范文一:【doc】在核苷酸三磷酸酶活化过程中核苷酸与Na^+之间的关系
在核苷酸三磷酸酶活化过程中核苷酸与
Na^,之间的关系
笫5卷第l划
1989年2月
生物化学杂志
ChineseBiochemicalJOurnal
Vo1.
5,No,1
Feb..1989
在核苷酸三磷酸酶活化过程中
核苷酸与Na之间的关系
赵睿珊斯悌霍万符云举邦廷
(河北省医学科学院实验鞋学研究所,生化研究室,石家庄)
Na+K一ATP酶反应序列包括依赖Na的磷酸化作用及依赖K的击磷酸化作 用[1-z].具体包括五部分反应【:1.N8和ATP与酶的高亲和结台部位任意结台J2.依赖
Na和Mg"的濞酸化反应,此步被ADP所抑制j3.从对ADP敏威的E1,P转化成对K敏
戚的ErP}4.在K刺激下使E2一P水解,释放无机磷}5.核苷酸促使K—E1K转换. 为探讨膜结合N8和K激活的核苷酸三磷酸酶活性及依赖Na的磷酸化反应的核苷酸
特异性,我们选用ATP,CTP,ITP和GTP四种核苷酸做底物,观察Na与核苷酸的关系.
材料和方法
采用Jq~rgensen【的方法从新鲜觅肾外髓质分离提取Na+K一ATP酶,并按Scheot【.】
和J~rgensen的方法测定酶活性及蛋白舍量.
所用介质舍有50mmol/L咪唑-HCI,pH7.2,1.2mmol/LMgCI2,0--500mmel/LNaCl,
5#g/ml纯制酶.另一管除上进介质外,还舍有0.1mmol/L哇巴因.37?预孵育30分钟.再
加等量的lmmol/L核苷酸(NTP)进行水解反应.37?孵育6O分钟,取出放冰中.用硫酸
亚铁试剂显色.室温放置3O分钟,700rim读取光密度值.以不舍哇巴因的样品读数藏去含有
哇巴因的读数,即为Na+KATP酶活性.
结果和讨论
以四种核苷酸作底物测定酶的水解活性.用咪唑一HCI缓冲液为介质(具有类Na作用),
可以提高酶活性川.
Fig.
1,表示在Na存在下,酶水解ATP的活性曲线.在无Na时的初始酶活性为 47#mol?mg?h,,相当最大活性的一牛在最高活性时需要的Na浓度即[Na].为 300mineI/L.当N8浓度低于~5mmol时活性下降58.此现象可能由于在无K+.隋况下,N8
抑制E-P自发水解【.继续提高Na浓度则变抑制为刺激,ATP水解骤然增高,蜂活性
为98~moI?mg..?h一.以后又下降.如此测得[Na]0为90mmol/L,对ATP的Km值为 0.6~mol?mg一?h,.
通讯地址t荷兰内伊棒根尢学医学皖生化系
奉文于1驰年3月l3日收弼初藕,19B7年6月23日收封修改档. 85
mmo】/LNr
Fi9.1Thehydrolyticcurve
0fNa.ATPa$eonATP
Fig.2Tkehydrolyticcurve
ofNa一CTPabeonCTP
Fig.
2表示在同样条件下,对CTP的水解活性曲线.无Ns时的初始活性为40~mol/mg?h,相
当最大活性的一半以下.在Na'浓度{匠于5mmol/L时,活性下降了48%.蜂活性102~mol/mg?h,
[Na]ml也为300mmol/L.UNa]D.I为8~mmoI/L.对CTP的Km值为25~tool/rag?h.
Fig.3表示对ITP的水解活性曲线.初始活性为10~mol/mg?h,低浓度Na时没有活性下
降反应高峰为74#tool/rag-h,此时的[Na]m.,~200mmol/L.ENs.B为37mmo1/L.对 ITP的Km值为60~mol/mg?h.
mmoVLHr
Fig.5ThehydrolyticcurveFig.4Thehydrolyticcurve
0fNa+.ITPaseolRITPofNa一OTPaseonGTP
Fig.
4表示对GTP的水解活性曲线.在无Na时的酶活性接近"0.随着N4浓度升高, 活性逐渐上升,达高峰时为36#tool/rag.h[Na]山.x为80mmol/L.[Na]D5为16mmol/L.
Km值为100--150~moI/mg?h.
以上四种桉苷酸随着对酶亲和力的逐渐降低,使初始活性递减,同时在低浓度Nt时酶
活性下降程度也禽来愈小.标志着这些接苷酸对Na的敏戚性愈来愈低.特别是GTP在低浓
86
应N8+时本身即不能水解,所以Na+也不能抑制E2一p水解.另一方面,最高酶活性从ATP
98,amol?mg-I.h一降到GTP36,amol?mg-1.h,,说明了酶对不同棱苷酸的水解能力依次减低.
从Table1中可知,四种核苷酸的Km值依次升高,指示对酶的亲和力逐渐减低.
此时的[Na]m.和[Na]【j王随之降低.由此得出结论:1.棱苷酸与酶的亲和力依次为
ATP>cTP>ITP>GTPj2.
随着酶对核苷酸亲和力降低,桉苷酸与Na的拮抗作用降低.
Table1TherelationbetweenKmnueleotideand(Na)..Eforstimulation 0fNTPaseactivitybyNaintheabsenceofK
在此基础上,向介质中加灭Immol/LK,则酶的峰活性此只有Na时增高,[Na]o降
低,曲线向左移,但ENa].不变.表示有K存在时,核苷酸与Na的拮抗作用此只有Na
时更小.
在反应的第一阶段,Na可促进ATP与酶分子结合,而K起抑制作用.此时如果逐渐
增
加Na浓度则可减弱K的作用.当介质中Na浓度超过K浓度的1.3倍时即可恢复
ATP的结
合州.但是在反应的第三阶段E2一P对K的亲和力异常增高….这种酶对Na及K
亲和力
的巨大变化,标志着阳离子运输过程.从细胞生理学角度看,细胞内K控制着ATP
的结台.
在ATP不足情况下,可以调整ATP的消耗[91,例如:细胞缺氧或损伤.只要细胞内K
浓度
仍保持高水平,ATP浓度下降时离子泵即可减少ATP的消耗.
参考文献
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?,Dr,NewCom?
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RelatiOnBetweenTheNucleotidesAndNaInNuclcoside TriphosphataseActivity
Zhao,Rei-shanSchuurmansStekhoven
,
F.
M.
A.
H.
FurYun—feng,
$warts,H.
G.
P.
DePont,J.
J.
H.
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M.
S.
L.
Bonting*
(HebelAcademy.,Medical,Sciences,8hijiazhuany) ?PresentaddressIDepartmentofBiochemistry,UniversityofNijmegen,P.O.Box9101,
6500HBNijmegen,TheNetherlands,
范文二:弓形虫论文:弓形虫 三磷酸核苷水解酶基因 LAMP 早期诊断 流行病学调查
弓形虫论文:应用LAMP检测弓形虫感染的研究
【中文摘要】弓形虫病是由一种专性细胞内寄生的刚地弓形虫引起的一种人兽共患寄生虫病,广泛分布于世界各地,弓形虫可感染包括人类在内的所有温血动物,甚至引起死亡。本病有三种传播方式,其中经口传播途径是人类和动物感染的最主要的方式。弓形虫病不仅威胁人类健康,同时对畜牧业生产造成一定经济损失。目前,弓形虫病的诊断方法主要以普通病原学和免疫学诊断为主,而随着分子生物学技术的不断发展,弓形虫病的分子诊断方法日益完善。本研究以弓形虫三磷酸核苷水解酶基因为靶基因,设计6条特异性引物,建立LAMP方法,检测弓形虫病的感染。该检测方法30 min即可检测出弓形虫三磷酸核苷水解酶基因,产生呈瀑布状的特异性条带,检测极限为20拷贝。经过比较试验,该方法的敏感性比PCR高10倍,与犬新孢子虫、鹦鹉热衣原体、柔嫩艾美耳球虫、吕氏泰勒虫、羊巴贝斯虫未定种、牛巴贝斯虫、边缘无浆体、支原体、伯氏疏螺旋体、副猪嗜血杆菌、猪链球菌等病原体无交叉反应,特异性高,且重复性良好。以猪和家兔为实验动物,按一定剂量人工接种弓形虫后,在猪的血液样本中, LAMP方法在攻虫后2 d即可检测到弓形虫,而PCR方法在攻虫后4 d的样本中方可检测到弓形虫;家兔的组...
【英文摘要】Toxoplasma gondii, as an obligate
intracellular parasite, it can cause epidemical parasitic
disease. As toxoplasmosis could infect humans and all other
warm-blooded animals, it not only threatens humans’health, but
also causes great economic losses on storkbreeding and was considered to be one of the most widespread parasites in the world. Among the three transmission ways of toxoplasmosis, fecal-oral is the most common way.The traditional diagnostic methods of toxoplasmosis are mainly based on etiology...
【关键词】弓形虫 三磷酸核苷水解酶基因 LAMP 早期诊断 流行
病学调查
【英文关键词】Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase gene LAMP early diagnosis epidemiological investigation
【目录】应用LAMP检测弓形虫感染的研究 摘要
5-6 Abstract 6 第一章 引言 11-19 1.1 研究的
目的和意义 11 1.2 弓形虫病的分子诊断技术研究进展
11-15 1.2.1 核酸探针技术 11-12 1.2.2 PCR 及其衍
生技术 12-14 1.2.3 环介导等温扩增技术 14 1.2.4
DNA 微阵列 14 1.2.5 总结与展望 14-15 1.3 三磷酸核
苷水解酶及其在弓形虫中的研究 15-18 1.3.1 NTPase 蛋白结
构分析 15-16 1.3.2 NTPase 在不同生物体中的作用
16-18 1.3.3 总结与展望 18 1.4 研究的方法和内容
18-19 第二章 弓形虫LAMP 方法的建立 19-35 2.1 材
料和方法 19-25 2.1.1 基因 19 2.1.2 菌株、载体
19 2.1.3 试剂 19-20 2.1.4 弓形虫GJS 株的培养
20 2.1.5 弓形虫基因组DNA 的提取 20 2.1.6 引物设
计 20 2.1.7 NTPase 基因的扩增 20-21 2.1.8 NTPase PCR 产物酶切鉴定 21 2.1.9 阳性重组质粒pMD19-T-NTPase 的构建 21-22 2.1.10 LAMP 引物的设计 22-23 2.1.11 LAMP 反应体系的建立 23-24 2.1.12 PCR 反应体系
24-25 2.1.13 LAMP 特异性试验 25 2.1.14 LAMP 敏感
性试验及与PCR 方法比较 25 2.2 结果 25-33 2.2.1 NTPase 基因扩增 25 2.2.2 NTPasePCR 产物酶切鉴定
25-26 2.2.3 重组质粒pMD19-T-NTPase 的鉴定
26-27 2.2.4 LAMP 反应条件优化 27-29 2.2.3 LAMP 反
应扩增 29 2.2.4 LAMP 扩增产物酶切鉴定 29-30 2.2.5 LAMP 反应的特异性 30-31 2.2.6 LAMP 反应的敏感性及与PCR 的比较 31-33 2.3 讨论 33-35 第三章 LAMP 方法在实
验动物弓形虫病的应用 35-43 3.1 材料和方法
35-37 3.1.1 实验动物 35 3.1.2 试剂及器材
35 3.1.3 接种弓形虫 35-36 3.1.4 试验样本采集
36 3.1.5 基因组的提取 36 3.1.6 弓形虫病早期诊断
36-37 3.2 结果 37-42 3.2.1 猪弓形虫病早期诊断
37 3.2.2 家兔弓形虫病诊断 37-42 3.3 讨论
42-43 第四章 LAMP 方法在弓形虫病流行病学调查中的应用
43-46 4.1 材料和方法 43-44 4.1.1 试剂
43-44 4.1.2 调查对象 44 4.1.3 基因组提取
44 4.1.4 方法 44 4.2 结果 44-45 4.3 讨论
45-46 第五章 全文结论 46-47 参考文献 47-54 致谢 54-55 作者简历 55
范文三:嘌呤核苷磷酸化酶 嘌呤核苷磷酸化酶使用说明
导读:就爱阅读网友为您分享以下“嘌呤核苷磷酸化酶使用说明”的资讯,希望对您有所帮助,感谢您对92to.com的支持!
嘌呤核苷磷酸化酶使用说明
货号:P6480
保存:-20?
反应公式:
产品性状:
外观:白色冻干粉末
1
来源:微生物
酶委员会编号:EC5.4.2.2
CASNumber:9030-21-1
比活:?200U/mgprotein
活性定义:嘌呤核苷磷酸化酶在pH7.7,温度为37?的条件下,1unit每分钟可氧化1μmol的肌苷磷酸化生成次黄嘌呤和1-磷酸核糖。
制备说明:该酶可溶于50mM磷酸钾缓冲液(pH7.7)中。
性能:
分子量:32kDa(SDS-PAGE)
等电点:6.0
米氏常数:2.2×10-4M(Inosine)
2
最适pH:7.5,8.0
最适温度:60?
pH稳定性:5.0,10.0
温度稳定性:<55?(pH7.7,
30min)
抑制剂:Ag+,Hg2+
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3
范文四:三磷酸腺苷 编辑 三磷酸腺苷(ATP)
三磷酸腺苷
三磷酸(ATP)是以次黄嘌呤为底物,经生物发酵的技术制得的高能化合物,三磷酸腺苷是体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源,被誉为细胞内能量的“分子货币”,储存和传递,蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合需它参与,可促使机体各种细胞的修复和再生,增强细胞代谢活性,对治疗各种疾病均有较强的针对性。
目 录
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1简介
在中,三磷酸(Adenosine triphosphate,?)是一种(又叫腺苷三磷酸),作为细胞内能量传递的“分子通货”,储存和传递。ATP在合成中也具有重要作用。
ATP是三磷酸的英文名称缩写。ATP分子的结构是可以简写成A-P~P~P,其中A代表,P代表磷酸,~代表一种特殊的,叫做,高能磷酸键断裂时,大量的能量会释放出来。ATP可以水解,这实际上是指ATP分子中的水解。水解时释放的能量多达30.54kJ/mol,所以说ATP是细胞内一种。
2化学性质
ATP由和三个磷酸基所组成,分子式C10H16N5O13P3,化学简式C10H8N4O2NH2(OH)2(PO3H)3H,分子量507.184。三个磷酸从开始被编为α、β和γ磷酸基。ATP的化学名称为5'-三磷酸-9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤,或者5'-三磷酸-9-β-D-呋喃核糖基-6-氨基嘌呤。
3供能方式
在ATP与ADP的转化中,ATP的第2个位于末端,能很快地水解断裂,释放能量。同样,在提供能ATP与ADP的相互转换
量的条件下,也容易加上第3个磷酸使ADP又转化为ATP。对于动物和人类来说,ADP转化成ATP时所需要的能量,来自呼吸作用;对于绿色植物来说,ADP转化成ATP时所需要的能量,来自呼吸作用和光合作用。构成生物体的活细胞,内部时刻进行着ATP与ADP的相互转化,同时也就伴随有能量的释放和储存。因其是能量“携带”和“转运”者,生物学家形象地称ATP为“能量通货”。
4合成
ATP的立体结构ATP可通过多种细胞途径产生,最典型的如在中通过磷酸化由合成,或者在植物的中通过光合作用合成。ATP合成的主要能源为通过分解释放的能量。每分子先在细胞质中产生2分子,最终在内膜中通过三羧酸循环产生最多36molATP。
5人体中的ATP
人体中ATP的总量只有大约0.1。人体细胞每天的能量需要水解200-300的ATP,这意味着每个ATP分子每天要被重复利用2000-3000次。ATP不能被储存,因为ATP的合成后必须在短时间内被消耗.
6其它三磷酸苷
活细胞中也有其他的高能三磷酸盐如三磷酸鸟苷。能量可以在这些三磷酸盐和ATP中由磷酸激酶之类的反应转移:当磷酸键被水解的时候能量就会被释放。这种能量可以被多种、肌动蛋白和运输蛋白用于细胞的活动。水解还会生成自由的磷酸盐和。又可以被进一步水解为另一个磷酸离子和一磷酸腺苷。ATP也可以被直接水解为一磷酸腺苷和,这个反应在水溶液中是高效的不可逆反应。
7ADP与GTP的反应
ADP + GTP→ATP + GDP
+ 三磷酸鸟苷→三磷酸腺苷 + 二磷酸鸟苷
C10H15N5O10P2+C10H16N5O14P3→C10H16N5O13P3+C10H15N5O11P2
ATP可能会被作为纳米技术和灌溉的能源。可能收益于这种技术而不再需要电池提供动力。
三磷酸是体内广泛存在的辅酶,是体内组织细胞所需能量的主要来源,蛋白质、脂肪、糖和的合需ATP参与。ATP经催化形成(cAMP),是细胞内的,对细胞许多代谢过程有重要的调节作用。
ATP为蛋白质、、、尿素等的合成提供能量,促使肝细胞修复和再生,增强肝细胞代谢活性,对治疗有较大针对性。但外源性ATP不易进入细胞,且与体内需要的量比较,可能提供的量微不足道。
8基本信息
三磷酸(Adenosine Triphosphate,ATP)
【异名】腺三磷。
【主要成分】三磷酸。
【药理作用】本品为一种辅酶。有改善肌体代谢的作用,参与体内脂肪、蛋白质、糖、及的代谢,同时又是体内能量的主要来源。适用于细胞损伤后细胞酶减退引起的疾病。动物试验发现本品对的电生理有明显作用,可抑制慢反应细胞的钙离子内流,阻断和延长折返环路的前向传导,大剂量尚可阻断房室旁路的折返性,具有增强迷走神经的作用,可用室上性心动过速。
【适应证】室上性心动过速、、、心肌梗塞、、冠状动脉硬化、急性脊髓灰质炎。
【不良反应】头痛、头昏、出冷汗、、低血压等。偶可见关节酸痛、荨麻疹等。
【禁忌证】对本品过敏、脑出血急性期、禁用。
【用法用量】肌注或静注:20mg/次,1~3次/日。
【注意事项】1、静注宜缓慢,以免引起头晕、、、低血压等。2、治疗快速型室上性时,首剂常用20mg用液稀释至5ml于20秒内快速静滴,若无效则间隔5分钟,再注入30mg,单剂注入量不超过40mg。由于本品在终止室上性发作过程中,可发生多种和全身反应,尽管是瞬间反应,不需处理,但仍有一定潜在危险,故使用本药时宜连续心电图监测,密切注意病人的全身反应。3、治疗剂量宜小剂量开始,无效时逐渐加量。4、本品对有明显抑制,故对、、老年人慎用或不用。5、部分疗效不确切,应引起注意切勿滥用。
9ATP对人体供能
无氧代谢剧烈运动时,体内处于暂时缺氧状态,
在缺氧状态下体内能源物质的代谢过程,称为无氧代谢。它包括以下两个供能系统。
①非乳酸能(ATP—CP)系统—一般可维持10秒肌肉活动
无氧代谢
②乳酸能系统—一般可维持1~3分的肌肉活动
非乳酸能(ATP—CP)系统和乳酸能系统是从事短时间、
剧烈运动肌肉供能的主要方式。ATP释放能量供肌肉收缩的时间仅为1~3秒,
要靠CP分解提供能量,但肌肉中CP的含量也只能够供ATP合成后
分解的能量维持6~8秒肌肉收缩的时间。因此,
进行10秒以内的快速活动主要靠ATP—CP系统供给肌肉收缩时的能量。
乳酸能系统是持续进行剧烈运动时,肌肉内的肌糖元在缺氧状态下进行酵解,
经过一系列化学反应,最终在体内产生乳酸,同时释放能量供肌肉收缩。
这一代谢过程,可供1~3分左右肌肉收缩的时间。
10禽用机理
【作用与用途】1.用于肉鸡、肉鸭、猪、肉牛、肉羊、鱼、虾等肉质动物的增肥、促生长;2.用于因疾病导致的动物饮水、采食量下降,快速补充机体能量水平;3.使用本品能促使动物发病后快速恢复健康;4.适用于动物因疾病、药物、毒素等各种致病因素引起的肝脏损伤、、肠粘膜损伤、输卵管损伤后的修复。
【用法用量】
饮水:本品100克兑水500公斤,连用3-5天
混饲:本品100克拌料250公斤,连用3-5天
适用动物:各种生长阶段的鸡、猪、鸭、鹅、牛、羊、毛皮动物、宠物等
【临床实际应用】
一、用于雏禽使用,促进卵黄吸收,增强体质,降低死淘率,提高首免效果
推荐方案:ATP+防治细菌垂直感染的药物如头孢噻恶等 连用5-7天
二、用于动物因疾病、药物、毒素等各种致病因素引起的肝脏损伤、,治疗肝肿、肾肿、尿酸盐沉积,,保肝健肾:
推荐方案:ATP单用 连用3-5天
特别说明:治疗时使用ATP+健肾药效果更佳
三、用于因疾病导致的动物饮水、采食量下降,快速补充机体能量水平,恢复健康,增进采食:
推荐方案:ATP 连用3-5天
四、用于动物因疾病、药物、毒素等各种致病因素引起的肠粘膜损伤、输卵管损伤后的修复,病禽表现拉料便,蛋壳质量不佳:
推荐方案:ATP单用 或ATP+鱼肝油粉 连用3-5天
五、用于疫苗接种前后使用,给免疫细胞提供能量,增强其对的应答,提高抗体滴度:
推荐方案:防疫前1-2天、后1-2天及当天使用
六、用于病毒、细菌、球虫等引起的病、肠道病及的辅助治疗:
推荐方案:ATP+相应治疗药
【注意事项】本品可与任何药物混混用;不可与消毒药混用。
细胞化学
腺苷三磷酸
其他科技名词
核酸与基因
其他科技名词
相关文献
-分析化学-2011年 第1期 (39)
-中国化工贸易-2011年 第10期 (3)
-中国全科医学-2011年 第3期
范文五:生长温度对核苷磷酸化酶的影响
生长温度对核苷磷酸化酶的影响
张文伟 冯胜彦
()武汉大学生命科学院 武汉 430072
摘要 通过对不同生长温度下嗜热脂肪芽孢杆菌核苷磷酸化酶活性的测量, 初步探讨了高温作为有效诱导手段
的可能性。
关键词 核苷磷酸化酶 生长温度
() 病毒唑 是一种核苷类广谱抗病毒药 RBV 作 用, 为 研 究 N P a se 的 表 达 调 控 进 而 提 高
的生产方法有化学合成 表达量提供一些线索。N P a se 物。 到目前为止, RBV
法、微和物发酵法及酶法。酶法比前两种方法北
率要高, 目前一般采用微生物完整细胞为酶源, 1 材料 () 利用细胞内核苷磷酸化酶 催化核糖基 N P a se菌 种 1. 1 B a c il lu s S tea roth e rm op h ilu s ( ) 转 移 反 应, 将 三 氮 唑 甲 酰 胺 转 化 为 T CA 1 ) ( 最适生长温度 55 ?购自中国典 12980 A T CC 。然而, 由于受微生物细胞膜通透性的限 RBV
制, 目前产率并不是很高, 而且需要制备大量菌 型培养物保藏中心。体, 反应和产物纯化过程都较繁琐, 因此国际上 培 养 基 1. 2 牛 肉 膏 0. 3% , 蛋 白 胨 0. 5% , 已开始探索用基因工程的方法获得大量 N P a se N aC l 0. 5% , 葡萄糖 0. 3% , pH 7. 0 生产核苷类似物。1996 年 等成功地 H am am o to 1. 3 腺苷、尿苷 购自武汉华美公司在 中 大 量 表 达 了 嗜 热 脂 肪 芽 孢 杆 菌 . Eco li
() —2 的嘌呤核苷磷酸化酶l l 和 6T H PN P a se2 () 嘧啶核苷磷酸化酶 。等 P yN P a seH am am o to 2 方法
发现 与 基因处于同一操纵 lP yN P a se PN P a se 2. 1 测量生长曲线3 元中, 但未鉴定到启动子区。目前有关嗜热脂 培养基于 15 磅灭菌 20 , 55 ?或 60 ? m in 肪芽孢杆菌 的表达调控未见报道, 如能 N P a se 培养, 转速 240 每隔 1 取样测 640 ?, rm in h nm 阐明其机制, 无疑对构建 高效表达体系 N P a se 处 吸 光 值, 分 别 以 时 间、为 横、纵 坐 标 做 OD 640 是有利的。 本实验室曾发现嗜热脂肪芽孢杆菌 图。 的表达可能与生长温度有关, 如采用高N P a se 2. 2 酶源制备
菌体培养同上, 在不同时间段取 5 培养 m l
液。取样液与 24 培养液经离心收集菌体作为 h
酶源。
4 温锻炼的方法可获得 RBV 高立菌株; 生长温
产 2. 3 度上升 10?, 菌体对不同反应底物的 RBV RBV 产率测定
( ) , 怀疑高温有某种诱导 率将有不同幅度增加等菌 体 来源于 24 菌体加 入 量 为 100,h 5 6 () ( ) 作用。 等1991和等1993先 Scho cn W u 200 m g?m l, 反应液含 T CA 、肌苷或腺苷及磷酸 后报道过在嗜热脂肪芽孢杆菌中存在一些受温 () 钾缓冲液 7. 0各 40 ?混匀后于 63, pH mm o lL 度 升 高 影 响 而 启 动 的 转 录 位 点, 但 未 见 有 关 ?反应 12 。反应液离心得上清液, 煮沸后再离 h受温度控制的报道。 本实验旨在通过测 N P a se
心得到样品。分离采用阳离子交换柱, 洗RBV 量不同温度下的 酶活, 探讨高温的诱导N P a se
脱液为蒸馏水, 流速 2. 5 ?。核酸蛋白质分m lm in
50 析仪的工作波长为 220 nm , B eckm an DU - 含氮碱和戊糖, 并只对核糖核苷作用。 PN P a se
检测波长为 205 。属于 的一类, 催化肌苷、鸟苷等分解,l nm N P a se
不对腺苷作用。的特点是催化可逆反应,2. 4 l 及核苷水解酶活性测定N P a se PN P a se
( ) 生成含氮碱和戊糖的磷酸酯。 由于 的这 来 源 于 取 样 液加 入 量 为 100 菌体 ?N P a se m g
7 一特点, 它参与了核苷酸代谢的补救途径, 更经 。检测方法参照文献, 根据反应生成的还原 m l
) (济地利用已有的成分。 核苷水解酶没有这种功糖测定酶活。 采用 湿菌为酶活单位。?U g
7 能2. 5 , 相反它在 RBV 生产中降解肌苷等反应底 PN P a se 及 P yN P ae s 活性测定 ?
, 起破坏作用。表 1 为 55 ?与 60 ?下两种酶 物 菌体加入量及来源同 2. 4, 反应液为腺苷或
() 的酶活变化。0 40 尿 苷 40 磷 酸 钾 缓 冲 液 7. ?, mm o lL pH
表 1 55 ?与 60 ?的 与核苷水解酶酶活 l PN P a se 。混匀后于 63 ?反应 6 , 加甲酸 10 ?mm o lL h Λl
T ab le 1 T h e ac t iv it ie s o f PN P a se and nuc leo side l 终止反应。 离心后取 10 上清液点样纸层析。 Λl 21 ? ? 10 ?5560? h yd ro la se a t an d U g 尿苷层析系统配方: 硼酸 1. 5 与冰乙酸 70 g Λl
3 4 8 10 12 培养时间?h 溶于蒸馏水 150 , 调至 。腺苷层析系统使 4m lpH
55? 4. 675 5. 148 4. 303 1. 581 4. 343 用 的氨水溶液。 层析 3 后吹干, 在紫外 10 pH h PN P a se l60? 6. 068 8. 02 8. 281 5. 432 6. 585 下 观 察, 剪 下 斑 点, 浸 泡 于 3 0. 05 ?m l m o lL 55?2. 207 2. 497 3. 983 3. 575 1. 632 核苷水解酶 若干小时, - 50 检测波长为H C l B eckm an DU 60? 2. 013 1. 798 3. 787 3. 406 1. 956 260 , 以反应产物与底物吸光值比为酶活指 nm
标。 如表 1 中所示, 温度提高 5 ?时 PN P a se l
酶活显著增加, 增加倍数最高点为培养 10 , 提 h 3 结果与讨论 高了 2. 44 倍。 核苷水解酶酶活整体上有所降 3. 1 生长曲线如图 1 所示 低, 降低最大幅度 27. 99% , 该点在培养 4 处。h
3. 3 在 产率方面, 以肌苷为底物 55 ?时 RBV
为 10. 3% , 60 ?时为 18. 74% 。产率的增RBV
加也表明高温时 酶活升高、核苷水 l PN P a se
解酶活降低对 生产无疑是有利的。RBV
3. 4 PN P a se 与 P yN P a se ?
以腺苷为底物, 以尿苷、胸苷为底P yN P a se
物, 两者在不同温度下变化如表 2。
表 2 5 ?与 60 ?的 与 酶活?PN P a seP yN P a se T ab le 2 T h e ac t iv it ie s o f PN P a se ?and
t?h ? ?5560P yN P a se a t and
图 1 55 ?生长曲线8 9 10 培养时间?h ?1 55 F ig T h e g row th cu rve a t 55? 0. 4375 0. 7100 0. 6568 PN P a se ?由图可见嗜热脂肪芽孢杆菌生长曲线为波 60? 0. 5761 0. 8495 0. 6767
55?浪型。 为避免每次培养因生长状况的差异而导 1. 1933 0. 8762 0. 6196 P yN P a se 致生长曲线位置的偏移, 以下均采取多时间点3. 7622 2. 3989 2. 2426 60?
采样同时比较的方法。
3. 2 与核苷水解酶l PN P a se 表 2 所示, P yN P a se 酶活有明显增高, 增高
() 核苷水解酶 也催化 倍数最大点为培养 10 处, 提高了 2. 61 倍。时 N u c leo side h yd ro la seh
核苷分解。 不同的是, 它催化不可逆反应, 生成 间与倍数均与 接近。等报l PN P a se H am am o to
29 倍的新高产株, 从这点来看, 高 率比原菌高 道 P yN P a se 与 PN P a se 同处一操纵元中, 与 l
温不 失 为 一 种 有 效 手 段。 本 实 验 表 明 三 种 上述实验结果相符。酶活相对变化不 ? PN P a se 表达水平在高温下有不同幅度增加, 提 N P a se 大, 增加最多的点为 8 , 提高了 31. 68% 。h P yN 2 示高温可能有诱导作用。 具体高温是如何影响 酶活的增高有重要的意义。和嘧 P a se P yN P a se 基因表达尚待进一步研究。N P a se 啶核苷激酶的作用是细胞内嘧啶的主要补救途
8 径之一。 它的酶活增高有利于高温下微生物
适应环境的变化。 参考文献
1 , . 1986, : 3976545F u jish im ae t a lU sp 3. 5 在 产率方面, 以腺苷为底物 55 ?时 RBV
, , T om o k i H am am o to K iyo sk i O k uyam aT o sh i2 2 为 23. 78% , 60 ?时为 25. 04% 。这表明 PN P a se
. . . .tada N o guch i e t a lB io sc iB io techB io ch em ? 酶活受温度影响不是很显著。 一般来说, PN 2 () 1997, 61 2: 272, 275和腺苷激酶引导的补救途径不是细胞内 ? P a se , , 3 K iyo sh i O k uyam aT om o k i H am am o to T o sh i2 8 嘌呤的主要补救途径。 微生物可能采取更为 . . . .tada N o guch i e t a lB io sc iB io techB io ch em 经济有效的途径去适应高温。 () 1996, 60 10: 1655, 16593. 6 由于采取多点采样同时比较的方法, 可以 龚晓艳, 冯胜彦, 陈蔚梅. 氨基酸与生物 资 源, 4 观察到 酶活的变化规律。 和 l N P a se PN P a se () 1998, 20 2: 11, 13 核苷水解酶酶活随进入对数期基本上呈上升趋 , . ; , . ; . 1991,Scho cn U Sch um annW JB ac te r io l 5 势, 在菌浓下降后也缓慢下降。10 基本上是所 h () 173 15: 4877, 4888有 酶活的最低点。 12 和核 l N P a se h PN P a se , ; , . . ; . 1993,W u L i junW e lk e rNEJB ac te r io l 苷水解酶酶活变化不一致, 酶活开始 l PN P a se 6 () 175 8: 2465, 2469回升, 可能与衰亡细菌分解物的诱导有关, 而核
. . , . , D av idW P a rk in B en jam in AH o ren ste in苷水解酶酶活继续下降。 酶活变化与 P yN P a se 7 相似。不与它们同处一操 . . . . . 1991,l ? PN P a se PN P a se D o r ina RA bdu lah e t a lJB io lC h em
纵元, 规律有些差异。 () 266 31: 20658, 20665
()沈同, 王镜岩, 赵邦悌等. 生物化学 下册. 高等 3. 7 本实验室曾用高温锻炼培养得到 产RBV 8 教育出版社, 298, 308, 311 E ffec t o f G row th T em p e ra tu re o n N u c leo s ide P ho sp ho ry la se
Zh an g W enw e i F en g Sh en gyan
() , 430072L if e sch oo l of W u h a n U n iv e rs ity W u h a n
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