范文一：液相色谱仪原理

液相色谱仪原理

高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 一特点

1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。

2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。

3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。

4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。

5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分

离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。

高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：

1 ．液 — 液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)

流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：

式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度； Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。

a. 正相液 — 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。

b. 反相液 — 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。

c. 液 — 液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。

2 ．液 — 固色谱法

流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：

Xm + nSa ====== Xa + nSm

式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。

当吸附竞争反应达平衡时：

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]

3 ．离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)

IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。

以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：

X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)

当交换达平衡时：

KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]

分配系数为：

DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]

[讨论：DX与保留值的关系]

凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。 4 ．离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)

离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：

X+水相 + Y-水相 === X+Y-有机相

式中：X+水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成的离子对化合物。

当达平衡时：

KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相

根据定义，分配系数为：

DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相

[讨论：DX与保留值的关系]

离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。

5 ．离子色谱法(Ion Chromatography)

用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。

以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：

抑制柱上发生的反应：

R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-

可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H+Br-，可用电导法灵敏的检测。 离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。

6 ．空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography)

空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。

二.高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、．分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。

1．进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。

2．输液系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l．47～

4．4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。

3.分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）．固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。

再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。

4．检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。

（1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。

（2）示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g／ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。

（3）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g

／ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。

（5）数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

范文二：液相色谱仪原理

液相色谱仪原理

悬赏分：0 | 解决时间：2007-3-27 15:39 | 提问者：wxshpop

各位请问液相色谱仪原理是什么？应用在哪些行业？

谢谢了！

最佳答案

高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 特点

1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。

2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。

3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。

4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。

5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。

高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：

1 ．液 — 液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)

流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：

式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度； Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。

a. 正相液 — 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。

b. 反相液 — 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。

c. 液 — 液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。

2 ．液 — 固色谱法

流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：

Xm + nSa ====== Xa + nSm

式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。

当吸附竞争反应达平衡时：

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]

3 ．离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)

IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。

以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：

X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)

当交换达平衡时：

KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]

分配系数为：

DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]

[讨论：DX与保留值的关系]

凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。

4 ．离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)

离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：

X+水相 + Y-水相 === X+Y-有机相

式中：X+水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成的离子对化合物。

当达平衡时：

KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相

根据定义，分配系数为：

DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相

[讨论：DX与保留值的关系]

离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。

5 ．离子色谱法(Ion Chromatography)

用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。

以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：

抑制柱上发生的反应：

R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-

可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H+Br-，可用电导法灵敏的检测。

离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。 6 ．空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography)

空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、．分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。

1．进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。

2．输液系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l．47～

4．4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。

3.分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由

另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。

再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。

4．检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。

（1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10g／ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。

（2）示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7g／ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。

（3）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。

（5）数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

范文三：安捷伦高效液相色谱仪验证方案

编号:STP-JYSB-QRFA-040-00 Aglient1100高效液相色谱仪确认方案

Aglient1100高效液相色谱仪

确认方案

版 次: ?新订 ?替代:

起 草: 年 月 日 审阅会签: 批 准: 年 月 日

编号:STP-JYSB-QRFA-040-00 Aglient1100高效液相色谱仪确认方案

确 认 计 划

1、概述

Aglient1100高效液相色谱仪为安捷伦科技有限公司生产的产品，我司在购买前对该产品的性能、价格、外观和售后服务进行了广泛地调查研究，在同类产品中价格适中、性能稳定、美观且售后服务好。购买该产品的目的是为今后新产品研制、开发、生产。为了确保使用该仪器检测数据真实可靠，也为了确认该仪器的各项指标能达到该仪器所设计的性能指标，计划对该仪器进行必要的确认。

2、确认目的

为了确保使用该仪器检测数据真实可靠，确认该仪器的各项指标能达到该仪器所设置的性能

指标，对该仪器进行必要的确认。

3、职责分工

检验仪器确认专业小组人员名单

确认项目:Aglient1100高效液相色谱仪确认方案

组 长

姓 名 职务/职称 部 门 职 责

确认方案、确认报告的批准、确认的组刘四英 质量管理部部长 质量管理部 织与实施

参与人员

姓 名 职务/职称 部 门 职 责

邱波 质控室主任 质量管理部 确认方案的起草、确认的具体实施

郭茎 质保室主任 质量管理部 确认方案、确认报告的审核、监督实施

袁世和 化验员 质量管理部 药化分析

孙清华 化验员 质量管理部 药化分析

孙磊 工程设备部部长 工程设备部 检验设备安装、调试 4、确认时间安排

确认开始时间: 年 月 日

确认结束时间: 年 月 日

编号:STP-JYSB-QRFA-040-00 Aglient1100高效液相色谱仪确认方案

目 录

(一) 概述 ...................................................................................................................... (二) 安装确认 ............................................................................................................

1、资料档案 .......................................................

2、技术特性 .......................................................

3、 安装环境及地点位置 ............................................ (三) 运行确认 ......................................................

1 Aglient1100型高效液相色谱仪高压恒流泵 ...........................

2 Aglient1100型高效液相色谱仪紫外可见光液相色谱检测器 .............

3.柱温箱 .......................................................... (四) 校正 .................................................................................................................... (五) 系统适用性试验 ................................................................................................. (六) 再确认 ................................................................................................................ (七)确认过程中出现偏差、变更处理程序 ................................................................ (八)确认报告的编写: ............................................................................................... (九)确认方案的审核: ............................................................................................... (十)确认方案的批准 ...................................................................................................

(一) 概述

Aglient1100型高效液相色谱仪为安捷伦科技有限公司生产的产品，我司在购买前对该产品的

编号:STP-JYSB-QRFA-040-00 Aglient1100高效液相色谱仪确认方案

性能、价格、外观和售后服务进行了广泛地调查研究，在同类产品中价格适中、性能稳定、美观且售后服务好。购买该产品的目的是为今后新产品研制、开发、生产。为了确保使用该仪器检测数据真实可靠，也为了确认该仪器的各项指标能达到该仪器所设计的性能指标，计划对该仪器进行必要的确认。

仪器名称:高效液相色谱仪 仪器负责人:邱波

仪器型号:Aglient1100 仪器编号:SB-040

生产厂家:安捷伦科技有限公司

仪器所在部门和房间:质量管理部、质检楼二楼精密仪器室

1.人员、分工:确认项目小组由质控室、设备动力部组成、质保室。

质控室:方案拟定，组织实施、汇总确认记录、填写确认报告。

设备动力部:设备调试、测试等。

质保室:审核确认方案，监督实施。

2.培训:在确认实施前，依据确认小组通过的方案，对参加确认人员培训，明确分工。

培训记录

签 名 培训内容 日 期

Aglient1100型高效液相色谱仪使用说 明书 Aglient1100型高效液相色谱仪确认方 案

(二) 安装确认

1、资料档案

1.1 概述

描述仪器的使用范围。

1.2 资料档案

仪器使用说明书、合格证、使用记录、维修保养记录及备件清单的存放情况。 2、技术特性

2.1备件

品 名 生产厂家 数量 存放处

D灯 2

色谱柱

维修工具 2.2技术参数

3、 安装环境及地点位置

编号:STP-JYSB-QRFA-040-00 Aglient1100高效液相色谱仪确认方案

3.1 检查环境:通风状况良好，附近没有火源,当使用易燃或有毒的溶剂作为流动相时，房间必须通风良好。当使用易燃溶剂时，室内严禁使用明火或其他火源。

3.2 检查安装的地点

3.2.1避免灰尘或腐蚀性气体，避免在有大量灰尘或腐蚀性气体的位置安装仪器，这样会影响仪器的使用寿命及性能。

3.2.2远离强磁场,请不要将仪器安装在会生成强磁场的设备附近。如果电源线受强电噪声的干扰，可以购买使用电源保护

器。

3.2.3 充足的安装台面与空间

用于安装本仪器的实验台应是牢固的，足以支撑Aglient1100型高效液相色谱仪的总重量。实验台应是水平的、稳固的，深度至少 600mm。如果要并排安装组件，请确保各组件之间至少相距 30 mm。 3.2.4 控制室内温度和湿度

室温应在 4 到 55?C 之间，全天温度变化不大。湿度应保持小于95%。

3.2.4 检查仪器放置在房间内的位置

仪器应放置在没有振动的位置，远离阳光直射，且远离热源及空调的出风口。 (三) 运行确认

目的:确认该仪器达到技术要求。

确认所需仪器:

仪器型号 器具编号 名称 数量 校验日期 有效期至

秒表 1 年 月 日 年 月 日

电子天平 1 年 月 日 年 月 日

1 Aglient1100型高效液相色谱仪高压恒流泵

1.1流量准确度

可执行标准:,?3%(以蒸馏水为标准)

测试方法:将输液系统、进样器、色谱柱和检测器连接好，以蒸馏水为流动相，将流速稳定后，分别设定1.0、2.5和5.0ml/min三段，在流动相排出口用已恒重的比重瓶收集流动相，同时计时收集10分钟，称重，重复三次，查表，即得，计算。

1.2流量精确度

可执行标准:,?0.3%(0.997ml/min,1.003ml/min，以蒸馏水为标准)

测试方法:将输液系统、进样器、色谱柱和检测器连接好，以蒸馏水为流动相，将流速稳定后，设定流量为1.0ml/min，在流动相排出口用已恒重的比重瓶收集流动相，同时计时收集10分钟，称重，查表，即得，共收集5次。

1.3压力范围

可执行标准:?0.2MPa+设定值

测试方法:在进样阀的出口接一个两通，再将两通的另外一端用OD1.6的盲管封住。启动泵，

编号:STP-JYSB-QRFA-040-00 Aglient1100高效液相色谱仪确认方案

使压力升至所设定的压力，观察仪器是否自动停泵。

设定值分别为:10.0Mpa、20.0Mpa、30.0Mpa

2 Aglient1100型高效液相色谱仪紫外可见光液相色谱检测器

2.1噪声与漂移

-4-4可执行标准:噪声 ,?1.0?10AU(250nm)， 漂移 ,?5.0?10AU/hr

测试方法:将仪器各部连接好，紫外检测器调至250nm，流动相为甲醇，流速为1.0ml/min，待柱平衡稳定后，进行基线的测试，测试时间半小时，观察并记录测试结果。 测试图谱见基线漂移测试。

2.2重复性(定性重复性及定量重复性)

目的:考核仪器整体稳定性能。

可执行标准:定性重复性RSD?1.5%，定量重复性RSD?3.0%

测试方法:精密量取二甲苯和苯适量，置棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀释成每1ml含上述两种物质都为0.002ml的溶液，摇匀;以甲醇为流动相，精密量取上述溶液20μl 注入色谱仪中，连续进样5次，记录色谱图，计算，即得。

A、定性重复性

取两组分保留时间差进行计算。组分1与组分2保留时间差，计算RSD% B、定量重复性

取两组分峰面积比进行计算。

2.3最小检出量

-7可执行标准:最小检出量应?1.0?10g/ml,以萘为样品。

-7测试方法:精密称定萘适量用甲醇溶解并稀释成1.0?10g/ml，以甲醇为流动相，精密量取20μl注入色谱仪中，记录色谱图,按这以下公式计算:

2NcV d

C = L

H?20

式中:C为最小检出浓度，g/ml L

N为基线噪声峰峰高，mm d

c为标准溶液浓度，g/ml

H为标准溶液的色谱峰高，mm

V为进样体积，μL

2.4波长偏差

可执行标准:?272?1.0nm。

测试方法:精密称取咖啡因适量，用甲醇溶解并稀释成2mg/100ml。用注射器将甲醇注入流通池流路清洗，然后用注射器将甲醇注入流通池，将波长设定为350nm，吸光度设为零;使用注射器

编号:STP-JYSB-QRFA-040-00 Aglient1100高效液相色谱仪确认方案

将咖啡因甲醇溶液注入流通池，不要让任何气泡进入流路，将波长设定以1nm的增量从266nm增加到277nm，并在每上升1nm后记录显示的吸光度值。

2.5 数据的保存、备份和存档

可执行标准:数据处理的安全性、存储、备份、恢复、审计追踪都正常。 测试方法:按照Aglient1100型高效液相色谱仪使用说明书，对工作站数据处理的安全性、存储、备份、恢复、审计追踪依次确认。

3.柱温箱

3.1确认所需仪器:

名称 数量 仪器型号 器具编号 校验日期 有效期至

秒表 1 年 月 日 年 月 日

数字温度计 1 年 月 日 年 月 日 3.2可接受标准:柱温箱温度设定值误差ΔT不超过?2?;温度稳定性TC不超过0.15?。 C

3.3测试方法:将数字温度计探头固定在柱温箱内，选择35?和45?(也可根据用户使用温度设 定)进行检定。按仪器说明书操作，通电升温，待温度稳定后，记下温度计读数并开 始计时，以后每隔10min 记录一次读数，共计7 次，求出平均值。平均值与设定值之 差为ΔTS，7 次读数中最大值与最小值之差为控温稳定性T。 C

(四) 校正

1、检查该仪器的计量部门检定证书

检 定 单 位:

检定证书编号:

检定日期: 年 月 日

(五) 系统适用性试验

目的:检查仪器在测试供试品的过程中，含量测定的相对标准偏差。

可执行标准:含量测定的相对标准偏差应不得过2.0%。

检验项目:小柴胡颗粒含量测定。 样品批号:

采用仪器:Aglient1100型高效液相色谱仪高效液相色谱仪。

检验依据:《中国药典》2010年版一部

含量%=[(A?C?S)/(A?W?1000)]?100% rir

式中:A、A---分别为样品与对照品峰面积; ri

C----为对照品浓度。

W---为样品重量(g); r

S----为供试品稀释倍数。

样品重(g):(1) (2)

编号:STP-JYSB-QRFA-040-00 Aglient1100高效液相色谱仪确认方案

样品与对照品峰面积见图谱。

计算:含量(1)

含量(2)

计算相对标准偏差 允许偏差?2.0%。

(六) 再确认

1.仪器变更等引起的再确认

1.1经历重大维修，或更换关键部位。

1.2 仪器的安装地点需要变化

1.3软件或硬件升级

1.4 由偏差，数据超出标准或数据趋势分析引起

这类再确认的范围应建立在风险评估、变更控制和偏差文件的基础上，根据评估结果，重新进行安装确认、运行确认或性能确认。仪器变更应该有记录，再确认应按照要求准备确认方案和报告。 2.定期再确认

1、线路连接:检查线路，接地等情况。

2、仪器维护:清洁仪器内部和外部。

3、检查:色谱柱参数是否降低，润滑是否良好。

4、功能确认:

5、工作日记:每次试验均应作操作者、日期和仪器状态的记录。

6、检查周期:

再确认项目 周期

1 每年一次

2 每次试验

3 每月一次

4 每年一次

5 每次试验

制订人: 日期: 年 月 日

(七)确认过程中出现偏差、变更处理程序

1.当检测结果异常时，按《偏差处理规程》的操作规程执行;

2.确认过程出现偏离确认方案要求时，执行人员应立即通知质控室主任。偏差的调查按照《偏差处理规程》执行，应清楚地描述该偏差的情况、调查记录、经过批准的对于偏差的影响的评估、解决偏差所需采取的行动措施。

3.方案变更的控制程序，当方案在执行过程中，发现方案内容或要求与实际执行情况不一致，需

编号:STP-JYSB-QRFA-040-00 Aglient1100高效液相色谱仪确认方案

对原批准方案进行变更，执行部门应按照《变更控制管理规程》执行。 (八)确认报告的编写:

所有测试项目完成后，由确认人员根据确认记录起草仪器确认报告，总结确认活动，并确认确认方案中所有项目是否完成，评估测试结果以及对仪器状态明确的阐述和结论。 (九)确认方案的审核:

审核意见:

审核人: 日期: 年 月 日 (十)确认方案的批准

批准意见:

批准人: 日期: 年 月 日

范文四：安捷伦高效液相色谱仪操作说明

安捷伦高效液相色谱仪操作说明

一、校枪及样品处理

1. 校枪

仪器：两个小烧杯、分析天平、移液枪1000μL、100μL

步骤：打开分析天平预热，一只烧杯放到称量盘上调零，一只装入纯水。将移液枪1000μL、100μL调至950μL、50μL，分别吸取纯水称质量，如偏大或偏小，调节移液枪直至准确到0.001g。（如枪使用过久或气密性不好，可以准备一个小烧杯装入纯水，每次先轻轻沾湿枪口，甩掉水或在用卫生纸吸取口上的水，再插上枪头使用。）注意慢吸慢放，不要挂珠。

2. 样品处理：用1.5mL离心管取0.5mL发酵液，取出样品后，首现在离心机上离心

（13000rap/min 3min）。然后将样品稀释20倍，取950μL纯水、50μL发酵液于离心管中。混匀后在离心机上离心（13000rap/min 3min）。准备自动进样瓶（瓶中放上内衬管），取200μL待测液盖紧盖子。按顺序放到自动进样盘中。

二、开机

1、仪器各组件

将在线脱气器、 泵 ：四元、进样器：自动进样器（六通阀）、柱温箱、检测器：示差折光检测器开关打开。

打开计算机,进入Windows XP 画面,并运行CAC Server程序，打开色谱仪各组件电源，待显示已联上各组件的信息及各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online ，图标打开工作站。化学工作站自动与1200LC通讯。

流动相:将流动相（一般不主张使用偏酸、偏碱的流动相）放入溶剂瓶中，打开冲洗阀，设流速为2ml/min，单击确定 ，再依次单击泵→控制，选中启动，单击确定，则系统开始冲洗，至管路无气泡为止，切换管路反复操作至所需管路均无气泡。在“控制”选项中选“关闭”，关闭泵，关闭冲洗阀。单击泵下面瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。

每次四元泵开始前，要打开冲洗阀阀门以5ml/min的流速冲洗10分钟，使脱气机与泵之间的流动相从冲洗阀流出，以免隔夜的流动相损伤色谱柱。

每次进样检测前，要用流动相冲洗色谱柱30分钟，达到柱温前20min流速设为0.2ml/min，达柱温后再改为0.6ml/min。待1—1.5h检测器的基线稳定方可进行进样检测；检测结束后，色谱柱要先用水冲洗20分钟，然后用甲醇或乙腈冲洗至少20分钟，以延长色谱柱的使用寿命。绝对禁止偏酸、偏碱的流动相以及缓冲液在色谱柱中过夜。

三、编辑分析方法

新方法建立：程序菜单显示绿色，即可进行参数设置及操作

泵参数设定：设定流速、比例、运行时间、平衡时间、泵辅助设定（梯度）等。 点击确定进入下一画面

自动进样器参数设定：设定进样量（5μL）、抽取位置（调节针高度 3.0mm）、进样方式等。 “序列”→序列参数→子目录（日期：年月日时间）

“序列表”：插入/批量输入向导→ “追加”、“插入”→ “样品位置”、“开始位置”、“增量”、“插入行数”

标准进样：只能输入进样体积，此方式无洗针功能。

抽取位置：3.0mm

洗针进样：可以输入进样体积和洗瓶位置此方式针从样品瓶抽完样品后会在洗瓶中洗针。

1

柱温箱参数设定：测定时75℃，反冲时80℃。（在”温度”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”更多>>”键,选中“与左侧相同”使柱温箱的温度左右一致，点击“确定”进入下一界面。

检测器参数设定－示差参比池

冲洗：10min（校零）。不需要每次都冲洗。

温度设置50℃（不要设很高，与检测器温度相当即可）

选中点击确定进入下一画面

方法保存

单击方法另存为 输入一—方法名，如test 单击确认

选择已有方法：点击【Method】，点击【Load method】选项，选取已存的各种操作方法。

四、样品分析与采集数据

将样品放于样品盘中相应位置，所有的样品均需澄清。

“序列”→“序列参数”：按照自动进样盘上的样品瓶的顺序编写参数（样品瓶位置、名称、方法）。 待仪器显示Ready，基线平稳，从【Run control】菜单中选择【Run Method】，开始进样分析。或点击“开始”开始进样分析。

数据处理：单击【View】菜单，单击【Data analysis】选项，进行数据分析。单击【View】菜单，单击【Method and Run control】选项，回到样品分析界面。

数据分析方法编辑

从File 菜单选择Load signal 选中您的数据文件名，单击Ok 积分：从“积分” 中选择“积分”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“积分事件” 选项选择合适的斜率灵敏度 、峰宽 、最小峰面积、 最小峰高

从积分菜单中选择积分 选项则数据被积分

如积分结果不理想则修改相应的积分参数直到满意为止

单击左边图标将积分参数存入方法

五、标准曲线的绘制

1.称取葡萄糖、果糖、蔗糖(恒重）各1g准确到0.0001g，稀释到1000mL容量瓶中。

2.将标准溶液摇匀，用离心管取糖标液，准备自动进样瓶（瓶中放上内衬管），取200μL待测液盖紧盖子。

3.设置：将样品放于样品盘中相应位置，所有的样品均需澄清。

“序列”→“序列参数”：按照自动进样盘上的样品瓶的顺序编写参数（样品瓶位置、名称、方法、进样量: 相应成梯度的量）。

用浓度和峰面积回归，就得到了标准曲线

7、关机

冲洗系统：反相柱用10％的甲醇水冲洗系统30分钟，再用100％甲醇冲洗系统20分钟，然后关泵，正相柱先用合适溶剂冲洗，后用柱保存液冲洗。

退出工作站，关闭计算机。

关闭10％异丙醇溶液控制阀。

关闭仪器各组件

关掉电源开关

8、注意事项

⑴、色谱柱使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；必须使用保护柱；色谱柱长时间不用时，柱内应充满溶剂，两端封死保存。 ⑵、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。

2

⑶、仪器运行时，泵头必须用10%异丙醇水溶液虹吸冲洗，不能干涸。

⑷、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵。

⑸、对于手动进样器当使用缓冲溶液时要用水冲洗进样口同时搬动进样阀数次每次数毫升 ⑹、若使用含盐流动相，开机时必须先用10%甲醇水溶液冲洗20分钟以上再换上含盐流动相。

⑺、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用35%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤。

⑻、检测器的灯有使用寿命限制，一般在正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯，分析结束，立即关灯。

⑼、使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相。

9、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞及其处理

请严格执行溶剂过滤

请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液

如果应用许可可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠.

在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气

避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液 堵塞后的处理法方法：

将过滤头从组件中取下在35%硝酸液中浸泡1h，然后用二次蒸馏水冲洗干净。不能超生清洗。

10、泵的维护

⑴、流动相使用前必须脱气过滤

⑵、使用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项

⑶、关机前反相色谱柱用10%的甲醇水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟，然后关泵。正相色谱柱用适当的溶剂冲洗。

⑷、及时更换Purge Valve内的过滤芯，当打开Purge Valve时压力高于10bar 表明过滤芯已堵 ⑸、使用合适的密封圈：标准密封圈能适合于大多数应用。但使用正相溶剂最好使用聚四氟乙烯密封圈，泵的压力限制最大压力设为200bar。

⑹、使用梯度比例时的注意事项：

当盐溶液与有机溶剂溶液混合时盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶而不会出现沉淀。

由于在比例阀的混合点重力作用使盐颗粒沉淀下来通常阀A接水相/盐溶液D接有机溶剂此法连接可有效使盐回落到盐溶液中并被溶解若颠倒过来盐可能落在有机溶剂中出现问题

当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时推荐将缓冲盐通道接在A通道上有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上定期用水冲洗所有的通道以除去阀口上可能出现的盐沉淀

11、自动进样器使用注意

使用自动洗针功能

自动洗针功能可以把程序设置为“带有洗针的进样”,或将自动洗针功能包 含在进样器程序中。当使用自动洗针功能时，进样针在取样后会转移到洗针 步骤。造成携留效应的主要原因是残留在进样针外的少量样品。通过进样后 的洗针功能可以立即洗去针外表面上残留的样品。当进样阀转回到主流路 时，定量管和针内所有的样品都被冲洗到色谱柱中。这种结合洗针和冲洗管 路的设计可以把携留效应减低到最小的程度。

去掉洗涤瓶盖：为了获得最佳的分析结果，装有溶剂的洗涤瓶是不加盖的，而且洗涤瓶中的 溶剂对样品组分有较好的溶解作用。如果洗涤瓶有盖将会有少量样品留在密 封垫上，这样会把残留的样品带到下一个样品中。

3

4

范文五：安捷伦1260液相色谱仪操作流程

安捷伦1260液相色谱仪操作流程及注意事项

1、配制流动相，水相置于棕色玻璃瓶中，有机相置于相应无色玻璃瓶中。水相和有机相必须过滤，滤膜选用0.45有机系滤膜（尼龙）。注意：过夜的流动相必须重新过滤。

2、流动相过滤后，置超声仪中超声20min。

3、将已超声的流动相轻轻换上，动作不要太剧烈，会产生气泡，注意不要把有机相和水相换反了（A是有机相，B是水相）。

4、将色谱柱接上，注意：流动相的流动方向必须和色谱柱上的箭头方向一致。

5、打开计算机电源、显示器开关，并输入密码。

6、依次从上往下打开液相色谱仪上的所有开关。

7、打开液相色谱在线工作站（online），输入密码。

8、打开的液相工作站上分为四个小部分，依次为进样器、泵、柱温箱及检测器。在第二个部分设置流动相的体积及溶剂瓶的总体积。

9、脱气：旋开purge阀开关，右击泵部分，选择“method”，选择B相100%，流速1ml/min，选择确定；右击泵部分，选择“control”，选择pump “on”，10秒后，调节流速为3ml/min，10秒后，调节流速5ml/min，开始水相脱气3min，水相脱气结束后，将流速按照5ml/min-3ml/min-1ml/min的流程往下调。然后开始有机相脱气，步骤同上，注意流速不可一下子从1ml/min调到5ml/min，需慢慢调节。流动相脱气结束后，旋紧purge阀开关。

10、建立样品的色谱方法：设置进样体积，选择洗针进样，注明洗针位置；设置流动相比例、流速及梯度洗脱条件，序列进样时设置样品运行时间和后运行时间；打开柱温箱，设置柱温；打开紫外检测灯，设置检测波长。全部设置好后，保存方法，不要覆盖别人的方法。

11、谱图保存路径的设置：View—preferences—data path（第二个选项）—remove旧的文件夹，add自己的文件夹。再打开Sequence—Sequence parameter—选择Data path为自己的文件夹即可。

12、设置进样序列，注意序列表的填写。序列进样后，如想关闭泵及检测器，请点击Sequence—Sequence parameter选择shutdown—standby。

13、将样品按顺序摆放在自动进样器的托盘上。

14、注意泵压力是否正常，色谱柱是否漏液，如一切正常，关上柱温箱的盖子。待基线平稳后，点击Sequence进样。

15、进样结束后，需冲洗色谱柱，色谱柱很脆弱，需用心保护。

16、液相用完后，请关闭液相色谱在线工作站，依次关闭液相色谱仪上的开关，最后关闭计算机。

17、将自己的色谱柱换下时，需用连接管代替色谱柱连在液相上，不可以让其暴露在空气中。

18、从计算机中拷取谱图必须使用CD/DVD盘刻录，不可直接使用U盘。

19、请大家共同维护液相色谱仪，每次做完液相，请收拾液相台面，注意台面的整洁，并注意废液瓶，及时倒出废液。

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