望下D风景
范文一：蛋白质检测方法
(一)蛋白质的盐析
取1.5mL蛋白质溶液，加入等体积饱和硫酸铵溶液(浓度为50%饱和)，微微摇动试管，使溶液混合均匀后，静置数分钟，球蛋白即析出呈絮状沉淀(如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵)，用滤纸滤取上清液，滤液中再加入固体硫酸铵粉末至不再溶解，析出的即为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。
(二)蛋白质的沉淀
1(用重金属盐沉淀蛋白质
取三支试管，各加1mL蛋白质溶液，分别各加3滴6%醋酸铅溶液、3滴2%硫酸铜溶液和3滴1%硝酸银溶液，观察蛋白质沉淀的析出。
2(用有机酸沉淀蛋白质
取二支试管，各加1mL蛋白质溶液，并加5%醋酸溶液使之呈酸性(该沉淀反应最好在弱酸中进行)。然后分别滴加饱和苦味酸、饱鞣酸溶液，直至沉淀产生为止。
用10%三氯醋酸溶液、3%磺柳酸溶液进行类似实验(用量同前)，观察现象。 (三)蛋白质的颜色反应
1(黄蛋白反应
于试管中，加1mL蛋白质溶液和10滴浓硝酸溶液，直火加热煮沸，观察溶液和沉淀颜色。冷却后，再加入20滴10%氢氯化钠溶液，观察颜色变化。
2(与茚三酮的反应
在二支试管中，分别加1%赖氨酸溶液和1mL蛋白质溶液，分别加2滴茚三酮溶液，加热至沸，观察有什么现象,
3(与硝酸汞试剂作用——米伦反应
在二支试管中，分别加1mL 0.5%苯酚溶液和1mL蛋白质溶液，再各加0.5mL米伦试剂(不可太多)，苯酚溶液出现玫瑰红色，而蛋白质溶液加热后出现沉淀，加热凝固的蛋白质呈砖红色，有时溶液也呈红色。
4(蛋白质的双缩脲反应
(1) 双缩脲的生成
于干燥试管中，加0.2g,0.3g尿素，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，放出的氨可用红色石蕊试纸试验。试管内有白色固体出现后，停止加热。
(2) 双缩脲反应
上述产物冷却后，加1mL10%氢氧化钠溶液，摇匀，再加2滴2%硫酸酮溶液，混匀，观察有无紫色出现。
于试管中，加1mL清蛋白溶液和1mL10%氢氧化铜溶液，再加1滴,2滴2%硫酸铜溶液共热，由于蛋白质与硫酸铜生成络合物而呈紫色。取1%赖氨酸溶液作对照，观察颜色变化。 (四) 核蛋白组成的鉴定
1(核蛋白的水解
取20mL酵母核蛋白混悬液于离心管中离心分离，弃去清液，将沉淀转入小烧杯中，加15mL 5%硫酸，盖上表面皿在水浴上煮沸约1h(煮沸过程中保持原有体积)，水解毕，离心分离，取上层清液作以下检查。
2(核糖的鉴定
于试管中，加1mL 20%间苯二酚盐酸溶液，以小火加热至沸，迅速加入5滴水解液，呈现红色，(如红色不显可再稍加热)。
3(磷酸的鉴定
取10滴水解液，置于试管中，加5滴7%钼酸铵溶液和2滴浓硝酸溶液，小心于火上加热，即有黄色沉淀生成。
4(嘌呤与嘧啶的鉴定
取约4mL水解液，置于小烧杯中，加入氨水至微碱性，过滤，在滤液中加1mL 5%硝酸银铵溶液，静置片刻，即有絮状的嘌呤或嘧啶银盐沉淀生成。
注意事项
米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞及亚硝酸汞之混合物，能与苯酚及某些酚类起颜色反应。
范文二：蛋白质检测方法
蛋白质的检测（参考GB/T6432-94）
一、原理
凯氏定氮法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化为硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氮溢出，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。
二、试剂
（1） 硫酸 化学纯，含量为98%，无氮；
（2） 混合催化剂 0.4g硫酸铜，含5个结晶水，6g硫酸钾或硫酸钠，均为化学
纯，磨碎混匀；
（3） 氢氧化钠 化学纯，40%水溶液（m/V）；
（4） 硼酸 化学纯，2%水溶液（m/V）；
（5） 混合指示剂 甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体
积混合，在阴凉处保存期为3个月；
（6） 盐酸标准溶液 基准无水碳酸钠法标定；
a) 0.1mol/l盐酸标准溶液：8.3mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。
b) 0.02mol/l盐酸标准溶液：1.67mL盐酸注入1000mL蒸馏水中。
（7） 蔗糖 分析纯；
（8） 硫酸铵 分析纯，干燥；
（9） 硼酸吸收液 1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，
0.1%甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液，混合，置阴凉处保存期为1个月（全自动程序用）。
三、仪器设备
（1） 实验室用样品粉碎机或研钵；
（2） 分样筛 孔径0.45mm（40目）；
（3） 分析天平 感重0.0001g；
（4） 消煮炉或电炉；
（5） 滴定管 酸式，10、25mL；
（6） 凯氏烧瓶 250mL；
（7） 凯氏蒸馏装置 常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式；
（8） 锥形瓶 150、250mL；
（9） 容量瓶 100mL；
（10） 消煮管 250mL；
（11） 定氮仪 以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。
四、分析步骤
（一）仲裁法
1. 试样的消煮 称取试样0.5-1g（含氮量5-80mg）（精确至0.0002g），放入凯式烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯式烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化、泡沫消失后，再加强活力（360-410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，消化全过程至少2h。
2. 氨的蒸馏
（1） 常量蒸馏法 将试样消煮液冷却，加入60-100mL蒸馏水，摇匀，冷却。将
蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有25mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。然后小心地向凯式烧瓶中加入50mL氢氧化钠溶液，轻轻摇动凯式烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体体积为100mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1-2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。
（2） 半微量蒸馏法 将试样消煮液冷却，加入20mL蒸馏水，转入100mL容量
瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有20mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补充硫酸。准确移取试样分解液10-20mL注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。
注：两种蒸馏法测定结果相近，可任选一种。
（3） 蒸馏步骤的检验 精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，选仲裁法或推荐法“氨
的蒸馏”中的步骤进行操作，测得硫酸铵含量为21.19%±0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。
（二）推荐法
1. 试样的消煮 称取0.5-1g试样（含氮量5-80mg）（精确至0.0002g），加入消化管中，加2片消化片（仪器自备）或6.4g混合催化剂，与420℃下在消煮炉上消化1h。取出冷却后加入30mL蒸馏水。
2. 氨的蒸馏 采用全自动定氮仪时，按仪器本身常量程序进行测定。
采用半自动定氮仪时，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以25mL硼酸为吸收液，加入2滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消煮管中加入50mL氢氧化钠溶液进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到100mL为宜。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内。
3. 滴定 用0.1mol/L的盐酸标准溶液滴定吸收液，溶液由蓝色变成红色为终点。
五、空白测定
称取蔗糖0.5g，代替试样，进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸溶液的体积不得超过0.2mL。消耗0.02mol/L盐酸标准溶液体积不得超过0.3mL。
六、分析结果的计算和表述
计算见下式：
粗蛋白质= V2?V1 ×c×0.0140×6.25
m×V×100%
式中：V2——滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL；
V1——滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL；
c——盐酸标准溶液浓度，mol/L；
m——试样质量，g
V——试样分解液总体积，mL
V’——试样分解液蒸馏用体积，mL；
0.0140——与1.00mL盐酸标准液【c（HCL）=1.000mol/L】相当的、以克表示的氮的质量。
6.25——氮换算成蛋白质的平均系数。
七、 重复性
当粗蛋白质含量在25%以上时，允许相对偏差为1%。
当粗蛋白质含量在10%-25%以上时，允许相对偏差为2%。
当粗蛋白质含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。
浙江紫香糖业使用的定氮仪是上海新嘉
型号：KDN-AZ智能型定氮仪蒸馏器
KDN-AZ智能型定氮仪是我公司根据用户对仪器自动化的需求进行改进的一款半自动凯氏测定装置，在A型的基础上安装了自动蒸馏控制元件，使原本繁琐的蒸馏控制更为简便，提升了工作效率，保证了样品测定的精准性，并且加装了自动排水系统，用户不用担心因蒸发炉水未排尽而造成下次开机出现烧保险丝的烦恼。
测定范围：0.1-200mg氮（0.05%~95%）
重现性：1%相对误差（包括消化步骤）
回收率：99.5%-100%（1~200mg氮）
耗能：800W
外形尺寸：380*330*750
重量（KG）：26
（可根据需要搭配消化炉）
范文三：蛋白质定性方法茚三酮反应
蛋白质定性方法茚三酮反应
蛋白质定性方法茚三酮反应
1.范围
本方法采用茚三酮试剂与蛋白质中a-氨基酸反应生成蓝紫色化合物最大吸收值的波长为570nm
本方法适用于各类蛋白质测定范围0.5 g 50 g 蛋白质
2.原理
茚三酮是使氨基酸和多肽显色的重要试剂当茚三酮在弱酸性条件下和-氨基酸反应时氨基酸被氧化分解生成醛放出NH3 和C02 水合茚三酮则变成还原型茚三酮然后还原型茚三酮与NH3 及另一分子茚三酮进一步缩合生成蓝紫色化合物最大吸收值的波长为570nm此反应为一切a-氨基酸所共有反应灵敏因而本法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色化合物最大吸收值的波长在44Onm 多肽和蛋白质虽然具有茚三酮反应但肽链越大灵敏度也越来越差故不宜作定量测定之用在多肽合成中常用来检验有无自由氨基的肽类存在
3 .试剂
茚三酮无水乙醇95%乙醇甘氨酸
4.试样制备
4.1 蛋白质溶液箱保存备用
4.2 1mg mL-1的茚三酮乙醇溶液,0.1g 茚三酮溶于100mL 95%乙醇新鲜配置 4.3 5mg mL-1的甘氨酸溶液
5.参考文献
1.陈曾燮刘兢罗丹 编.生物化学实验.合肥中国科学技术大学出版社1994.1-6 2.李建武等 合编.生物化学实验原理和方法.北京北京大学出版社1994.150-174
3.宁正祥 编.食品成分分析手册.北京中国轻工业出版社1998.62-80
范文四：蛋白质的检测方法
1.在热酸、、碱重金、盐、紫属外线等作作用，蛋下质会发白生质上性改的变而凝起来结．种凝结这是不逆可，不的再使它能们复成原恢的蛋白质来．蛋质的这种变白叫化做变．性
蛋
白质性后，变就去了失有的原可溶性也，失就去它们了理生上的用作．此因白质蛋的性变固是个不凝逆可过．程
造成白质变性蛋原的因
物理素因包括：加热、压、搅拌、振加荡紫外线、射照、X射线、超波等：声
化学因包素括强酸、：碱、重金强盐、属氯三酸乙、乙、丙酮等醇
2.蛋白质可以跟许。多试剂发颜色反应生例．在鸡蛋白如溶中滴入液浓酸硝，则鸡白溶液蛋呈色．黄是由这蛋白于（含苯环结构）质与硝酸发浓了生颜色应反缘的故还可以用．缩双脲剂试对其行检进验该试,遇蛋剂质变紫白
3
.蛋质在灼烧白分时解，可以生产一烧种羽毛的特焦殊气，利味这用一性可质鉴别蛋白质．以
范文五：蛋白质检测方法汇总
蛋白质检测方法汇总
2010-04-26 12:00:38| 分类： | 标签： |字号大中小 订阅
本文引用自啸月天狼《蛋白质检测方法汇总》
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蛋白质检测方法汇总
本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。
了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：
①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；
②蛋白质的性质；
③溶液中存在的干扰物质；
④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：
CH2COOH
| + 3H2SO4--------- 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
NH2
2NH3 + H2SO4 -------- ---(NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH ----------- 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
五种蛋白质测定方法比较如下：
方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明
凯氏定氮法（Kjedahl法） 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％ 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长
双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低1～20mg 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不
同蛋白质显色相似
紫外吸收法 较为灵敏50～100mg 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正
Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高～5mg 慢速 40～60分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高1～5mg 快速5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化
二、双缩脲法（Biuret法）
（一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
H2O
O=C C=O
HN NH
R-CH CH-R
O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色络合物 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2. 器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
三、Folin—酚试剂法（Lowry法）
（一）实验原理
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。
（二）试剂与器材
1.试剂
（1）试剂甲：
（A） （ A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。
（B） （B） 0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。
（2）试剂乙：
在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
（3）标准蛋白质溶液:
精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。
2. 器材
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）秒表
（4）试管16支
（三）操作方法
1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。
进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。
Folin—酚试剂法实验表格：
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（A700）
2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。
根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。
注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。
四、改良的简易Folin—酚试剂法
（一）试剂
1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。
2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。
3. 标准蛋白质溶液：同基本法。
（二）操作步骤
测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。
改良的快速简易法，可获得与 Folin—酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。
五、考马斯亮兰法（Bradford法）
（一）实验原理
双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：
（1）可见光分光光度计
2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。
3. 标准蛋白质溶液：同基本法。
（二）操作步骤
测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。
改良的快速简易法，可获得与 Folin—酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。
五、考马斯亮兰法（Bradford法）
（一）实验原理
双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）试管16支
（三）操作方法
1. 标准方法
（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 考马斯亮兰法实验表格：
管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 &
nbsp; (1.0mg/ml) 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml) 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 G－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
每管中的蛋白质量（mg） 光吸收值 （A595）
（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
2. 微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。
0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。
六、紫外吸收法
蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。
此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注
意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。
下面介绍四种紫外吸收法：
1. 280nm的光吸收法
因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。
蛋白质浓度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)
(Q 1%浓度?10mg/ml)
例：牛血清清蛋白 ： A1％1cm=6.3 (280nm)
溶菌酶 ： A1％1cm=22.8 (280nm)
若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。
标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：
管号 1 2 3 4 5 6
BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
A280
用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1％1cm,280nm
2. 280nm和260nm的吸收差法
核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：
纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 ? 1.8
纯核酸的光吸收比值： A280/A260 ? 0.5
含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)
此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。
3. 215nm与225nm的吸收差法
蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。
用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：
吸收差D= A215 －A225
以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。
4. 肽键测定法
蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。
进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。
本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。 考马斯亮兰法（Bradford法）
（一）实验原理
双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷
基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液，用g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）试管16支
（三）操作方法
1. 标准方法
（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 考马斯亮兰法实验表格：
管 号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10标准蛋白质0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
(1.0mg/ml)
未知蛋白质0.02 0.04 0.06
(约1.0mg/ml)
蒸馏水0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04
考马斯亮蓝
G－250试剂5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0每管中的蛋
白质量（mg）
光吸收值
（A595）
（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
2. 微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。
0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。
