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范文一：紫外分光光度法原理
紫外分光光度法原理，使用范围，仪器的校正，测定方法和注意事项
紫外分光光度法
一、原理
可见光、紫外线照射某些物质，主要是由于物质分子中价电子能级跃迁对辐
射的吸收，而产生化合物的可见紫外吸收光谱。基于物质对光的选择性吸收的特
性而建立分光光度法或称吸收光谱法的分析方法。它是以朗伯??比耳定律为基础。
1
朗伯—比耳定律 A = lg—- = ECL
T
式中 A为吸收度；
T为透光率；
E为吸收系数，采用的表示方法是（E１％１ｃｍ），其物理意义为当溶液浓度
为1%（g/ml），液层厚度为1cm时的吸收度数值；
C为100ml溶液中所含被测物质的重量（按干燥品或无水物计算），g；
L为液层厚度，cm。
二、使用范围
凡具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物，根据在特定吸收波长处所测得
的吸收度，可用于药品的鉴别、纯度检查及含量测定。 三、仪器
可见-紫外分光光度计。其应用波长范围为200～400nm的紫外光区、400～850nm的可见光区。主要由辐射源（光源）、色散系统、检测系统、吸收池、数
据处理机、自动记录器及显示器等部件组成。
本仪器是根据相对测量的原理工作的，即先选定某一溶剂（或空气、试样）
作为标准（空白或称参比）溶液，并认为它的透光率为100％（或吸收度为0），而被测的试样透光率（或吸收度）是相对于标准溶液而言，实际上就是由出射狭
缝射出的单色光，分别通过被测试样和标准溶液，这两个光能量之比值，就是在
一定波长下对于被测试样的透光率（或吸收度）。
本仪器可精密测定具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物、有色物质或在
适当条件下能与某些试剂作用生成有色物的物质。
使用前应校正测定波长并按仪器说明书进行操作。 四、仪器的校正
1.波长的准确度试验
以仪器显示的波长数值与单色光的实际波长值之间误差表示，应在?1.0nm范围内。
可用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm谱线进行校正。
2.吸收度的准确度试验
3.杂散光的试验
4.波长重现性试验
5.分辨率试验
五、测定方法
1.对照品比较法
（1）按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶
液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100?10%，所用溶
剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后，按下
式计算含量，即得。
（2）计算式
×G/稀释倍数×100×1 A样对
含量（%）= ————————————-- ×100%
A×G/稀释倍数×100×1 对样
2.吸收系数法
（1）按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸收度，
再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，应注意仪器的校正和检定。
（2）计算式
A 样
含量（%）= ——————————————- ×100%
G/稀释倍数×(E１％１ｃｍ)×100×1 样对
3.计算分光光度法
采用计算分光光度法应慎重。本法有多种，使用时均应按各品种项下规定的
方法进行。当吸收度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时，波长的微小
变化可能对测定结果造成显著影响，故对照品和供试品测试条件应尽可能一致。
若测定时不用对照品，如维生素A测定法，则应在测定时对仪器作仔细的校正和检定。
六、注意事项
1.空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预先过滤，
并弃去初滤液。
2.测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采
用1cm的石英吸收池。
3.在规定的吸收峰波长?2nm以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确，除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长
?2nm以内；否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度，并以吸收
度最大的波长作为测定波长。
4.一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.3～0.7之间的误差较小。
5.吸收池应选择配对，否则要引入测定误差。在规定波长下两个吸收池的透
光率相差小于0.5％的吸收池作配对，在必要的情况时，须在最终测量扣除吸收
池间的误差修正值。
6.由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减
去空白读数，再计算含量。
7.仪器的接地必须良好，一切裸露的零件对地电位不得超过24伏（测电笔
的氖管不得发亮）。
8.在使用过程中，如需开启试样室盖时或暂时停止测试时，必须及时推入光
门钮杆（使光电管前光门关闭），保护光电管，以防止光电管受强光或长时间照
射而损坏。
9.在测定时或改测其它检品时，应用待测溶液冲洗吸收池3～4次，用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨损）。
10.取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。
使用完后及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾
干后，放入吸收池盒中，防尘保存。
11.若吸收池内外壁沾污，两池差较大的处理。
（1）可用绸布缠在扁竹条外或用脱脂棉缠在细玻璃棒上蘸上乙醇，轻轻摩
擦，再用纯化水冲净。
（2）如上述方法处理不好，必要时可用重铬酸钾-硫酸洗液泡洗1～2分钟，
用自来水冲净，再用纯化水冲净。
（3）不得用毛刷刷洗或硬物拭擦，以防止表面光洁度受损影响正常使用。
12.请务必注意经常保持硅胶的干燥，目的是保护光学元件和光电放大器系
统不致受潮损坏而影响仪器的正常工作，如发现有的硅胶由蓝色变为粉红色，应
立即更换。该仪器干燥剂筒有两个：一个是装在放大器暗盒上，另一个装在单色光器暗盒上。
13.在更换硅胶干燥剂时，应关闭切断电源。
14.在停止工作期间，主机试样室内应放入袋装或筒装硅胶干燥剂。用防尘
罩罩住整个仪器，并在防尘罩内放数袋防潮硅胶。
15.仪器在操作中，狭缝的宽度应从小逐渐开大。若狭缝过大，由于进入光
电管的光能量强度过大，将会使放大器输出信号达到饱和，以至数字显示出溢出
（即数字闪烁或示1不变）。这不是仪器有故障。
16.将波长旋转放在625nm，铗缝关闭在0.02nm附近，选择按键恢复在停止工作部位（即三个键均弹出）。
17.搬动仪器时应搬在主体端，不要搬在试样室和光电管盒端以及光源灯室
部位，以防止仪器狭缝或光路部件受力而发生变形。并在搬动或运输时，应将可
动部分固定，如各旋钮可用胶布贴住，狭缝位置开大些，然后固定，不要关小狭
缝，以免运输时振动使狭缝刀口受损坏。
18.仪器的光栅、反射镜绝对不能擦拭，否则将损坏仪器光学表面，增加杂
散光。
19.仪器经过搬动请及时检查并纠正波长精度，为保证测定的准确性请经常
校准波长精度。如有异常，应立即报告质量保证部，但不得擅自调整，并及时做
好记录。
七、结果计算
A
１％１ｃｍ（供试品） = —— E
CL
E１％１ｃｍ（供试品）
含量（%）= ——————————- ×100%
E１％１ｃｍ（标准值或对照品） 八、允许差
仪器分析方法的误差限度，除另有规定外，其相对偏差应在?(2.0～3.0)
范文二：紫外-分光光度法原理
紫外分光光度计的使用原理和方法
紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS)
1定义:
它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。 2分类:
按所吸收光的波长区域不同:分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。
3、紫外-可见分光光度法的特点:
(1) 其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快;(与其它光谱分析方法相比) (2)灵敏度高;
(3)选择性好;
(4)精密度和准确度较高;
(5)用途广泛。
?1. 紫外-可见吸收光谱
1. 物质对光的选择性吸收
物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是
通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度(吸光度)，以波长为横坐标，吸光谱法的基础。
光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。 在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。
2.有机化合物的紫外-可见吸收光谱
2.1 有机化合物的电子跃迁
与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的σ电子、形成双键的π电子以及未参与成键的n电子。跃迁类型有:σ?σ*、n?σ* 、π?π *、 n?π * 四种。 饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ?σ*，n?σ* 跃迁，
吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。 不饱合机化合物的电子跃迁类型为n?π*，π?π* 跃迁，吸收峰一般大于200nm。 生色团:是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。
助色团:是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，
并且增加其吸收强度。
红移和紫移:
在有机化合物中，常常因取代基的变更或溶剂的改变，使其吸收带的最大吸收波长λmax发生移动。向长波方向移动称为红移(表3-3)，向短波方向移动称为紫移。
2.2 有机化合物的吸收带
吸收带(absorption band): 在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。
(1) R吸收带
(2) K吸收带
(3) B吸收带
(4) E吸收带
3.无机化合物的紫外-可见吸收光谱
1. f电子跃迁吸收光谱
镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的吸收是基于内层f电子的跃迁而产生的。其紫外可见光谱为一些狭长的特征吸收峰，这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影响。 2. d电子跃迁吸收光谱
过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰强烈受
2+配位环境的影响。例如 Cu以水为配位体，吸收峰在794nm处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。此类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。
3. 电荷迁移光谱
某些分子既是电子给体，又是电子受体，当电子受辐射能激发从给体外层轨道向受体跃迁时，就会产生较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。如苯酰基取代物在光作用下的异构反应。
1.4 影响紫外-可见吸收光谱的因素
物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件(温度、溶剂极性、pH等)不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。
1.温度:在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。
2.溶剂 :注意如下几点:
(1)尽量选用低极性溶剂;
(2)能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性;
(3)溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。
3. pH值
1.5 紫外-可见吸收光谱的应用
紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴
定、结构分析。
1.定性分析
2.纯度的鉴定:用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。如蛋白质与核酸的纯度分析中， 可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。
3.结构分析
紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。
?2. 朗伯-比尔定律
一、吸光度和透光度
设入射光强度为I，吸收光强度为Ia, 透射光强度为 I，反射光强度为Ir，则: I= Ia + It + 0t0Ir，由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，上式可简化为: I= Ia + I，透光度:透光度0t为透射光的强度I与入射光强度I之比，用T表示: t0
透射光的强度It
透光度T = ----------------------
入射光强度I0
即 T= It / I 0
1/T I0/It 吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示，即 A = lg= lg
二、朗伯-比尔定律
朗伯-比尔定律:当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即
溶液的吸光度 = A= κ c l
式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。(朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。)
三、吸光系数
当l以cm，c以g/L为单位，κ称为吸光系数，用 a表示。
A= a cl a的单位为L/(g.cm)
吸光系数分为:摩尔吸光系数和比吸光系数
摩尔吸光系数:
当l以cm，c以mol/L为单位，κ称为摩尔吸光系数，用 ε表示。
ε的单位为L/mol.cm，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。
1%E1cm比吸光系数:比吸光系数是指百分含量为1%， l为1cm时的吸光度值，用 表示
1% ,,0.1MErcm1
四、偏离朗伯-比耳定律的因素
(1)入射光为非单色光
(2)溶液的不均性。
实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均
可吸光质点的吸光特性变化大。
(3)光程的不一致性。
光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光
径不一致，从而与定律偏离。
?3. 紫外-可见分光光度计
一、主要部件的性能与作用
基本结构:光源?单色器?吸收池?检测器?信号显示系统
?
样品
1、光源: 在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类:热辐射光源 和 气体放电光源 热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯;气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。 2、单色器
单色器的主要组成:入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。
3 吸收池:
吸收池又称比色皿或比色杯，
按材料可分为:玻璃吸收池(不能用于紫外区)和石英吸收池
吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。 4、检测器
检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。
现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。 5、信号显示系统
常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。 二、紫外-可见分光光度计的类型
按其光学系统可分为单波长分光光度计和双波长分光光度计。
1.单波长单光束分光光度计
目前国内广泛采用721型分光光度计。具有结构简单、价格低廉、操作方便、维修也比较容易，适用于常规分析。单波长单光束分光光度计还有国产751型、XG-125型、英国SP500型和伯克曼DU-8型等。
2.单波长双光束分光光度计
单波长双光束分光光度计有国产710型、730型、740型、日立UV-340型等就属于这种类型。 3.双波长分光光度计
双波长分光光度计的优点:是可以在有背景干忧或共存组分吸收干忧的情况下对某组分进行定量测定。国产WFZ800-5型、岛津UV-260型、UV-265型等。
三、分光光度计的校正和检验
1. 波长校正
2. 吸光度校正
3. 杂散光的检验
4. 稳定性的检验
?4 分析条件的选择
一、 仪器测量条件的选择
1.适宜的吸光度范围
由朗伯-比尔定律可知:
1/T A = lg= εcl
微分后得:
dlgT=0.4343dT/T= -εldc
或 0.4343ΔT/T= -εlΔc
代入朗伯-比尔定律有:
Δc/c=0.4343ΔT/TlgT
要使测定的相对误差Δc/c最小，求导取极小得出:
lgT=-0.4343=A 即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小。 最适宜的测量范围为0.2~0.8之间。 2.入射光波长的选择
通常是根据被测组分的吸收光谱，选择最强吸收带的最大吸收波长为入射波长。当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。 3.狭缝宽度的选择
为了选择合适的狭缝宽度，应以减少狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的十分之一。
二、显色反应条件的选择
对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质。 常见的显色反应有配位反应、氧化还原反应等。
这些显色反应，必须满足以下条件:
1.反应的生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大;
2(反应有较高的选择性，即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别;
3. 反应生成的产物有足够的稳定性，以保证测量过程中溶液的吸光度不变;
4. 反应生成物的组成恒定。
1(酸度
显色反应最适宜的酸度范围可通过实验来确定:测定某一固定浓度的试样的吸光度随酸度的变化，以吸光度为纵坐标，溶液的pH值为横坐标作图。
2.显色剂的用量
3.显色时间和温度
三、参比溶液的选择
测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调节透光度(吸光度为0)为100%，以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。
参比溶液的选择视分析体系而定，具体有:
1(溶剂参比 试样简单、共存其它成分对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸收池等因素;
2(试样参比 如果试样基体溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基体显色时，可按
与显色反应相同的条件处理试样，只是不加入显色剂。
3(试剂参比 如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入
试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。
4. 平行操作参比 用不含被测组分的试样，在相同的条件下与被测试样同时进行处理，由此
得到平行操作 参比溶液。
?5 测定方法
一、 单组分定量方法
单组分:是指样品溶液中含有一种组分，或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰与其他共有物质的吸收峰无重叠。其定量方法包括校准曲线法、标准对比法和吸收系数法。 1 校准曲线法
方法:配制一系列不同含量的标准溶液，选用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列标准溶液
的吸光度，
作A-c曲线，即标准曲线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方程。
在相同条件下测定未知试样的吸光度，从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度。
2、标准对比法
即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件下，测定各自的吸光度，建立朗伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。
? As = K c ; ? Ax = K c s x
cAsxc,xAs
?6 紫外-可见分光光度法在医学检验中的应用
例1.血清铜的测定
例2.新生儿血清胆红素的测定
范文三：紫外分光度法测水杨酸
紫外吸收光谱法测定 APC 片剂中乙酰水杨酸的含量
一、实验目的
1、了解 7500型紫外-可见分光光度计的性能、结构及其使用方法。
2、掌握紫外-可见分光光度法定量分析的基本原理和实验技术。
二、方法原理
APC 药片,研磨成粉末,用稀 NaOH 水溶液溶解提取,乙酰水杨酸水解成水杨酸钠进入 水溶液, 该提取液在 295nm 左右有一个吸收峰, 测出稀释成一定浓度的提取液的吸光度值, 并用已知浓度的水杨酸的 NaOH 水溶液做出一条标准曲线, 则可从标准曲线上求出相当于乙 酰水杨酸的含量。根据两者的分子量,即可求得 APC 中乙酰水杨酸的含量。溶剂和其他成 分不干扰测定。
+COO CH 3
+C 3O C H O OH 3+H O 22
乙酰水杨酸浓度 =[水杨酸浓度]×12
. 13815. 180 三、仪器和试剂
仪器 天美 7500或岛津 240紫外—可见分光光度计; 3G 玻璃砂芯漏斗 1个; 抽滤瓶 250mL 1个;容量瓶 250mL 1支; 50mL 7支;胖肚吸量管 20mL 1只;刻度吸量管 5mL 2只。 试剂 0.5000mg·mL -1水杨酸贮备液:称取 0.5000g 水杨酸先溶于少量 0.10moL ·L -1
NaOH 溶液中,然后用蒸馏水定容于 1000mL 容量瓶中; 0.10moL ·L -1 NaOH 溶液。 四、实验内容
1、将七个 50mL 容量瓶按 0-6依次编号。分别移取水杨酸储备液 0.00、 1.00、 2.00、 3.00、 4.00、 5.00mL 于相应编号容量瓶中,各加入 1.0mL 0.10moL·L -1
NaOH溶液,先用蒸 馏水稀释至 30mL 左右, 80℃水浴加热 10分钟,冷却至室温,稀释至刻度,摇匀。
2、放一片 APC 药片在清洁的 50mL 烧杯中,加 2.0mL0.10moL ·L -1 NaOH先溶胀 , 再用玻 棒搅拌溶解。 在玻璃砂芯漏斗中先放入一张滤纸, 用玻璃砂芯漏斗定量地转移烧杯中的内含 物,用 10mL 的 0.1MNaOH 淋洗烧杯和玻璃砂芯漏斗 2次 (共 20mL) , 20mL 蒸馏水淋洗漏斗 4次 (共 80mL) ,并将滤液收集于同一个 250mL 容量瓶中,最后用蒸馏水稀释至刻度,摇匀。
3、从 250mL 容量瓶中取 20.0mLAPC 溶液至一个 50mL 容量瓶中,蒸馏水稀释至 30mL 左 右, 80℃水浴加热 10分钟,冷却至室温,稀释至刻度,摇匀。
4、在紫外分光光度计上对标样 3进行扫描,波长范围是 320— 280nm ,找出最大吸收波 长,并在该波长下由低浓度到高浓度测定标准溶液的吸光度,最后测定未知液的吸光度。
五、数据处理
1、以吸光度 A 为纵坐标,水杨酸浓度 C 为横坐标作标准曲线。
2、根据 APC 溶液的吸光度值,在标准曲线上求出相应的浓度(mg/mL) ,并换算成乙酰 水杨酸的浓度。
3、 稀释关系,求出 1片 APC 中乙酰水杨酸的含量,与制造药厂所标明的含量(25mg ) 进行比较,计算误差。
六、注意事项
1、配制样品前要将所使用的玻璃仪器用自来水冲洗,再用少量蒸馏水润洗。
2、取标准溶液时,应先倒少量标准溶液于小烧杯中移取,不要直接将移液管伸入标准 液试剂瓶中。移取标准溶液之前要润洗移液管。
3、药片需充分溶胀后,再碾碎。
4、水浴加热时容量瓶塞子要松松塞住,防止加热气体膨胀,塞子冲出。
5、测量前用待测液润洗比色皿,测量由低浓度到高浓度依次进行。
6、从实验步骤可知,试样是两次稀释后,用很稀的浓度进行吸光度测试的,因此提取 和各步转移必须严格定量, 制作标准曲线的标样浓度也必须很准确, 不然就会使求得的 试样浓度产生较大的误差,而乘上稀释体积后,所求的药片含量误差会更大。
思考题
1、 实验中为什么要加热?
2、 引起误差的因素有哪些?如何减少误差?
范文四：001-01紫外-分光光度法原理
紫外分光光度计的使用原理和方法
紫外-可见吸收光谱
朗伯-比耳定律
紫外-可见分光光度计
分析条件的选择
测定方法
紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS)
1定义： 定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收。
2分类： 合称为紫外-可见分光光度法。
3、紫外-可见分光光度法的特点：
（1 其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快;（与其它光谱分析方法相比）
（2 灵敏度高;
（3 选择性好;
（4 精密度和准确度较高;
（5 用途广泛。
§1. 紫外-可见吸收光谱
1. 物质对光的选择性吸收
物质对光的吸收是选择性
通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。如图3-1；
在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。
2 有机化合物的紫外-可见吸收光谱
2.1 有机化合物的电子跃迁
与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的σ电子、形成双键的π电子以及未参与成键的n电子。
跃迁类型有：σ→σ*、n→σ* 、π→π *、 n→π * 四种。
饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*，n→σ* 跃迁，
吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。
不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π* 跃迁，吸收峰一般大于200nm。
生色团：是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结
助色团：是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于
200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸收强度。见表3-4。
红移和紫移：
在有机化合物中，常常因取代基的变更或溶剂的改变，使其吸收带的最大吸收波长λmax发生移动。 表3-3)，向短波方向移动称为紫移。
2.2 有机化合物的吸收带
吸收带(absorption band): 在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。
(1) R吸收带
(2) K吸收带
(3) B吸收带
(4) E吸收带
3 无机化合物的紫外-可见吸收光谱
1. f电子跃迁吸收光谱
镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的吸收是基于内层f电子的跃迁而产生的。
其紫外可见光谱为一些狭长的特征吸收峰，这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影响。
2. d电子跃迁吸收光谱
过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。
这些峰强烈受配位环境的影响。
例如 cu2+以水为配位体，吸收峰在794nm处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。此类光谱吸收强
度弱，较少用于定量分析。
3. 电荷迁移光谱 某些分子既是电子给体，又是电子受体，当电子受辐射能激发从给体外层轨道向受体
跃迁时，就会产生较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。如 苯酰基取代物在光作
用下的异构反应。
1.4 影响紫外-可见吸收光谱的因素
物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。
测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能
发生变化。
1.温度 在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。
2. 溶剂
注意如下几点：
（1）尽量选用低极性溶剂；
（2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；
（3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。
3. pH值
1.5 紫外-可见吸收光谱的应用
紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。
1.定性分析
如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。
3.结构分析
紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和
芳环结构还是有一定价值。
例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构
§2. 朗伯-比尔定律
一、吸光度和透光度
设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia, 透射光强度为 It，反射光强度为Ir，则： I0= Ia + It + Ir
由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，上式可简化为： I0= Ia + It
透光度：T表示：
透射光的强度It
透光度T = ----------------------
入射光强度I0
即 T= It / I0
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示，即 A = lg1/T = lg I0/It
二、朗伯-比尔定律
朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、
液层厚度乘积成正比，即
溶液的吸光度 = A= κ c l
式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。
（朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。）
三、吸光系数
当l以cm，c以g/L为单位，κ称为吸光系数，用 a表示。
A= a cl a的单位为L/(g.cm)
吸光系数分为：摩尔吸光系数和比吸光系数
摩尔吸光系数：
当l以cm，c以mol/L为单位，κ称为摩尔吸光系数，用 ε表示。 ε的单位为L/mol.cm，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。
%比吸光系数：比吸光系数是指百分含量为1%， l为1cm时的吸光度值，用 E 1 1
cm 表示
1%??0.1MrE1cm
四、偏离朗伯-比耳定律的因素
（1）入射光为非单色光
（2）溶液的不均性。
实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点的
吸光特性变化大。
（3）光程的不一致性。
光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从
而与定律偏离。
§3. 紫外-可见分光光度计
一、主要部件的性能与作用
基本结构:光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统
↑
样品
1、光源： 在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类
热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；
气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。
2 单色器
单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。
单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。
色散元件常用棱镜和光栅。
3 吸收池： 吸收池又称比色皿或比色杯，
按材料可分为：
吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。
4 检测器
5 信号显示系统
常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。 二、紫外-可见分光光度计的类型
1.单波长单光束分光光度计
目前国内广泛采用721型分光光度计。
单波长单光束分光光度计还有国产751型、XG-125型、英国SP500型和伯克曼DU-8型等。
2.单波长双光束分光光度计
单波长双光束分光光度计有国产710型、730型、740型、日立UV-340型等就属于这种类型。
3.双波长分光光度计
双波长分光光度计的优点：是可以在有背景干忧或共存组分吸收干忧的情况下对某组分进行定量测定。
国产WFZ800-5型、岛津UV-260型、UV-265型等。
三、分光光度计的校正和检验
1. 波长校正
2. 吸光度校正
3. 杂散光的检验
4. 稳定性的检验
§4 分析条件的选择
一、 仪器测量条件的选择
1.适宜的吸光度范围
由朗伯-比尔定律可知：
A = lg1/T = εcl
微分后得：
dlgT=0.4343dT/T= -εlc
或 0.4343ΔT/T= -εlΔc
代入朗伯-比尔定律有：
Δc/c=0.4343ΔT/TlgT
要使测定的相对误差Δc/c最小，求导取极小得出：
lgT=-0.4343=A
即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小。
最适宜的测量范围为0.2~0.8之间。
2.入射光波长的选择 通常是根据被测组分的吸收光谱，选择最强吸收带的最大吸收波长为入射波长。
当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。
3． 狭缝宽度的选择
为了选择合适的狭缝宽度，应以减少狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。
一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的十分之一。
二、显色反应条件的选择
对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质。
常见的显色反应有配位反应、氧化还原反应等。
这些显色反应，必须满足以下条件：
1．反应的生成物必须在紫外-可见光区有较强的吸光能力，即摩尔吸光系数较大；
2．反应有较高的选择性，即被测组分生成的化合物吸收曲线应与共存物质的吸收光谱有明显的差别；
3. 反应生成的产物有足够的稳定性，以保证测量过程中溶液的吸光度不变；
4. 反应生成物的组成恒定。
1．酸度
显色反应最适宜的酸度范围可通过实验来确定：测定某一固定浓度的试样的吸光度随酸度的变化，以
吸光度为纵坐标，溶液的PH值为横坐标作图。
2.显色剂的用量
3.显色时间和温度
三、参比溶液的选择
测定试样溶液的吸光度，
需先用参比溶液调节透光度（吸光度为0）为100%，以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射
和吸收带来的测定误差。
参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：
1．溶剂参比 试样简单、共存其它成分对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸收池等因素；
2．试样参比 如果试样基体溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反应相
同的条件处理试样，只是不加入显色剂。
入试剂和溶剂作为参比溶液。
4. 平行操作参比 用不含被测组分的试样，在相同的条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行操作
参比溶液。
§5 测定方法
一、 单组分定量方法
单组分： 是指样品溶液中含有一种组分，或者是在混合物溶液中待测组分的吸收峰与其他共有物质的
吸收峰无重叠。
其定量方法包括校准曲线法、标准对比法和吸收系数法。
1 校准曲线法
方法：配制一系列不同含量的标准溶液，选用适宜的参比，在相同的条件下，测定系列标准溶液的吸光度，
作A-c曲线，即标准曲线，也可用最小二乘数处理，得线性回归方程。
在相同条件下测定未知试样的吸光度，从标准曲线上就可以找到与之对应的未知试样的浓度。
2 标准对比法
即将待测溶液与某一标样溶液，在相同的条件下，测定各自的吸光度，
建立朗伯-比尔定律，解方程求出未知样浓度与含量。
① As = K c s ； ② Ax = K c x
§6 紫外-可见分光光度法在医学检验中的应用
例1.血清铜的测定
例2.新生儿血清胆红素的测定
范文五：紫外分光度法测定维生素C片的含量
紫外分光光度法测定维生素 C 片的含量
班级:姓名:学号:
前言:
原理:分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些集团吸收了紫外可见 辐射光后发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。 它说带状光谱, 反应了分子中 某些基团的信息。 可以用标准光图谱再结合其他手段进行定性分析, 吸收曲线的 形状是物质定性的主要依据, 在定量分析中, 可提供测定波长, 一般以灵敏度较 大的最大吸收波长为测定波长。物质对紫外可见光吸收符合 Lambert-Beer 定律 A=εcl 。
仪器构造:光源、单色器、样品池、检测器、显示屏 。
仪器特点:
1、 320*240位点阵高质量大屏幕液晶显示器,显示清晰,信息完备,充分 考虑人性化设计
2、强大的数据处理功能,使实验结果能得到充分的应用,使用户编辑更为 简单快捷
3、主要元件采用进口配置,使精度更高、速度更快、可靠性更强、兼容性 更广、自动化程度更高
4、丰富的应用功能,使用户随心所欲,应用更灵活、开放,使分光光度计 的应用领域得到了极大的拓展
5、高自动化程度,使维护方便、操作简便、效率更高
维生素 c 的化学结构为
理化性质
外观:无色晶体
沸点:无
熔点:190~192℃
酸性:维生素 C 分子结构中的烯二醇基,尤其是 C3位 OH 由于受共轭效应 的影响,酸性较强(pK =4.17); C2位 OH 由于形成分子内氢键,酸性极弱 (pK =11.75) 。 故维生素 C 一般表现为一元酸, 可与碳酸氢钠作用生成钠盐。 紫外线吸收最大值:245nm
荧光光谱:
激发波长:无
荧光波长:无
药理作用
维生素 C 为抗体及胶原形成,组织修补(包括某些氧化还原作用),苯丙 氨酸、酪氨酸、叶酸的代谢,铁、碳水化合物的利用,脂肪、蛋白质的合成,维 持免疫功能,羟化与羟色胺,保持血管的完整,促进非血红素铁吸收等所必需, 同时维生素 C 还具备有抗氧化,抗自由基,抑制酪氨酸酶的形成,从而达到美 白,淡斑的功效。
文献报道测定方法
方法名称
维生素 C 测定 — 氧化还原滴定法
应用范围
该方法采用滴定法测定维生素 C 的含量。
该方法适用于维生素 C 。
方法原理
供试品加新沸过的冷水与稀醋酸使溶解,加淀粉指示液,以直接碘法滴定, 计算维生素 C 的含量。
试剂
1、水(新沸放置至室温)
2.碘滴定液(0.05 mol/L)
3.淀粉指示液
4.冰醋酸溶液
仪器设备:
1、碘滴定液(0.05 mol/L)
配制:取碘 13.0g ,加碘化钾 36g 与水 50mL 溶解后,加盐酸 3滴与水适量 使成 1000mL ,摇匀,用垂熔玻璃滤器滤过。
标定:取在 105℃干燥恒重的基准三氧化二砷约 0.15g ,精密称定,加氢氧 化钠滴定液 (1 mol/L) 10mL ,微热使溶解,加水 20mL 与甲基橙指示液 1滴,加 硫酸滴定液 50mL 与淀粉指示液 2mL ,用本液滴定至溶液显浅蓝紫色。每 1mL 碘(0.1mol/L)相当于 4.946g 的五氧化二砷。根据本液的消耗量与三氧化二砷的 取用量,算出本液的浓度,即得。
贮藏:置玻璃塞的棕色玻璃瓶中,密闭,在凉处保存。
2.淀粉指示液
取可溶性淀粉 0.5g ,加水 5mL 搅匀后,缓缓倾入 100mL 沸水中,随加随搅 拌,继续煮沸 2分钟,放冷,倾出上清液,即得。本液应临用新制。
操作步骤
取该品 0.2g ,精密称定,加新沸过的冷水 100mL 与稀醋酸溶液 10mL 使溶 解,加淀粉指示液 1mL ,立即用碘滴定液(0.05mol/L)滴定,至溶液显蓝色并
在 30秒内不褪,并将滴定结果用空白试验校正。记录消耗碘滴定液的体积数 (mL ),每 1mL 碘滴定液(0.05mol/L)相当于 8.806mg 的 C6H8O6。
一、仪器与试药
紫外分光光度仪(UV-2550, 日本岛津),分析天平(BS 110S,梅特勒)。 25ml 容量瓶 8个, 5ml 移液管一支, 1ml 移液管一支,胶头滴管一个,过滤 器若干
对照品 (抗坏血酸,天津市天新精细化工开发中心,含量不少于 99.7%); 维生素 C 片(临汾宝珠制药有限公司,批号:131002)。
0.1mol/L盐酸 , 。
二、方法与结果
2.1 溶液的配制
2.1.1 对照品溶液的配制
精密称取维生素 C 片对照品 13.28mg ,加 0.1mol/L HCl溶解,定容到 25ml , 做为对照品储备液。吸取上述溶液 0.5ml ,加 0.1mol/L HCl稀释到 25ml ,则对照 品溶液的浓度为 10.624μg/ml,测定吸光度值。
2.2 光谱扫描
将对照品溶液在 200~800nm
处扫描紫外 -可见光谱, 记录光谱图及最大吸收波长。
图 1 紫外 -可见吸收光谱图
2.3 含量测定
2.3.1 标准曲线的制备
分别量取对照品储备液 0.18mL 、 0.30mL 、 0.50 mL 、 0.60 mL 、 0.70 mL 于 25mL 容量瓶中,加 0.1mol/L盐酸定容,摇匀,得浓度分别为 3.655μg/mL 、 6.374μg/mL 、 10.62 μg/mL 、 12.75 μg/mL 、 14.62 μg/mL 的一系列对照品溶液。 以标准溶液的质量浓度(X )为横坐标,吸光度(Y )为纵坐标,绘制标准曲线, 其线性方程为:Y=0.006+0.0535X,相关系数为 r= 0.9992,表明维生素 C 片在 3.655~14.62μg/mL 浓度范围内线性关系良好。
表 1 标准曲线浓度
编号 1 2 3 4 5
浓度(μg/ml) 3.655 6.374 10.62 12.75 14.62
吸光度 0.21 0.34 0.57 0.68 0.80
图 2 标准曲线
2.3.2 样品测定
取 10片药片称量后计算平均片重及标示量。药片于研磨中研碎,称取药粉 约 20.93mg ,置 25mL 量瓶中,加 0.1mol/L HCl溶解,定容,再从中吸取 0.4 mL置 25mL 量瓶中,加 0.1mol/L HCl稀释并定容,测定吸光度值,代入标准曲线方 程中计算浓度。 (W总 =1.1994g;平均片重 =119.94mg;标示量 =100mg)
表 2 样品测定结果(n=2)
编号 1 2
吸光度 0.62 0.66
样品浓度(μg/ml) 11.48 12.22
样品百分含量 (%) 85.71 91.21
百分含量平均值 (%) 88.46
产品是否合格的判断:
样品实际的百分含量 / 样品的标示百分含量 ×100%
样品的标示百分含量:119.94/100×100%=119.94%
样品实际的百分含量 / 样品的标示百分含量 ×100%=88.46/119.94×100%=73.75%样品含量占标示量的百分含量在 95%~105%,为合格药品,若不在此范围 内,则为不合格药品。
3. 讨论
将对照品溶液在 200~800nm处扫描紫外 -可见光谱,其最大吸收波长为 242nm , 吸光度为 0.58; 其线性方程为:Y=0.006+0.0535X, 相关系数为 r= 0.9992, 表明维生素 C 片在 3.655~14.62μg/mL 浓度范围内线性关系良好。
本实验中测定的维生素 C 片药品为不合格药品,样品含量占标示量的百 分含量为 73.75%,不在规定的 95%~105%范围内,所以为不合格药品。分析原 因有几下几方面:(1)该药品为过期药品, 已经过了生产日期; (2)实验人员操作 不规范; (3)药品保存方式不当; (4)药片含量不均匀。
实验中遇到的问题:设置标准曲线的浓度梯度时, 计算容易出现错误, 所 以应该采用两人同时计算, 以保数据的正确, 才能继续后续的实验; 定容时应该 以一人为标准,不同的人观察凹液面不同;溶液配置时应该注意移液管的量程, 以减小误差; 移液管的规范操作; 有条件的情况下应该将所用到玻璃容器干燥完 全,不应含水蒸气,液滴,以减小误差;所用到的移液管移取液体前应该用所移 取的液体润洗;应该保证桌面整洁,以免移液管放置时沾染杂物。
