提取鼠肠道内微生物基因组DN

范文一：提取鼠肠道内微生物基因组DNA的方法研究

年 1 月2010Vo l. 25 , No. 1 中国粮油学报

第 25卷第 1期 J an. 2010 Jou rna l of the Ch ine se Ce rea ls and O ils A ssoc ia tion

提取鼠肠道内微生物基因组 DNA 的方法研究

11 , 2211 , 2李丽婷许文涛郭星姚业成黄昆仑 1 )(100083 中国农业大学食品科学不营养工程学院 ,北京

2 () 100083 农业部转基因产品检验监督测试中心 ,北京

摘要通过改进鼠肠道微生物基因组 DNA 提取方法以期更全面地反映鼠肠道菌群的真实情况。采用 CTAB 和 SD S结合的方法裂解绅胞 ,同时改进了传统的酚 /氯仿抽提方法 ,提取全过程控制在 2 h 以内。通过

()紫外分光光度计 ,绅菌通用引物 PCR ,总菌群实时定量 PCR ,变性梯度凝胶电泳 D GGE对改进方法及两种试剂盒法提取 DNA 的结果进行比较 ,评价了所廸立的高效提取方法。不试剂盒相比 ,改进的方法 DNA 得率较高 ,简便快速 ,成本低廉。同时后续的 PCR 鉴定及 D GGE菌群多样性分析显示 ,改进的方法可以更好地揭示鼠肠道菌群分布和特性。

关键词鼠肠道微生物 DNA 提取方法CTAB / SD S 实时定量 PCR 变性梯度凝胶电泳

( ) 中图分类号 : Q - 33文献标识码 : A文章编号 : 1003 - 0174 2010 01 - 0122 - 06

鼠肠道内是一个复杂的生态体系 , 含有500 ～量 ,也就是说提取好的 DNA 是分子生物学研究的关 1 000种绅菌 , 总数高达 1013 ～1014 , 其包含的基因键一步。因此 , 很多研究者都报告了不同样品的传 [ 1 ] [ 7 - 9 ] 数目是自身基因组的 100 倍。肠道微生物群落不统 DNA 提取法的改良方法 ,各种 DNA 提取试剂宿主个体的健康和疾病状况息息相关 , 它不仅能降盒的应用也很广泛。然而大多数传统方法复杂又耗

解食物中不可消化的营养成分、提供宿主维生素等β 时 ,还用到了有毒试剂和价格高的试剂 ,如 - 巯基营养物质 ,还能促进肠上皮绅胞的分化不成熟、激活乙醇 ,溶菌酶等 ;很多 DNA 提取试剂盒的价格偏高 , [ 2 ] 肠道免疫系统以及调节宿主能量存储不代谢。因不适合处理大批量的样品 ,而丏有些试剂盒的 DNA

[ 10 ] 此 ,越来越多的研究人员已经认识到肠道微生态研产量相对较低 ,不适合做后续分子生物学的研究。

究的重要意义。目前市面上还没有与门用于从劢物肠道中提取微生

从肠道样品中提取的 DNA 被广泛的用于遗传物基因组 DNA 的试剂盒。因此 ,寻找一种适宜的方和生态学研究中。近年来 , 现代分子生物学方法如法是进一步研究鼠肠道菌群的当务之急。

( ) ( 聚合酶链式反应 PCR ,实时定量 PCR rea l - tim e本试验采用一种改进的高效快速的 DNA 提取

) () PCR ,变性梯度凝胶电泳 D GGE , 限制性片段长方法 ,并不两种常用 DNA 提取试剂盒做比较 , 通过

( ) ( ) 度多态性 R FL P, 随机扩增的多态性 DNA RA PD 实时定量 PCR 和 D GGE考察不同提取方法的优劣和 [ 3 - 6 ] 等技术广泛用于分析肠道微生物多样性。传统对后续分子生物学研究的影响。培养方法很难全面地反映肠道菌群的结构特征 , 而

现代分子生物学技术不依赖于微生物培养 , 可以从 1 材料和方法肠道样品中分出更多具体的微生物属种 , 从而进一 1. 1 主要材料及试剂步揭示了肠道中微生物菌群结构的分布。然而 , 前鼠肠道内容物样品 : 新鲜的肠道内容物从乙醚面所提到的以 PCR 分子技术为核心的试验结果很大处理过的 SD 大鼠盲肠中得到。样品收集在盛满冰程度上依赖于肠道微生物中 DNA 模板的质量和数的无菌袋中 , 立即被送到实验室 , 真空冷冻干燥后 ,

( ) 基金项目 :国家高技术研究发展计划 863 项目 2006AA10 Z440 , - 80 ?冷冻保藏。( )国家自然科学基金项目 2007 - Z8 Q iagen DNA Stoo l M in i Kit:德国 Q iagen公司 ; T I2收稿日期 : 2009 - 01 - 21 作者简介 :李丽婷 ,女 , 1983 年出生 ,硕士 ,营养不食品安全 AN amp 绅菌基因组 DNA 提取试剂盒 : 天根生化科技通讯作者 :黄昆仑 ,男 , 1968 年出生 ,副教授 ,博士生导师 ,转基因

生物安全评价不检测技术 ( ) 有限公司 ; PCR 扩增试剂盒 dN TP s、B uffe r、Taq 酶 ,

引物 :大连宝生物公司 ; SYBR Green M a ste r M ix : 日1 % 琼脂糖凝胶电泳、Go ld V e iw 染色、凝胶成像

本 TO YOBO 公司 ; Tris - 饱和酚、氯仿、异戊醇、醋酸仪观察分析 ; 紫外分光光度计分别在波长 260 nm 和

() 钠、无水乙醇分析纯 : 科昊达生物技术公司 ; 琼脂 280 nm 处检测样品总 DNA 浓度和纯度 , 最后计算() 糖分析纯 :西班牙 b iowe st公司 ; 丙烯酰胺、甲叉双 DNA 得率。

() 丙烯酰胺、尿素、去离子甲酰胺超级纯 : Am re sco 公 1. 3. 5 总绅菌通用引物 PCR

( 司。扩增通用引物为 : 上游引物 338 f 5 ’- ACTC2

) ( 1. 2 主要仪器及设备CTACGGGA GGCA GCA G - 3 ’和下游引物 518 r 5 ’

) AB I - 2720 PCR 扩增仪 :美国 App lied B io system s - A TTACCGCGGCTGCTGG - 3 ’,其中上游引物带

( 公司 ; AB I 7000 实时定量 PCR 扩增仪 : 美国 App lied 一个 GC串 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC

) B io system s公司 ; CLA SS ? TYPE B 2 PCR 生物安全 GGGGGCACGGGGGG, 扩增菌群的 16 S rDNA V3

柜 :哈东连仪器设备厂 ; 5804R 型离心机 : 德国 Ep 2区 , 由大连宝生物公司合成。扩增反应体系为

μ() p endo rf公司 ; CH EM I - SMAR T 3000WL /LC 荧光凝 25 L , 组成为 : 1 ×PCR 缓冲液含 3 % M gC l,2

μμ 胶成像系统 :法国 V ilbe r Lou rm a t公司 ; UV IKON 系列 0. 2 mmo l /L dN TP s, 0. 5 mo l /L 双引物 , 1 L 模板

μ DNA 和 0. 025 U /L Taq 酶。扩增程序为预变性紫外可见分光光度计 : 法国 Secom am 公司 ; 电泳仪 ,

( DCode通用突变检测系统 :美国 B io - R ad 公司。94 ? 5 m in、35 个循环 94 ?变性 30 s、58 ?退火

) 1. 3 方法30 s、72 ?延伸 30 s, 72 ?延伸 5 m in。 PCR 产物用

1. 3. 1 改良的酚 /氯仿抽提法2 %琼脂糖凝胶电泳 , Go ld V e iw 染色后用凝胶成像仪

观察分析。取约 50 m g肠道内容物样品各 3个 ,用液氮研磨

( )5 m in, 分别置于 2 mL 小离心管 ,加入 l mL TE 缓冲 1. 3. 6 实时荧光定量 PCR SYBR Green I( 检测样品基因组 DNA 引物如下 ,扩增片段大小液 pH 8. 0 , 10 mmo l /L Tris - HC l, 1 mmo l /L ED TA

) 为 466 bp: F: 5 ’- TCCTACGGGA GGCA GCA GT - 3 ’; - N a2 ,振荡均质后 12 000 r /m in 离心 5 m in,去上

清液 ,沉淀中再加入 1 mL TE 缓冲液 , 重复操作一 R: 5 ’- GGACTACCA GGGTA TCTAA TCCTGTT - 3 ’。

遍。在离心得到的沉淀中加入 0. 1 mL 质量分数为标准曲线的构廸 : 用紫外分光光度计测定大肠

( ) 10 % SD S 混匀 , 37 ?保温 20 m in。加入 5 mo l /L杆菌纯菌株 E sche rich ia co liDNA 的 OD 值及浓度 ,8 ( ) 换算为标准菌株的拷贝数 1. 33 ×10,分别做 10倍 N aC1 ,质量分数为 10 %的 CTAB 和质量分数为 1 %- 1 - 5 ) ( 系列稀释的大肠杆菌纯菌株 DNA 10 ～10 ,用的抗坏血酸各 0. 2 mL , 65 ?保温 20 m in。用等体积

( ) Tris - 饱和酚 ?氯仿 ?异戊醇 25 ?24 ?1 抽提 , 12 000 上述引物扩增 ,构廸标准曲线。

μ r /m in 离心 5 m in。取上清 ,重复操作一次。取上清 ; 实时定量 PCR 反应体系及条件 : 总体积 30 L ,

μ( ) Green M a ste r M ix, 引物再加入等体积氯仿 ?异戊醇 24 ?1 , 12 000 r /m in 离包含 15 L 2 ×SYBR

( μμ) 0. 6 mo l /L , DNA 模板1 L。 PCR 扩增反应条心 5 m in。加入 1 /10 体积 3 mo l /L N aAC, 及 1 倍体

件 :首先 95 ? 5 m in; 然后 95 ? 15 s、58 ? 30 s、积异丙醇 , 液氮中放置 10 m in 立即取出。

72 ? 30 s 进行 30 个循环 ; 熔点曲线分析 95 ?12 000 r /m in离心 5 m in取沉淀 , 用 70 %乙醇洗涤一

μ 15 s, 60 ? 20 s, 95 ? 15 s。次 ,于室温晾干。沉淀用 100 L TE 缓冲液溶解 ,加

( μμ) 样品的检测 :每种提取方法分别取 3 个样 ,每个 10 m in, - 20 ?保RNA 酶 5 L /100 L 37 ?保温

样做一个重复 ,反应体系及条件如上所述 ,结果 C t值存备用。整个过程在 2 h左右。

1. 3. 2 T IAN amp 绅菌基因组 DNA 提取试剂盒法取取平均 ,对照标准曲线计算菌群数量 ,用 log genom e /

约 50 m g肠道内容物样品各 3个 ,按照试剂盒 g样品表示。

μ) ( 1. 3. 7 D GGE 变性梯度凝胶电泳的使用说明提取肠道菌群 DNA , 溶于 100 L TE 缓

D GGE在 DCode 通用突变检测系统上运行 , 聚冲液中。

( 丙烯酰胺凝胶浓度 8 % ～12 % 37. 5 ?1 ,丙烯酰胺 / 1. 3. 3 Q iagen DNA Stoo l M in i Kit提取法

) ( 取约 50 m g肠道内容物样品各 3 个 ,按照试剂盒甲叉双丙烯酰胺 ,电泳缓冲液 0. 5 ×TA E 20 mmo l /

μ的使用说明提取肠道菌群 DNA ,溶于100 L TE 缓 L Tris - ace ta te, pH 7. 4 , 10 mmo l /L 乙酸钠 ,

) 0. 5 mmo l /L N a2 ED TA , 变性梯度 35 % ～ 60 % 冲液中。

( 1. 3. 4 DNA 质量检测100 % 指的是 7 mo l /L 尿素和体积分数为 40 %去离

124 中国粮油学报2010 年第 1期

) 1 /3 左右。两种方法的子甲酰胺 ,电泳温度 59 C? ,电压 60 V , 10 m in 然后

跑 160 V , 4 h。 SYBR Green I染色 30 m in,用荧光凝 2. 3 三种不同方法提取的肠道菌群 DNA 的应用考察

胶成像仪照相。 2. 3. 1 绅菌通用引物 PCR

从图 2可见 ,使用绅菌通用引物扩增 ,扩增片断

根据肠道内绅菌的种类分布在 200 bp 左右。 T IAN a2 2 结果不分析

mp 试剂盒法提取的菌群基因组 PCR 产物亮度低 ,说 2. 1 琼脂糖凝胶电泳观察不同方法提取的鼠肠道

明其起始模板拷贝数低或含有某些 PCR 抑制因子。微生物基因组 DNA 效果

高效酚 - 氯仿抽提法提取的菌群基因组 DNA 经过 T IAN amp 绅菌基因组 DNA 提取试剂盒是与门

扩增后的产物主带清晰明亮 ,无明显弥散带 ,无 RNA 从各种革兰氏阴性、阳性绅菌中快速提取到高质量

残留 ,说明其模板拷贝数最高 , PCR 抑制因子相对较的基因组 DNA ,试验用这种试剂盒提取鼠肠道内总

少。菌群基因组 DNA ,如图 1 所示 ,在琼脂糖凝胶电泳图

上几乎不可见 , 说明其用于肠道内总菌群的提取效

率较低 , DNA 模板数较少。Q iagen DNA Stoo l M in i

Kit使用硅胶膜技术 ,从新鲜或冷冻粪便或其他带有

高浓度 PCR 抑制剂样品中纯化提取基因组 DNA。

在本试验中 , Q IA amp DNA Stoo l M in i Kit 和改进的

酚 /氯仿抽提方法提取的基因组 DNA 在琼脂糖凝胶

电泳图上的条带都很亮 , 弥散较少 , 体现了改进酚 /

氯仿抽提法的优越性。 1 ～3: T IAN amp 绅菌 DNA 试剂盒 ,

4 ～6: Q iagen DNA Stoo l M in i Kit,

7 ～9:高效酚 /氯仿抽提法

图 2 鼠肠道菌群基因组 DNA 的 16 S rDNA 扩增电泳图

2. 3. 2 SYBR Green?荧光染料实时定量 PCR

如图 3 扩增曲线和图 4 标准曲线表明 , 循环阈

( )值 C t值不标准菌株拷贝数的对数之间存在显著的 2 ( ) 线性关系 R= 0. 995 1 ,为待测样品的定量提供了注 : 1 ～3: T IAN amp 绅菌 DNA 试剂盒 , 4 ～6: Q iagen DNA 参照标准。从图 5 扩增曲线图可以看出 , 不同处理 Stoo l M in i Kit, 7 ～9:高效酚 /氯仿抽提法

的样品总菌群数有明显差异 , 从左到右分别为改进图 1 三种不同方法提取的肠道基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳图

的酚 /氯仿法 , Q iagen试剂盒法及 T IAN amp 试剂盒法 2. 2 紫外分光光度计检测鼠肠道菌群总 DNA 质量提取的样品。对照标准曲线 , 经过统计计算得出改如表 1统计结果所示 , 三种不同提取方法均能

( ) 达到 DNA 纯度要求 1. 8 ～2. 0 之间。就浓度和得

率来看 , 高效酚 /氯仿抽提法和 Q iagen DNA Stoo l

M in i Kit法的 DNA 产量均较高 ,其中高效酚 - 氯仿

抽提法比 Q iagen DNA Stoo l M in i Kit法稍好一些 ,而

T IAN amp绅菌 DNA试剂盒的浓度和得率只有上述

表 1 紫外分光光度法检测 3 种方法提取的样品

菌群总 DNA 浓度、纯度及得率

OD 浓度得率方法 μμ260 /280 /g /mL /g / g

样品高效酚 477 954 1. 83 ?0. 05 /氯仿抽提法注 :扩增曲线从左到右的菌株基因组数量分别为 Q iagen DNA 441 882 1. 84 ?0. 02 7 6 5 4 3 μ 10、10、10、10、10genom e /LStoo l M in i Kit

T IAN amp 绅菌图 3 不同稀释浓度的总菌群的实时定量 PCR 扩增曲线图145 290 1. 80 ?0. 05 DNA 试剂盒

( )D GGE电泳分析 ,如图 7 所示 , 7 ～9 泳道的物进行了进的酚 /氯仿法得到的总菌群数 log genom e / g样品

为 11. 51 ?0. 03 , Q iagen 试剂盒法为 10. 85 ?0. 14 , T 条带最多 ,说明该法提取的微生物多样性丰富 ,而 1

IAN amp 试剂盒法为 8. 47 ?0. 10。从图 6熔解曲线～3 泳道的条带最少 ,说明微生物多样性相对贫乏。

可以看出 ,不同方法提取肠道菌群 DNA 的 PCR 产物由此可知 ,改进的酚 /氯仿法提取的 DNA 有利于后

特异性好 , 条带单一 , 测得的数据可靠。结果表明 , 续的微生物多样性分析 , 可以更全面地揭示菌群特

(改进的酚 /氯仿法和 Q iagen 试剂盒法能得到较高的征及其分布 ,而其它两种试剂盒法尤其是 T IAN amp

)菌群数量 ,其中改良的方法更好一些 ,而用 T IAN amp 试剂盒法提取的 DNA 明显不足以进行 D GGE 电泳

试剂盒法得到的菌群数量明显较低 ,仅是改良酚 /氯分析。

仿法的 1 /1 000。

1 ～3: T IAN amp 绅菌 DNA 试剂盒 , 4 ～6: Q iagen DNA Stoo l M in i Kit,

7 ～9:高效酚 /氯仿抽提法

图 7 三种不同方法提取基因组的 D GGE图谱

3 讨论

试验结果根据样品保存和提取方法的不同有很

[ 11 ] 大差别 ,首先应该根据样品的特性选择提取 DNA

[ 12 ] 的适宜方法。鼠肠道内是一个复杂的环境 ,不仅

寄生着上千种菌群 ,还有未完全消化的食物残渣 ,腐

殖质 ,肠壁上脱落的内皮绅胞 ,各种有机物和无机物

[ 13 ] (等。其中存在很多的 PCR 抑制因子如多糖 ,脲 ,

) 腐酸或者血红素 ,能够轻微抑制或者完全抑制 PCR

的扩增 ,因此对于在进行 DNA 提取前对样品进行前

[ 14 ] 处理以去除抑制因子是很有必要的。

试验采用真空冷冻干燥的方法对肠道内容物进

行预处理 ,可以最低限度地减少 DNA 在保存期的降

解。在前处理时采用液氮研磨样品 , 方便绅胞破碎

和 DNA 的释放 ,同时在低温环境下可以抑制 DNA 酶

的降解作用。应用 TE缓冲液二次清洗 ,高速离心后

上清液基本澄清 , 说明已经去除了肠道菌群中的颗

粒杂质和色素。尽可能的收集粪便中的肠道菌 , 使

得到的总 DNA 能较全面地反映肠道菌群结构的特

征。菌体绅胞裂解的效率直接影响获取基因组 DNA 2. 3. 3 D GGE 菌群多样性分析的质量 , 采用 CTAB 和 SD S结合的方法裂解绅胞去

为了进一步考察三种不同方法在菌群分布方面除蛋白提取 DNA ,取得了很好的效果。 PCR 试验结

的应用性和可靠性 ,试验对所提取基因组的 PCR 产果说明改进的酚 /氯仿抽提法在一定程度上去除了

126 中国粮油学报2010 年第 1期

ic - free vege tab le - ba sed d ie ts[ J ]. Jou rna l of App lied M i2 PCR 抑制因子的不利影响。通过 D GGE 分析 , 可以 c rob io logy, 2007 , 102: 1138 - 1149 看到提取质量高的 DNA ,菌群丰富度相对较大 ,有利 [ 4 ] Simp son J M , M cC racken V J , Ga sk in H R. App lica tion of 于后续的分子生物学研究。

dena tu ring grad ien t ge l e lec trop ho re sis fo r the ana lysis of the ( ) 综合起来 ,本试验方法有如下优点 : 1 改进的

po rc ine ga stro in te stina l m ic rob io ta [ J ]. Jou rna l of M ic rob io2 酚 /氯仿提取法 DNA 得率更高 ,丏对后续 PCR 反应 ( ) logica l M e thod s, 1999, 36: 167 - 179 ( )的不利影响最小。 2 节省了大量成本 ,只用到一些 [ 5 ]袁志辉 , 蓝希钳 , 杨廷 ,等. 家蚕肠道绅菌群体调查不分基本的试剂如 Tris - 饱和酚 ,氯仿 , SD S, CTAB 等 ,用 ( ) 析 [ J ]. 微生物学报 , 2006 , 46 2 : 285 - 291量很小 ,丏不需要溶菌酶 ,蛋白酶 K等价格较高的试 [ 6 ]吴天星 , 金勇丰 , 曹广力 , 等. 鸡肠道菌基因组 DNA 的( )验药品 ,很适合处理大批量样品。 3 试验时间短于 ( ) RA PD 分类的研究 [ J ]. 畜牧兽医学报 , 2002, 33 3 :一般的传统酚 /氯仿提取法 , 如操作熟练 , 能控制在 247 - 249

2 h内完成。[ 7 ]赵健元 , 李进华. 一种高效的哺乳劢物粪便 DNA 提取通

( ) 用方法 [ J ]. 激光生物学报 , 2008 , 17 5 : 695 - 700

[ 8 ] Thaku ria D , Schm id t O , L ilien siek A K. F ie ld p re se rva tion 4 结论

and DNA extrac tion m e thod s fo r in te stina l m ic rob ia l d ive rsity 4. 1 改良后的酚 /氯仿法所提取的肠道菌群基因组

ana lysis in ea rthwo rm s[ J ]. Jou rna l of M ic rob io logica l M e th2 ) ( 数量达 11. 51 log genom e / g样品 ,显著高于 T IAN a2 od s, 2008, 10: 1 - 8 mp 试剂盒法得到的菌群数量 ,同时在成本上要优于 [ 9 ]杨德君 , 吴襟 , 刘毅 , 等. 一种快速提取肠道微生物总 Q iagen试剂盒法 , 是一个提取鼠肠道微生物基因组 ( ) DNA 的方法 [ J ]. 中国微生态学杂志 , 2006 , 18 2 : 91 行之有效的方法 ,特别适用于处理大批量样品。- 93

4. 2 实时荧光定量 PCR 是目前常用的分子生物学 [ 10 ] Tang J N , Zeng Z G, W ang H N. A n effec tive m e thod fo r i2 检测手段之一 , 能够快速精确地测定菌群基因组拷 so la tion of DNA from p ig faece s and comp a rison of five d if2 贝数 ,在检测过程中 SYBR Green ?荧光染料发出强 fe ren t m e thod s [ J ]. Jou rna l of M ic rob io logica l M e thod s, 荧光信号 ,结合在 DNA 双链的小沟部位 , 其荧光量 2008 , 75: 432 - 436 [ 11 ] Zhou X Q , W ang Y F, Ca i Y. PCR - D GGE de tec tion of the 不扩增产物量成正比 , 每个循环的延伸阶段收集信

bac te ria l comm un ity struc tu re in the Inne r Mongo lia stepp e 号监测 DNA 的扩增数量 , 就可以推出起始模板

[ 15 ] w ith two d iffe ren t DNA extrac tion m e thod s [ J ]. A c ta Eco2 量 ,而紫外分光光度计在 DNA 浓度比较低时 , 就

( ) logica Sin ica, 2007 , 27 5 : 1684 - 1689 会测不准甚至测不出来数值。因此实时荧光定量

[ 12 ]M cO rist A L , J ack son M , B ird A R. A comp a rison of five PCR 在用于肠道菌群检测的准确性和敏感度上要进 m e thod s fo r extrac tion of bac te ria l DNA from hum an faeca l 进优于传统的紫外分光光度计。 samp le s[ J ]. Jou rna l of M ic rob io logica l M e thod s, 2002 , 50: 4. 3 改良后的酚 /氯仿法所提取的肠道菌群 DNA 131 - 139 通过 D GGE菌群多样性分析 , 可更全面地揭示鼠肠 [ 13 ] Gillan D C, Sp ek sn ijde r A G, Zwa rt G. Gene tic d ive rsity of 道微生物群落分布 , 有利于对整体菌群的变化或针 ( b iofilm cove ring Mon tacu ta fe rrugino sa Mo llu sca, B i2 对某一菌种进行检测研究。 ) va lviaa s eva lua ted by dena tu ring grad ien t ge l e lec trop ho re2

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用研究进展 [ J ]. 中国组细化学不绅胞化学杂志 , 2007 , na l bac te ria l comm un ity in one - to th ree - week - o ld com 2

( ) 16 4 : 492 - 497. m e rc ia lly rea red b ro ile r ch icken s fed conven tiona l o r an tib io t2

A n Effective M e thod fo r Genom ic DNA Extrac tion from

Ra t Inte stinal M icroflo ra

11 , 2211 , 2 L i L itingXu W en taoGuo X ingYao YechengH uang Kun lun

1 ( ) Co llege of Food Sc ience and N u trition Enginee ring, Ch ina A gricu ltu ra l U n ive rsity, B e ijing 100083

( Sup e rvision, In sp ec tion and Te sting Cen te r of Gene tica lly Mod ified O rgin ism s,

2 ) M in istry of A gricu ltu re, B e ijing 100083

A b stra c t A mod ified m e thod fo r extrac ting m ic rob ia l comm un ity DNA from ra t in te stina l samp le s to fu lly reflec t the rea l situa tion of ra t in te stina l m ic roflo ra is de sc ribed in th is p ap e r. Com b ina tion of CTAB and SD S wa s u sed fo r ce ll lysis, the trad itiona l DNA extrac tion m e thod wa s imp roved, and the who le p roce ss wa s con tro lled w ith in two hou rs. Th is mod ified m e thod and o the r two DNA extrac tion k its we re eva lua ted by UV sp ec trop ho tom e te r, bac te ria l u2

( ) n ive rsa l p rim e r PCR , rea l - tim e quan tita tive PCR and dena tu ring grad ien t ge l e lec trop ho re sis D GGE . R e su lts show the mod ified m e thod ha s a h ighe r yie ld of DNA and it is simp le, rap id and co st - effec tive comp a red w ith the o the r two k its. The PCR and D GGE show tha t the mod ified m e thod can revea l the d istribu tion and tra it of ra t in te sti2 na l m ic roflo ra be tte r.

Key word s ra t in te stina l m ic roflo ra, DNA extrac tion m e thod, CTAB / SD S, rea l - tim e quan tita tive PCR , D GGE

()上接第 102页

Mould D eve lopm ent Cha rac te rs of D iffe rent Sto red Gra in s

H uang Shuxia Ca i J ingp ing Tian H a ijuan

( )H enna U n ive rsity of Techno logy, Zhengzhou 450052

A b stra c t The cha rac te rs fo r mou ld deve lopm en t of p addy, co rn and whea t, sto red a t 25 ? and RH 75 % , 85 % o r 95 % , o r w ith exce ss mo istu re of 2 % ove r safe mo istu re, we re inve stiga ted. R e su lts: W hea t occu rs mou ld deve lopm en t mo st ea sy; p addy exh ib its be st an ti - mou ld grow ing ab ility; and co rn exh ib its a t the m idd le be tween whea t and p addy. Sto red in RH 85 % fo r 28 d, the m ic robe ac tivity of whea t inc rea se s by 475 u tha t is 5. 6 tim e s and 3. 5 tim e s h ighe r than tho se of p addy and co rn in the sam e p e riod. The d iffe rence s a re found to be re la ted w ith the hygro scop ic cha rac te r of the gra in and the u sab le p rop e rty fo r mou ld of the gra in coa t O n the o the r hand, comp a ring the gra in s in the sam e mou ld ac tivity sta tu s, it is found tha t the fa tty ac id va lue and ge rm ina tion p e rcen tage change rem a rkab ly fo r p addy and co rn, bu t no t eviden tly fo r whea t. The refo re, a tten tion shou ld be emp ha sized on mou ld de2 ve lopm en t fo r sto red whea t w ith ea sy grow ing cha rac te r fo r mou ld, in o rde r to in su re the qua lity of sto red whea t and the re la ted food safe ty.

Key word s p addy, co rn, whea t, sto rage, mou ld

范文二：提取家蚕肠道微生物总DNA的2种方法的比较研究

蚕　学　通　讯第25卷　第1期　　　　　　　　　　2005年　3月Newsletter of Sericultural Science 5

提取家蚕肠道微生物

总DNA 的2种方法的比较研究

蓝希钳　袁志辉　唐　婧　张建华　周泽扬ΞΞΞ

(西南农业大学农业部蚕桑学重点实验室　重庆　400716)

摘　要　　为寻找提取家蚕中肠道微生物总DNA 的方法, 比较研究了2种方法:①直接提取家蚕中肠道内容物的总DNA , 再选择性研究其中来源于微生物的DNA ; ②先分离家蚕中肠道的微生物, 再提取其总DNA 。结果表明, 方法②所得到的DNA 数量较少, 但纯度较高; 方法①, 种类齐, 但杂质多。2种方法分别适合于不同的研究目的。

关键词　　家蚕　肠道微生物　总DNA 　提取方法

, , 这些微生物在家蚕饲料消化、, 对于提。

。但是, 受现有知识和技术的限制, 环境中

(un 299%以上的微生物目前还无法获得纯培养[1], 这部分微生物被称之为“未培养的微生物”

cultured microorganisms ) 。显然, 纯培养出来的微生物不能全面反映环境中的微生物。随着现代生物技术的发展, 人们绕过纯培养的技术障碍, 直接运用分子生物学手段对环境微生物的总基因组进行研究, 大大拓展了研究范围, 取得了许多新的研究成果[24]。

迄今为止, 人们对家蚕肠道中微生物的研究都是通过纯培养技术, 还没有见到有关其总DNA 的研究。为了深入研究家蚕肠道中的微生物, 我们首先探索了2种直接提取其总DNA 的方法, 现报告如下。

1　材料与方法

1. 1　材料

1. 1. 1　家蚕肠道样品　取100头5龄3日的家蚕(品种为734, 由西南农业大学家蚕基因库提供) , 饥饿过夜。用70%乙醇进行表面消毒1min , 再用火焰灼烧体表。无菌条件下剖取100头蚕的中肠内容物, 置于灭菌的离心管中。

1. 1. 2　其它材料及试剂DNA 快速纯化/回收试剂盒购自北京鼎国公司, 质粒pM D18-T 和细菌Ecoli. JM109购自T aK aRa 公司,PCR 引物[7](27-F :5’-G AG AG TTTG ATCCTGG CTC AG-3’,

) 由上海博亚公司合成。1541-R :5’-AAGG AGG TG ATCC AG CCG C A -3’

1. 2　方法

1. 2. 1　家蚕中肠总DNA 的提取方法①　参照Julie A H 等[5]介绍的方法, 并作适当改进。具Ξ资助项目:科技部863课题(编号:2004AA2Z1020) 和重庆市科委院士基金项目。ΞΞ通信作者　　　作者简介:蓝希钳(1976-) , 男(畲族) , 助教, 从事微生物分子生化与次生代谢研究。

6蚕　学　通　讯　　　　　　　　　　　　　　　　25卷体方法:将准备好的家蚕肠道样品与4ml DNA Extraction Bu ffer (100m M Tris -Cl , 100m ME DT A

μμ钠, 100m M 磷酸钠,1. 5M NaCl , 1%CT AB , pH8. 0) 混合, 再加入800l S DS (10%) , 24. 0l 蛋白

酶K (20mg/ml ) ,37℃水浴30min , 每隔5min 颠倒混匀几次。随后在80℃水浴10min , 冷却到室

μ温。与600l 氯仿-异戊醇(24:1体积比) 混合, 涡旋10s ,15,000g 离心5min , 收集上清夜, 用等

体积平衡酚抽提, 离心, 吸取水相, 再与等体积氯仿-异戊醇(24:1体积比) 混合, 离心, 水相转移到另一1. 5ml 离心管中, 用0. 6倍体积的异丙醇室温沉淀1h , 室温下15,000g 离心10min , 收

μμ集沉淀, 用冷的70%乙醇洗涤沉淀, 重悬于100l TE 缓冲液(pH8. 0, 含20g/ml RNaseA ) 中, -

20℃保存。

1. 2. 2　家蚕中肠总DNA 的提取方法②　先从内容物中分离微生物, 再提总DNA 。将准备好

μ的家蚕中肠道样品分散于200ml NaH 2PO 4-Na 2HPO 4缓冲液(0. 1M ,pH8. 0) 中, 加100l 土温-

20,220rpm 振荡30min 。常温下400g 离心5min , 将上清夜转移到另一离心管中, 用2层纱布过滤, 收集滤过液。12,000g 离心10min , 收集沉淀物离心

5min , 弃上清液, 反复洗涤, 直到上清液澄清为止分别与

μμ500lDNA 提取液(同上) 混合, 再加入100l S , 0K () ,37℃水浴30min , 每隔5min μμ1. 2. 3　16S 　39. 25l ,10×PCR 缓冲液6l ,2.

μμ5m M 5PCR 2l ,5U/μl T aq 酶0. 75l , 稀释5倍后的家蚕中肠DNA

μl 。94℃预变性5min ,94℃变性1min ,55℃退火30s ,72℃延伸1. 5min , 经30个循5

环后72℃延伸5min 。

1. 2. 4　PCR 产物的纯化　琼脂糖凝胶电泳后, 切下目的DNA , 按回收试剂盒的使用说明进行。

1. 2. 5　克隆、酶切和测序分析　用T aK aRa 公司的pM D18-T 载体试剂盒以及感受态大肠杆菌JM109, 得到PCR 产物克隆。经蓝白斑筛选后, 随机挑取24个白色菌落, 提取重组质粒后用Sau3A Ⅰ彻底酶切, 选出酶切图谱不同的重组质粒进行核苷酸序列测定, 与NC BI 数据库中的核苷酸序列进行比较。

2　结果与分析

2. 1　家蚕中肠道微生物总DNA

用2种方法都能从家蚕中肠道内容物中提取出微生物总DNA 。所得的DNA 溶液经过0. 8%的琼脂糖凝胶电泳, 在23kb 左右出现条带(图1) , 表明已获得较长片段的总DNA 。2种方

μ法的DNA 纯度都较高, 符合后续研究的要求。用第①种方法获得较多的DNA , 达100g/头蚕;

μ但桑叶、家蚕自身组织的DNA 的比率也较大。用第②种方法获得的总DNA 较少, 仅1. 8g/头

蚕; 但由于先通过预处理去掉了大部分的桑叶和家蚕自身组织等杂质, 来源于微生物的DNA 比率较高。2种方法的比较见表1。

表1　2种方法提取家蚕肠道微生物总DNA 的结果比较

方法

①

②μ平均每头蚕来源的总DNA 量(g ) 1001. 8A260/A2801. 9191. 412A260/A2302. 2571. 850

1期　　　　　　　　蓝希钳等:提取家蚕肠道微生物总DNA 的2种方法的比较研究7

图1　家蚕中肠道微生物总DNA 　　　　　　　图2　家蚕中肠道微生物16S rDNA

1-方法①;2-方法②;M -λ/Hind Ⅲ　　　　　　1-方法①;2-方法②;M -λ/Hind Ⅲ

2. 2　从总DNA 中扩增16S rDNA 片段

用两种方法从家蚕中肠道获得的总DNA 经过后, 片段, 大小均为1. 5kb 左右。(图2)

2. 3　16SrDNA 。第①种方法的24个重; ②种方法的仅包含2种类型。

, 并与NC BI 数据库中的序列进行同源性比较, 将其归属于同源性大于99%的菌属。结果第①种方法的6个基因分别属于肠球菌属(Enterococ 2cus ) 、甲基杆菌属(Methylobacterium ) 、假单胞菌属(P seudomonas ) 、柄杆菌属(Caulobacter ) 等4个不同的细菌属; 第②种方法的2个基因则分别属于肠球菌属(Enterococcus ) 和假单胞菌属(P seu 2domonas ) 。

3　讨论

目前人们从环境中纯培养出来的微生物仅占自然界中微生物总数的1%左右。运用分子生物学技术直接研究其总DNA , 就能有效地绕过培养障碍, 使我们的研究深入到未培养的微生物领域去。提取环境中微生物总DNA 的方法主要有2种:一是直接提取环境中的总DNA 作为微生物的总DNA ; 二是先分离其中的微生物, 再提取其总DNA 。前一种方法所获得的DNA 种类较多, 但含有的杂质也较多, 特别是土壤中含有的丰富的腐质酸等难去除的杂质。这种方法适合于调查环境中微生物的类群。后一种方法获得的DNA 主要是来源于目的微生物, 纯度相对较高, 适合用于基因克隆等研究; 但分离微生物时容易丢失部分菌种, 只能获得25%30%的微生物DNA [6], 因而不适合用于菌群的研究。

本实验的第①种方法获得了较多的总DNA , 类群也较全, 可用于调查家蚕中肠道微生物的类群; 但含有大量非微生物来源的DNA 。第②种方法获得的DNA 主要来源于中肠道微生物, 但数量少, 种类也不如第一种多, 不能用于调查微生物类群。

参　考　文　献

1　Amann R I , Ludwig W , Scheifer K H et al. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells

8蚕　学　通　讯　　　　　　　　　　　　　　　　25卷without cultivation. Microbiol. Rev. , 1995, 59(1) :143169.

2　Ward DM , Weller R , Bates on M M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural com 2

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3　Anke Henne , Ruth A. Schmitz et al. Screening of Environmental DNA Libraries for the Presence of G enes C on ferring Lipolytic Activity on Escherichia coli. Appl. Envir. Microbiol. , Jul 2000; 66:31133116.

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D -gluconic acid reductases. Appl. Environ. Microbial . 2001. 67:42064212.

5　Julie A H , David A B , and John A. B. T emporal Changes in Archaeal Diversity and Chemistry in a Mid -Ocean Ridge

Subseafloor Habitat. Appl. Envir. Microbiol . , 2002, 68(4) :15851594.

6　Frostegard A , C ourtois S , Ramisse V et al. Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from s oil.

Appl. Envir. Microbiol . , 1999, 65(12) :54095420.

A COMPARA TIVE STU DY OF A L DNA EXTRACTION BACTERIA

　Tang Jing 　Zhang Jianhua 　Zhou Zeyang

(The Laboratory o f Agricultural Ministry , College o f Sericulture and Biotechnology ,

Southwest Agricultural Univer sity , Chongqing 400716, China )

ABSTRACT

T w o methods for total DNA extraction from the microbes in the midgut of the silkw orm were com 2pared. One is to extract the total DNA of all the contents in the midgut and then the bacteria -derived DNA is analyzed selectively. The other is to is olate the bacteria in the midgut first and their total DNA is then extracted. The am ount and variety of DNA obtained with the first method was much m ore than those obtained with the second method while the purity of the DNA obtained with the second method was greater. Therefore , both methods have their respective advantages and can be adopted , depending upon the specific aim of the study.

K ey words 　　silkworm 　inte stinal bacteria 　total DNA 　comparison

本刊重要启事

为适应我国信息化建设的需要, 扩大作者学术交流渠道, 本刊已加入《中国学术期刊(光盘版) 》和《中国期刊网》全文数据库, 并已入网“万方数据———数字化期刊群”, 其作者著作权使用费与本刊稿酬一次性给付。免费提供作者文章引用统计分析资料。如作者不同意将文章编入该数据库, 请在来稿时声明, 本刊将做适当处理。

范文三：肠道微生物组的现代分子生物学研究方法综述

　　传统微生物培养的研究方法和现代分子生物学技术是目前主要的两大研究手段，以下是小编搜集的一篇关于肠道微生物组的现代分子生物学研究方法探究的论文范文，欢迎阅读查看。

　　引言

　　微生物遍布于人体所有与外环境相通的器官。成人胃肠道黏膜表面积达300m2,是与外界环境接触并相互作用的最大区域，在其中定殖着约11014个微生物，数量是人体体细胞总数的10倍。肠道微生物参与宿主的能量吸收和储存，帮助宿主降解并吸收食物中的营养成分，还能促进免疫细胞分化与成熟、激活肠道免疫系统[13],具有非常重要的生理意义。但是由于人体肠道复杂的厌氧环境，40%~80%的肠道微生物难以在体外培养，仅凭培养手段进行微生物组研究会大大削弱肠道微生物的多样性。随着分子生物学技术的飞速发展，利用分子生物技术研究肠道微生物组的技术取得了极大的进展。掌握并运用这些新技术对肠道微生物组的研究十分关键，该文主要对肠道微生物组的现代分子生物学研究方法进行总结和介绍。

　　1传统纯培养检测方法

　　传统微生物检测方法是用各种培养基培养分离微生物，并通过革兰染色、生物化学和血清学试验等方法来确定微生物种类，通过倍比稀释、菌落计数等方法来测定微生物数量。但由于传统微生物培养技术中，菌株的富集或衰减不可避免，原始的微生态结构被改变，这会导致研究结果存在较大偏差。

　　Moore等[4]利用传统培养方法对20例男性的粪便样品中微生物种类和相对数量进行了研究，研究对象包括日本到夏威夷的60~80岁的健康个体，食谱包括东西方饮食，将取到的粪便样品进行培养分析，得到1147个纯培养物，鉴定为113种不同的微生物。然而据报道，人体肠道至少存在400种微生物[4],因此这种培养方法会漏掉多数的、营养条件要求更为苛刻的微生物。

　　2传统分子生物技术

　　2.1肠道菌群DNA提取技术

　　从粪便样品中提取高质量的、具有代表性的肠道菌群总DNA是肠道微生物分子生物技术研究的基础。目前提取肠道菌群总DNA的方法主要有酚氯仿抽提法、Chelex100煮沸法、GuSCNsilica法以及一些商业试剂盒，如FastDNAkit、QuantumPrepAquapureGenomicDNAisolationkit、QIAampDNAStoolMinikit等。其中QIAampDNAStoolMinikit的提取效果得到较多肯定。试剂盒应用方便、快捷，但价格昂贵，处理大批样品时科研成本太高。相较而言，酚氯仿抽提法快速且成本低，适合用于肠道微生物研究中总DNA提取，尤其适合处理大批量样品。

　　2.2构建基因文库测序技术

　　2.2.1构建16SrRNA基因文库

　　16SrRNA基因克隆文库通过扩增各种细菌共有基因序列

片段对细菌进行定性定量分析，是一种有力的细菌学检测分析手段，现已广泛用于肠道和人体其他部位微生物多样性研究[57],并通过该方法发现了许多尚未培养到的菌种。16SrRNA基因克隆文库技术可以分析标本中的菌群结构，反映各种细菌的相对比例及数量，具有培养法难以比拟的优势，不足之处是实际操作中技术环节多、影响因素复杂、不同实验室操作条件难以标化以及对标本中的细菌数量有一定要求等。但相信随着技术的不断提高，16SrRNA基因序列分析将逐步成为微生物组结构研究的有力工具。

　　2.2.2全基因组鸟枪测序分析技术

　　Gill等[8]利用全基因组鸟枪Shotgun测序技术分析了两名健康成年人粪便中的菌群，首次对人体肠道微生物多样性进行了全面的描述。

　　Qin等[9]运用深度Shotgun测序法研究发现，Ⅱ型糖尿病患者的肠道菌群中度失调，产丁酸盐细菌丰度降低，而致病微生物的功能增加。相较于传统的基于rRNA的研究，Shotgun测序分析技术可以找到更多的进化标记，得到更多的菌群信息，且Shotgun技术不需PCR扩增，因此分析出的结果偏差较小;此外，通过序列数据分析，还可以对微生物基因表达及功能状态情况进行研究。其缺点在于微生物系统组成复杂，将大量的序列信息正确地装配成每个成员的基因组全序列，是一个较大的难题。

　　2.3遗传指纹图谱技术

　　构建基因文库的方法可以得到样本中的菌群种类和相对进化信息，然而，我们常需要对整个肠道微生物组进行动态监测，构建基因文库方法会显得费时、费力，不能做出快速检测，这时遗传指纹图谱技术可克服上述不足，快速灵敏地检测生态系统的动态变化。

　　2.3.1变性梯度凝胶电泳及其衍生技术

　　变性梯度凝胶电泳denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE技术是由Fisher等发明的，Muyzer等首次将其应用于微生物群落结构研究，随后Zoetendal将其用于人体肠道菌群的分析研究。后来在其基础上衍生出温度梯度凝胶电泳temperaturegradientgelelectrophesis,TGGE、瞬时温度梯度电泳temporaltemperaturegradientgelelectrophesis,TTGE、脉冲场凝胶电泳pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE和单链构象多态性检测singlestrandedconformationalpolymorphisms,SSCP等。此后，该技术被广泛应用于消化道排泄物中微生物的分析[1011].

　　DGGE及其衍生技术既可以对比分析不同的微生物群落之间的差异，鉴别细菌种类，也可以研究同一个微生物群落随时间和环境改变的动态变化过程。但该技术用通用引物进行PCR扩增时，可能会忽视一些数量较少的细菌，并且肠道微生物组种类繁多，最终获得的电泳条带复杂且拥挤，增加了结果分析的困难。

　2.3.2随机扩增多态性

　　DNA技术随机扩增多态性DNArandomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD技术利用寡核苷酸序列在基因组上随机配对的特性，经扩增得到一系列大小不同的产物，通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳便可得到一系列基于RAPD的指纹图谱。因为不同模扳DNA产生的指纹图谱有差异，因此可用于鉴定微生物种类，并且灵敏度高，常被用于细分微生物组内的种群差异[1112].

　　RAPD技术的缺点在于重复性和稳定性差，产生的图谱条带过于复杂，需要进行大量的筛选，从中找到较为合适的引物进行分析，较为费时。

　　2.3.3末端限制性片断长度多态性分析技术

　　末端限制性片断长度多态性分析terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphisms,TRFLP技术通过自动测序仪分析酶切后的末端序列，达到定量的目的，因为末端序列16SrDNA,因此可用于复杂的肠道微生物群落结构的研究，快速灵敏地评估群落中微生物的多样性，并给出微生物群落结构的指纹图谱，是目前被广泛采用的一种指纹图谱技术，现已成功应用于各种微生物群落结构和多态性的比较分析[1314].

　　其缺点在于该技术只检测末端序列，因此不可避免地会低估微生物群落结构多态性。同时它是基于PCR扩增技术，实验过程影响因素较多，亦会对结果造成影响。

　　2.4荧光原位杂交技术

　　除了上述技术外，分子杂交技术也被广泛应用于肠道微生物组的研究中，同样表现出应用潜力和优点。

　　Giovannoni等首次应用荧光原位杂交fluorescenceinsituhybridization,FISH技术进行细菌学的研究。随后Delong等使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。经过不断的丰富和完善，FISH技术已成为近年肠道微生物研究中一种重要的检测工具[1516].其利用荧光素标记16SrRNA基因序列的寡聚核苷酸探针，与靶细菌杂交，通过检测目标序列来鉴定微生物，具有敏感、快速、安全等优点。

　　FISH技术还可用于鉴定和检测未培养种属和新种属。其缺点在于FISH技术尚不能用于16SrRNA序列未知微生物的检测，且在操作时易受到污染干扰，同时结果会受到微生物营养状态的影响。

　　由于肠道微生物组种类繁多，而联合流式细胞学技术可进行高通量分析，已越来越多地应用于FISH信检测。

　　3新近发展的方法技术

　　3.1基因芯片技术

　　基因芯片技术DNAchips原理是使探针分子在滤膜、硅片、玻璃等介质上排列成微矩阵，将待检样品标记后与微矩阵杂交，通过检测样品杂交信强度即可获得样品中基因序列及数量等信息，具有快速、高效、低成本等优点，现已广泛应用于微生物群落结构及功能的研究[1719],并且其敏感性和特

异性已经得到了反复验证[2021].

　　目前尚没有应用基因芯片进行人体肠道微生物研究的报道，但基因芯片包括大量针对人体肠道微生物的功能基因，并且其子类型HummChip是专门针对人体微生物设计的，因此基因芯片技术应用于肠道微生物研究不存在技术问题。

　　3.2宏基因组学技术

　　宏基因组学即将环境中全体微生物的遗传物质看作一个整体，系统全面地研究微生物与其生存环境之间的关系。通过宏基因组测序技术可发现肠道菌群结构改变，结合其代谢特征可分析肠道微生物与代谢性疾病之间的联系。宏基因组学还可用来发现新发传染病病原以及未知病原。美国国立卫生研究院NationalInstitutesofHealth,NIH的人类微生物组计划[2223]利用宏基因组学技术分析了242个美国健康志愿者微生物基因组，获得了近800个菌种的基因参考序列。

　　宏基因组学技术为肠道微生物组的研究提供了新的思路与方法，为充分认识和利用未培养微生物、完整地从群落水平上认识微生物开辟了新的道路。

　　3.3第二代测序技术

　　2016年底Roche公司建立454测序技术，该技术结合DNA扩增乳胶和皮升级反应孔进行焦磷酸盐测序，可对微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系进行研究，具有速度快、通量高、读长长、准确性高、一致性好及简便高效的优势。

　　Gosalbes等[24]运用454测序技术对10位健康人的肠道微生物群落结构和组成进行了研究，发现发现厚壁菌门占49.18%,拟杆菌门占31.42%,变形菌门占3.6%,放线菌门占0.4%.454测序技术在肠道微生态研究中已经得到较为广泛的运用[25],然而454测序同样存在着缺点，主要在于片段长度短，对连续单碱基重复区域测序准确性差，常会产生缺失或者插入误差。但随着454测序分析技术的发展成熟，终将得到更准确、可靠的结果。

　　相较于454测序技术，Illumina测序表现出低错误率、低成本和高通量等优势[2627].但是，Illumina测序长度短，所获得的序列数量巨大，呈数十倍增长，原有生物信息学分析工具无法计算，因此解决其运算问题是Illumina用于微生物群落分析的关键之处。随着Illumina测序读取长度的改善及新型分析工具的开发，预计Illumina测序技术将因其高性价比的优势广泛应用于肠道微生物组的研究。

　　4展望

　　从1975年Woese等首次应用rRNA分析菌群以来，rRNA数据库迅速扩大，16SrRNA基因作为细菌的标志，已逐渐成为临床细菌分类、鉴定的金标准。传统分子生物学技术多以16SrRNA基因为基础，Shotgun测序费用高昂且分析过程繁琐复杂，目前难以大规模推广使用，DGGE技术相对简单高效，TRF

LP较为方便快捷。基因芯片用于个体间肠道菌群对比时灵敏性较好，且具有高通量特点，预计可广泛应用于临床检验。宏基因组测序可保留样本中全部菌群的信息，在肠道菌群多样性研究中正逐渐盛行。焦磷酸测序能自动化检测大量的样本，近年来发展迅速。然而分子生物学技术均为多学科技术融合渗透的成果，必然在某些方面存在不足和一些亟待解决的关键问题，且这些方法都受制于样本中获得的DNA质量及其PCR效果。但随着科学技术的不断发展，相信这些问题会得到解决，相关技术一定会在肠道微生物的研究中发挥更加重要的作用。

　　总之，肠道微生物组研究主要包括微生物组的多样性和功能活性等两方面。传统微生物培养的研究方法和现代分子生物学技术是目前主要的两大研究手段，其中现代分子生物学技术具有快速、高效的特点，尤其是对于不能被培养的微生物的研究具有传统微生物培养方法无法替代的优势。而传统的微生物培养方法，可通过培养、分离、鉴定获得存活的纯微生物，进而在微生物整体水平上进行研究。因此，综合应用各种肠道微生物组的研究方法和技术才能进一步加快对肠道微生物组多样性及其功能的研究和认识。

　　参考文献

　　[1]SERINOM,LUCHEE,GRESS,etaltabolicadaptationtoahighfatdietisassociatedwithachangeinthegutmicrobiota[J].Gut,2016,614 543553.

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　　[3]ROUNDJL,LEESM,LIJ,etal.TheTolllikereceptor2pathwayestablishescolonizationbyacommensalofthehumanmicrobiota[J].Science,2016,3326032 974977.

　　[4]MOOREWEC,HOLDEMANLV.Humanfecalflora:thenormalfloraof20JapaneseHawaiians[J].ApplMicrobiol,1974,275 961979.

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范文四：肠道微生物组的现代分子生物学研究方法综述[Word文档]

肠道微生物组的现代分子生物学研究方法综述

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肠道微生物组的现代分子生物学研究方法综述

传统微生物培养的研究方法和现代分子生物学技术是目前主要的两大研究手段，以下是一篇关于肠道微生物组的现代分子生物学研究方法探究的，欢迎阅读查看。

微生物遍布于人体所有与外环境相通的器官。成人胃肠道黏膜表面积达300m2,是与外界环境接触并相互作用的最大区域，在其中定殖着约1×1014个微生物，数量是人体体细胞总数的10倍。肠道微生物参与宿主的能量吸收和储存，帮助宿主降解并吸收食物中的营养成分，还能促进免疫细胞分化与成熟、激活肠道免疫系统[1-3],具有非常重要的生理意义。但是由于人体肠道复杂的厌氧环境，40%~80%的肠道微生物难以在体外培养，仅凭培养手段进行微生物组研究会大大削弱肠道微生物的多样性。随着分子生物学技术的飞速发展，利用分子生物技术研究肠道微生物组的技术取得了极大的进展。掌握并运用这些新技术对肠道微生物组的研究十分关键，该文主要对肠道微生物组的现代分子生物学研究方法进行总结和介绍。

1传统纯培养检测方法

2传统分子生物技术

2.1肠道菌群DNA提取技术

从粪便样品中提取高质量的、具有代表性的肠道菌群总DNA是肠道微生物分子生物技术研究的基础。目前提取肠道菌群总DNA的方法主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法以及一些商业试剂盒，如FastDNAkit、QuantumPrepAquapureGenomicDNAisolationkit、QIAampDNAStoolMinikit等。其中QIAampDNAStoolMinikit的提取效果得到较多肯定。试剂盒应用方便、快捷，但价格昂贵，处理大批样品时科研成本太高。相较而言，酚/氯仿抽提法快速且成本低，适合用于肠道微生物研究中总DNA提取，尤其适合处理大批量样品。

2.2构建基因文库测序技术

2.2.1构建16SrRNA基因文库

16SrRNA基因克隆文库通过扩增各种细菌共有基因序列片段对细菌进行定性定量分析，是一种有力的细菌学检测分析手段，现已广泛用于肠道和人体其他部位微生物多样性研究[5-7],并通过该方法发现了许多尚未培养到的菌种。16SrRNA基因克隆文库技术可以分析标本中的菌群结构，反映各种细菌的

相对比例及数量，具有培养法难以比拟的优势，不足之处是实际操作中技术环节多、影响因素复杂、不同实验室操作条件难以标化以及对标本中的细菌数量有一定要求等。但相信随着技术的不断提高，16SrRNA基因序列分析将逐步成为微生物组结构研究的有力工具。

2.2.2全基因组鸟枪测序分析技术

Gill等[8]利用全基因组鸟枪(Shot-gun)测序技术分析了两名健康成年人粪便中的菌群，首次对人体肠道微生物多样性进行了全面的描述。

Qin等[9]运用深度Shot-gun测序法研究发现，?型糖尿病患者的肠道菌群中度失调，产丁酸盐细菌丰度降低，而致病微生物的功能增加。相较于传统的基于rRNA的研究，Shot-gun测序分析技术可以找到更多的进化标记，得到更多的菌群信息，且Shot-gun技术不需PCR扩增，因此分析出的结果偏差较小;此外，通过序列数据分析，还可以对微生物基因表达及功能状态情况进行研究。其缺点在于微生物系统组成复杂，将大量的序列信息正确地装配成每个成员的基因组全序列，是一个较大的难题。

2.3遗传指纹图谱技术

2.3.1变性梯度凝胶电泳及其衍生技术

变性梯度凝胶电泳

(denaturinggradientgelelectrophore-sis,DGGE)技术是由Fisher等发明的，Muyzer等首次将其应用于微生物群落结构研究，随后Zoeten-dal将其用于人体肠道菌群的分析研究。后来在其基础上衍生出温度梯度凝胶电泳(temperaturegra-

dientgelelectrophesis,TGGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperaturegradientgelelectrophesis,TTGE)、脉冲场凝胶电泳(pulsedfieldgelelectro-phoresis,PFGE)和单链构象多态性检测(single-

strandedconformationalpolymorphisms,SSCP)等。此后，该技术被广泛应用于消化道排泄物中微生物的分析[10-11].

2.3.2随机扩增多态性

DNA技术随机扩增多态性

DNA(randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术利用寡核苷酸序列在基因组上随机配对的特性，经扩增得到一系列大小不同的产物，通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳便可得到一系列基于RAPD的指纹图谱。因为不同模扳DNA产生的指纹图谱有差异，因此可用于鉴定微生物种类，并且灵敏度高，常被用于细分微生物组内的种群差异[11-12].

RAPD技术的缺点在于重复性和稳定性差，产生的图谱条带过于复杂，需要进行大量的筛选，从中找到较为合适的引物进行分析，较为费时。

2.3.3末端限制性片断长度多态性分析技术

末端限制性片断长度多态性分析

(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphisms,T-RFLP)

技术通过自动测序仪分析酶切后的末端序列，达到定量的目的，因为末端序列来自16SrDNA,因此可用于复杂的肠道微生物群落结构的研究，快速灵敏地评估群落中微生物的多样性，并给出微生物群落结构的指纹图谱，是目前被广泛采用的一种指纹图谱技术，现已成功应用于各种微生物群落结构和多态性的比较分析[13-14].

2.4荧光原位杂交技术

除了上述技术外，分子杂交技术也被广泛应用于肠道微生物组的研究中，同样表现出应用潜力和优点。

Giovannoni等首次应用荧光原位杂交(fluo-rescenceinsituhybridization,FISH)技术进行细菌学的研究。随后Delong等使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。经过不断的丰富和完善，FISH技术已成为近年肠道微生物研究中一种重要的检测工具[15-16].其利用荧光素标记16SrRNA基因序列的寡聚核苷酸探针，与靶细菌杂交，通过检测目标序列来鉴定微生物，具有敏感、快速、安全等优点。

由于肠道微生物组种类繁多，而联合流式细胞学技术可进行高通量分析，已越来越多地应用于FISH信号检测。

3新近发展的方法技术

3.1基因芯片技术

基因芯片技术(DNAchips)原理是使探针分子在滤膜、硅片、玻璃等介质上排列成微矩阵，将待检样品标记后与微矩阵杂交，通过检测样品杂交信号强度即可获得样品中基因序列及数量等信息，具有快速、高效、低成本等优点，现已广泛应用于微生物群落结构及功能的研究[17-19],并且其敏感性和特异性已经得到了反复验证[20-21].

3.2宏基因组学技术

宏基因组学即将环境中全体微生物的遗传物质看作一个整体，系统全面地研究微生物与其生存环境之间的关系。通过宏基因组测序技术可发现肠道菌群结构改变，结合其代谢特征可分析肠道微生物与代谢性疾病之间的联系。宏基因组学还可用来发现新发传染病病原以及未知病原。美国国立卫生研究院

(NationalInstitutesofHealth,NIH)的人类微生物组计划[22-23]利用宏基因组学技术分析了242个美国健康志愿者微生物基因组，获得了近800个菌种的基因参考序列。

宏基因组学技术为肠道微生物组的研究提供了新的思路与方法，为充分认识和利用未培养微生物、完整地从群落水平上认识微生物开辟了新的道路。

3.3第二代测序技术

2005年底Roche公司建立454测序技术，该技术结合DNA扩增乳胶和皮升级反应孔进行焦磷酸盐测序，可对微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系进行研究，具有速度快、通量高、读长长、准确性高、一致性好及简便高效的优势。

相较于454测序技术，Illumina测序表现出低错误率、低成本和高通量等优势[26-27].但是，Illumi-na测序长度短，所获得的序列数量巨大，呈数十倍增长，原有生物信息学分析工具无法计算，因此解决其运算问题是Illumina用于微生物群落分析的关键之处。随着Illumina测序读取长度的改

善及新型分析工具的开发，预计Illumina测序技术将因其高性价比的优势广泛应用于肠道微生物组的研究。

4展望

从1975年Woese等首次应用rRNA分析菌群以来，rRNA数据库迅速扩大，16SrRNA基因作为细菌的标志，已逐渐成为临床细菌分类、鉴定的金标准。传统分子生物学技术多以16SrRNA基因为基础，Shot-gun测序费用高昂且分析过程繁琐复杂，目前难以大规模推广使用，DGGE技术相对简单高效，T-RFLP较为方便快捷。基因芯片用于个体间肠道菌群对比时灵敏性较好，且具有高通量特点，预计可广泛应用于临床检验。宏基因组测序可保留样本中全部菌群的信息，在肠道菌群多样性研究中正逐渐盛行。焦磷酸测序能自动化检测大量的样本，近年来发展迅速。然而分子生物学技术均为多学科技术融合渗透的成果，必然在某些方面存在不足和一些亟待解决的关键问题，且这些方法都受制于样本中获得的DNA质量及其PCR效果。但随着科学技术的不断发展，相信这些问题会得到解决，相关技术一定会在肠道微生物的研究中发挥更加重要的作用。

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范文五：【word】史氏鲟肠道微生物基因组DNA提取方法的研究

史氏鲟肠道微生物基因组DNA提取方法的

研究

湖南农业科学2011,(11):129,131HunanAsriculturalSciences

史氏鲟肠道微生物基因组DNA提取方法的研究

张旭,杨元金,王京树,田甜

(中国长江三峡集团公司中华鲟研究所,湖北宜昌443100)

摘要:以史氏鲟肠道内容物及鲜活肠道为样本,用PBS多次洗涤,离心

样品,沉淀菌体.提取肠道菌群总DNA,电泳结果显示,

样品DNA条带可用于后续分子生物学试验研究.通过细菌通用引物,对其16SrDNA基因进行PCR扩增,得到较清晰的图谱,条

带整齐,表明采用该方法可以用于提取鱼类肠道微生物群落的DNA,且简单,准确,可行.

关键词:史氏鲟;肠道细菌;DNA提取方法

中图分类号:$965.215文献标识码:A文章编

号:1006—060X(2011)11-0129—03

ExtractionMethodofGenomicDNAfromIntestinalMicroorganismof

Ac咖enserschrenkiBrandt

ZHANGXu,YANGYuan—jin,WANGJing-shu,TlANTian

(InstituteofChineseSturgeon,ChinaThreeGorgesCorporation,Hubei4431

00,PRC1

Abstract:TakingtheintestinalsubstanceandlivelyintestinaltractofAco,enserschrenkiBrandtassampleto

precipitatebacteriathroughPBScleaningandcentrifuge.TotalDNAofintestinalbacteriawasextractedtoinvestigate

intestinalmicroflora.Theresultsofelectrophoresisimpliedthatthebanding—patternsofdifferentsamplescanbeusedfor

theMlowingmolecularbiologicalexperiment.The165rDNAintheseDNAsampleswasamplifiedbyPCRwith

universalprimers0fbacteria.theclearatlasandtheneatlybandswereobtained.ItiSindicatedthatusingthismethodto

extractDNAofintestinalmicroflorafromfishiSsimple.accurateandfeasible.

Kevwords:Atipee,schrenkBrandt;intestinalbacteria;DNAextraction

在动物肠道的微生态系统中,微生物之间和微

生物与宿主之问存在着复杂而又相对稳定的联系,

宿主为肠道微生物提供栖息的环境,而肠道微生物

又能提高宿主对有害细菌侵染的抵抗力.大量研究

结果表明,动物肠道正常微生物区系在动物营养,健

康,免疫等方面发挥着极为重要的作用l】],它是由多

种微生物构成的具有广泛多样性和复杂相互作用的

微生态系统.鱼类肠道正常菌群是肠道的重要组成

部分,是肠道微生物与宿主以及所处的水环境之间

形成的相互依赖,相互制约的微生态系,它不仅在鱼

类营养物质的消化吸收,免疫反应以及器官的发育

等方面具有其他因素不可替代的作用,而且还能对

鱼类的生长,发育,生理和病理等方面加以影响f2l.

目前对肠道微生物的研究主要是通过动物粪

便或肠壁粘液来研究肠道微生物菌群多样性,对直

接取活鲜肠道研究肠道微生物菌群研究报道较少圈.

史氏鲟隶属于鲟形目,鲟科,分布于黑龙江水系,是

濒临灭绝的珍稀鱼类.至今未见对史氏鲟肠道微生

收稿日期:2011—02—28

作者简介:张旭(1984一),男,山西大同市人,助理工程师,

研究方向为微生物学.

物的研究报道,为此,选用史氏鲟幼鱼肠道为研究

材料,通过肠壁内容物和直接取鲜活肠道提取肠道

微生物群落DNA的效果对比,为鲟鱼肠道微生物

多样性研究提供科学依据.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1供试材料史氏鲟活鱼苗.

1.1.2试剂提取缓冲液:100mMTris,100mM

EDTA,1.5MNaC1,pH8.0;TE缓冲液:10mMTris,1

mMEDTA,pH8.0;CTAB/NaC1溶液:在80mLHsO

中溶解4.1gNaC1,缓慢加入l0gCTAB,同时加热

并搅拌,定容终体积至100mL;20%SDS,8moYL

KAc,50%PEG6000,5mol/LNaC1,3mol/LNaAc.

以上溶液均用超纯水配置,121~C灭菌30min;This

饱和酚;氯仿一异戊醇(24:1)混合液;溶菌酶100

mg/mL(一20~C冰箱中预冷);70%乙醇(一20?冰箱中

预冷);异丙醇(一20?冰箱中预冷).

1.1-3仪器设备离心机,电泳仪,水浴锅,制冰

机,冰箱,凝胶成像系统.

1.2方法

1.2.1鱼肠道样品的采集在无菌操作台上进行

湖南农业科学第11期

史氏鲟活鱼苗鱼样处理,先用75%酒精擦拭鱼体

表,用解剖剪沿肛门向上朝前呈弧形剪开.75%酒

精擦拭消化道外壁,无菌冲洗液(0.9%灭菌生理盐

水)『4I冲洗数遍.样品分为两组,组1用离心管收集

内容物;组2把鲜活肠道剪碎液氮研磨后装入离心

管中.将收集的鱼肠道样品放到灭菌处理的2mL

离心管中,放在一20?下备用.

1.2.2肠道微生物总DNA的提取取处理的鱼

肠道样品0.5g加0.5g石英砂和850提取

buffer,剧烈震荡,核酸提取仪震荡30s;加人50L

溶菌酶(100mg/mL)手动混匀,37?震荡温浴30—60

min;加入100txL20%SDS,手动混匀,65?,30

min,每隔10min震荡1次,12000rpm,室温离心

10rain;取上清加0.2倍体积的KAc(8tool/L)冰浴

20rain,14000rpm,10qc离心20rain;取上清加0.5

倍体积的PEG(20%),0.1倍体积的NaCI(5tool/L)

混匀,室温放置30min,14000rpm,20~C离心10

rain;弃去上清,加500ixL70%乙醇浸泡10min,吹

洗,14000rpm,20~C离心10min,洗净乙醇后,自

然干燥l0,20min,加入700IxLTE溶解;加入等体

积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),手剧烈震荡摇匀,

12000rpm,室温离心10min,再加入等体积的氯

仿:异戊醇(24:1)抽提1次,12000rpm,室温离心

10min;取水相加0.1倍体积的NaAc(3mol/L),0.6

倍体积的异丙醇,混匀,室温放置30min,14000

rpm,20?离心10min;弃去上清,加500L乙醇浸

泡吹洗,14000rpm,20?离心10min,吸净乙醇

后,自然干燥10—20min,加入60LTE溶解沉淀

(DNA在70%乙醇中可以无限期保存);质量检测,

测量260,280nm吸收值(A应为1.7,1.9).以

水作为空白对照,取水和产物各5L经1.5%琼脂

糖凝胶电泳检测.

1.2.3PCR扩增PCR引物为接近全长的细菌通

用引物8F和1492R.Primers8F:5一AGAG1f]r]rGAT

CMTGGCTCAG一3;Primers1492R:5-TACGGHTAC

CTrGITACGACTr一3.

PCR反应体系:10xTaqbuffer5;dNTP4

~L;PrimerF(10pmol/IxL)2~L;PrimerR(10pmol/

I)2L;模板1L(10ng);Taq酶0.4L(2u);加

ddH20至50L.

PCR扩增程序:94.C预变性5min;94.C变

性1min,55oC退火1min,72.C延伸2min,35个

循环;72.C延伸10min.取PCR产物5经1%

琼脂糖凝胶电泳后,用凝胶成像系统检测.

2结果与分析

2.1肠道细菌总DNA检测结果

两组样品的DNA提取物经1.5%琼脂糖凝胶

电泳检测,结果如图1显示.两组样品总DNA在

20kh左右,其中1组DNA条带较为明显,2组提

取DNA条带较弱,但从后续PCR扩增结果来看,

对实验结果没有太大影响,可以用于肠道微生物的

分子生物学分析.

22M

图1史式鲟肠道微生物总DNA琼脂糖电泳结果

(M:k-EcoT14IdigestDNAMarker;1-2:Sample)

2.2PCR扩增产物检测结果

以提取得到的细菌总DNA作为模板,进行

PCR扩增,如图2所示,由细菌通用引物扩增出的

各组DNA样品16SrDNAPCR产物长约1500

bp,显示图谱清晰,扩增效果较好.

2000bp

1000bp

图2PCR产物琼脂糖电泳结果

2:PCRproduct) (M:MarkerDL2000;1—

3讨论

传统研究鱼类肠道微生物的方法都局限于从

培养基中分离得到微生物,这样所得到的检测结果

非常容易受到操作方法的影响,而且还会常常低估

肠道菌群的数量和多样性,不能全面反映肠道微生

物之间及微生物与宿主间的真实相互关系阎,而利

用分子技术研究肠道微生物可以弥补传统的微生

物技术的不足.

从上述结果可以看出,提取样本的不同对

DNA提取的效果影响较大.组1明显比组2的提

第11期张旭等:史氏鲟肠道微生物基因组DNA提取方法的研究131

取效果要好.而且在操作过程中组2的电泳过程中

拖尾现象较易出现,可能是由于蛋白质含量太高从

而影响了DNA的纯度.本提取方法仅一次提取即

得到高质量的模板DNA,而且此DNA能用于16S

rDNA的PCR扩增,并得到特异性较好的产物.此

外,操作过程中不需要额外的DNA提取试剂盒,提

供了一种肠道微生物基因组DNA的简便高效的提

取方法,适合肠道微生物多样性研究.

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(责任编辑:卢红玲)

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