阴隐淫音
范文一：线粒体的分离与观察
线粒体的分离与观察
一、实验目的
1. 初步掌握用差速离心法分离大鼠肝细胞线粒体的方法。
2. 学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。
二、实验原理
线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体时，可将组织匀浆液悬浮在悬浮介质中进行差速离心法进行分离。在一定的离心场中(选用离心机的一定转速)，大小不一的颗粒沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在—定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4?，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
三、实验用品
(一) 材料 小鼠12 只
(二)器材 冷冻高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼龙网、玻璃匀浆器、PH 计、高压灭菌锅等。
(三)试剂 氯化钠、詹纳斯绿B、盐酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、D(十)蔗糖、 甲醇、冰醋酸、双蒸水、甘油、姬姆萨染料、KH2PO4 、Na2HPO4。 1(0.9%灭菌的生理盐水。
2. 1%詹纳斯绿B 染液，用0.9%灭菌的生理盐水配制。
3. 0.25mol/L 蔗糖十0.01mo1/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4):
0.1mol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10ml
0.1mol/L 盐酸8.4ml
加重蒸水到100ml
加蔗糖到0.25mol/L。
4. 0.34mol/L 蔗糖十0.01mol/L tris-盐酸缓冲液(pH7.4)
5. 固定液:甲醇:冰醋酸(9:1)
6. 姬姆萨染液(原液):Giemsa 粉0.5g，甘油33m1，纯甲醇33m1。先将Giemsa 粉置于研钵内中，加少量甘油研磨至无颗粒，再将剩余甘油倒入混匀，56?左右保温2h 令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。
7. 姬姆萨染液(应用液):临用时，吸出1ml 原液，用9ml 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)作l0 倍稀释。
8. 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.8):
l/15mol/L KH2PO4 50ml
l/15 mol/L Na2HPO4 50ml
四、实验操作
1. 制备小鼠肝细胞匀浆实验前小鼠空腹12h，拉颈处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0,4?的0.25mol/L 缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0,4?条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L 缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加。匀浆液用200 目铜筛过滤备用。
2. 离心先将9ml 0.34mol/L 缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入9ml 肝匀匀浆使其覆盖于上层。用冷冻高速离心机按图图4-3 顺序进行差速离心。差速离心提取鼠肝线粒体流程见图4-3。
3. 分离物鉴定
(1) 细胞核取细胞核沉淀1 滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴1 滴姬姆萨染液应用液染色10min。自来水冲洗，吹干，镜检。结果:细胞核呈紫红色，上面附着的少量胞质及浅蓝色碎片。
(2) 线粒体取线粒体沉淀1 滴涂片，滴加1%詹纳斯绿B 染液染20min，覆上盖玻片，镜检。线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
五、实验建议
1. 注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。最好在在0,4?或冰浴中进行。
2. 将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防匀浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。
3. 姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应用液不可使用。
六、实验报告及作业
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0,4?进行,
2. 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题,根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。
3. 分离介质0.25mol/L 及0.34mol/L 缓冲蔗糖溶液哪一种在下层? 有什么作用?
范文二：线粒体的分离与观察
一． 了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。了解提取线粒
体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般
形态，增加对线粒体的感性认识。掌握詹娜斯绿B染线粒体的方法。
掌握用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。掌握詹娜斯绿B染线粒体
的方法。
：蔗糖密度梯度离心加样操作技能。
：讲解原理、实验操作示范或具体指导。
:
制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心。
在一给定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在
均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种cell器及其它内食物，由于沉降速度不同将
停留在不同的位置。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶
液，它比较接近细胞的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法，詹纳斯绿B是对线粒体专一的活细胞染料毒性很小，属
于碱性染料，解离后带正电，由此吸引堆积在线粒体膜上，线粒体 cell色素氧化酶，使该料保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
1．匀浆:取1g肝细胞，剪碎，加9ml、0.25ml/L缓冲蔗糖液匀浆(先加2ml匀浆, 匀浆后再
加7ml)，双层尼龙布过滤于10ml试管中备用。
2．差速离心：取1ml 0.34mol缓冲蔗糖液于2ml刻度离心管中(用滴管加至1ml刻度即可)，
然后沿管壁小心加入肝匀浆，约0.5ml覆盖于上层，700×g (3000rpm)离心10分钟，弃
沉淀取上清液，10000×g (12000rpm)离心10分钟，沉淀为线粒体。
3．染色：取线粒体沉淀涂片
(注意勿太浓密), 不待干即加1滴1%詹纳斯绿B染色15min。
4．观察：盖上盖玻片，显微镜观察。（线粒体蓝绿色，呈小棒状或亚铃状。）
1
线粒体蓝绿色，呈小棒状或亚铃状。
根据学生的实验结果进行总结。
如果使用不带冷冻控温的普通高速离心机操作，应尽量缩短操作时间、注意样品的冷冻，保持
其生理活性。
2
范文三：线粒体的分离与观察
细胞生物学实验教案 邵邻相
实验八 线粒体的分离与观察
一( 教学目标:了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。了解提取线粒
体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般
形态，增加对线粒体的感性认识。掌握詹娜斯绿B染线粒体的方法。 二(重点:掌握用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。掌握詹娜斯绿B染线粒体
的方法。
三(难点:蔗糖密度梯度离心加样操作技能。
四(授课方式与教学方法:讲解原理、实验操作示范或具体指导。 五(教学内容:
实验原理
制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心。
在一给定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种cell器及其它内食物，由于沉降速度不同将停留在不同的位置。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法，詹纳斯绿B是对线粒体专一的活细胞染料毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由此吸引堆积在线粒体膜上，线粒体 cell色素氧化酶，使该料保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
实验步骤
1(匀浆:取1g肝细胞，剪碎，加9ml、0.25ml/L缓冲蔗糖液匀浆(先加2ml匀浆, 匀浆后再
加7ml)，双层尼龙布过滤于10ml试管中备用。
2(差速离心:取1ml 0.34mol缓冲蔗糖液于2ml刻度离心管中(用滴管加至1ml刻度即可)，
然后沿管壁小心加入肝匀浆，约0.5ml覆盖于上层，700×g (3000rpm)离心10分钟，弃
沉淀取上清液，10000×g (12000rpm)离心10分钟，沉淀为线粒体。
3(染色:取线粒体沉淀涂片(注意勿太浓密), 不待干即加1滴1%詹纳斯绿B染色15min。
4(观察:盖上盖玻片，显微镜观察。(线粒体蓝绿色，呈小棒状或亚铃状。)
1
细胞生物学实验教案 邵邻相 实验结果
线粒体蓝绿色，呈小棒状或亚铃状。
结果讨论
六(课堂小结
根据学生的实验结果进行总结。
如果使用不带冷冻控温的普通高速离心机操作，应尽量缩短操作时间、注意样品的冷冻，保持其生理活性。
2
范文四：线粒体的提取与染色观察
线粒体的超活染色
一）实验目的：
1. 观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。
2. 学习一些细胞器的超活染色技术。
二）实验原理：
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类，体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学“特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用；一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等) 的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。
三）实验用品：
一、器材
显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿，吸管、牙签、吸水纸。
二、试剂
1、Ringer 溶液
2、1％、1／5 000詹纳斯绿B 溶液
四）实验步骤：
1、用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织一小块，放入表面皿内。用吸管吸取Ringer 液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。
2、在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加1／5 000詹纳斯绿B 溶液，再将肝组织块移入染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成（一般需染20—30min ）。
3、吸去染液，滴加Ringer 溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。
4、在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有l 一2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。
五）实验结果与分析：
图：
六）注意事项：
范文五：细胞器线粒体的分离与观察
细胞器线粒体的分离与观察
高熹 1120152430(李安一)
(北京理工大学生命学院 16121501班)
摘要:差速离心法是交替使用低速和高速离心, 用不同强度的离心力使具有不同 质量的物质分级分离的方法。 此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的 分离。 离心分离出细胞核与线粒体, 进行染色, 对细胞核和线粒体的形态进行观 察并记录。
关键词:差速离心法;细胞核;线粒体;实验。
1 引言
差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。 起始 的离心速度较低, 让较大的颗粒沉降到管底, 小的颗粒仍然悬浮在上清液中。 收 集沉淀,改用较高的离心速度离心悬浮液,将较小的颗粒沉降,以此类推,达到 分离不同大小颗粒的目的。
线粒体是真核细胞特有的, 司能量转换的重要细胞器。 细胞种的能源物质— —糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化,并通过偶联磷酸华生成 ATP ,供 给细胞生理活动之需。 对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行 的。
制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。 在一给定的离心 场中(对于所使用的离心机,就是选用一定的转速) ,球形颗粒的沉降速度取决 于它的密度、 半径和悬浮介质的粘度。 在一均匀悬浮介质中离心某一时间内, 组 织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位 置。 依次增加离心力和离心时间, 就能使这些颗粒按其大小、 轻重分批沉降在离 心管底部,从而分批收集。细胞器中最先沉降的是细胞核,其次是线粒体,其他 更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液, 它比较接近细胞质的分散相, 在一定程度 上能保持细胞器的结构和酶的活性, 在 pH7.2的条件下, 亚细胞组分不容易重新 聚集,有利于分离。整个操作过程应注意样品保持 4,避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿 B (janus green B)是对线粒 体专一的活细胞染料,毒性很小,属于碱性染料,解离后带正电,由电性吸引而 堆积在线粒体膜上。 线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿 色从而使线粒体显色,而胞质中的染料被还原成无色。
Giemsa 染液为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物,本染色液最适于血液涂 抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色。染前用蛋 白酶等进行处理, 然后再用姬姆萨染液染色, 在染色体上, 可以出现不同浓淡的 横纹样着色。 姬姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色, 胞浆染成粉红色, 在 光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。
2 实验器材及材料
2.1 实验材料
大鼠肝脏。
2.2 实验仪器
高速离心机,解剖刀剪,小烧杯,冰浴盘,漏斗,尼龙织物,玻璃均浆器。 图 1 玻璃匀浆器
玻璃匀浆器的作用:让玻璃管与柱塞之间微小的缝隙和细微的凹凸咬合 , 将 其柱塞转动时 , 产生碾切作用 , 使生物细胞和其他较硬的细胞组织被轻易的碾碎。
(1)洗干净,烘干,太脏用酸泡洗。
(2)选择合适的匀浆缓冲液 , 配置好。
(3)在冰上匀浆 , 匀的次数依实验样品和目的而定。
(4)匀浆完毕 , 倒出样品。
2.3 实验试剂
(1)生理盐水。
(2) 1%詹纳斯绿 B 染液,生理盐水配制。
(3)蔗糖-Tris 盐酸缓冲液(pH7.4) :0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4) ,0.1mol/L Tris10ml,0.1mol/L盐酸 8.4m, 加重蒸水到 100ml, 加蔗糖到 0.25mol/L。蔗糖为密度梯度离心用 D(+)蔗糖 ,0.34mol/L蔗糖 +0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)配制如上,加蔗糖到 0.34mol/L。
(4)固定液:甲醇-冰醋酸(9:1) 。
(5) Giemsa 染液:Giemsa 粉 0.5g ,甘油 33ml 。先往 Giemsa 粉中加少量甘 油在研钵内,研磨至无颗粒,再将剩余甘油倒入混匀, 56左右保温 2h ,令其充 分溶解,最后加甲醇混匀,成为 Giemsa 原液,保存于棕色瓶中。用时吸出少量 用 1/15mol/L磷酸缓冲液作 10~20倍稀释。 1/15mol/L磷酸缓冲液(pH6.8) :
1/15mol/L KH 2 PO
4
50ml,1/15mol/L Na
2
HPO
4
50ml 。
3实验步骤
(1)制备大鼠肝脏细胞匀浆
实验前大鼠空腹 12h ,击头处死,剖腹取肝,迅速用生理盐水洗净血水,用 滤纸吸干。称取肝组织 1g ,剪碎,用预冷到 0~4°C 的 0.25mol/L缓冲蔗糖溶 液洗涤数次。然后在 0~4°C 条件下,按每克肝加 9ml 冷的 0.25mol/L缓冲蔗糖 溶液将肝组织匀浆, 蔗糖溶液分数次添加, 匀浆用双层尼龙织物过滤备用。 注意 尽可能先充分剪碎肝组织, 缩短匀浆时间, 整个分离过程不宜过长, 以保持组分 生理活性。
(2)先将 9ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管,然后沿管壁小心的加 入 9ml 肝匀浆使其覆盖在上层。 用冷冻控温高速离心机按照图 2顺序进行差速离 心。
图 2差速离心顺序图
(3)分离物鉴定
细胞核:取细胞核沉淀一滴涂片,在甲醇-冰醋酸溶液中固定 15min ,充分 吹干, 滴 Giemsa 染液 (原液 10~20倍稀释) 染色 10分钟。 自来水冲洗, 吹干, 镜检。观察结果。
线粒体:取线粒体沉淀涂片,注意勿太浓密,不待干即滴加 1%詹纳斯绿 B 染液染色 20min ,盖上盖玻片镜检。观察结果。
4实验结果
图 3 细胞核染色观察图
图 4 细胞核染色局部放大图
图 5 线粒体染色观察图
图 6 线粒体染色局部放大图
图 7 借鉴线粒体染色图
5结果分析
图 3和图 4中我们可以清楚的看到分离成单个的被染成紫颜色的细胞核, 易 于辨认。 而在线粒体染色图 5和图 6中, 线粒体染色可能出现了实验失败, 无明 显可辨的染色后的线粒体。 在图 7借鉴的照片中, 我们可以看见成单颗装椭圆形 的线粒体。
6实验反思
本次实验成败关键在于推片,即制作临时涂片时,可取一片载玻片作推片, 将推片自液滴左侧向右侧移动, 使液滴均匀地附着在两片之间。 细胞核的推片和 染色较为成功, 可以观察到较好的结果。 而线粒体组观察较为模糊不清, 分析原 因为,染色时候,滴加染液后只计时,没有时刻保持观察样品,室内温度较高, 导致染色液干结,干结后影响了观察。后来又用清水冲洗玻片,未有明显改善。 综上, 由线粒体染色中较为失败的玻片得出反思, 以后实验耗时较长又无需 操作的步骤不能放任不管, 要时刻观察, 避免出现该次试验中染色液变干这种情 况的发生。
7参考文献
[1]李万杰 , 胡康棣 . 实验室常用离心技术与应用 [J]. 生物学通报 , 2015, 50(4):10-12.
[2]辛华 . 细胞生物学实验 [M]. 科学出版社 , 2001.
[3]王崇英 , 高清祥 . 细胞生物学实验 [M]. 高等教育出版社 , 2011.
