菌种的扩大培养就是把保藏的菌

范文一：菌种的扩大培养就是把保藏的菌种

菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。

作为生产用的种子，必须具备如下的条件：

①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速生长；

②生理性状稳定；

③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求；

④无杂菌污染（不带杂菌）；

⑤生产能力稳定。

一、种子的制备过程

种子制备的过程大致可分为实验室种子制备阶段和生产车间种子制备阶段。实验室种子制备阶段是指琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养）或液体摇瓶培养；生产车间种子制备阶段是种子罐扩大培养。

（一）、实验室种子的制备

实验室种子的制备一般采用两种方式：固体孢子培养法和液体种子培养法。对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌；对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。

１、孢子的制备

（1）细菌的制备

细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，培养温度一般为37?C 。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。

（2）霉菌孢子的制备

霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基，培养的温度一般为25~28?C ，培养时间一般为4~14天。

（3）放线菌孢子的制备

放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等，培养温度一般为28?C ，培养时间为5~14天。

２、液体种子制备

（1）好氧培养：

对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。试管→三角瓶→摇床→种子罐。

（2）厌氧培养：对于酵母菌，试管→三角瓶→卡式罐→种子罐。

（二）、生产车间种子制备

实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。

种子罐培养一方面使菌种获得足够的数量，另一方面种子罐中的培养基更接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，譬如通无菌空气，搅拌形式等等，以使菌体适应发酵环境。

1、种子罐的作用

主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。

2、种子罐级数的确定

种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。种子罐的级数取决于菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度、所采用发酵罐的容积等。对于细菌来说，菌体生长快，种子用量比例少，级数也较少，一般采用二级发酵，即茄子瓶→种子罐→发酵罐。对于霉菌来说，霉菌生长较慢，如青霉菌，需要三级发酵，即孢子悬浮液→一级种子罐（27?C,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27?C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐。对于放线菌来说，放线菌生长更慢，采用四级发酵。对于酵母菌来说，酵母生长比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子。

确定种子罐级数需注意一些问题。种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会。但种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会。虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。

二、种子质量的控制

（一）、影响孢子质量的因素及控制

影响孢子质量的因素主要有培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间。

1、培养基

生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg 、Cu 、Ba 能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。水质对孢子的质量也有影响，地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。

控制措施是：

①培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用；

②严格控制灭菌后培养基的质量

③斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间；

④供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。

２、培养条件

（1）温度

温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。

（2）湿度

制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。

3、培养时间和冷藏时间

（1）培养时间 2+2+2+

一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。控制措施是孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。

（2）冷藏时间

斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4?C 冰箱保存，发现冷藏7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。

冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6? C 冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。

（二）、影响种子质量的因素及控制

影响种子质量的因素主要有培养基、培养条件、种龄、接种量。

1、培养基

培养基的营养成分要适合种子培养的需要，选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高，营养成分要尽可能与发酵培养基相近。

2、培养条件

（1）温度

（2）通气量

在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。

3、种龄

种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。

4、接种量

接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或

者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。

通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%

三、种子质量标准

1、细胞或菌体

包括菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等。单细胞要求菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。

2、生化指标

包括种子液的糖、氮、磷的含量和pH 变化、产物生成量、酶活力。

在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。

四、种子异常情况

包括菌种生长速度过快或过慢；菌丝结团、菌丝粘壁。

范文二：生产菌种的扩大培养与保藏

目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左

右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。要从保藏在试管中的微

生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。其生产方

法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长

的快慢；产孢子能力的大小；及对营养、温度、需氧等条件的要求均有所不同。因

此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、

数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提

高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。

：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种

接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和

质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。

发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：

（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；

（2）生理形状稳定；

（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；

（4）无杂菌污染；

（5）保持稳定的生产能力。

在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段：

（1）实验室种子制备阶段

（2）生产车间种子制备阶段

实验室种子的制备一般采用两种方式：

对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养

孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子

能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。

（一）孢子的制备

1，细菌孢子的制备

细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37?。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。

2，霉菌孢子的制备

霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。

培养的温度一般为25~28?。培养时间一般为4~14天。

3，放线菌孢子的制备

放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的

营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28?。培养时间为5~14天。

（二）液体种子制备

1，好氧培养

对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。

将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为

种子。其过程如下：

试管?三角瓶?摇床?种子罐

2，厌氧培养

对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的制备过程如下：

试管?三角瓶?卡式罐?种子罐

例如生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基（培养基配制：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克琼脂与升水中）的斜面上，于4?冰箱内保藏。每年移种3-4次。将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25?培养2-3天后，再扩大至含有250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25?培养2天后，移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培养罐中，于15-20?培养3-5天即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角

瓶到卡氏培养罐培养期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有利

与酵母菌的增殖。

实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不

同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如

果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液

中均匀分布，获得相同的培养条件。

1，种子罐的作用：

主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一

定的菌体量，以利于产物的合成。

2，种子罐级数的确定

：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：

（1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；

（2）所采用发酵罐的容积。

比如：

：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。

茄子瓶?种子罐?发酵罐

：生长较慢，如青霉菌，三级发酵

孢子悬浮液?一级种子罐（27?,40小时孢子发芽，产生菌丝）?二级种子罐（27?，10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）?发酵罐

：生长更慢，采用四级发酵

：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子

3，确定种子罐级数需注意的问题

（1）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会

（2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染

菌机会

（3）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有

关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种

子罐的级数。

影响孢子质量的因素通常有：培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间等。

1，培养基

生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。

例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品

种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨

或骨胨对孢子影响也不同。原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量

2+2+2+不同，如微量元素Mg 、Cu 、Ba能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会

影响孢子的质量。

水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子

质量。

菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的

菌落类型也越多，不利于生产的稳定。

：

（1）培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用；

（2）严格控制灭菌后培养基的质量；

（3）斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间；

（4）供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基

则采用较复杂的有机氮源。

2，培养条件

（1）温度

温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于37?培

养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价

降低等现象。一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。

（2）湿度

制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。例如土霉素生

产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在

含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发

呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管

下部冷凝水多而不利于孢子的形成。从表中看出相对湿度在40%~45%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。

表7-1 不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响

相对湿度（%）斜面外观活孢子计数（亿/支）

16.5~19 1.2 上部稀薄、下部稠略黄

25~36 2.3 上部薄、中部均匀发白

40~45 5.7 一片白，孢子丰富，稍皱

3，培养时间和冷藏时间

（1）培养时间

一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶

段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。

：

孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培

养。

（2）冷藏时间

斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面

培养4天左右即于4?冰箱保存，发现冷藏7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。

冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6?冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。

4，接种量

接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。

二、影响种子质量的因素及控制

生产过程中影响种子质量的因素通常有：孢子的质量、培养基、培养条件、种

龄、接种量。

1，培养基

种子培养基要满足以下要求：

（1）营养成分适合种子培养的需要

（2）选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；

（3）营养上要易于被菌体直接吸收和利用；

（4）营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高

（5）营养成分要尽可能与发酵培养基相近。

2，培养条件

（1）温度

（2）通气量

在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以

提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况

下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。

3，种龄

：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时

间。

通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培

养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，

造成发酵前期生长缓慢。

不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来

确定。如嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好（见下图）。

4，接种量

：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。

接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量

可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂

菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影

响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发

酵罐的生产率。

通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%

种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必

须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获

得优良种子。因此在生产过程中通常进行以下两项检查。

（1）菌种稳定性的检查

（2）无（杂菌）检查

1，细胞或菌体

菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）

单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；

霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和

内含物情况好。

2，生化指标

种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。

3，产物生成量

在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物

生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。

4，酶活力

种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。

菌种生长速度，过快或过慢

菌丝结团

菌丝粘壁

斜面菌种?一级种子培养?二级种子培养?发酵罐

1，斜面菌种的培养

菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得

混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮而不含

或少含糖为原则。

(1)斜面培养基组成

葡萄糖 0.1%，蛋白陈 1.0%，牛肉膏 1.0%，氯化钠 0.5%，琼脂 2.0~2.5%，

pH 7.0~7.2（传代和保藏斜面不加葡萄糖）。

(2)培养条件

33~34?，培养18~24h。

2，一级种子培养

一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，

多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。

(1)培养基组成

葡萄糖 2.5%，尿素 0.5%，硫酸镁 0.04%，磷酸氢二钾 0.1%，玉米浆

2.5~3.5%(按质增减)，硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm，pH7.0。

(2)培养条件

用1000mL三角瓶装入培养基200mI，灭菌后置于冲程7.6cm、频率96次/min

的往复式摇床上振荡培养12h，培养温度33~34?。

(3)一级种子质量要求

种龄：12h，pH值：6.4?0.1 光密度：净增OD值0.5以上残糖：0.5％以下无菌检查：(-) 噬菌体检查：(-)

镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐

革兰氏阳性反应。

3，二级种子培养

为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到

种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。

(1)培养基组成

T6-13 B9 T738 AS1.299 培养基组成（%）

2.5 2.5 2.5 水解糖 2.5

2.5-3.5 2.5-3.5 2.5 玉米浆 2.5-3.5

0.15 0.2 0.1 磷酸氢二钾 0.15

0.04 0.05 0.04 硫酸镁 0.04

0.4 0.5 0.5 尿素 0.4

++2 2 2 Fe（ppm） 2

++2 2 2 Mn（ppm） 2

6.8-7.0 7.0 6.5-6.8 pH 6.8-7.0

(2)培养条件

接种量：0.8~1.0％

培养温度：32~34?

培养时间：7~8h

通风量：

50L种子罐1:0.5

搅拌转速340r／min；

250L种子罐1:0.3

搅拌转速300r／ min

500L种子罐1:0.25

搅拌转速230r／ min

(3)二级种子的质量要求种龄：7~8h

pH：7.2左右

OD值净增0.5左右无菌检查(-)

噬菌体检查(-)

一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍，第2级到第

3级为4-6倍。

1，实验室扩大培养

2，车间扩大培养

生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移

种入一个种子罐；从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。

（1）从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种

通常有两种方式

2，从种子罐接种

1、菌种保藏的意义

菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有

关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生

物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时

还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。2、菌种保藏的

原理

菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代

谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧

状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。

一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑

到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。

3、菌种保藏的方法

（1）斜面低温保藏法

将菌株接种于合适斜面培养基上，待生长好后置于4冰箱保藏，每隔一定时间进行移接培养后再将新斜面继续保藏。

这种保藏方法简单，存活率高，易于推广，经常使用的菌种可采用这种方法。

其缺点是菌种仍有一定强度的代谢活动条件，保存时间不长，而且传代多，因此菌

种客易产生变异。

（2）石蜡油封保藏法

将生长好的新鲜斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层要高出斜面上

端1cm，使之与空气隔绝，然后垂直放于室温或冰箱内保藏即可。

这种方法也比较简便，且保藏时间一般可长达l年以上。适于保存部分霉菌、酵母菌、放线菌，但对细菌效果较差，对某些能同化烃类的微生物则不适用。

（3）砂土管保藏法

将孢子悬浮液转移至灭过菌的砂土管中，于真空干燥器内用真空泵抽干，再转

至有干燥剂的容器中，密封低温保藏。本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得

以栖息。适用于细菌的芽孢、霉菌和放线菌孢子的保藏，不适于对干燥敏感的无芽

孢的细菌和酵母菌。主要包括砂土制备和真空抽干两步。

（4）冷冻干燥法

此法的原理是在低温下迅速将细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下

使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异和死亡，因

而能长期保存，一般为5~10年。微生物在此条件下易死亡，所以需加入一些物质

作保护剂，一般常用的是脱脂牛奶、血清等。该法存活率高，变异率低，并能广泛

适用于细菌（有芽孢和无芽孢的）、酵母、霉菌孢子、放线菌孢子和病毒等，因此是

目前广泛采用的好方法。其缺点是手续麻烦，操作复杂，要求严格，并需有一定设

备条件。

（5）超低温保藏法

由于现在超低温冰箱的使用已较普及，所以菌种的超低温保藏法在生产企业和

研究机构已得到广泛应用。该方法的要点是：将要保藏的菌种置于10%甘油或二甲

基亚砜保护剂中，密封于试管或安瓿管中，然后将其放入超低温冰箱中于-70?下保

藏。该法简便易行，而且保藏效果较好。

微生物具有生命活动能力，其世代时间一般是很短的，在传代过程中易发生变

异甚至死亡，因此常常造成工业生产菌种的退化，并有可能使优良菌种丢失，所以，

如何保持菌种优良性状的稳定是研究菌种保藏的重要课题。

（一）微生物菌种的衰退

菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态

特征逐渐减退或消失的现象。常见的菌种衰退在形态上表现为分生孢子的减少或菌

落颜色的改变。在生理上常指菌种发酵能力的降低，有些菌的抗噬菌体能力下降。

对诱变育种而获得的高产变异株则常表现出恢复野生型性状等。但菌种的真正退化

必须与由于环境原因变化而引起菌种形态、和生理上的变异区别开来。如培养基中

微量元素缺乏会导致孢子数量减少，也会引起孢子颜色的改变。此外，温度、pH、

不同碳氮源都会导致菌种变化。但只要一旦恢复正常条件，这些现象就会消失。此

外，杂菌污染也会造成菌种退化的假象。因此，必须正确判断是否退化，才能找出

正确的解决办法。一般菌种退化是从量变到质变逐渐发生的，同时也是整个群体中

产量降低及其相联系的种种特性的变化，而不是指单个细胞的改变。

引起菌种退化的原因主要有：

1、基因突变

菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变则

会引起产量下降，如果控制孢子生成的基因发生负突变则孢子性能就会下降。当然，

这些负突变都是自发形成的。经常处于旺盛生长状态的细胞比休眼状态细胞发生突

变的机率大得多。在发酵生产中常用营养缺陷型突变株，如缺陷型发生回复突变就

Serratia marcescens)H-2892菌株生产力为会使产量水平下降。如粘质赛氏杆菌(

18g/L组氨酸，经5次传代后因回复突变型增多，产量下降至4g/L。很多抗生素生物合成、产生气生菌丝和色素等性状都部分或全部受质粒基因控制。当菌株连续传

代、菌体发生质粒脱落而出现大量光秃型菌落，则生产能力也显著下降。

2、变异菌株性状分离

变异菌株性状分离也会引起高产型状的丧失。在菌种筛选工作中经常遇到初筛

摇瓶产量很高，复筛产量逐渐下降而被淘汰的现象，在霉菌中更为常见。这是一种

广义的退化现象。当诱变的单菌落是由一个以上孢子或细胞形成，而其中只有一个

孢子或细胞是高产时，在移接传代过程中，这个高产菌株数量减少，当然产量也就

下降。即使菌落是由一个孢子或单个细胞形成，只要它是多核细胞，在诱发突变中

核的变化不会都一样，随着菌种传代和核的分离也会使性状表现多样化，产量也会

随之变化，即使是单核孢子发生突变时，如果双链DNA上仅一条链上某个位点发生变化，经移殖后也会出现性状分离。因此一个较稳定的变异株的获得必须经过多次

分离纯化。为了得到较多纯种，有人考虑提高诱变剂量，使单核细胞DNA双链中一

条链的某一点发生突变，另一条链完全失活不再复制来提高纯菌产生率。通过实验

得到下表所示数据。

不同剂量紫外线处理裂殖酵母时不纯菌落百分数

剂量菌落总数突变菌落数突变频率不纯菌落

（以存活率（突变菌落（%）纯不纯

3）计，%） /10

12165 1 0.08 100（对照） — —

12060 13 2 80~100 12 43

8553 46 27 60~80 20 30

4922 65 16.7 20~60 17 21

9884 195 22.6 1~20 28 13

诱变突变株的稳定性和诱变剂作用机制有关，一般认为诱发DNA碱基转换或颠换时不稳定菌株出现较多，而诱发缺失交界时不稳定菌株出现较少，因为缺失是不

能回复的。

3、连续传代

连续传代也是菌种退化的直接原因。个别细胞性状改变不足以引起菌种退化，

经多次传代，退化细胞在数量上占优势，于是退化性状表现逐步明朗化，最终成为

一株退化菌株。以芽孢杆菌的黄嘌呤缺陷型在斜面上移殖代数对回复突变率和产量

的关系为例，如下表所示。

产腺苷的黄嘌呤缺陷型菌株在接种传代过程中产量和回复子数量间的关系实移接腺苷产量每代斜面保存时间（天）回复子比数验代数（g/L）

6 1 0 147 1/4.5×1013.5

62 2 133，14 1/2.4×10 14.9

53 6 47，3，9，3，71，14 1/2.2×10 10.7

54 7 47，3，9，3，13，58，14 1/3.5×10 13.1

35 9 47，3，9，3，13，8，3，47，4 1/5.3×10 8.1

36 12 47，3，9，3，13，8，3，4，14，6，6，31 1/1.0×10 7.4

由上表可见，虽菌种总的保存时间都是147天，但随着移植代数的增加，回复

突变率也增加，腺苷产量下降。这也说明，退化并不突然明显，而是当退化细胞在

繁殖速率上大于正常细胞时，每移植一代，使退化细胞的优势更为显著，从而导致

退化。

4、其它因素

其它如温度、湿度、培养基成分及各种培养条件都会引起菌种的基因突变。例

在保藏菌种中基因突变率就随温度降低而减少，又例在产腺苷的黄膘吟缺陷型

中，若在培养基中加入黄嘌呤、鸟嘌呤及组氨酸和苏氨酸可降低回复突变的数量。

（二）防止菌种衰退和退化菌种的复壮

1、防止菌种衰退

防止菌种衰退的方法有：

（1）控制传代次数

基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中，繁殖越颇繁，复制的次数越多，基

因发生变化的机会也就越多。因此应该尽量避免不必要的接种和传代，把传代次数

控制在最低水平，以降低突变机率。一般情况下，斜面每移植一代，霉菌、放线菌、

芽孢杆菌在低温下可保藏半年左右，酵母可保藏3个月左右，无芽孢细菌可保藏1

个月左右。为此，生产菌种每移植一代，最好同时移植较多的斜面，以供一段时间

生产之需，这样移植次数就可减少。

（2）选择合适的培养条件

培养条件对菌种衰退有一定的影响，选择一个适合原种生长的条件可以防止菌

种衰退。另外，生产上应避免使用陈旧的斜面菌种。

（3）利用不同类型的细胞进行传代

在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含有许多核，甚至是异核体，因此

用菌丝接种时就会出现衰退和不纯的子代。而孢子一般是单核的，利用孢子来接种，

可以达到防止衰退的目的。但是这也必须注意到微生物细胞本身的特点。对构巢曲

霉来说，利用它的分生孢子传代易发生衰退而用它的子囊孢子移种则不易退化。

（4）选择合适的保藏方法

采用有效的菌种保藏方法也可以防止菌种的衰退。

由于菌种衰退的情况不同，对有些衰退原因还不甚了解，因此要切实解决具体

问题，需根据实际情况，通过实验正确地加以运用。

2、退化菌种的复壮

使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性，称为。常用的方法是对已退化菌株用一定培养条件进行单细胞分离纯化。从而限制退化菌株在数量上占优势，最后

淘汰已退化菌落而使原菌株得得以复壮。例如用高剂量UV或再配以低剂量NTG

对退化菌株进行处理，可得到较多的纯菌落，又如选择一种对退化型菌株细胞核具

有更大杀伤力的诱变剂亦可使原菌株得到复壮。但这工作量不亚于新突变株的诱变

育种，另外，用遗传方法选育不易退化的稳定菌株或采用双缺、三缺菌株及减少传

代次数等方法，都可防止菌种退化，保存稳定菌株。

范文三：菌种与种子扩大培养

菌种与种子扩大培养

2008-05-11 15:12:43| 分类：阅读337 评论0 字号：大中小订阅

1.1 微生物工业用菌种

1.1.1 发酵工业对生产菌种的要求

1) 能在易得、价廉的原料制成的培养基上迅速生长，且代谢产物产量高（目标产物的产量尽可能接近理论转化率）。目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离。

2) 发酵条件粗放、易于控制，且所需的酶活性高。

3) 菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短。发酵周期短的优点在于感染杂菌的机会减少；提高设备的利用率。

4) 根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株（微生物菌种缺少或丧失了合成某种或多种必需生长因子的能力）或调节突变菌株或野生菌株。

5) 抗杂菌、抗噬菌体能力强。

6) 菌种纯粹，遗传性状稳定（不易变异退化），以保证发酵生产和产品质量的稳定性。菌种退化，生产性能下降是生产中常碰到的问题。

7) 菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素等），以保证安全。使用新菌种时更应注意；应用食品领域更需经严格鉴定，如早期酱油生产采用黄曲霉，现已停止。

1.1.2 工业上常用的微生物

微生物的共同特性

1) 个体小、构造简单；

2) 容易培养、易于代谢；

3) 生长旺盛、繁殖迅速；

4) 适应性强、容易变异；

5) 分布广泛、种类繁多

工业上常用的微生物

发酵工业上常用的微生物有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌四大类群。要求复习微生物知识，掌握工业上常用微生物的基本形态。此处介绍其中具有工业价值的主要微生物。

细菌

细菌是自然界中分布最广、数量最多、与人类关系最为密切的一类微生物，也是发酵工业上使用最多的一种单细胞生物。细菌的一般结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体及内含物几部分；特殊结构是某些细菌所特有的，如荚膜、鞭毛、芽胞等，它们在细菌的分类鉴定中有重要的意义。

发酵工业上常用的细菌大多是杆菌，如枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、梭状芽孢杆菌大肠杆菌等。

1) 醋酸杆菌（Acetobacter ）：用于酿醋，把乙醇氧化成乙酸。

2) 假单胞菌（Pseudomonas ）

3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和CO 2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。

4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。

5) 枯草芽孢杆菌：是一类好气性的生芽孢杆菌，可用于生产淀粉酶、蛋白酶、某些氨基酸、肌苷、5’-核苷酸酶等。例如枯草杆菌BF7658是生产淀粉酶的主要菌种，枯草杆菌AS1.398是生产中性蛋白酶的主要菌种。

6) 梭状芽孢杆菌：发酵生产丙酮丁醇。

7) 棒杆菌、短杆菌：北京棒状杆菌AS1.299为谷氨酸的高产菌株。

酵母

酵母菌是工农业生产上极为重要的一类微生物，也使微生物遗传学研究的非常有价值的材料。除了广泛用于面包及酒精制造外，还应用在石油脱蜡、单细胞蛋白制造、酶制剂生产以及糖化饲料、猪血饲料发酵等许多方面。此外，从酵母菌体中还可以提取如核糖核酸、细胞色素C 、凝血质及辅酶A 等医药产品。

能产生子囊孢子并进行芽殖的酵母菌，属于有性繁殖的类型，这是鉴别酵母种属之间差别的一个重要特征。

按照洛德（Lodder ）的分类系统，酵母菌共分39属，372种。发酵工业上常用的酵母菌除了酵母属（Saccharomyces ）外，还有假丝酵母属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属及裂殖酵母属等。

1) 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）：属于酵母属，是酵母菌中最重要、应用最广泛的一类。

2) 异常汉逊氏酵母异常变种：属汉逊氏酵母属。

3) 假丝酵母属

4) 毕赤氏酵母属、汉逊氏酵母属：这两个属的酵母都是产膜酵母，在液体表面形成白色的膜，使液体浑浊，常常是酒类饮料的污染菌，它们在饮料表面形成干而皱的菌蹼，是酒精发酵工业及酿造工业的有害菌。

霉菌

霉菌与人类日常生活密切相关。除了用于传统的酿酒、制酱油外，近代广泛用于发酵工业和酶制剂工业。工业上常用的霉菌，有子囊菌纲的红曲霉、藻状菌纲的毛霉、根霉和犁头霉，以及半知菌纲的曲霉及青霉等

1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机酸。如米曲霉（Asp. oryzae）用于酿酒和L-乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、果胶酶、单宁酶等的黑曲霉(Asp. niger)。

2) 青霉属（Penicillium ）：j 既是使果实腐败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄糖酸的产生菌。

3) 根霉属（Rhizopus ）：用于米酒、黄酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机酸发酵以及甾体转化等许多方面。

4) 毛霉属（Mucor ）：产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族化合物。土曲霉：衣康酸

5) 犁头霉属（Absidia ）

放线菌

放线菌是由不同长短的纤细菌丝所形成的单细胞微生物。放线菌是抗生素的主要产生菌。除抗生素外，放线菌在甾体激素生物合成和酶制剂生产上也有广泛应用。链霉菌属是放线菌研究中最为广泛的一类。放线菌产生的抗生素能抑制其他微生物的生长，这种作用称为拮抗作用。不同抗生素对其他微生物的抑制作用是有选择性的。

噬菌体

噬菌体是寄生在细菌和放线菌细胞内的一类微生物。噬菌体的寄生性均有高度专一性，亦即一种噬菌体只能侵染某一种微生物的某个菌株。当噬菌体钻入寄主细胞后迅速增殖，引起微生物（寄主）细胞的裂解和死亡。

1.1.3 生产用菌种的保藏及选育

1.1.3.1 菌种保藏

在发酵工业中，得到一株高产、优良的菌种是一项艰苦的工作，因此，菌种保藏是微生物工业生产的重要环节。菌种保藏工作的要求在于提高菌种存活率和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来优良的生产性能。

菌种保藏的基本原理：

根据菌种的生理生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖受到抑制处于休眠状态，同时，使菌株避免污染、死亡、衰退和变异。保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽胞等）；其次是要创造一个最有利于休眠的条件，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等。

菌种保藏方法：

1) 斜面低温保藏法：将菌种接种于合适的斜面培养基上，待生长好后置于4℃冰箱保藏，每隔一定时间进行转接培养后，再将新斜面继续保藏。

2) 液体石蜡保藏法：在无菌条件下，往生长好的新鲜斜面中倒入已灭菌的液体石蜡，油层要高出斜面上端1cm ，使之与空气隔绝，然后垂直放于室温或冰箱内保藏。

3) 砂土管保藏法：将斜面培养基上长好的霉菌或放线菌孢子刮下，接到灭菌的沙土管中搅匀，置于盛有干燥剂（如CaCl 2）的容器中密封，低温保藏。

4) 冷冻干燥保藏法：在较低温度下使菌液呈冻结状态，同时抽气减压使之干燥的菌种保藏方法。

5) 液氮超低温冻结法：菌种保藏在液氮冰箱中，温度可低至－196℃。这是目前保藏菌种的新技术。

6) 硅胶保藏法：

1.1.3.2 菌种选育

根据微生物遗传变异的特点，人们在生产实践中已经试验出一套行之有效的微生物育种方法。主要包括自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程等。

一、自然选育

在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过程，叫做自然选育。菌种的自发突变往往存在两种可能性：一种是菌种衰退，生产性能下降；另一种是代谢更加旺盛，生产性能提高。具有实践经验和善于观察的工作人员，就能利用自发突变而出现的菌种性状的变化，选育出优良菌种。例如，在谷氨酸发酵过程中，人们从被噬菌体污染的发酵液中分离出了抗噬菌体的菌种。又如，在抗生素发酵生产中，从某一批次高产的发酵液取样进行分离，往往能够得到较稳定的高产菌株。但自发突变的频率较低，出现优良性状的可能较小，需坚持相当长的时间才能收到效果。

新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快速而准确的新种分离和筛选方法。

分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定。

典型的微生物新种分离筛选过程

采样原则：

1) 材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。

2) 可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。

培养方法：

培养方法可采用分批式富集培养（摇瓶培养）和恒化富集培养（连续培养）。分批式富集培养是将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此重复转种几次后，再取此富集培养物接种到固体培养基上，以获得单菌落。恒化富集培养是通过改变限制性基质的浓度，来控制不同菌株的比生长速率。

二、诱变育种

诱变育种是指用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用。诱变育种与其他育种方法相比，具有操作简便、速度快和收效大的优点，至今仍是一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。诱变育种包括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。

出发菌种是指用于诱变的原始菌种。出发菌种可以是从自然界的土样或水样中分离出来的野生型菌种；也可以是生产中正在使用的菌种；还可以从菌种保藏机构中购买。选择的原则是菌种要对诱变剂的敏感性强、变异幅度大、产量高。

为了使菌体与诱变剂均匀接触，通常要将出发菌种制成细胞（或孢子）悬浮液，再进行诱变处理。诱变剂有物理诱变剂（如紫外线、X 射线、γ射线、快中子）、化学诱变剂（如亚硝酸、硫酸二乙酯、氮芥）等。在生产实践上，选用哪种诱变剂、剂量大小、处理时间等，都要视具体的情况和条件，并经过预备实验后才能确定。

过量的紫外线照射会造成菌体丢失大段的DNA ，或使交联的DNA 无法打开，不能进行复制和转录，从而引起菌体死亡。

在正常的微生物细胞中，紫外线造成的DNA 损伤是可以得到及时修复的。若将受紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下，菌体的突变率和致死率均会下降，这就是光复活作用。

光复活作用是因为微生物等生物的细胞内存在光复活酶(photoreactivating enzyme)，即光裂合酶(photolyase)。光复活酶会识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物，此时的光复活酶没有活性。可见光光能(300-500nm)可以激活光复活酶，使之打开二聚体，将DNA 复原。与此同时，光复活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行光复活功能。

一般微生物细胞内都具有光复活酶，所以，微生物紫外线诱变育种应在避光或红光条件下操作。但因为在高剂量紫外线诱变处理后，细胞的光复活主要是致死效应的回复，突变效应不回复，所以，有时也可以采用紫外线和可见光交替处理，以增加菌体的突变率；光复活的程度与可见光照射时间、强度和温度(45-50℃温度下光复活作用最强) 等因素有关。

细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，所以称为暗修复(dark repair)或切除修复作用(excision repair)。它可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA 造成的损伤。

菌种经诱变处理后，会产生各种各样的突变类型。如何从中挑选出所需要的突变类型呢？一般要经过初筛和复筛两个阶段。下面以青霉素产生菌高产突变菌种的筛选为例说明。将经诱变处理的菌液按一定浓度稀释后，涂布在平板培养基上。培养后，将单个菌落挑到斜面培养基上，经培养后，再将斜面上的菌落逐个接种到摇瓶中，振荡培养后测它们的抗生素效价。这就是初筛。初筛中所得到的超过对照效价10%以上的菌种，再进行复筛。复筛的过程与初筛基本相同，不同的是一般将斜面上的单个菌落接种到三个摇瓶中，得出平均效价。复筛可进行1～3次。由此筛选出的高产稳定菌种还要经过小型甚至中型试验，才能用到发酵生产中。

诱变育种方法中应注意的问题

1. 出发菌株的选择

用来育种处理的起始菌株或称为出发菌株，合适的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量的菌株。首先应考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力。出发菌株的来源主要有三方面：

1) 自然界直接分离到的野生型菌株这些菌株的特点是它们的酶系统完整，染色体或DNA 未损伤，但它们的生产性能通常很差(这正是它们能在大自然中生存的原因) 。通过诱变育种，它们正突变(即产量或质量性状向好的方向改变) 的可能性大。

2) 经历过生产条件考验的菌株这些菌株已有一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。

3) 已经历多次育种处理的菌株这些菌株的染色体已有较大的损伤，某些生理功能或酶系统有缺损，产量性状已经达到了一定水平。它们负突变(即产量或质量性状向差的方向改变) 的可能性很大，可以正突变的位点已经被利用了，继续诱变处理很可能导致产量下降甚至死亡。

一般可选择(1)或(2)类菌株，第(2)类较佳，因为已证明它可以向好的方向发展。在抗生素生产菌育种中，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有所提高的菌株作出发菌株。

出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。

2. 制备菌悬液

待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期。

悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免细胞团中变异菌株与非变异菌株混杂，出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。为避免细胞团出现，可用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。对产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢。将经过一定时期培养的斜面上的孢子洗下，用多层擦镜纸过滤。

利用孢子进行诱变处理的优点是能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂，更重要的是它尽可能地避免了出现表型延迟现象。

所谓的表型延迟(phenotypic lag) 就是指某一突变在DNA 复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。表型延迟现象的出现是因为对数期细胞往往是多核的，很可能一个核发生突变，而另一个核未突变，若突变性状是隐性的，在当代并不表现出来，在筛选时就会被淘汰；若突变性状是显性的，那么，在当代就表现出来，但在进一步传代后，就会出现分离现象，造成生产性状衰退。所以应尽可能选择孢子或单倍体的细胞作为诱变对象。

另外，还有一种生理性延迟现象，就是虽然菌体发生了突变，并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍不表现出突变性状。这可以用营养缺陷型来说明。

一个发生营养缺陷型突变的菌株，产某种酶的基因已发生突变，但是由于突变前菌体内所含的酶系仍然存在，仍具有野生型表型。只有通过数次细胞分裂，细胞内正常的酶得以稀释或被分解，营养缺陷型突变的性状才会表现出来。

3. 诱变处理

仅仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用量常会造成偏差，不利于重复操作。例如，同样功率的紫外线照射诱变效应还受到紫外灯质量及其预热时间、灯与被照射物的距离、照射时间、菌悬液的浓度、厚度及其均匀程度等诸多因素的影响。另外，不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率表示诱变剂造成菌悬液中死亡菌体数占菌体总数的比率。

要确定一个合适的剂量，常常需要经过多次试验。就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。对于诱变剂的具体用量有不同

的看法。有人认为应采用高剂量，就是造成菌体致死率在90-99.9%时的剂量是合适的，这样能获得较高的正突变率，并且淘汰了大部分菌体，减轻了筛选工作的负担。许多人倾向于采用低剂量(致死率在70%-80%),甚至更低剂量(致死率在30-70%)，他们认为低剂量处理能提高正突变率，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。

诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可用同一诱变剂重复使用。因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起的变异有局限性，复合处理则可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大，因此，诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理.

抗噬菌体菌株的选育

在工业微生物发酵过程中，不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。为此，可采用以下方法：消灭噬菌体和选育抗噬菌体菌株。噬菌体易变异，要不断地选育抗噬菌体菌株。

抗噬菌体菌株选育的方法

1) 自然选育：以噬菌体为筛子，敏感的菌株不经任何诱变自然突变获得的抗性菌株。抗性突变频率低。

2) 诱变选育：敏感菌株经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上，经处理后的存活的孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。

3) 将敏感菌株经诱变因素处理后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天；再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取出菌丝进行平板分离，从中筛选抗性菌株。

抗噬菌体菌株的特性试验

1) 抗噬菌体性状的稳定性试验：抗性菌株分别在孢子培养、种子培养、发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。要多次传代考察稳定性。

2) 抗性菌株的产量试验：抗性菌株与原敏感菌株在发酵特性上有所改变，因此，有考察碳源、氮源、通气量等发酵条件对产量的影响。

3) 真正抗性与溶源性的区别试验。

三、杂交育种

杂交育种(Hybridization)一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F 因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。

有杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的微生物中更少，而且即使发生杂交，遗传重组的频率亦不高，这影响了基因重组在微生物中的应用。

四、原生质体融合

原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦可称为“细胞融合”(cell fusion)。

原生质体融合技术始于1976年, 最早是在动物细胞实验中发展起来的，后来，在酵母菌、霉菌、高等植物、以及细菌和放线菌中也得到了应用。

原生质体融合技术是继转化、转导和接合等微生物基因重组方式之后，又一个极其重要的基因重组技术。应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频率大大提高了，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于10-1(而诱变育种一般仅为10-8) 。如今，能借助原生质体融合技术进行基因重组的细胞极其广泛，包括原核微生物、真核微生物以及动植物和人体的细胞。

原生质体融合技术示意图

主要步骤为：选择亲株、制备原生质体、原生质体融合、原生质体再生及筛选优良性状的融合子。

1、选择亲株

为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。同时，为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等。可以通过诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。在进行原生质体融合前，应先测定菌株各遗传标记的稳定性，如果自发回复突变的频率过高，应考虑该菌株是否适用。

2、原生质体制备

去除细胞壁是制备原生质体的关键。一般都采用酶解法去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。有时需结合其它一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。

一些微生物的去壁方法

在菌体生长的培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解。甘氨酸的作用机理并不十分清楚，有人认为甘氨酸渗入细胞壁肽聚糖中代替D-丙氨酸的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。

不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相同。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。蔗糖的作用可能是扰乱了菌体的代谢，最适的蔗糖添加浓度随不同菌种而变化。

青霉素能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，所以，在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。

菌龄也是影响溶壁的因素之一。一般处于对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。

原生质体对渗透压极其敏感，低渗将引起细胞破裂。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。

对于不同微生物，原生质体的高渗稳定液组成也是不同的。如细菌的稳定液常用SMM 液(用于芽孢杆菌原生质体制备和融合，其主要成分是蔗糖0.5M, 顺丁烯二酸0.02M, MgCl20.02M) 和DF 液(用于棒状杆菌原生质体制备和融合，主要成分是蔗糖0.25M, 琥珀酸0.25M, EDTA0.001M, K2HPO40.02M, KH2PO40.11M , MgCl2 0.01M)。在链霉菌中用得较多的是P 液(主要成分蔗糖0.3M, MgCl20.01M, CaCl20.25M及少量磷酸盐和无机离子) 。真菌中广为使用的

是0.7M NaCl或0.6M MgSO4溶液，高渗稳定液使原生质体内空泡增大，浮力增加，易与菌丝碎片分开。

3、原生质体融合

原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有所差别，如再生培养基成分及培养温度等。但最重要的一个共同点是都需要高渗透压。

能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。细菌一般再生率为3-10%。但有资料报道，在再生培养基中添加牛血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的再生率达100%。真菌再生率一般在20-80%。链霉菌再生率最高可达50%。

4、原生质体再生

为获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力使原生质体破裂。

涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。因为若有残存的菌体存在，它们将会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。

另外，菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生。

5、筛选优良性状融合重组子

原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代称为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-。

重组子的检出方法有两种：直接法和间接法。

直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子；

间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。

从实际效果来看，直接法虽然方便，但由于选择条件的限制，对某些重组子的生长有影响。虽然间接法操作上要多一步，但不会因营养关系限制某些重组子的再生。特别是对一些有表型延迟现象的遗传标记，宜用间接法。若原生质体融合的两亲株带有抗药性遗传标记，可以用类似的方法筛选重组子。

原生质体融合后，两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生多种多样的基因组合，从而得到多种类型的重组子，而且参与融合的亲株数不限于两个，可以多至三、四个。这些都是常规杂交育种不可能达到的。

以上获得的还仅仅是融合重组子，还需要对它们进行生理生化测定及生产性能的测定，以确定它是否是符合育种要求的优良菌株。

五、基因工程育种

基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA 分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA 分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。

图：基因工程的主要过程

目标基因可以从酶切的供体细胞染色体碎片中获得，或首先提取目标产物的mRNA ，然后将其反转录合成cDNA 而获得，或从目标蛋白的氨基酸顺序推测出基因的碱基顺序，人工合成DNA 片段。

将目标基因的两端和载体DNA 的两端用特定的核酸内切酶酶切后，让它们连接成环状的重组DNA 。因为这是在细胞外进行的基因重组过程，所以，有人将基因工程又称为体外重组DNA 技术。

以质粒为载体的重组体DNA 可以通过转化进入受体细胞，而用噬菌体为载体的重组DNA 可以通过转导或转染进入受体细胞。

重组DNA 在受体细胞中将自主复制扩增。多拷贝的重组DNA 将有利于积累更多的目标产物。

基因工程的操作有着非常强的方向性，但是，最终获得的并非是目标重组体的纯培养物，因为还有许多其它的细胞存在，如：目标基因可能没有被重组、重组的目标基因可能是反向的、重组DNA 无法稳定存在于受体细胞中等。所以，筛选仍然是基因工程育种工作中的重要内容。因为在载体DNA 中可以较容易地设置多种特定遗传标记(如药物抗性标记) ，因此筛选工作的目标性和有效性很高，是其它育种工作所无法比拟的。

1.1.3.3 菌种筛选方法

所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。

菌种筛选方案

在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，应精确测定每个菌株的生产指标。

筛选方案：

第三轮、第四轮…(操作同上)

初筛和复筛工作可以连续进行多轮，直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选方案，不仅能以较少的工作量获得良好的效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。

筛选获得的优良菌株还将进一步做工业生产试验，考察它们对工艺条件和原料等的适应性及遗传稳定性。

抗性筛选

抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10–6频率的突变体存在，就容易筛选出来。抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段。

1. 一次性筛选法

一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。抗噬菌体菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。

耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。耐高温菌株也常采用此法筛选。将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。

耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。

耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。

2. 阶梯性筛选法

药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的代谢物结构类似物来筛选，大量细胞中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。

因为药物抗性常受多位点基因的控制，所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，而对高浓度药物敏感，经“驯化”或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏，所以说，阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下。

(1)梯度平板法(Gradient plate) 先将10ml 左右的一般固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结成斜面，然后将皿底放平，再倒入7-10ml 含适当浓度的药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上层培养基越薄的部位，其药物浓度越稀，造成一由稀到浓的药物浓度渐增的梯度。再将菌液涂布在梯度平板上，药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物高浓度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会形成的明显界线。

梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，以提高相应代谢产物的产量。如异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构类似。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变有可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合成更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实验证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性的。这样，通过梯度培养法就可以达到定向培育生产吡哆醇的高产菌株。

阶梯性筛选法也有一定的缺点，它们只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。

(2) 纸片扩散法

纸片扩散法与梯度平板法的原理类似，用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。

推理选育 (Rational Selection)

抗生素产生菌的推理选育是建立在抗生素生物合成机制已知或较清楚的基础上按需要定向选育的一种方法。近几年研究较多, 应用较广, 成效亦较为显著。就一些抗生素而言, 经过多年的研究, 其代谢机理已较清楚。实践证明, 推理选育在抗生素育种上的应用其效果远比传统的随机筛选优越得多, 只需适量筛选, 即可达到所期望的目的。

培养基的调整

一个突变株由于基因突变，失去生理特性的平衡，同时也因此降低了与原来环境条件的适应能力。由于这种环境因素的选择作用，不适应的突变株优良性状不能表达，甚至被淘汰。

在实际选育中，当选育到一个优良变株时，要改变环境条件，即调整培养基配方和培养条件，使变株处于一个适应的环境中得到充分表达的机会，使高产性状及其他优良特性完全发挥出来，这就是表达型＝基因型＋环境的作用。

基于上述道理，对诱变1～2代后的优良菌株，要进行培养基和培养条件的调整，使它在短时间内的群体遗传结构占优势，从而表现出更高的生产性能，发酵单位达到最佳水平。

培养基调整方法：正交设计和相应面方法

1.1.4 防止菌种衰退的措施

菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。常见的菌种衰退在形态上表现为分生孢子的减少或菌落颜色的改变。在生理上常指菌种发酵力的降低，或抗噬菌体能力降低。对通过诱变育种而获得的高产变异株则常表现出恢复野生型性状等。

但菌种的真正退化必须与由于环境原因变化而引起菌落形态和生理上的变异区别开来。如培养基中微量元素缺乏会导致孢子数量减少，也会引起孢子颜色的改变。此外，温度、pH 值、不同碳氮源都会导致菌种变化。但只要一旦恢复正常条件，这些现象就会消失。杂菌污染也会造成菌种退化的假象。因此，必须正确判断是否退化，才能找出正确的解决办法。一般菌种退化是从量变到质变逐渐发生的，同时也是整个群体中产量降低及其相联系的种种特性的变化，而不是指单个细胞的变化。

引起菌种退化的原因：

1) 核基因突变：菌种退化的主要原因是有关基因的负突变，这些负突变都是自发形成的。在发酵生产中常用营养缺陷型突变株，如缺陷型发生回复突变就会使产量水平下降。

2) 连续传代：连续传代也是菌种退化的直接原因。个别细胞性状改变不足以引起菌种退化，经多次传代，退化细胞在数量上占优势，于是退化性状表现逐步明朗化，最终成为一株退化菌株。

3) 其它因素：温度、湿度、培养基成分及各种培养条件都会引起菌种的基因突变。例如在菌种保藏中基因突变率就随温度降低而减少。

菌种的复壮

菌种发生衰退，并不是所有菌体都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的、具有更强生命力的菌体。因此，可采用单细胞菌体分离的措施淘汰已退化菌体，获得具有原来性状的菌株。也可以改变培养条件，达到复壮的目的。

纯种分离的方法常用的有三种：稀释分离法、平板划线法和组织分离法。稀释分离法是通过不断的稀释手段使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，这样分散的菌种就被固定在原处而形成菌落。平板划线法是用划线的方法将混杂的微生物在平板表面分散开来，最后以单个菌体细胞生长繁殖，形成单个菌落，达到分离，得到纯种。

1.2 种子扩大培养

1.2.1 种子扩大培养的任务

将保存于砂土管、冷冻干燥管、斜面中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程，称为种子扩大培养，这些纯种培养物称为种子。

工业发酵用的微生物菌种必须经过扩大培养，增加细胞数量，同时培养出强壮、健康、活性高的细胞，才能满足大规模工业化生产的需要。菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。

1.2.2 工业微生物的培养类型

工业微生物的培养法分为静置培养和通气培养两大类型。

静置培养法，即将接有菌种的试管斜面或克氏瓶转接到三角瓶液体培养基中静置培养，在转接到种子罐的培养过程中也无需通风。

通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。

在静置和通气培养两类方法中又可分为液体培养和固体培养两大类型，其中每一类型又有表面培养与深层培养之分。对于好氧微生物，一般先用克氏瓶或茄子瓶进行扩大，再转接到曲盘扩大培养，或接种到装有液体培养基的三角瓶中在摇床上振荡培养。

主要培养方法及特点

1．种子扩大培养阶段

1) 液体培养法：包括液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。摇瓶通气量大小与摇瓶机型式、转数、振程(或偏心距) 、三角瓶容量、装料量有关。

2) 表面培养法：包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。

3) 固体培养法：包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。

2．大规模生产阶段

(1)表面培养：

表面培养是一种好氧静置培养方法。针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固态表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液(气固界面向培养基内传递，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。这种培养方法菌的生长速度与培养基深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度也越快。氧的供给常成为发酵的限速因素，所以发酵周期长，占地面积大。优点是不需要深层培养时的搅拌和通气，节省动力。如醋酸、柠檬酸发酵和曲盘制曲。

(2)固体培养

固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。

固体培养具有以下优点：

1) 原料：以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适量水分、无机盐等。培养基组成简单。

2) 防止污染：利用霉菌能在水分较低的基质表面进行增殖的特性，在这种条件下，细菌生长不好，因此不易引起细菌污染。

3) 通气：无论浅盘或深层固体通风制曲，可以在曲房周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度，并且能根据菌种在不同生理时期的需要，灵活加以调节。在固体培养中，氧气是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通气搅拌供给氧气节能。

(3)液体深层培养

用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。

特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。

深层培养基本操作的3个控制点：

1) 灭菌：发酵工业要求纯培养，因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。所以发酵罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和发酵罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于发酵罐内。

2) 温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行发酵，由于随着微生物的增殖和发酵会发热、搅拌产热等，所以为维持温度恒定，须在夹套中以冷却水循环流过。

3) 通气、搅拌：空气进入发酵罐前先经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进人，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌的目的除了溶解氧之外，可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内，促进热传递，以及为调节pH 而使加入的酸和碱均匀分散等。

(4)载体培养

载体培养脱胎于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。

特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制，发酵结束，只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。

载体的取材必须耐蒸汽加热或药物灭菌，多孔结构既有足够的表面积，又能允许空气流通。

1.2.3 影响种子质量的主要因素

菌种扩大培养的关键就是搞好种子罐的扩大培养，影响种子罐培养的主要因素包括营养条件、培养条件、染菌的控制、种子罐的级数和接种量控制等等。

培养基：对于某一菌种和具体设备条件来说，最适宜的培养基成分配比完全应该进行多因素的优选，通过对比试验去确定，从而最大地发挥菌种的特性，提高产量。

2) 种龄与接种量：种子罐中培养的菌种开始移入下一级种子罐或发酵罐的培养时间称为种龄。通常以菌体处于生长旺盛期（对数生长期）为合适。移入的种子液体积与接种后培养液体积的比例即为接种量。接种量取决于菌种在发酵罐中生长繁殖速度，接种量的大小直接影响发酵周期。一般地，细菌0.5～1% ，酵母菌10～15%。

温度：温度直接影响微生物生长和合成酶。

4) pH 值：由于环境中pH 值不同，微生物原生质膜（具有胶体性质）所带的电荷也不同，从而影响微生物对营养物质的吸收、酶的合成及其活性、代谢途径和细胞膜的通透性的变化。各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH 值。在种子扩培过程中。控制pH 值，不但可以保证微生物种子的很好生长，而且可以防止杂菌污染。

5) 通气和搅拌：通气可以供给大量的氧，而搅拌则能使通气的效果更好。

6) 泡沫：泡沫的持久存在影响微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排出；影响设备的利用率；易招致染菌。

7) 染菌的控制：必须加强接种室的消毒管理工作，定期检查消毒效果，严格无菌操作技术。

8) 种子罐级数：制备种子需逐级扩大培养的次数。种子罐级数一般根据菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖速度以及采用发酵罐体积而定。

种子质量要求

1) 纯：具体检验方法有(1)显微镜观察；(2)斜面接入种子液进行无菌试验，观察有无异常菌落出现；(3)有些要检查有无噬菌体

2) 活力旺盛：镜检观察菌体形态，是否粗壮、整齐、处于分裂期

3) 足够的菌体浓度：浊度测定（A640）

范文四：微生物工业菌种的扩大培养

来源：青岛海博

作为生产用的种子，必须具备如下的条件：

①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速生长；

②生理性状稳定；

③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求；

④无杂菌污染（不带杂菌）；

⑤生产能力稳定。

一、种子的制备过程

（一）、实验室种子的制备

１、孢子的制备

（1）细菌的制备

细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，培养温度一般为37?C。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。

（2）霉菌孢子的制备

霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基，培养的温度一般为25~28?C，培养时间一般为4~14天。

（3）放线菌孢子的制备

２、液体种子制备

（1）好氧培养：

（2）厌氧培养：对于酵母菌，试管→三角瓶→卡式罐→种子罐。

（二）、生产车间种子制备

1、种子罐的作用

主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。

2、种子罐级数的确定

二、种子质量的控制

（一）、影响孢子质量的因素及控制

影响孢子质量的因素主要有培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间。

1、培养基

生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg2+ ?、Cu2+ ?、Ba2+ 能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。水质对孢子的质量也有影响，地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。

控制措施是：

①培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用；

②严格控制灭菌后培养基的质量

③斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间；

④供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。

２、培养条件

（1）温度

温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。

（2）湿度

制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。

3、培养时间和冷藏时间

（1）培养时间

（2）冷藏时间

斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4?C冰箱保存，发现冷藏7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。

冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6? C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。

（二）、影响种子质量的因素及控制

影响种子质量的因素主要有培养基、培养条件、种龄、接种量。

1、培养基

2、培养条件

（1）温度

（2）通气量

在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。

3、种龄

4、接种量

接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。

通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%

三、种子质量标准

1、细胞或菌体

2、生化指标

包括种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化、产物生成量、酶活力。

四、种子异常情况

包括菌种生长速度过快或过慢；菌丝结团、菌丝粘壁。

范文五：微生物菌种的扩大培养技术

菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序，该工序又称之为种子制备。种子制备不仅要使菌体数量增加，更重要的是，经过种子制备培养出具有高质量的生产种子供发酵生产使用。因此，如何提供发酵产量高、生产性能稳定、数量足够而且不被其他杂菌污染的生产菌种，是种子制备工艺的关键。

种子扩大培养的任务

工业生产规模越大，每次发酵所需的种子就越多。要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。因此，种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的菌体，而且还要获得活力旺盛的、接种数量足够的菌体。对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数，抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖较慢，常常采用三级种子扩大培养。一般50 t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵，如链霉素生产。有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵。而谷氨酸及其他氨基酸的发酵所采用的菌种是细菌，生长繁殖速度很快，一般采用二级发酵。

种子制备的过程

细菌、酵母菌的种子制备就是一个细胞数量增加的过程。细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。细菌培养温度大多数为37 ℃，少数为28 ℃，细菌菌体培养时间一般1～2天，产芽孢的细菌则需培养5～10天。

霉菌、放线菌的种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。

⒈ 孢子制备

孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点。

⑴ 放线菌孢子的制备　放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳源和氮源不要太丰富(碳源约为1％，氮源不超过0.5％)，碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境，不利于放线菌孢子的形成，氮源丰富则有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。一般情况下，干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28 ℃，少数为37 ℃，培养时间为5～14天。

采用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。采用母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异，采用子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。菌种进入种子罐有两种方法。一种为孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子罐。此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成为发酵生产的一个方向。另一种方法为摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间。

⑵ 霉菌孢子的制备　霉菌的孢子培养，一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖，而且这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为25～28 ℃，培养时间为4～14天。

⒉ 种子制备

种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。种子制备所使用的培养基和其他工艺条件，都要有利于孢子发芽、菌丝繁殖或菌体增殖。

⑴ 摇瓶种子制备　某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。摇瓶相当于微缩了的种子罐，其培养基配方和培养条件与种子罐相似。

摇瓶种子进罐，常采用母瓶、子瓶两级培养，有时母瓶种子也可以直接进罐。种子培养基要求比较丰富和完全，并易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓，子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近种子罐的培养基配方。

⑵ 种子罐种子制备　种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子，把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子，将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。

种子罐的级数主要决定于菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。种子制备的目的是要形成一定数量和质量的菌体。孢子发芽和菌体开始繁殖时，菌体量很少，在小型罐内即可进行。发酵的目的是获得大量的发酵产物。产物是在菌体大量形成并达到一定生长阶段后形成的，需要在大型发酵罐内才能进行。同时若干发酵产物的产生菌，其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此，将两个目的不同、工艺要求有差异的生物学过程放在一个大罐内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。种子罐级数减少，有利于生产过程的简化及发酵过程的控制，可以减少因种子生长异常而造成发酵的波动。

种子培养

种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条件和培养方法，从而保证种子正常生长。工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型，静置培养法即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。而通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性培养。

⒈ 表面培养法

表面培养法是一种好氧静置培养法。针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固体表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养基内传递。这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度越快。

⒉ 固体培养法

固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称为曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。

⒊ 液体深层培养

液体深层种子罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。其特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。

⑴ 深层培养基本操作的三个控制点

① 灭菌　发酵工业要求纯培养，因此在种子培养前必须对培养基进行加热灭菌。所以种子罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和种子罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于种子罐内。

② 温度控制　培养基灭菌后，冷却至培养温度进行种子培养，由于随着微生物的生长和繁殖会产生热量，搅拌也会产生热量，所以要维持温度恒定，需在夹套中或盘管中通冷却水循环。

③ 通气、搅拌　空气进入种子罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌的目的除增加溶解氧以外，可使培养液中的微生物均匀地分散在种子罐内，促进热传递，以及pH均充，并使加入的酸和碱均匀分散等。

⑵ 几种深层培养法

① 控制培养法　根据罐内部的变化情况，掌握短暂时间内状态变量的变化以及可能测定的环境因子对微生物代谢活动的影响，并以此为基础进行控制培养，以达到产物的最优培养条件。为此，用测定状态变量的传感器取得数据，经电子计算机进行综合分析，再将其结果作为反馈调节的信号，将环境(培养条件)控制于给定的基准内。这就叫做电子计算机控制培养。目前已大量用于露天大罐啤酒发酵。

② 载体培养法　载体培养法脱胎于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固体基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制。发酵结束，只要将菌体和培养基挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。

③ 两步法　在酶制剂的两步法液体深层培养中，每一步菌体相同而培养条件不同，因为微生物生长与产酶的最适条件有很大的差异。例如往培养基中添加葡萄糖能大大增加菌体或菌丝的生长，然而却严重阻碍许多种酶的合成。加强培养液的通气虽然能促进微生物的生长，可是在多数场合下反而抑制酶的合成。为了取得最大的高活力酶，必须制定一种调节方法，既要求细胞的单位酶活力高，又要求细胞数量多，也就是说，给菌体在各种生理时期创造不同的条件。两步法液体深层培养就是实现这种调节的具体措施之一。酶制剂生产两步法的特点是将菌体生长条件(生长期)与产酶条件(生产期)区分开来。菌体先在丰富的培养基上大量繁殖，然后收集菌体浓缩物，洗涤后再转入添加诱导物的产酶培养基，在此期间，菌体积累大量的酶，一般不再繁殖，营养成分或诱导物得到充分的利用。

种子质量的控制

种子质量是影响发酵生产水平的重要因素。种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件两个方面。这就是说既要有优良的菌种，又要有良好的培养条件才能获得高质量的种子。

㈠影响孢子质量的因素及其控制

孢子质量与培养基、培养温度、湿度、培养时间、接种量等有关，这些因素相互联系、相互影响，因此必须全面考虑各种因素，认真加以控制。

⒈ 培养基

构成孢子培养基的原材料，其产地、品种、加工方法和用量对孢子质量都有一定的影响。生产过程中孢子质量不稳定的现象，常常是原材料质量不稳定所造成的。原材料产地、品种和加工方法的不同，会导致培养基中的微量元素和其他营养成分含量的变化。例如，由于生产蛋白胨所用的原材料及生产工艺的不同，蛋白胨的微量元素含量、磷含量、氨基酸组分均有所不同，而这些营养成分对于菌体生长和孢子形成有重要作用。琼脂的牌号不同，对孢子质量也有影响，这是由于不同牌号的琼脂含有不同的无机离子造成的。

此外，水质的影响也不能忽视。地区的不同、季节的变化和水源的污染，均可成为水质波动的原因。为了避免水质波动对孢子质量的影响，可在蒸馏水或无盐水中加入适量的无机盐，供配制培养基使用。例如在配制生产四环素的斜面培养基时，有时在无盐水内加入0.03％(NH4)2HPO4，0.028％KH2PO4及0.01％MgSO4，确保孢子质量，提高四环素发酵产量。

为了保证孢子培养基的质量，斜面培养基所用的主要原材料，糖、氮、磷含量需经过化学分析及摇瓶发酵试验合格后才能使用。制备培养基时要严格控制灭菌后的培养基质量。斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定的时间，使斜面无冷凝水呈现，水分适中有利于孢子生长。

配制孢子培养基还应该考虑不同代谢类型的菌落对多种氨基酸的选择。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，各种氨基酸对菌落的表现不同。氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。斜面培养基上用较单一的氮源，可抑制某些不正常型菌落的出现；而对分离筛选的平板培养基则需加入较复杂的氮源，使其多种菌落类型充分表现，以利筛选。因此在制备固体培养基时有两条经验：① 供生产用的孢子培养基或作为制备砂土孢子或传代所用的培养基要用比较单一的氮源，以便保持正常菌落类型的优势；② 作为选种或分离用的平板培养基，则需采用较复杂的有机氮源，目的是便于选择特殊代谢的菌落。

⒉ 培养温度和湿度

微生物在一个较宽的温度范围内生长。但是，要获得高质量的孢子，其最适温度区间很狭窄。一般来说，提高培养温度，可使菌体代谢活动加快，缩短培养时间，但是，菌体的糖代谢和氮代谢的各种酶类，对温度的敏感性是不同的。因此，培养温度不同，菌的生理状态也不同，如果不是用最适温度培养的孢子，其生产能力就会下降。不同的菌株要求的最适温度不同，需经实践考察确定。例如，龟裂链霉菌斜面最适温度为36.5～37 ℃，如果高于37 ℃，则孢子成熟早，易老化，接入发酵罐后，就会出现菌丝对糖、氮利用缓慢，氨基氮回升提前，发酵产量降低等现象。培养温度控制低一些，则有利于孢子的形成。龟裂链霉菌斜面先放在36.5 ℃培养3天，再放在28.5 ℃培养1天，所得的孢子数量比在36.5 ℃培养4天所得的孢子数量增加3～7倍。

斜面孢子培养时，培养室的相对湿度对孢子形成的速度、数量和质量有很大影响。空气中相对湿度高时，培养基内的水分蒸发少；相对湿度低时，培养基内的水分蒸发多。例如，在我国北方干燥地区，冬季由于气候干燥，空气相对湿度偏低，斜面培养基内的水分蒸发的快，致使斜面下部含有一定水分，而上部易干瘪，这时孢子长得快，且从斜面下部向上长。夏季时空气相对湿度高，斜面内水分蒸发得慢，这时斜面孢子从上部往下长，下部常因积存冷凝水，致使孢子生长得慢或孢子不能生长。试验表明，在一定条件下培养斜面孢子时，在北方相对湿度控制在40％～45％，而在南方相对湿度控制在35％～42％，所得孢子质量较好。一般来说，真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。

在培养箱培养时，如果相对湿度偏低，可放入盛水的平皿，提高培养箱内的相对湿度，为了保证新鲜空气的交换，培养箱每天宜开启几次，以利于孢子生长。现代化的培养箱是恒温、恒湿，并可换气，不用人工控制。

最适培养温度和湿度是相对的，例如相对湿度、培养基组分不同，对微生物的最适温度会有影响。培养温度、培养基组分不同也会影响到微生物培养的最适相对湿度。

⒊ 培养时间和冷藏时间

丝状菌在斜面培养基上的生长发育过程可分为五个阶段：① 孢子发芽和基内菌丝生长阶段；② 气生菌丝生长阶段；③ 孢子形成阶段；④ 孢子成熟阶段；⑤ 斜面衰老菌丝自溶阶段。

⑴ 孢子的培养时间　基内菌丝和气生菌丝内部的核物质和细胞质处于流动状态，如果把菌丝断开，各菌丝片断之间的内容是不同的，有的片断中含有核粒，有的片断中没有核粒，而核粒的多少亦不均匀，该阶段的菌丝不适宜于菌种保存和传代。而孢子本身是一个独立的遗传体，其遗传物质比较完整，因此孢子用于传代和保存均能保持原始菌种的基本特征。但是孢子本身亦有年轻与衰老的区别。一般来说衰老的孢子不如年轻孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。孢子的培养工艺一般选择在孢子成熟阶段时终止培养，此时显微镜下可见到成串孢子或游离的分散孢子，如果继续培养，则进入斜面衰老菌丝自溶阶段，表现为斜面外观变色、发暗或黄、菌层下陷、有时出现白色斑点或发黑。白斑表示孢子发芽长出第二代菌丝，黑色显示菌丝自溶。孢子的培养时间对孢子质量有重要影响，过于年轻的孢子经不起冷藏，如土霉素菌种斜面培养4.5天，孢子尚未完全成熟，冷藏7～8天菌丝即开始自溶。而培养时间延长半天(即培养5天)，孢子完全成熟，可冷藏20天也不自溶。过于衰老的孢子会导致生产能力下降，孢子的培养时间应控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。

⑵ 孢子的冷藏时间　斜面孢子的冷藏时间，对孢子质量也有影响，其影响随菌种不同而异，总的原则是冷藏时间宜短不宜长。曾有报道，在链霉素生产中，斜面孢子在6 ℃冷藏2个月后的发酵单位比冷藏1个月的低18％，冷藏3个月后则降低35％。

⒋ 接种量

制备孢子时的接种量要适中，接种量过大或过小均对孢子质量产生影响。因为接种量的大小影响到在一定量培养基中孢子的个体数量的多少，进而影响到菌体的生理状态。凡接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落者为正常接种。接种量过小则斜面上长出的菌落稀疏，接种量过大则斜面上菌落密集一片。一般传代用的斜面孢子要求菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代培养。接种摇瓶或进罐的斜面孢子，要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标准。一般一支高度为20 cm、直径为3 cm的试管斜面，丝状菌孢子数要求达到107以上。

接入种子罐的孢子接种量对发酵生产也有影响。例如，青霉素产生菌之一的球状菌的孢子数量对青霉素发酵产量影响极大，若孢子数量过少，则进罐后长出的球状体过大，影响通气效果；若孢子数量过多，则进罐后不能很好地维持球状体。

除了以上几个因素需加以控制之外，要获得高质量的孢子，还需要对菌种质量加以控制。用各种方法保存的菌种每过1年都应进行1次自然分离，从中选出形态、生产性能好的单菌落接种孢子培养基。制备好的斜面孢子，要经过摇瓶发酵试验，合格后才能用于发酵生产。

㈡影响种子质量的因素及其控制

种子质量主要受孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等因素的影响。摇瓶种子的质量主要以外观颜色、效价、菌丝浓度或黏度以及糖氮代谢、pH值变化等为指标，符合要求方可进罐。

种子的质量是发酵能否正常进行的重要因素之一。种子制备不仅是要提供一定数量的菌体，更为重要的是要为发酵生产提供适合发酵、具有一定生理状态的菌体。种子质量的控制，将以此为出发点。

⒈ 培养基

种子培养基的原材料质量的控制类似于孢子培养基原材料质量的控制。种子培养基的营养成分应适合种子培养的需要，一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养上易于被菌体直接吸收和利用，营养成分要适当地丰富和完全，氮源和维生素含量较高，这样可以使菌丝粗壮并具有较强的活力。另一方面，培养基的营养成分要尽可能地和发酵培养基接近，以适合发酵的需要，这样的种子一旦移入发酵罐后也能比较容易适应发酵罐的培养条件。发酵的目的是为了获得尽可能多的发酵产物，其培养基一般比较浓，而种子培养基以略稀薄为宜。种子培养基的pH值要比较稳定，以适合菌的生长和发育。pH值的变化会引起各种酶活力的改变，对菌丝形态和代谢途径影响很大。例如，种子培养基的pH值控制对四环素发酵有显著影响。

⒉ 培养条件

种子培养应选择最适温度，前面已有叙述。培养过程中通气搅拌的控制很重要，各级种子罐或者同级种子罐的各个不同时期的需氧量不同，应区别控制，一般前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大供氧量。在青霉素生产的种子制备过程中，充足的通气量可以提高种子质量。例如，将通气充足和通气不足两种情况下得到的种子都接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但是，在土霉素发酵生产中，一级种子罐的通气量小一些却对发酵有利。通气搅拌不足可引起菌丝结团、菌丝粘壁等异常现象。生产过程中，有时种子培养会产生大量泡沫而影响正常的通气搅拌，此时应严格控制，甚至可考虑改变培养基配方，以减少发泡。

对青霉素生产的小罐种子，可采用补料工艺来提高种子质量，即在种子罐培养一定时间后，补入一定量的种子培养基，结果种子罐放罐体积增加，种子质量也有所提高，菌丝团明显减少，菌丝内积蓄物增多，菌丝粗壮，发酵单位增高。

⒊ 种龄

种子培养时间称为种龄。在种子罐内，随着培养时间延长，菌体量逐渐增加。但是菌体繁殖到一定程度，由于营养物质消耗和代谢产物积累，菌体量不再继续增加，而是逐渐趋于老化。由于菌体在生长发育过程中，不同生长阶段的菌体的生理活性差别很大，接种种龄的控制就显得非常重要。在工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。此时的种子能很快适应环境，生长繁殖快，可大大缩短在发酵罐中的迟滞期（调整期），缩短在发酵罐中的非产物合成时间，提高发酵罐的利用率，节省动力消耗。如果种龄控制不适当，种龄过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、泡沫多、发酵周期延长以及因菌体量过少而菌丝结团，引起异常发酵等等；而种龄过老的种子接入发酵罐后，则会因菌体老化而导致生产能力衰退。在土霉素生产中，一级种子的种龄相差2～3 h，转入发酵罐后，菌体的代谢就会有明显的差异。

最适种龄因菌种不同而有很大的差异。细菌的种龄一般为7～24 h，霉菌种龄一般为16～50 h，放线菌种龄一般为21～64 h。同一菌种的不同罐批培养相同的时间，得到的种子质量也不完全一致，因此最适的种龄应通过多次试验，特别要根据本批种子质量来确定。

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