小刀29860943
范文一：多功能原生质体融合菌株的构建
多功能原生质体融合菌株的构建
作者：湖南农业大学来源：湖南农业大学时间：2009-01-07
项目负责人：谭周进
完成单位：湖南农业大学
项目来源及编号：省教育厅青年项目（05B029）
成果简介：
一、研究背景
微生物广泛应用于农业、工业、医药、食品及环保等各个领域。迄今其应用多采用纯培养方式,即一种菌单独培养以获取有用物质。人类对微生物的利用经历过天然混合培养到纯种培养两个阶段,纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面,能够不受干扰地对单一目的菌株进行研究,从而丰富了我们对微生物形态结构,生理和遗传特性的认识。但是,在长期的实验和生产实践中，人们不断地发现很多重要生化过程是单株微生物不能完成或只能微弱地进行的，必须依靠两种或多种微生物共同培养完成，在自然界更为常见的是多种微生物混合培养。随着微生物应用技术的广泛开展，微生物培养技术也显得越来越重要。 在活菌制剂的应用方面，人们希望一种产品能够行使多种功能，解决多方面的问题，许多产品都是由多种微生物组成。目前，这类产品的生产形式上，一般采用将单一菌种分开培养，然后将多种菌的培养物混合在一起，组成多菌种多功能产品。这种生产方式，要求每种菌使用一次发酵罐，要求生产设备投资较大，能耗较高，大大提高了生产成本。现代发酵技术已建立了多菌种混合发酵技术，但该技术生产过程也较复杂，难以保证产品中各菌种的数量协调。应用微生物育种技术中的微生物原生质体融合技术，设法将不同功能的菌种通过原生质体融合技术构建多功能单一菌种，能够达到单一菌种多功能的效果，对于降低多功
能微生物产品的生产成本,增加效率,在实际应用中很有意义。
二、研究方法与步骤
1．菌体培养
斜面上挑取少量KR和B13菌种，分别接种至含50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 ml三角瓶中，37 ℃，150 r/min活化12 h；取1 mL活化后的培养液接种至新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基，KR在37 ℃，
150 r/min条件下培养16 h，B13在37 ℃，150 r/min条件下培养12 h。
2．两菌株生长曲线的测定
分别将活化12 h的两菌株牛肉膏蛋白胨发酵液1 mL移至100 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基，摇匀，取12支无菌大试管，每支加入5 mL，37 ℃，150 r/min培养，两小时取样一次，测定A600 nm下的吸光
度。
3．酶解前计数
分别将两菌种发酵液3000 r/min离心5 min，除去杂质，取上清，摇匀，取1 mL用装有9 mL无菌水的大试管依次稀释到合适浓度，各吸0.1 mL分别涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板，37 ℃培养24 h，计数为
A。
4．原生质体制备
将离心后除去杂质的KR上清液与pH 8.0，1.2 mol/L蔗糖的高渗溶液按1：1混合，加入一定量溶菌酶，使溶菌酶浓度为8 mg/mL，37 ℃，150 r/min酶解80 min；将离心后除去杂质的B13上清液与pH 7.0，0.6 mol/L NaCl的高渗溶液按1：1混合，加入一定量溶菌酶，使溶菌酶浓度为6 mg/mL ，37 ℃，150 r/min酶解45 min。期间用血球计数板在光学显微镜下观察原生质体形成情况，隔20或15 分钟取样一次，用无
菌水稀释成合适浓度后涂布牛肉膏蛋白胨固体平板计数B。原生质体得率即为：（A-B）/A%
5．酶浓度对原生质体制备的影响
分别将酶解体系中溶菌酶的浓度调至2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL，按上述方
法制备KR的原生质体，平板计数法计算原生质体得率。
分别将酶解体系中溶菌酶的浓度调至2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL，按上述方法制备B13的原生质体，
平板计数法计算原生质体得率。
6．酶解时间对原生质体制备的影响
按上述方法制备KR和B13的原生质体。KR分别酶解20 min、40 min、60 min、80 min及100 min，平板计数法计算KR原生质体得率； B13分别酶解15 min、30 min、45 min、60 min，平板计数法计算
B13原生质体得率。
7．菌龄对原生质体制备的影响
分别取在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养12 h、16 h和20 h的KR和B13菌体制备原生质体，按上述
方法。平板计数法计算KR和B13原生质体得率。
8．稳定剂对原生质体制备的影响
分别将离心后的KR和B13发酵液与含0.8 mol/L，1.2 mol/L，1.6 mol/L的NaCl，蔗糖，葡萄糖，D-果糖的磷酸缓冲液1：1混合，按上述方法制备KR和B13的原生质体，平板计数法计算KR和B13原生
质体得率。
9． pH值对原生质体制备的影响
分别用pH值为5、6、7、8、9的磷酸缓冲液作为反应体系，按上述方法制备KR和B13的原生质体，
平板计数法计算KR和B13原生质体得率。
10．原生质体制备和再生
分别将两菌种发酵液3000 r/min离心5 min，取上清，摇匀。将KR上清液与pH 8.0， 1.2 mol/L蔗糖的高渗溶液按1﹕1混合，加入溶菌酶，使酶浓度达到8 mg/mL，37 ℃，150 r/min酶解80 min；将B13上清液与pH 7.0，0.6mol/L NaCl的高渗溶液按1﹕1混合，加入溶菌酶，使酶浓度达到6 mg/mL ，37 ℃，
150 r/min酶解45 min。
将原生质体酶解液1500 r/min离心10 min，去上清，用一定量SMM保存原生质体沉淀，轻轻摇匀，制成原生质体悬浮液。取1 mL SMM原生质体悬浮液用水依次稀释到合适浓度后，分别接种至原生质体再生培养基，采用夹层培养方式，为未酶解的细胞B；另取1 mL SMM原生质体悬浮液用SMM稳定剂依次稀释
到合适浓度后，涂布平板计数，为再生细胞数C。原生质体再生率=（C-B）/A-B%。
11．酶解时间对两菌株原生质体再生率的影响
KR分别酶解20、40、60和80 min，终止酶解，B13分别酶解15、30、45和60 min，按上述方法再
生两菌株，计算两菌株原生质体再生率。
12．再生方式对两菌株原生质体再生的影响
将KR和B13分别采用不同方式再生。单层培养：含2 %琼脂的再生培养基倒平板，加入原生质体悬浮液0.1mL，涂布再生；夹层培养：下层为再生培基，琼脂含量2 %，除去冷凝水，取原生质体悬浮液0.1mL加到平板上，然后加含琼脂0.8 %的半固态再生培养基5 mL左右，迅速摊步均匀；混合培养：培养皿加入原生质体悬浮液0.1 mL，加入40 ℃含0.8 %琼脂的再生培养基，混匀培养按上述方法再生两菌株，计算
两菌株原生质体再生率。
13．稳定剂对两菌株原生质体再生的影响
分别以0.4 mol/L NaCl；0.6 mol/L NaCl；0.8 mol/L NaCl；0.4 mol/L蔗糖；0.6 mol/L蔗糖；0.8 mol/L蔗糖；0.4 mol/L葡萄糖；0.6 mol/L葡萄糖；0.8 mol/L葡萄糖；0.4 mol/L D-果糖；0.6 mol/L D-果糖；0.8 mol/L D-果糖作为KR和B13再生培养基中的稳定剂，按上述方法再生两菌株，计算原生质体再生率。
14．Ca2+对两菌株原生质体再生的影响
再生培养基中分别添加0.01 mol/L、0.02 mol/L、0.03 mol/L、0.04 mol/L CaCl2，按上述方法再生两菌
株，计算原生质体再生率。
15．Mg2+对两菌株原生质体再生的影响
再生培养基中分别添加0.01 mol/L、0.02 mol/L、0.03 mol/L、0.04 mol/L MgCl2，按上述方法再生两菌
株，计算原生质体再生率。
16．L-色氨酸对两菌株原生质体再生的影响
再生培养基中分别添加0 mol/L、0. 1 mol/L、0. 2 mol/L、0.03 mol/L L-色氨酸，按上述方法再生两菌株，
计算原生质体再生率。
17．再生培养基放置时间对两菌株原生质体再生的影响
将再生培养基倒人平皿中，在37 ℃烘箱中分别放置24 h、48 h、72 h后涂布原生质体悬液再生，按上述
方法再生两菌株，计算原生质体再生率。
18．融合子筛选及遗传稳定性鉴定
将KR和B13两菌株原生质体SMM悬液按体积比1：1混合，轻轻混匀，3000 rmp/m离心10 min，去上清，菌体沉淀加入一定量浓度为40 %的PEG 5000融合液，38 ℃水浴静置3 min，用装有9 ml SMM的大试管稀释到适当浓度，每个含氯霉素和硫酸妥布霉素（为筛选的抗性标记）的筛选平板滴加0.1 mL，用涂棒轻轻涂布均匀，采用夹层培养法，37 ℃培养48—120 h，将长出的菌落分离、纯化，挑选单菌落，用牛肉膏蛋白胨斜面保存。每个处理做3次重复，每次涂布20个平皿，计算每种处理融合子总数。并在
含有双抗生素的融合子筛选培养基上传代培养以鉴定其稳定性。
19．融合子的特性研究
通过细菌形态学与生理生化方法研究融合子的细菌学特征,并且利用平板对峙法研究研究融合子的抑菌
功能。
三、研究的主要内容与结论
本课题选育了对白菜软腐菌有较好抑制效果的芽孢杆菌KR和对白菜黑斑病菌有较好抑制效果的假单胞菌B13，然后以此二菌为出发菌株，对二者的原生质体制备、融合、再生和筛选进行了研究，构建了融合子KB1，并对其进行了形态结构、生理生化以及对白菜软腐菌和白菜黑斑病菌的抑制作用研究，其主要结
果如下：
1、选育了对白菜软腐菌有较好抑制效果的芽孢杆菌KR和对白菜黑斑病菌有较好抑制效果的假单胞菌B13，并且对其相关特性与效果进行了研究，培养硕士生1名（贺小香，大白菜软腐病菌的拮抗内生细菌
的筛选及其拮抗作用的研究，2006年）；
2、进行了芽孢杆菌KR和假单胞菌B13原生质体制备酶解时间与浓度、稳定剂、菌龄、pH值等因素对革兰氏阳性菌株芽胞杆菌KR和革兰氏阴性菌株假单胞菌B13的原生质体制备影响的研究，结果表明：在以0.6 mol/L蔗糖为稳定剂，pH 8.0，溶菌酶浓度8 mg/ml，37 ℃，酶解80 min的条件下，芽胞杆菌KR原生质体得率为31.6%；在以.0.6 mol/L NaCl为稳定剂，pH 7.0，溶菌酶浓度6 mg/ml，37 ℃，酶解45 min
假单胞菌B13原生质体得率最高，为95.2%；
3、对影响革兰氏阳性菌株芽胞杆菌KR和革兰氏阴性菌株假单胞菌B13的原生质体再生的因素进行了研究，结果表明：对KR酶解20 min，采用夹层培养，再生培养基中加入0.6 mol/L蔗糖，0.03mol/L Ca2+，0.02 mol/L Mg2+，0.3 mol/L琥珀酸钠，0.2 g/L L-色氨酸，培养基在37 ℃下放置72 h，原生质体再生率可达42.7 %；对B13酶解15 min，采用夹层培养，培养基中加入0.6 mol/L NaCl，0.02 mol/L Ca2+，0.01 mol/L Mg2+，0.3 mol/L琥珀酸钠，0.1 g/L L-色氨酸，培养基在37 ℃下放置48 h，原生质体再生率
可达15.3 %；
4、对芽孢杆菌KR和假单胞菌B13的融合及融合子筛选进行了研究，结果表明：2.0 单位/mL的硫酸妥布霉素和5×10-3 g/mL的氯霉素可分别抑制B13和KR，培养基中添加这两种抗生素可选出融合子。通过PEG法制备KR和B13原生质融合子，本试验共得到182个融合子，连续传10代后，得到一株能稳定遗
传的融合子KB1；
5、对融合子KB1的研究表明：KB1杆状，长2.99μm，宽0.45 μm，周生鞭毛，有芽孢，革兰氏染色阴性。在NA培养基中添加KB1经35 ℃，pH 6.5，60 h发酵的滤液，用平板打孔法，置于平板的孔内，对软腐菌产生了1.70 cm的抑菌圈；在PDA培养基中按10 %的量添加KB1经35 ℃，pH 6.5，60 h发酵
的滤液，黑斑病菌饼生长8 d后大小仅为1.61 cm，明显小于对照。
以上2-5的内容培养硕士生1名（郑重谊，白菜病害生防多功能工程菌株的构建，2007年）。
四、主要研究成果
本课题利用原生质体融合技术，成功构建了同时对白菜软腐菌和白菜黑斑病菌有拮抗作用的芽孢杆菌和
假单胞菌属间融合子，融合子保留了亲本的优良特性，能够稳定遗传；
发表相关论文5篇，其中全国性科技期刊4篇；
培养了硕士研究生2名。
范文二：原生质体的制备
实验六 原生质体的制备
一、实验目的
原生质体是除去细胞壁的裸露细胞,在离体培养条件下,具有再生新壁、连续进行细胞分裂并再生完整植株的能力。由于消除了细胞壁的障碍，故是遗传育种、基因转化的好材料。本实验学习和掌握酶解法脱除植物细胞壁、获得原生质体的方法。
二、实验用具和药品
1. 实验用具:离心机、离心管、超净工作台、滤器、400目尼龙网、培养皿、血
球计数板、移液管等。
2. 药品试剂:
? 预处理液:在蒸馏水中加入1 mmol/L NH4NO3，0. 1mmol/L CaCl2?2H2O
及10mg/L头孢霉素，抽滤灭菌后备用。
? 酶液:CaCl2?2H2O 0.4mg/m1，2-N-吗琳乙磺酸(MES)1 mg/ml，甘露醇
11% ，纤维素酶(Onozuka R-10) 1.5%，果胶酶0.5%，离析酶(OnozukaR-10)
0. 4 %，半纤维素酶0.2%，用蒸馏水定容，PH5.8，抽滤灭菌后备用。
? 清洗液:KH2PO4 27.2mg/L，KNO3 101.0mg/L，CaCl2?2H2O 1480.0mg/L，
MgSO4?7H2O 246 .0mg/L，甘露醇11%，用蒸馏水定容，PH5.8，抽滤灭
菌后备用。
三、实验材料
丹参组培苗叶片。
四、实验方法
(1)表面灭菌:
(2)预处理:将丹参组培苗叶片分别置于盛有一定预处理液的三角瓶中，在摇床上振荡8-24h，速度为110r/min，温度25?。
(3)酶液处理:将预处理过的叶片切成约0.5mm3的小块，分别置于盛有适量无菌水的三角瓶中振荡清洗30min，去掉无菌水后，加入酶液，1g材料加入10ml酶液。将三角瓶在28,30 ?下，暗中静置8,10h，然后过400目滤网，将滤液在700r/min条件下离心，弃上清，用清洗液反复清洗3次，最后定容记数，并拍照。
五、结果与分析
1、验拍照所得如下图，制备好的原生质体
(1)上图为原生质体，位于中间下方的一淡黄色小点为原生质体，以及其右上方一团淡黄绿原生质体。
(2)由于数量不足，只能观察，不予计算。
(3)分析原因:材料不足，即所得丹参原生质体不足，可能是酶液解离不够，
也可能是稀释过度，还有可能是制片时制的不好。
2、实验总结
(1)要确保酶液的活性和合适的量
(2)叶片量要足，且剪切的足够小;
范文三：原生质体的制备
拟南芥原生质体转化实验
每次做大反应（用于CO-IP）最多做8管，每管需3 ml 原生质体溶液，浓度为106 ，10 ml 酶液需要40片叶子。小反应用于用于做蛋白定位，每管需200 μl 原生质体溶液
叶片的选取：，取刚刚完全展开，叶面光滑，非凹凸不平的，最上面最中间的叶片，依次向下选取，取瘦长的，叶缘尖锐的叶片为佳。每四棵苗取8-10片叶子。
1． 打开水浴锅，TM=55oC
2. 配40 ml酶解液 (8种试剂)
Cellulose R10 0.6 g 不要粘在管壁上
Macrozyme R10 0.16 g
Mannitol(4 oC) 20 ml
KCl 0.4 ml
MES 4 ml
55 oC，10 min(严格，前边摇2-3次，待管壁不再粘有酶，溶液澄清就不用摇) 待酶液自然降至室温，加入0.4 mL CaCl2 母液以及15.2 mL DDW ，0.04 g BSA，放置于
3． 将0.4 M mannitol 滴至一次性培养皿上，将叶片切成细丝，一刀一刀断开切，忌来回蹭。
4． 23 oC酶解2 h (或3 h，放置时间较长的酶液)，40 rpm。收获前75 rpm，摇1 min。
5． 配PEG 100 ml 用 Mannitol(4 oC)
PEG 4000 40 g
DDW 30 ml
Mannitol 25 ml
CaCl2 10 ml
6． 提前将BD 50 ml 离心管置于冰上，尼龙膜过滤收集原生质体，100 g，3min，23 oC，升速3，降速3离心
7． 用5 ml 大枪头吸除酶液，原生质体多则把酶液吸净，少则留一点酶液，加入W5 10-20 ml （依量而定）洗涤。100 g，3min，23 oC，升速3，降速3离心
8． 吸去上清，再加入W5 20 ml，轻摇离心管重悬原生质体。100 g，3min，23 oC，升速3，降速3离心。
9．加入3-9 ml Mmg重悬,使原生质体浓度达到106，冰上放置。
10．取50 ml离心管（大反应），每管加入120 μg 质粒/每一种，然后用枪吸打混匀，阴性对照加一种质粒，然后用水补齐使总体积一致，然后用枪吸打混匀。冰上放置。
11． 50 ml离心管中加入3 ml 原生质体溶液，沿管壁缓慢加入，充分摇匀。
12． 每次室温摇匀后随即每50 ml离心管加入3 ml PEG溶液，轻柔颠倒混匀，不要有PEG溶液一点一点，而应是充分均匀的溶液。加完PEG后每管室温放置6 min。（PEG刚加入时要分层，否则转化效率不好）。
13． 好的情况下，6 min后不应看见有沉渣。加入室温W5 10-12 ml ，马上混匀，终止反应。盖子一定不要盖得太紧，100 g，3min，23 oC，升速3，降速3离心。
14． 用5 ml 枪吸除上清，留约5 ml ，再加入10 ml W5，100 g，3min，23 oC，升速3，降速3离心。
15． 用5 ml 枪吸除上清，留约1-2 ml ，再加入10 ml W5，倾斜放置于白色白炽灯下，液体不要粘在盖子上，用一张白纸遮盖住(光不要太强)，放约10-12 h，然后进行后续试验。
范文四：原生质体的制备
原生质体的制备
稳渗剂:0.6 mol/L甘露醇, 121 ℃高温高压灭菌 20 min后备用。
2%溶壁酶:在无菌操作台中称取溶壁酶(广东省微生物研究所生产) ,加入 灭菌过的稳渗剂(甘露醇 0.6 mol/L) ,最终使酶液浓度达到 2%,再用 0.22 μm 滤膜过滤除菌待用。
(观察锁状联合)乳酸石炭酸棉蓝染色液:石炭酸 10 g,棉蓝 0.02 g,甘油 20 mL,乳酸 10 mL,蒸馏水 10 mL,将石炭酸加入蒸馏水中加热融化,之后加 入乳酸和甘油,最后加入棉蓝,溶解备用。
原生质体制备
(1)将杏鲍菇菌丝接种于固体 PDA 培养基中, 25℃培养 5-7 d。
(2)活化后的菌丝接入液体 PDA 培养基中, 25℃, 120 rmp摇床培养 5-6 d。
(3)将菌丝球倒入 50 mL 离心管中, 10000 rpm 离心 10 min ,倒去上清液, 再用无菌水、甘露醇各离心清洗一次。
(4)用灭菌滤纸吸干菌丝水分, 称取 0.2 g 菌丝放入 10 ml 离心管中, 再加入 2 mL 2%浓度的溶壁酶, 30℃水浴 2-2.5 h,每隔 1 h镜检破壁情况。
(5) 加入 6mL 甘露醇混匀,终止酶解。 800 rpm 离心 5 min ,用移液枪小心 转移上清酶液至新的 10毫升离心管,再用 0.6 mol/L甘露醇离心离心清洗一次 (4000 rpm, 15 min) ,液体再生培养基离心清洗一次(4000 rpm, 15 min) 。
范文五：原生质体的制备
背景：植物原生质体在基因表达调控、基因定位、细胞融合、新品种培育等方面有重要用途，尤其在现如今植物分子生物学领域，拟南芥叶肉细胞原生质体在蛋白亚细胞定位，启动子活性研究以及蛋白间体内互作方面有着广泛的应用。但是，诸多因素影响植物原生质体的制备和活力，传统的方法：利用刀片快速地将叶片切成非常细的小条来收集原生质体，不但会造成细胞死亡，并且效率很低。 方法改进：寻找市面上粘力较强的胶布，经过比较，电工用的那种塑料胶布效果较好。首先将叶片上表面依次逐一粘在胶布上，再取相同大小的一块胶布粘在叶片下表面上。轻轻按压，使它们紧紧粘合。然后用手揭起胶布一角，快速使两个粘合的胶布分离，这时会发现叶片的下表皮已被胶布顺带揭下。最后将带有叶肉细胞的胶布放入酶液中酶解分离原生质体。
结果：由于叶肉细胞都在叶片表面，并且未收到什么机械损伤，在酶解液中很容易分离。产量大，效率高。
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