由于有了全基因组信息，根据编码ＧＳＴ亚基在染色体上的位置来编号，而在基因组信息不完整的植物中，是基
于编码ＧＳＴ亚基的基因在该植物中的发现顺序编掣¨１。
２ＧＳＴ的基因组织
收稿日期：２００４－８－１０
作者简介：胡惩章（１９６５－），男，四川简阳人，重庆三峡学院副教授。复旦大学在职博士研究生．
一１２１—
■圈墨圈
植物ＧＳＴｓ基因家族是一个大家族，现已发现…一～…。
构时，酶的Ｇ和Ｈ位点是可动的，表明在结合底物
的拟南芥有４８个ＧＳＴ基因，大豆有２５个ＧＳＴ基时，ＧＳＴ亚基经历重大的构象变化，这被＿（ｐＧＳＴ的
因，玉米有４２个ＧＳＴ基因，水稻有５９个ＧＳＴ基
脱辅基蛋白ＺｍＧＳＴＦ３．３与ｔｐＧＳＴ的三元复合物（包因ｉ４Ａｏｊ２］。
含ＧＳＴ和底物）的结构差异所证实【１９１。ＧＳＨ与ＧＳＴ系统进化分析表明：可溶性ＧＳＴ来自一个共同的结合遵循诱导契合机带ｌＪｔ３，１９１。
的祖先基因。在拟南芥ＧＳＴ家族中，分析ＥＳＴ库４
ＧＳＴ基因表达的组织特异性和可诱导性
表明：４８个ＧＳＴ基因中有４１个表达。一些ＧＳＴ在较多的禾谷类作物中，ＧＳＴ是高表达的，在的功能可能存在重叠，导致一些冗余。主要作物的叶中，可达总蛋白的２％。在植物中，一些ＧＳＴ基大规模ＥＳＴ计划为植物中ＧＳＴ基因家族的多样性因的表达具有组织特异性，在近交玉米系的研究中，提供了有价值的信息，在这些ＥＳＴ研究中，每类ＧＳＴ同功酶在不同的组织中表达【２２１。例如，花粉包ＧＳＴ的相对丰度非常相似于拟南芥基因组的基因含单一ＧＳＴ，而角质绒片有相应的５个同功酶。用化分布，虽然一些植物如大豆可能较玉米和拟南芥含学试剂处理植物，其表达的组织特异性可能受到影有更少的ｑ）ＧＳＴｔ４１。拟南芥基因组包含４８个ＧＳＴ类响。例如，ＺｍＧＳＴＦ２在正常情况下只在根中表达，似基因，ｔ和（ｐ是两类最多的，分别为２８和１３基但在除草剂安全剂或化学试剂处理后，在叶中也表
因，而０只有３个，三只有２个，九也只有２个【４】。达【２３１。在转基因烟草中，大豆的ＴＧＳＴ启动子启动
在玉米的４２个ＧＳＴ中，已报道１２个Ｑ序列，２８ＧＵＳ基因的表达模式也存在类似情测２４１。
个Ｔ序列，２个三序列。在２５个大豆ＧＳＴ中，有２０在生物和非生物压力下，会诱导一些中和ｔ个＂ｃＧＳＴ，１个薹ＧＳＴ，４个（ｐＧＳＴｔｌ３】。分析ＧＳＴ基因ＧＳＴ的表达，利用差异减法筛选法克隆到许多植物在拟南芥染色体上的位置，发现３４个ＧＳＴ基因是的胁迫诱导ＧＳＴ基因的ｃＤＮＡｔ２５］。在非生物压力下，成簇存在，这清楚表明，这些ＧＳＴ基因来自于基因一些ＧＳＴ的表达得到增强。冷、热、重金属离子、
的复制，ＧＳＴ基因的复制引起大量序列的分化，从而盐、ＰＥＧ、ＡＢＡ、ＳＡ、ＪＡ、ＮＡＡ、Ｈ２０２、甲基
形成不同的ＧＳＴ基因。在氨基酸水平，在不同类的紫精等可引起一些ＧＳＴ的响应。除草剂和除草剂安ＧＳＴ之间序列的同源性小于３０％，即使在同一类全剂的作用可引起一类ＧＳＴ的响应，ＧＳＴ通过ＡＴＰ－ＧＳＴ中，同源性也可能低于３０％ｔ４】。
结合转运酶使除草剂向液泡汇聚，从而达到解毒的３
ＧＳＴ的结构特征
目的，使植物的生长不受除草剂的影响【ｌ０’２６１。在一每个可溶性ＧＳＴ是由约２６ｋＤａ亚基组成的二
些情况下，ＧＳＴ因对一般的细胞损伤或除草剂和化聚体，形成疏水的５０ｋＤａ的蛋白，等电点在ｐＨ４．５学毒素引起的氧化压力的反应而被诱导瞄】。而在另的范围内。ＧＳＴ可以是同源二聚体，也可以是异源一些情况下，ＧＳＴ的诱导是针对特异胁迫作用的响二聚体。由于亚基间界面残基的不相容性，不同类应，诱导Ｑ和ｚＧＳＴ表达，引起植物的防御反应，型的ＧＳＴ亚基间不能二聚化。在同类亚基中，即使而不会强加任何可见的化学胁迫给植物【２７】，如除草氨基酸序列差异很大，也能形成二聚体【４０¨鄂。异剂安全剂处理的禾谷类植物，除草剂安全剂通过增源二聚体的形成大大增加了ＧＳＴ在植物中的多样加包括ＧＳＴ在内的解毒酶表达，增强对除草剂的耐性１２＇４】。研究不同类型的ＧＳＴ的结构表明：尽管不受性１４，２ｓｌ。细胞分裂或有生长素或细胞分裂素存在同类型的ＧＳＴ序列差异很大，但ＧＳＴ的二级结构也会诱导一些ｔＧＳＴ表达［”。９】。
及高级结构是非常相似的，ＧＳＴ的一些结构特征在ＧＳＴ的表达调节是在转录水平１．２５，２８１。在一些情其它的ＧＳＴ依赖蛋白中也存在，如谷氧还蛋白【３４’
况下，胁迫处理会出现新的ＧＳＴ变体，这是通过可
１６。１１。
变剪切得到的，其意义还不清划Ⅻ。亚基的转录调
蛋白二聚体的每一个ＧＳＴ亚基包含独立的催
节最终影响一系列ＧＳＴ同源二聚体和异源二聚体化位点，该位点由两部分组成，一是ＧＳＨ特异结的形成。例如，在组成型条件下，玉米和小麦叶中合位点（Ｇ位点），是由多肽链的氨基端区域的保占优势分别是ｔ类ＴａＧＳＴＵｌ．１和Ｑ类ＺｍＧＳＴＦｌ．１守氨基酸残基基团组成。二是结合疏水底物的位点同源二聚体，经除草剂安全剂处理，增加了特异亚（Ｈ位点），该位点的结构可变性较大，由来自于基的合成，出现了新的异源二聚体∞’３１１。在玉米中，羧基端的残基组成。Ｇ位点与Ｈ位点是由５一ｌＯ个安全剂诱导ＺｍＧＳＴＦ２亚基的合成，它与组成型表氨基酸残基组成的可变连接区连接。在测定晶体结
达的ＺｍＧＳＴＦｌ结合形成ｚＩＩｌＧＳＴＦｌ．２异源二聚体，
－１２２－
这是安全剂处理的组织中主要存在的ＧＳＴ同功酶之～ｆ２川。在小麦中，三个ＴＧＳＴ亚基，即ＴａＧＳＴＵ２、
ＴａＧＳＴＵ３和ＴａＧＳＴＵ４被安全剂诱导，它们与组成型亚基ＴａＧＳＴＵｌ结合分别形成异源二聚体ＴａＧＳＴＵｌ—２、ＴａＧＳＴＵｌ—３、ＴａＧＳＴＵｌ－４Ｉ圳。已有的
证据表明，安全剂诱导的异源二聚体的相对丰度是由新合成的亚基的相对丰度决定的。
５
ＧＳＴ的细胞定位和功能
在植物中，生物化学和兔役学研究表明大量的可溶性ＧＳＴ定位于胞质中…＿５１，这被拟南芥ＧＳＴ的基因组分析所证明：只有一个（ｐＧＳＴ和一个）、．ＧＳＴ有定位于质体和线粒体的序列，而所有其它的ＧＳＴ都不包含这些定位序列，因此预测它们存在于胞质中。还有少量的ＧＳＴ在细胞核或在细胞外表达【¨】。
ＧＳＴ在植物体中具有多种多样的功能，主要表现在以下几个方面：（１）植物中ＧＳＴ的主要功能在于解除外界毒素以及内源有毒代谢物的侵害：能催化还原型谷胱甘肽（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）的巯基与多种亲电、亲脂底物的结合，生成水溶性的产物，从而降低底物的毒性１２，４，１０１。（２）一些ＧＳＴ是非催化载体，例如：其中的生长素、细胞分裂素载体在激素的稳定中起作用，花色素苷载体在液泡花色素苷的汇集中起作
用。玉米ＴＧＳＴ基因突变体（Ａｎ９）不能在液泡中
储藏类黄素衍生色素，研究表明，ＧＳＴ涉及类黄素的细胞内结合和稳定，而不是催化它们谷胱甘肽化［１０－１１，３２］。（３）具有过氧化物酶活性，能解除羟基过氧化物（ｈｙｄｒｏｘｙ．ｐｅｒｏｘｉｄｅ）的毒性。已知０、中、Ｔ具有谷胱甘肽过氧化酶活性，ＧＳＴ利用谷胱甘肽还原脂肪酸和核酸生成相应的单羟基醇。该还原作用在阻止有机氢过氧化物降解成细胞毒素的醛衍生物
中起作关键作用［４，１０，３３－３４】。（４）还有些ＧＳＴ在细胞的
氧化还原稳态和调节细胞程序衰老方面起作用。有
趣的是，酵母表达的结果进一步证明ＧＳＴ与氧化
胁迫耐受性的联系，来自于西红柿的ｔＧＳＴ能抑制Ｂａｘ蛋白诱导的程序死亡，很明显，这是通过阻止氧化伤害的结果１４，１０，３５１。（５）也有ＧＳＴ的作为胁迫信号蛋白。西芹中被紫外光诱导的编码类黄酮生物合成酶的基因需要ＧＳＨ和特异的ＴＧＳＴ的表达，表明ＧＳＴ也作为细胞信号在胁迫耐受方面起作用［４，１０，３６１。（６）ＧＳＴ也在日ｒ代谢中催化异构化作用。在拟南芥植物中，Ｔｙｒ的降解的倒数第二步，暑ＧｓＴ催化依赖ＧＳＨ的顺丁烯二酸单酰乙酰乙酸异构化成反丁烯二酸单酰乙酰乙酸［４３０，３７１。
６酶促反应机制
由于植物ＧＳＴ能适应各种生物功能，因此，研究ＧＳＴ的酶化学是非常有意义的。Ｇ位点的保守性表明，在催化反应中，谷胱甘肽的结合和正确定向是关键。Ｇ位点也促进ＧＳＨ的巯基与临近的羟基形成氢键而离子化，产生硫醇盐阴离子。在哺乳动物中，Ｇｔ、兀、Ｉ．ｔＧＳＴ是由一个Ｔｙｒ残基提供羟基，而在植物中，酶的这个残基被Ｓｅｒ替代。形成的氢键使硫醇基的解离常数降低，例如，ＺｍＧＳＴＦＩ－１的氢键活性效应使硫醇基的解离常数从８．７降低到６．２。细菌的［ＢＧＳＴ是由Ｃｙｓ替代ＳｅｒｆＦｙｒ，从而与ＧＳＨ形成二硫化合物，导致该酶具有与其它ＧＳＴ有不同的催化活性。可变的Ｈ位点负责接受疏水性底物，然后由硫醇盐阴离子驱动一系列反应１３８１。
７展望
利用基因组和ＥＳＴ库对ＧＳＴ进行分类、研究
它们的进化和序列多样化，而结晶体的研究为了解它们的生物学结构提供了强有力的手段。然而，植物ＧＳＴ家族给功能基因组学提出了一个难题，即这些蛋白的功能是什么，它们在哪里，为什么它们的数量有如此之多，具有这样复杂的调节？在植物的初级代谢和二级代谢、胁迫耐受、细胞信号，ＧＳＴ似乎行使许多不同的功能；研究表明，即使差异很大的ＧＳＴ也可能具有相似的功能【１１Ｉ。继续分析这个蛋白超级家族无疑将进一步揭示其功能的多样化。对ＧＳＴ的深入研究将为作物的品种改良、提高作物
的抗逆性打下基础。
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１６：９５－１０７．
Ｉ
Ｐｈｙｓｉｏｌ１９９５，１０８：９１９—９２７．
【９】Ｐｉｃｋｅｔ
ｔＣＢ．Ａｎｎｕ
ＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ，１９８９，５８：
【２５】ＭａｒｒｓＫＡ．ＡｎｎｕＲｅｖＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔＭｏｌ
７４３－７６４．
Ｂｉｏｌ
１９９６．４７：１２７－１５８．
［１０】ＭｏｏｎＡ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２００３，５５３：４２７－４３２
【２６】ＥｚａｋｉＢ，ＳｕｋｉＭ，ＭｏｔｏｄａＨ
ｅｔ
ａ１．Ｐｌａｎｔ
［１ｌ】ＥｄｗａｄｓＲ，ＤｉｘｏｎＤＰ，ＷａｌｂｏｔＶ．ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ
２００４，１３４：１６７２—１６８２
Ｓｃｉ
２０００．５：
９３－１９８．
【２７】ＭａｕｃｈＦ，Ｄｕｄｌｅｒ
Ｒ．Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉ０１１９９３，
【１２】ＳｏｒａｎｚｏＮｅｔ
ａ１．ＭｏｌＧｅｎｅｔＧｅｎｏｍｉｃｓ．２００４Ａｐｒ７
１０２：１１９３－１２０１．
【Ｉ３】ＭｃＧｏｎｉｇＩｅＢ，ＫｅｅｌｅｒＳＪ。ＬａｕＳ－Ｍｅ
ｅｔ
ａＩ．Ｐｌａｎｔ
【２８】Ｄａｖｉｅｓ
Ｊ，Ｃａｓｅｌｅｙ
ＪＣ．ＰｅｓｔｉｃＳｃｉ
１９９９，
Ｐｈｙｓｉｏｌ
２０００。１２４：１１０５－１１２０．
５５：１０４３－１０５８．
【１４】ＤｉｘｏｎＤＰ，ＣｏｌｅＤＪ，ＥｄｗａｒｄｓＲ．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ
【２９】ＧｏｎｎｅａｕＪ，ＭｏｒｎｅｔＲ，ＬａｌｏｕｅＭ．ＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔ
１９９９．４０：９９７—１００８．
１９９８，１０３：１１４—１２４
【１５】ＳｏｍｍｅｒＡ，ＢｔｇｅｒＰ．ＰｅｓｔｉｃＢｉｏｃｈｅｍＰｈｙｓｉｏｌ
【３０】ＭａｒｒｓＫＡ，Ｗａｌｂｏｔ
Ｖ．Ｐｌａｎｔ
ＰｈｙｓｉｏＩ
１９９７，
１９９９．６３：１２７－１３８．
１１３：９３－１０２．
［１６】Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ
ＲＮ．Ｃｈｅｍ
Ｒｅｓ
Ｔｏｘｉｃｏｌ
１９９７，【３１】Ｃｕｍｍｉｎｓ
Ｉ，ＣｏｌｅＤＪ，Ｅｄｗａｒｄｓ
Ｒ．Ｐｅｓｔｉｃ
１０：２－１８．
ＢｉｏｃｈｅｍＰｈｙｓｉｏｌ
１９９７．５９：３５—４９．
【１７】ＤｉｒｒＨ，ＲｅｉｎｅｍｅｒＰ，ＨｕｂｅｒＲ．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ【３２】ＭｕｅｌｌｅｒＬＡ，ＧｏｏｄｍａｎＣＤ，ＳｉｌａｄｙＲＡ
ｅｔ
ａ１．
１９９４，２２０：６４５－６６１．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ
２０００，：１５６卜１５７０．
【１８】ＲｅｉｎｅｍｅｒＰ，ＰｒａｄｅＬ，ＨｏｆＰ
ｅｔａ１．ＪＭｏｌＢｉｏｌ
【３３】ＲｏｘａｓＶＰ，ＳｍｉｔｈＲＫ，Ａ１ｌｅｎＥＲ
ｅｔ
ａ１．Ｎａｔ
１９９６。２５５：２８９－３０９．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
１９９７，１５：９８８—９９１．
【１９】ＮｅｕｅｆｅｉｎｄＴ，ＨｕｂｅｒＲ，ＤａｓｅｎｂｒｏｃｋＨ
ｅｔａ１．Ｊ
【３４】Ｃｕｍｍｉｎｓ
Ｉ，ＣｏｌｅＤＪ，ＥｄｗａｒｄｓＲ．ＰｌａｎｔＪ１９９９，
ＭｏｌＢｉｏｌ
１９９７．２７４：４４６—４５３．
１８：２８５—２９２
［２０】ＮｅｕｅｆｅｉｎｄＴ，ＨｕｂｅｒＲ，ＲｅｉｎｅｍｅｒＰ
ｅｔ
ａ１．ＪＭｏｌ
【３５】ＫａｍｐｒａｎｉｓＳＣ，ＤａｍｉａｎｏｖａＲ，ＡｔａｌｌａｈＭ
ｅｔａ１．
ＢｉｏＩ
ｉ９９７。２７４：５７７—５８７．
ＪＢｉｏｌ
Ｃｈｅｍ
２０００，２７５：２９２０７－２９２１６
【２１】ＴｈｏｍＲ，ＤｉｘｏｎＤＰ，ＥｄｗａｒｄｓＲ
ｅｔａ１．ＪＭｏｌＢｉｏｌ
【３６】ＬｏｙａｌｌＬ，ＵｅｈｉｄａＸ，ＢｒａｕｎＳ
ｅｔ
ａ１．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ
２００１．３０８：９４９－９６２．
２０００，２：１９３９—１９５０．
【２２】Ｓａｔｉ－ＧｏｒｌａＭ，ＦｅｒｒａｒｉｏＳ，ＲｏｓｓｉｎｉＬｅｔａ１．
【３７】ＤｉｘｏｎＤＰ，ＣｏｌｅＤＪ，ＥｄｗａｒｄｓＲ．ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍ
Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ
１９９３，６７：２２１—２３０．
Ｂｉｏｐｈｙｓ２０００，３８４：４０７—４１２．
［２３】ＤｉｘｏｎＤ，ＣｏｌｅＤＪ，ＥｄｗａｒｄｓＲ．ＰｅｓｔｉｃＳｃｉ１９９７，
【３８】ＬａｂｒｏｕＮＥ，ＭｅｌｌｏＬＶ，Ｃｌｏｎｉｓ
ＹＤ．ＢｉｏｃｈｅｍＪ
５０：７２－８２．
２００１，３５８：１０１—１１０．
【２４】ＵｌｍａｓｏｖＴ，ＯｈｍｉｙａＡ，ＨａｇｅｎＧ
ｅｔａ１．Ｐｌａｎｔ
（责任编辑：李涛）
ＰｌａｎｔＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＦａｍｉｌｙ
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Ｇｏｒｇｅｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｎｚｈｏｕ４０４０００，ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＪ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｓｏｌｕｂｌｅｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｓｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ（ＧＳＴｓ，ＥＣ２．５．１．１８）ａｒｅｅｎｃｏｄｅｄｂｙ
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ｐｌａｎｔｓ
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ｐｒｉｍａｒｙａｎｄ
ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｉｎｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｉｎｃｅｌｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ．
Ｋｅｙ
Ｗｏｒｄｓ：ｐｌａｎｔ；ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＳＴｇｅｎｅ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ＧＳＴｆｕｎｃｔｉｏｎ
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