范文一：纸层析法分离氨基酸实验报告

纸层析法分离氨基酸实验报告

纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸

姓名:敖礼贤学号:5602212013 班级:生物工程121

一、前言

1、研究意义与前景

层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等)，使各组分在两相(一相为固定的，称为固定相;另一相流过固定相，称为流动相)中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。

【1】

纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂

是流动相。【2】

分配层析法 分配色谱系色谱法之一种，利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。【3】

2、实验目的

(1)掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)

(2)学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。

3、实验原理

层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”(Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 1944年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄

层层析、亲和层析、凝胶层析等。 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等)，使各组分在两相(一相为固定的，称为固定相;另一相流过固定相，称为流动相)中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。

按层析过程的机理分类:

吸附层析:利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。 分配层析:利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。

离子交换层析:利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。

凝胶层析:利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相

(固定相)，有机溶剂称为流动相。展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相:一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。

分配系数(α),溶质在固定相的浓度(CS)/溶质在流动相的浓度(CL)

当用滤纸进行分配层析时,流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。分配层析的原理可用一个模式解释(英国Martin等):把滤纸看成是一个层析柱，可以分成若干层板，设层板的物质为A、B;且A和B的分配系数(α)分别为1和1/3;又设固定相为S，流动相为L，两相互相接触但不相混溶。当第一层流动相中加入一定量的A、B两项物质后，溶质根据各自的分配系数在第一层的两相中分配，流动相继续在流动，此时第一层固定相与新流到的流动相之间以及原来第一层流动相与第二层固 定相之间进行第二次分配，以此类推三次分配即可看出A与B最浓部分以分开，A在第二层最浓，B在第三层最浓，如果继续抽提下去，经过若干此后，A、两物

质便可完全分开。显然，分配系数越大的,则越易分开。

物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移值)来表示的:

Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统;层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。

无色物质的层析图谱可用光谱法或显色法鉴定。本实验采用茚三酮为显色剂。茚三酮显色反应受温度、 ph、时间影响较大。如果要使结果重复，必须严格控制上述条件。

二、实验材料与方法

1、实验试剂

1. 氨基酸标准液(1mg/ml)

四种氨基酸是甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、混合氨酸分别配置成一定浓度的溶液

2. 80%甲酸

3. 0.5%茚三酮溶液

4. 氨基酸混合液

5. 正丁醇

2、实验器材

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

新华滤纸 培养皿 电热鼓风干燥箱 点样管及点样架 针、线、尺 烧杯 钟罩

3、实验操作

(一)标准氨基酸纸上层析

1、单向上行层析

(1)氨基酸Rf值的测定

A、 滤纸:选用国产新华1号滤纸，28cmX28cm，在距纸边2cm处，用铅笔轻轻划一条线，

于线上每隔3cm处画一小圆圈作为点样处，圈直径不超过0.5cm。

B、 点样:点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清，氨基酸的点

样量以每种氨基酸含5—20ug为宜，将准备好的滤纸悬挂在点样架上，滤纸

垂直桌面，用点样管吸取氨基酸样品10ug，在滤纸垂直方向轻轻碰触点样中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。

C、 将点好的样品的滤纸俩侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处的纸的俩边不要接

触，避免由于毛细管现象使溶剂沿俩边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。

D、 酸溶剂系统:正丁醇:80%甲酸:水=15:3:2，茚三酮2ml，温度25*C，时间1h。注意:

使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。展层溶剂每张约需25ml。

E、 显色:待展层基本结束后，置65.C鼓风箱中10—20min, 鼓风保温，滤纸上即显出紫

红色\黄色斑点。

F、 Rf值的计算:用尺测量显色斑点的中点与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，

求出此值，即得氨基酸的Rf值，计算出4种氨基酸在酸系统中的Rf值。

三、实验数据与分析

原点到层析点

中点的距离

(mm) 甘氨酸 14 亮氨酸60脯氨酸 36混合氨酸

原点到溶剂前

沿的距离

7070 70

四、讨论

1、注意事项

?.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。

?.点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。

?.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。

?.展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。

2、思考题

( 1)、纸层析法分离氨基酸为什么在展层时使用一种溶剂系统,有时使用俩种溶剂系统,

这是根据Nernst在1891年提出的分配定律:一种溶质在两种给定的互不相溶

的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数，即分配系数(Kd)。

Kd=Ca/Cb

Ca和Cb是互不相溶的两相，即A相和B相的浓度。这里的两相可以使固相、液相和气相。

意思就是溶质在A和B两种溶剂组成的混合溶剂里分配时，分配比是恒定的。

(2)、酸性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离有何影响,

酸性溶液中，有利于氨基酸的碱式电离，氨基结合质子，整个分子带正电荷;

反之，碱性溶液中有利于羧基的酸式电离，氨基酸分子整体带负电荷。

(3)、展层剂酸性溶剂系统对酸性氨基酸的Rf值有什么影响,

溶剂系统pH影响氨基酸电离情况，如果用有机溶剂做展层剂，那么氨基酸

电越多，溶解度越小，Rf也就越小。

五、参考文献

感谢老师的指导和辛勤劳动～

【1】

篇二:实验六 氨基酸的纸层析法

氨基酸的纸层析法

一(目的

了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。

二、原理

以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法;有上向下移动的，称为下行法。将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。

在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变)，不同的氨基酸有固定的移动速率(Rf值)Rf=

原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。

本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。

三、实验仪器

1、 新华滤纸

2、 层析缸

3、 细线

4、 点样管

5、 橡皮筋

6、 电吹风

7、 喷雾器

四、实验试剂

1、 混合氨基酸(精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸)

2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v)

3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中

五、实验步骤

1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点(原点)。

2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。

3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层(大约2~3小时)。

4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干(或烘箱60?)烘干。

5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。

6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。

7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。(书上图谱横着看)

六(实验结果

H1=1.0cmH2=4.4cm H3=5.0cm

H4=0.99cm H=11.7cm

由此可得

Rf1=0.08547

Rf2=0.37607

Rf3=0.42735

Rf4=0.08461

据此可知，混合氨基酸是由甘氨酸(Gly)和苯丙氨酸(Phy)组成。

七(实验分析

实验中出现了拖尾的现象。

拖尾现象是指展层，显色后在层析分配图上，所看到的某一种氨基酸的分子位移，不是如标准图谱所示的那样，完整地显示在某一位置上，而是形成象笤帚似的那样，前端粗圆而逐渐细小下来，宛如拖着一个尾巴。其图所呈颜色也是由浓渐淡。

图象的出现，是在实验中对影响Rf值的主要因素要求，掌握不够所致。诸如，物质结构与极性对Rf值的影响，层析溶剂对Rf值的影响，PH对Rf值的影响(溶剂、滤纸和样品的PH值)，温度对Rf值的影响，滤纸的质地是否均匀，薄

厚是否适当，纤维的松紧度是否适中等对Rf值的影响，展层的方式(上行、下行)对Rf值的影响。然而在多次实验过程中无论怎佯严格遵循其影响Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出现拖尾现象。此时，这就需要从具体操作规范方面，诸如样品的处理，点样、展层、显色等几个操作程序去考虑思索，经仔细分析，样品的处理是为除去杂质纯化样品，达到层析分

配某氨基酸的情晰显色图像;展层过程是在上述影响Rf值的主要因素要求下进行，使样品达到一个适当的位移，便于在显色后从图象上，区分不同样品的氨基酸;显色是在用配制好的，与水不相混合，并挥发性较快喷雾后迅速吹干的。更何况显色剂又是含水量极低，不会影响洋品的斑点扩散，那么问题就集中在点样这个操作程序上了。点样是将被层析分配的几种氨基酸混合液，和为了对照实验结果，而分别配制的几种氨基酸的溶液，用微量点样管或毛细管，或血球计数器将5一j5微升的样品，点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设计好的多点位置中去。点样后要自然风干，

或冷风吹干。最好不要用加热装置，如吹风机，灯泡之类的热源将其样品点加速干燥。因为加热装置在学生操作时，一但注意不够，掌握不好，则温度升高势必要使样品破坏，更会使佯品点干的太燥。正是由于这样，样品点太干(转载于:www.xiElw.coM 写论文 网:纸层析法分离氨基酸实验报告)燥，使其样品物的分子，牢固地吸牢在层析纸的纤维上。所以在展层过程中，样品点的每个物质分子，不能在层析纸上同时起步，而是形成了有先有后，鱼贯而上行或下行的状况，最终使洋品物质的分子，不能同时都集中到达一个位置。致使在显色后，实验结果的图象上，观察到的不是一个完整的斑点，而是一个拖着尾巴的斑点。这就是上述所说的拖尾现象。

纸上分配层析所出现的拖尾现象，究其原因很简单，就是在点样品后，样品点吹的太干燥所致。样品点不要吹的太干燥，否则，样品物质的分子，会牢吸在层析纸的纤维上，出现拖尾现象”。

影响 Rf值的主要因素

篇三:实验四 氨基酸的纸层析法

姓名:郭沈杰 年级专业:2012级生

物科学 同组者:蔡萍萍 学号:12050011012

实验四 氨基酸的纸层析法

一、实验目的

了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。

二、实验原理

以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为固定相，它与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法;有上向下移动的，称为下行法。

将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。

在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变)，不同的氨基酸有

固定的移动速率(Rf值)

Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，

就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。

氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 本实验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、苯丙氨酸。

三、实验仪器

1、 新华滤纸 2、 层析缸 3、 细线 4、 点样管 5、 橡皮筋 6、 电吹风 7、 喷雾器 8、铅笔 9、直尺

四、实验试剂

1、精氨酸、 苯丙氨酸、 混合氨基酸(精氨酸、苯丙氨酸)

2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v)

3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色

瓶中

五、实验步骤

1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，在上面相同间隔画3圆点(原圈直径约5mm)。

2、取毛细管3支，分别吸取精氨酸、苯丙氨酸、氨基酸混合液少许，在原圈处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。

3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层(大约2~3小时)。

4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干(或烘箱60?)烘干。 5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。 6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。

7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。(书上图谱横着看)

六、实验结果

实验数据

与表中标准氨基酸Rf值比较，可知混合氨基酸是1:1混合的谷氨酸和苯丙氨酸的混合物。

原始数据

七、实验分析

1、纸层析法是利用各种氨基酸在两相中不断进行分配，分离系数不同，导致氨基酸随流动相的速率不同，在滤纸上相互分离形成距原点不等的层析点，而且在一定条件下，不同的氨基酸有固定的移动速率的原理。由于分离时间，室温等条件的限制，分离会出现误差，可以通过计算相对的Rf 值,减少实验误差。

2、根据各个氨基酸的Rf值，知道要分离的氨基酸是否能被分开，分的有多开。 就是说如果知道每个氨基酸的Rf值，没做实验，基本上就知道各个氨基酸在纸层析后的相对位置，及氨基酸谱带。

3、纸上分配层析所出现的拖尾现象原因是在点样品后，样品点吹的太干燥所致。

八、问题讨论

1.

Rf的影响因素:

室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等

2.

注意事项:

1)样点直径不宜超过5mm，且应边吹边点。

2)点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层。

3)喷茚三酮—无水丙酮液时要均匀，注意使溶液不倒流，不间断。

4)观察层析点时要多等一段时间，使得显色点更清楚，更有利于几何中心的确定。 5)操作时要带手套,一定不要直接用手接触滤纸已层析过的部分。因为手上的油脂汗液等会影响展层剂，影响氨基酸的溶解度

范文二：纸层析法分离氨基酸实验报告

前言

纸层析法 纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。

纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。

在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。在

做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液（石油醚）混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。

纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢；含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法 能清楚地将叶绿体中的色素分离。

图1 叶绿素的分离

氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61％，在饮料工业占30％，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。

氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用：

(1)在食品行业的应用

(2)在医药工业的应用

(3)在饲料添加剂行业的应用

(4)在化妆品行业的应用

(5)在农业上的应用

(6)在其他行业的应用

氨基酸工业还有着广阔的发展前景：

(1)传统的氨基酸生产方法

(2)运用基因工程手段生产氨基酸

(3)大力发展药用中间体,具体为：

①氨基酸及其衍生物逐渐成为药用中间体

②非天然氨基酸是合成活性药物的重要原料

③生产高附加值的非天然氨基酸

一、实验目的

(1)掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色）。

(2)学习未知样品的氨基酸成分（水解、层析及鉴定）分析的方法。

二、实验原理

(1)纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流过固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。

(2)溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf值表示。

(3)Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。

(4)在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。材料与方法

三、实验装置与试剂

(1)氨基酸标准液(1mg/ml)

亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。

(2)80%甲醇

(3)0.1%茚三酮丙酮溶液

(4)氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)

(5)正丁醇

实验仪器

(1)新华滤纸×1

(2)培养皿×1

(3)电热鼓风干燥箱×1

(4)吹风机×1

(5)毛细管×4

（6）针、线、尺×1

（7）钟罩(高约430mm,直径约290mm，具磨口塞)×1

实验操作

(1)滤纸

选用国产新华 1号滤纸， 6cm×7cm。在距滤纸2cm处划线，用

铅笔在线上标上四个点作为点样位子（留出缝线空间）。

（2）点样

点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果。 将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。

(3)展层

将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内 (注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置。

酸溶剂系统：

正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml。温度25℃，时间1h。

注意：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。

（4）显色

待展层基本结束后, 置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。

（5）Rf值的计算

用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。

四、实验数据记录及处理

1、实验数据

图2 实验结果

原点到层析斑点中心

35mm

的距离

原点到溶剂前沿的

75mm

距离

O.280mm0.467

Rf 0.467mm 0.270mm 0.747mm

mm 0.760mm

甘氨酸，脯氨

判断待测氨基酸 脯氨酸 甘氨酸 亮氨酸 酸，亮氨酸 74mm 75mm 75mm 20mm 56mm 57mm 脯氨酸 甘氨酸 亮氨酸 待测氨基酸 21mm，35mm

表1 实验数据记录

五、讨论

1、注意事项

(1)使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨。

(2)点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。

(3)展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。

(4)展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。

2.思考

(1)为什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统? 这是根据Nernst在1891年提出的分配定律：一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数，即分配系数(Kd)。

Kd=Ca/Cb

Ca和Cb是互不相溶的两相，即A相和B相的浓度。这里的两相可以使固相、液相和气相。意思就是溶质在A和B两种溶剂组成的混合溶剂里分配时，分配比是恒定的。

(2)酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对氨基酸极性基团的解离有何影响?

酸性溶液中，有利于氨基酸的碱式电离，氨基结合质子，整个分子带正电荷；反之，碱性溶液中有利于羧基的酸式电离，氨基酸分子整体带负电荷。

(3)酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对碱性氨基酸(赖、精、组)和 酸性氨基酸(天冬、谷)的Rf值有什么影响?

酸性溶剂系统对碱性氨基酸的溶解性加强，在层析过程中易溶于流动相。所以跑得比较快，因此Rf值增大。反之，碱性性溶剂系统中酸性氨基酸Rf值增大。

（4）什么是分配系数？

在平衡状态下，组分在固定相与流动相中的浓度之比。

六、参考文献

[1] 杨丽，尤丽，叶金秀，袁燕。纸层析分离鉴定氨基酸实验的改进 ,云南民族大学学报(自然科学版) ，2011

[2] 王琳，陈仲道，马玉玲。分离氨基酸层析液制备方法的改进，济宁医学院学报，2004

[3] 陈刚，马晓，杨玉珍。关于做好“纸层析法分离氨基酸”实验的总结，生物学通报，2012

[4] 韩生彧。一种改良纸层析分离氨基酸的方法，承德医学院学报

范文三：薄层层析法,华东理工实验报告

薄层层析法,华东理工实验报告

氨基酸的薄层层析实验报告

生物化学实验报告

姓 名: XXX

学 号: XXXXXX

专业年级:临床八年制 __

组 别: 第二实验室

篇二:薄层色谱法实验报告

实验报告

一、实验目的

掌握薄层色谱的基本原理及其在有机物分离中的应用。

二、实验原理

有机混合物中各组分对吸附剂的吸附能力不同，当展开剂流经吸附剂时，有机物各组分会发生无数次吸附和解吸过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前，而吸附力弱的组分则滞后，由于各组分不同的移动速度而使得她们得以分离。物质被分离后在图谱上的位置，常用比移值Rf表示。

Rf?

原点至层析斑点中心的距离原点至溶剂前沿的距离

三、实验仪器与药品

5.0cm×15.0cm硅胶层析板两块，卧式层析槽一个，点样用毛细管。

四、物理常数

五、仪器装置图

“浸有层析板的层析槽”图

1-层析缸，2-薄层板，3-展开剂饱和蒸汽，4-层析液 六、实验步骤

(1)薄层板的制备:

称取2,5g层析用硅胶，加适量水调成糊状，等石膏开始固化时，再加少许水，调成匀浆，平均摊在两块5.0×15cm的层析玻璃板上，再轻敲使其涂布均匀。(老师代做～) 固化后，经105?烘烤活化0.5h，贮于干燥器内备用。 (2)点样。

在层析板下端2.0cm处，(用铅笔轻化一起始线，并在点样出用铅笔作一记号为原点。)取毛细管，分别蘸取偶氮苯、偶氮苯与苏丹红混合液，点于原点上(注意点样用的毛细管不能混用，毛细管不能将薄层板表面弄破，样品斑点直径在1~2mm为宜～斑点间距为1cm)

(3)定位及定性分析

用铅笔将各斑点框出，并找出斑点中心，用小尺量出各斑点到原点的距离和溶剂前沿到起始线的距离，然后计算各样品的比移值并定性确定混合物中各物质名称。

实验注意事项

1、铺板时一定要铺匀，特别是边、角部分，晾干时要放在平整的地方。

2、点样时点要细，直径不要大于2mm,间隔0.5cm以上，浓度不可过大，以免出现拖尾、混杂现象。

3、展开用的烧杯要洗净烘干，放入板之前，要先加展开剂，盖上表面皿，让烧杯内形成一定的蒸气压。点样的一端要浸入展开剂0.5cm以上,但展开剂不可没过样品原点。当展开剂上升到距上端0.5,1cm时要及时将板取出，用铅笔标示出展开剂前沿的位置。 讨论:

七、思考题

篇三:氨基酸的薄层层析实验报告

生物化学实验报告

姓 名: XXXXX

学 号: XXXXXXXXXXXXXX

专业年级:XXXXXXXXXXXXXXX

组 别: 第X实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称

实验日期 XXXX-XX-XX

合作者

评分 XXXX 氨基酸的薄层层析 实验地点 指导老师 第X实验室 XXX 教师签名 批改日期

一、实验目的

1、掌握薄层层析法的实验原理。

2、掌握氨基酸薄层层析法的基本操作方法。

3、掌握如何根据移动速率(Rf值)来鉴定被分离的物质(即氨基酸混合液)的方法。

二、实验原理

1、薄层层析法是色谱分析技术的一种。 是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板(如玻璃板、塑料片、金属片等)上，形成薄层(常用厚度为0.25毫米左右)后，在此薄层上进行层析分离的分析方法。 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相(展开溶剂)在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。(即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来) 硅胶吸附薄层层析:

吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。硅胶:表达式为SiO2?XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基(,Si,OH)，这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附.

硅胶吸附薄层层析的特点:

?硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。

? 硅醇基显较弱的酸性，因此，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。

? 硅胶的活化温度通常为105?,110?，不能过高。

2、氨基酸与茚三酮的显色反应:

茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。

3、混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值(rate of flow)

来表示。

层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。

即:

Rf=原点到层析斑点中心的距离 原点到斑点对应前沿的距离

由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率(Rf值)也是恒定的，因

此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

三、材料与方法:

(一)、材料:分析样品(氨基酸混合液)、吸附剂(硅胶)、粘合剂(0.5%的羧甲基纤维素钠)、氨基酸的异丙醇溶液(丙氨酸、精氨酸、甘氨酸)、展开-显色剂(正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液);

(二)、器材:层析板(5cm×15cm)、尺子、铅笔、小烧杯、玻棒、量筒(10ml)、吹风(来自:WWw.XieLw.com 写 论 文 网:

薄层层析法,华东理工实验报告)机、毛细玻璃管、层析缸、药匙、

烘箱;

(三)、方法:

1、实验流程:

2、操作步骤:

(1)薄层板的制备:

(2)点样:

(3)层析:

(4)显色:

四、结果与讨论:

(一)结果:

1、实验数据:

范文四：氨基酸纸层析法实验报告

氨基酸纸层析法实验报告

氨基酸的分离鉴定—纸层析法

化学与生物工程学院生物工程系

生物化学实验报告

课程名称: 生物化学实验项目: 氨基酸的分离鉴定—纸层析法实验室名: 生物化学实验室 实验时间: 2012-11-15 任课老师:

专业班级:生物工程1142 学生姓名:髙晔 学 号:201121030219

组别: 第五组

注:1、报告内的项目或内容设置，可根据实际情况加以调整和补充。

2、学生提交实验报告时间为实验后10日内。

篇二:实验四 氨基酸的纸层析法

姓名:郭沈杰 年级专业:2012级生物科学 同组者:蔡萍萍 学号:12050011012

实验四 氨基酸的纸层析法

一、实验目的

了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。

二、实验原理

以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为固定相，它与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶

剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法;有上向下移动的，称为下行法。

将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。

在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变)，不同的氨基酸有

固定的移动速率(Rf值)

Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，

就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。

氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 本实验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、苯丙氨酸。

三、实验仪器

1、 新华滤纸 2、 层析缸 3、 细线 4、 点样管 5、 橡皮筋 6、 电吹风 7、 喷雾器 8、铅笔 9、直尺

四、实验试剂

1、精氨酸、 苯丙氨酸、 混合氨基酸(精氨酸、苯丙氨酸)

2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v)

3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中

五、实验步骤

1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，在上面相同间隔画3圆点(原圈直径约5mm)。

2、取毛细管3支，分别吸取精氨酸、苯丙氨酸、氨基酸混合液少许，在原圈处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。

3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层(大约2~3小时)。

4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干(或烘箱60?)烘干。 5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。 6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。

7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。(书上图谱横着看)

六、实验结果

实验数据

与表中标准氨基酸Rf值比较，可知混合氨基酸是1:1混合的谷氨酸和苯丙氨酸的混合物。

原始数据

七、实验分析

1、纸层析法是利用各种氨基酸在两相中不断进行分配，分离系数不同，导致氨基酸随流动相的速率不同，在滤纸上相互分离形成距原点不等的层析点，而且在一定条件下，不同的氨基酸有固定的移动速率的原理。由于分离时间，室温等条件的限制，分离会出现误差，可以通过计算相对的Rf 值,减少实验误差。

2、根据各个氨基酸的Rf值，知道要分离的氨基酸是否能被分开，分的有多开。 就是说如果知道每个氨基酸的Rf值，没做实验，基本上就知道各个氨基酸在纸层析后的相对位置，及氨基酸谱带。

3、纸上分配层析所出现的拖尾现象原因是在点样品后，样品点吹的太干燥所致。

八、问题讨论

1.

Rf的影响因素:

室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等

2.

注意事项:

1)样点直径不宜超过5mm(转载于:www.xiElw.coM 写论文 网:

氨基酸纸层析法实验报告)，且应边吹边点。

2)点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层。

3)喷茚三酮—无水丙酮液时要均匀，注意使溶液不倒流，不间断。

4)观察层析点时要多等一段时间，使得显色点更清楚，更有利于几何中心的确定。 5)操作时要带手套,一定不要直接用手接触滤纸已层析过的部分。因为手上的油脂汗液等会影响展层剂，影响氨基酸的溶解度

篇三:氨基酸纸层析法

生物医药工程系《生物化学实验》预习报告

姓名刘英学号 12104114 专业 生物科学班级 1班

注:此表格若地方不够可自行调整。

范文五：实验报告亲和层析法纯化胰蛋白酶

亲和层析法纯化胰蛋白酶

一．实验目的

1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；

2. 掌握利用紫外可见分光光度计测定酶活性和抑制酶活性的原理和方法。 二．实验原理

亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性。这种分子之间的结合能力做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”。

在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（Ligand ），在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（如Sepharose4B ）制成亲和吸附剂，然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。

本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在pH=7-8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH=2-3时，又能被解离下来。采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从粗提液中通过一次亲和层析直接获得高纯度的胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多。纯化效率可达到10-20倍以上。 三．实验方法步骤 1. 鸡卵粘蛋白的制备

取蛋清60ml ，加入等体积的三氯乙酸丙酮溶液（丙酮：三氯乙酸=40:60）后，出现大量白色沉淀，搅匀后室温静置4h 以上，待清蛋白完全沉淀，3000rpm 离心10min ，弃去沉淀，47ml 上清液倒入250ml 锥形瓶并用塑料薄膜封好，置于

冰箱中冰浴片刻，缓慢加入3倍体积(141ml)的预冷丙酮，搅匀后冰浴4h 直到出现沉淀, 用真空泵抽去部分上清液，剩余部分的部分沉淀和上清液全部转移至离心管中，以3000rpm 下离心15min ，弃上清液。离心管底部沉淀物放置真空干燥器内，抽气去丙酮，然后用20ml 蒸馏水溶解。之后将鸡卵粘蛋白溶液装入透析袋内对蒸馏水透析。将透析液转移到离心管内，再次以3000rpm 下离心15min 。 2. 鸡卵粘蛋白含量测定

取上述离心液0.5ml 稀释6倍，测A 280nm ，求其浓度，由于浓度值过大，再次稀释10倍，测A 280nm ，得到最终的浓度。 3. 胰蛋白酶的比活性测定

在比色杯中加入2.95mlBAEE 底物溶液和20μl 的胰蛋白酶溶液，在λ253nm 的条件下测定4分钟内的A 253，算出?A 的值。 4. 鸡卵粘蛋白的抑制比活性测定

以苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物测定胰蛋白酶的活性。先在试管中加入0.14ml 0.1mol/l pH7.8tris-HCL缓冲液，0.07ml 胰蛋白酶溶液及0.07ml 鸡卵黏蛋白溶液，混合后在25℃水浴加热放置10min ，使胰蛋白酶和鸡卵黏蛋白充分结合，然后取反应混合液0.2ml ，加到装有2.8ml 底物溶液的比色皿中，迅速测定其在波长253nm 的条件下，4min 的A 253，求得其比活性。 5. 载体Sepharose4B 的活化

将适量的Sepharose4B ，用0.5mol/lNaCl淋洗后用蒸馏水洗净NaCl ，抽干后移至小烧杯中，加1.5mol/l NaCO3150ml ，将装有Sepharose4B 的小烧杯放置在一个冰浴里振荡2h ，用电动磁力搅拌器缓缓搅拌，反应器内的温度保持在5℃左右。称取2g 溴化氰放入一个烧杯中，加入5ml 乙肼使溴化氰完全溶解，取移液枪向装有凝胶的烧杯中滴加溴化氰，直到溴化氰加完后继续反应5min 。停止反应，将凝胶迅速转到玻璃烧结漏斗内用抽滤，用蒸馏水洗涤后再用20ml0.2mol/l，pH9.5 Na2CO3缓冲液洗涤, 抽干后偶联。 6. 鸡卵粘蛋白与活化的载体Sepharose-4B 偶联

将已活化好的Sepharose-4B 转移到三角瓶中。用10ml0.2mol/L，pH=9.5Na2CO3缓冲液将上述制备好的20ml 卵粘蛋白溶解，溶液全部转移到三角瓶中与活化好的Sepharose4B 偶联。在4℃恒温摇床振荡24小时左右。偶联终

止后，将凝胶倒入玻璃烧结漏斗中抽干并用100ml0.5mol/LNaCl溶液洗去未偶联上的蛋白（收集滤液，测蛋白含量以计算偶联蛋白量）, 再用100ml 蒸馏水淋洗。接着用50ml 亲和洗脱液（0.1mol/L甲酸—0.5mol/LKClpH=2.5）淋洗。最后用蒸馏水洗至中性，浸泡于亲和柱平衡（0.05mol/LCaCl2-0.1mol/LpH=7.8Tris-HCl缓冲液）中，放冰箱待用。 7. 亲和层折纯化胰蛋白酶

取层折柱一支，柱内装入1/4体积的亲和柱平衡液，亲和吸附剂一次装入柱内，自然沉降，调好流速(2-4ml/min)，亲和柱平衡液洗至流出液在检测仪上绘出稳定基线，测定其OD 值小于0.02即可。将胰蛋白酶粗提液pH 调至8.0，过滤，取清液上柱吸附，亲和柱平衡液流至流出液在检测仪上绘出的曲线回归到原来基线水平，测定的OD 值小于0.02即可。用亲和柱洗脱液洗脱，收集胰蛋白酶峰，测胰酶的比活及含量。 整个实验流程为： 鸡蛋清 Spharose4B ↓ ↓ 提取 活化 ↓ ↓ 分离纯化 ↓ ↓ ↓

纯卵粘蛋白(CHOM)→ ←活化Spharose4B ↓ 偶联 ↓

CHOM-Spharose4B→←胰蛋白酶提取液 ↓ 亲和层析 ↓

酶促动力学←纯胰蛋白酶→酶含量、活性测定

四．实验结果

1. 鸡卵黏蛋白浓度值

将稀释6倍测得A 280nm =0.965代入公式： 鸡卵黏蛋白浓度（mg/ml）=

A 280nm *稀释倍数

≈14.02mg/ml，要获得的浓度值在

0. 413

0.2mg/ml，则需要再稀释10倍，测定A 280nm =0.100，鸡卵黏蛋白浓度为0.242mg/ml

?A 253nm /min

，则未加抑制剂的胰蛋白酶的?

0. 001

A 253nm /min=(0.232-0.022)/(4*0.001)=52.5BAEE (2)胰酶比活性（BAEE/mg）

(1)胰蛋白酶活性（BAEE ）=

=

胰蛋白酶活性52. 5

*2. 5=9722BAEE/mg =

胰酶浓度*酶体积0. 27mg /ml *0. 05ml

(3)鸡卵黏蛋白比活性（胰蛋白酶BAEE/mg）=

?A 253nm /min (未加入抑制剂的胰蛋白酶的) -?A 253nm /min (加入抑制剂的胰蛋白酶的)

0. 001*抑制剂的浓度*抑制剂的体积

（0. 232-0. 022）*2. 5/4-0. 043-(-0. 117) /4==7520BAEE/mg

0. 001*0. 242*0. 05

3. 偶联蛋白量

偶联蛋白含量

=14.02mol/L*20ml-(0.171*117ml/0.413+1.348*52ml/0.413)=62.23mg

4. 酶蛋白含量、比活性测定 （1）亲和层析分离胰蛋白酶层析图

（2）4min 内测得的OD 值

测定的酶蛋白OD 280=0.767，则浓度=0.767/1.35=0.568mg/ml 酶蛋白含量=0.568mg/ml*22ml=12.5mg

胰蛋白比活性=（0.275-0.021）/(4min*0.001*0.568*10μl*10-3)=11180BEAA/mg 五．数据分析与讨论

（1）鸡卵黏蛋白的浓度约为14.02mg/ml，选用的是稀释6倍得出值，这与稀释60倍反推浓度值是不一样的，存在着实验误差。在测定鸡卵黏蛋白抑制比活性值时，加入抑制剂得到的OD 值随时间t 变化曲线性不好，在60s 有一个很大的波动，同时在4min 的时刻，从曲线中看不出反应是否结束，所以我觉得应该舍弃60s 之前的数据，将时间控制在1.5min-5min 范围内得到的才能更好的反应它的鸡卵黏蛋白抑制比活性值。通过观察未加抑制剂的胰蛋白酶与加抑制剂的胰蛋白酶的OD 值曲线，可以看出两条曲线斜率相近，表现出抑制效率在该时间段内是相等的。

（2）在鸡卵粘蛋白与活化的载体Sepharose-4B 偶联终止淋洗阶段，洗脱液洗脱之后的滤液测定的OD 值为0.000，说明洗脱效果显著。得到的偶联蛋白含量为62.23mg ，偶联率为62%，偶联效果还不错。

（3）亲和层析分离胰蛋白酶层析图中出现了两组峰值，第一是杂蛋白的洗脱峰，而需要测定胰蛋白需要收集的是第二个洗脱峰。层析效果较好，则收集到的蛋白纯而含杂质较少。测定胰蛋白比活性的OD 值随时间t 变化曲线性较好，说明加的酶（10μL ）和抑制剂(2.99ml)的用量合适。我们组刚开始加的酶量为15μL ，反应很快达到平衡，曲线斜率高。通过这个变化可知，在测定胰蛋白酶活性及抑制剂抑制活性时，应注意酶和抑制剂的用量，若酶用量较大，则反应很快达到平衡，动力学曲线斜率高；反之，若用量小，则反应缓慢，达到平衡所需时间较长，动力学曲线斜率低。同理，抑制剂用量过大，则很快抑制了酶的活性；反之，则酶活性下降很少，动力学曲线会产生较大的偏差。通过实验数据可知亲和层析法得到的纯胰蛋白酶比活可达1.118*104BAEE 单位/mg，纯化效率为10倍以上，获得的胰蛋白酶纯度高。

（4）pH 值及温度的调控在本实验中至关重要，因为鸡卵黏蛋白和胰蛋白酶都是蛋白质分子，对pH 值和温度都有相应的耐受区间。比如胰蛋白酶应保存在4℃冰箱中，用时迅速拿出，取样后再迅速放入，才能尽量避免失活。同时pH 值不能小于2，否则易引起酸变性，pH 大于5时开始表现一定的活性；pH7.6时，表现活性；pH8.0时，活性最高；当pH 大于8．5时，酶活性反而降低，这是困为胰蛋白酶在碱性条件下水解自溶的缘故。所以在每一个步骤当中，都需控制好溶液的pH 值及温度。才能保证实验的顺利进行。

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