范文一:有毒甲藻_塔玛亚历山大藻在厦门地区虾塘引起赤潮
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有关钙质超微化石 F l o r is p h a e r a p r o f u n d a
3的古海洋学意义综述
张拭颖 刘 传联
( ) 同济大学海洋地质国家重点实验室 ,上海 200092
提要 Fl o ris p h ae ra p ro f u n d a 是古海洋学研究中应用最广的一种钙质超微化石 。利用 F. p ro f u n d a 百分含量可 以研究海水上层结构变化 、海水初级生产力的演变并进而推断古气候变化及其机制 。这一方法在世界诸大洋第四 纪古海洋 、古气候研究中都已有成功的先例 。本文综述了利用 F. p ro f u n d a 百分含量研究古海洋 、古气候的基本 原理和方法 ,并对其主要应用实例进行了介绍 。
关键词Fl o ris p h ae r a p ro f u n d a 钙质超微化石 海水上层结构 初级生产力 古气候
( ) Fl o ris p h ae r a p ro f u n d a 深水花球藻是形态
和生态都十分特殊的一种钙质超微化石 。该种单个
颗石呈不规则矩形板状 ,依大小差异又可分为两个
变种 ,较 小的 为 Fl o ris p h ae r a p ro f u n d a va r . p ro2
f u n d a , 较 大 的 称 为 Fl o ris p h ae r a p ro f u n d a va r .
( ) () el on g at a O ka da & Ho njo ,1973图 1A , B。现
生的 F. p ro f u n d a ,多个颗石叠合在一起 ,恰似一盛
( ) 开的花 朵 , 因 此 而 得 名 图 1C。O ka da 和 Ho njo 1973 年 最 先 在 太 平 洋 水 柱 样 中 发 现 现 生 的 F. 图 1 Fl o risohae ra p ro f un d a 的形态
() p ro f u n d a ,后来 O ka da 1980在菲律宾海 D SD P442 A . Fl o ris p h ae ra p ro f u n d a var . p ro f u n d a ; B . Fl o ri2
站 沉 积 样 中 发 现 了 化 石 F. p ro f u n d a , 1983 年 s p hae ra p ro f u n d a va r . el on g at a ; C. 颗石球 。
Fig. 1 Mo rp holo gy of Fl o ris p hae ra p ro f u n d a O ka da 指出该种最早出现在晚中新世 。现代大洋钙
A . Fl o ris p h ae ra p ro f u n d a var . p ro f u n d a ; B . Fl o ri2 质超微浮游植物调查表明 , F. p ro f u n d a 是一中低
s p hae ra p ro f u n d a va r . el on g at a ; C. Cocco sp here of F. 纬度种 ,仅见于 40?N 以南的大洋中 ,生活水温一般 p ro f u n d a. 在 10 —28 ?之间 。但与绝大多数中低纬度钙质超
( 古水深 的 演 变 L i & O ka da , 1985 ; Ta kaya na gi et 微浮游植物不同的是 , F. p ro f u n d a 主要生活在水
) al . , 1987。但是这种应用主要是在滨浅海地区 。 ( 体较深的下透光带 ,水深大约 60 m 到 180 m O ka da
1985 年李文勤和 O ka da 首次报道了热带西太平洋 ) & Ho njo ,1973。
深海柱状样 L 2011 晚第四纪沉积物中 F. p ro f u n2由于 F. p ro f u n d a 的这一生态习性 ,在最初应
d a 相对丰度变化并注意到其变化与浮游有孔虫氧 用于古环境研究时被当作古水深的标志 ,如 O ka da
同位素变化有关 ,从而揭示了其在古海洋学研究中 () 1983 ,1992对日本近海表层沉积钙质超微化石的
的潜力 。但 F. p ro f u n d a 真正用于深海古海洋学分析 ,发现 F. p ro f u n d a 丰度与水深有明显的相关
( ) 研究是从 Molfi no 和 Mc Int yre 1990 在 赤 道大 西 关 系 ,于是有些学者利用其丰度变化来再造第四纪
( ( ( ) ) 3 国家自然科学基金 批准号 : 40376019 ,40331002,国家重点基础研究专项经费 批准号 : G2000078502和创新研究群体科学基金 批准 ) 号 :40321603资助项目 。
收稿日期 2005204229
洋的工作开始 ,他们开创性提出了 F. p ro f u n d a 对 之 , F. p ro f u n d a 百分含量是营养跃层深度变化的 海水营养跃层深度的响应模式 ,成为利用该化石进 函数 :营养跃层浅 , F. p ro f u n d a 百分含量低 ; 营养 行古海洋学研究的经典 ,所以本文先从此谈起 。 跃层深 , 则 F. p ro f u n d a 百分含量高 。
该模式的提出为研究海水上层结构提供了一种
F. p ro f u n d a 与海水上层结构 1 新的 、简便的途径 ,因为 F. p ro f u n d a 形态特殊 ,在
偏光显微镜下极易识别 。在实际鉴定统计中 ,仅仅 Molfi no 和 Mc Int yre 1990 年研 究了 赤道 大 西 只需把钙质超微化石分为 F. p ro f u n d a 和其它种 洋沿 113?0′W 呈南北向的一个剖面 。该剖面跨越
类两部分 , 分别统计 , 很容易得出 F. p ro f u n d a 百( ) ( ) 西向的南赤道流 S EC和东向的赤道潜流 EU ,海
水上层结构特征变化明显 。他们用 PO离子浓度 4 分含量数据 。所以 ,这一方法已成为利用钙质超微
μ达到 1 . 0 mol/ L 时的深度来表 示营 养 跃层 深度 , 化石进行古海洋学研究最常用的手段 ,在世界许多 发现其变化范围在 50 m 到 200 m 之间 。对该剖面 () 海区都得到广泛应用 。如 A ha go n 等 1993在西北 11 个站位表层样品 F. p ro f u n d a 百分含量进行分 ( ) 太平洋琉球海沟 ,成鑫荣和汪品先 1998在冲绳海 析 ,发现随着营养跃层深度的变化 , F. p ro f u n d a 百 ()() 槽 ,O ka da 和 Mat suo ka 1996及 Bea ufo rt 等 1997 分含量的高低也呈现相关的变化 。营养跃层深 , F. ( ) 在印度洋 ,Ba ssi no t 等 1997在大西洋以及 Ca st ra2
p ro f u n d a 百分含量高 ; 营养跃层浅 , F. p ro f u n d a() do ri 1993在地中海的工作等等 。刘传联和成鑫荣 百分含量则变低 。上述规律在营养跃层深度变化强 () 2001也用此方法探讨了南沙海区近二百万年来海 烈的 RC2427 和 RC2429 站位样品中表现的最为明 水上层结构的变化 ,在此作为实例作一简单介绍 。 显 。 位于南沙海区的 OD P1143 站 2 . 3 Ma 以来 , F.
根据以上研究结果 , Molfi no 和 Mc Int yre 提出 p ro f u n d a 百分含量呈现两种不同时间尺度的变化 。 了 F. p ro f u n d a 对海水营养跃层深度响应的概念 一是冰期 —间冰 期 旋回 变 化 : 在 0 . 9 Ma 以 前 , F.
( ) 模式 图 2: 当营养跃层深 、处在下透光带时 ,有利 p ro f u n d a 百分含量冰期时高 ,间冰期低 ;0 . 9 Ma 以
于 F. p ro f u n d a 的生产 , F. p ro f u n d a 百分含量要后则相反 , 冰期时 F. p ro f u n d a 百分含量低 , 间冰 大于所有其它颗石藻总百分含量 ;当营养跃层浅 ,处 期时含量高 。除了随冰期 —间冰期旋回变化以外 , 在上透光带时 ,则有利于其它颗石藻的生产 ,不利于 OD P1143 站 F. p ro f u n d a 百分含量可分成 6 个阶 F. p ro f u n d a生产 , F. p ro f u n d a相 对 含 量 低 。简 言 () 段 图 3。
( ) 阶段 ?2 . 32 - 1 . 84 Ma, F. p ro f u n d a 百分
含量较高 ,平均为 79 % ,但全段变化比较稳定 ; 阶段
() ?1 . 84 - 1 . 47 Ma, F. p ro f u n d a 百分含量逐渐
降低 ,虽然平 均 值 为 66 % , 但 最 低 达 33 % ; 阶 段 ?
() 1 . 47 - 0 . 9 Ma , F. p ro f u n d a 又开始逐渐升高 ,
而其它钙质超微化石却与此相反 ,特别是在该阶段
的 顶 部 , F. p ro f u n d a 可 达 99 % 以 上 ; 阶 段 ?
() 0 . 9 - 0 . 49 Ma, 在 0 . 9 Ma 左右即 M IS22 期 , 其
它钙质超微化石含量突然升高 ,而 F. p ro f u n d a 突
然下降 ,从近 90 %降到 60 % ,而在以后到 0 . 49 Ma ,
() 两者的变化都较稳定 ;阶段 ?0 . 49 - 0 . 22 Ma, 在
M IS12 期 ,其它钙质超微化石再次升高 ,到 M IS8 期
达到研究层段的最高值 ,而 F. p ro f u n d a 却进一步
降低 ,其百分含量也 是 研究 层段 的 最低 值 ; 阶段 ?
() 0. 22 - 0 Ma,其它钙质超微化石迅速降低 ,而 F.
p rof un d a 百分含量又开始变高 ,并一直保持到现在 。 图 2 F. p ro f un d a 对海水营养跃层深度变化响 应
() 的概念模式 根据 Molfino 和 Mc Int yre ,1990根据 F. p ro f u n d a 百分含量的变化 ,推测南沙
Fig. 2 The co ncep t ual mo del of F. p ro f un d a re2 海区 2 . 32 Ma 以来海水营养跃层可能存在两种不( spo nse to va riatio n in nut ricline dep t h Af ter
)Molfino a nd Mc Int yre ,1990
2 F. p ro f u n d a 与海水初级生产力
钙质超微浮游植物是海洋中最重要的初级生产
者之一 ,它们的丰度变化可以用来再造海洋初级生
产力的 变 化 。近 年 来 应 用 最 广 的 方 法 是 利 用 F.
p ro f u n d a 百分含量定量计算海水初级生产力 。这
() 一方法源自 Bea ufo r t 等 1997在印度洋的工作 。
( ) Bea ufo r t 等 1997 对 取 自 印 度 洋 不 同 环 境 的
96 个表层沉积样品进行了钙质超微化石分析 。结
果发现 , F. p ro f u n d a 百分含量和由卫星数据估算
出的初级生产力之间存在着密切的关系 。他们建立
( ) 了 F. p ro f u n d a 百 分含 量 Fp 与 初 级 生 产 力 P P
- 2 - 1 ( ) Pri ma r y Pro ductivit y ,单位 g Cm yea r 的函数
关系式 :
( ) P P = 617 - [ 279 ×lo g Fp + 3]
Bea ufo r t 等用此方程式定量再造了赤道印度洋
MD900963 孔 910 kyr 以来初 级生 产 力的 演变 。其
结果与根据浮游有孔虫估算出的初级生产力记录极
为吻合 。说明这一方法的可用性 。
自此以后 ,该方法广泛应用于热带低纬海区第
四纪初级生产力的研究 。如 De Ga ri del2Tho ro n 和
() Bea ufo rt 2001用此方法再造了苏禄海 20 万年海
( ) 水初级生产力的变化 ; He nri k sso n 2000 再造了赤
道 大 西 洋 20 万 年 来 海 水 初 级 生 产 力 的 变 化 ;
() Bea ufo rt 等 2001更是用此方法再造了整个赤道太 图 3 南海南部 OD P1143 站 2 . 3 Ma 以来 F. p ro f u n d a
百分含量变化及其反映的营养跃层变化 平洋和印度洋晚更新世初级生产力的变化 ,并探讨 Fig. 3 Va riatio n in t he p ercent age of F. p ro f u n d a and ( ) 了厄尔尼诺 —南方涛动 EN SO 对初级生产力的驱
nut ricline dep t h fo r t he pa st 2 . 3 Ma in t he OD P 动作用 。
Site 1143 , so ut her n So ut h China Sea 西太平洋暖池的古海洋学 、古气候学是当今研
究的热点 。近年来 刘传 联 等对 位于 暖池 核 心区 的 同时间尺度的演化 。一种是随冰期 —间冰期旋回 , OD P 807 站和位于边缘区的 OD P1143 站第四纪海 营养跃层 呈 高 频 低 幅 的 反 复 升 降 。在 0 . 9 Ma 以 水初级生产力进行了研究 。为了更好的展示暖池区 前 ,间冰期 时 , 营养 跃 层浅 , 冰 期 时 变 深 ; 而 在 0 . 9 第四纪海水初级生产力的变化特征 ,我们同时还收 Ma 以后 ,间冰期时 , 营养 跃层 深 , 冰期 时 变浅 。第 集了其他学者在该区的研究结果 ,一并展示如图 4 , 二种是低频高幅长时间尺度营养跃层变化 ,也可分 借以说明 F. p ro f u n d a 百分含量对于定量计算海 为六个阶段 。2 . 32 Ma 到 1 . 84 Ma ,海水营养跃层 水初级生产力的重要性 。
深 ,同时变化较为稳定 。1 . 84 Ma 以后 ,逐渐变浅 。
到 1 . 47 Ma , 营养跃层再次逐渐变深 , 并在该阶段 3 F. p ro f u n d a 与 古 气 候 变 化 及 机 的晚期达到 2 . 3 Ma 以来的最深值 。在 0 . 9 Ma 左 制研究
右突然变浅 , 而后变化频繁 ,但幅度不大 。在 0 . 49
Ma 处又一次突然变浅 ,而后到 0 . 22 Ma 一直较浅 ,无论是海水上层结构还是初级生产力的变化都
与气候变化密切相关 。所以根据 F. p ro f u n d a 百是研究层段营养跃层最浅的时期 。0 . 22 Ma 以后 ,
()图 4 西太平洋暖池区若干钻孔第四纪海水初级生产力的变化 根据 F. p ro f un d a 百分含量算出
( ) Fig. 4 Variatio n in t he Q uater na r y p rima r y p ro ductivit y calculated f ro m percentage of F. p ro f un d ain so me co re s i n t he
We ster n Pacific Wa r m Pool
( ) () Molfi no 和 Mc Int yre 1990首先在赤道大西洋 Molfi no & Mc Int yre ,1990。 化的周期性
对 F. p ro f u n d a 百分含量与气候的关系进行了探 自此以后 ,钙质超微化石研究工作者在世界其 索 。大西洋赤道系统的变化主要受太阳辐射量控制 它热带海区也都发现了 F. p ro f u n d a 百分含量变
( ) ( 的赤道东风 即贸易风控制 : 夏季时 10W? 处东风 化的周期性 , 但不同海区得出的 周 期并 不相 同 表
( ) ) ( ) ( ) 强盛 ,南赤道流 S EC流速 、赤道发散 dive r ge nce1。如 O ka da 等 1996对赤道印 度洋 OD P716 孔
700 kyr 以 来 钙 质 超 微 化 石 的 研 究 显 示 , F. p ro 2 和初始生产力均高 ; 冬季则反之 。而营养跃层和温
跃层也相应在夏季时浅 ,位于上透光带 ,冬季时深 , f u n d a 百分含量变化的周期为 100 kyr ,23 kyr 和 41
( ) 位于下透光带 。所以 ,该地区 F. p ro f u n d a 百分含 kyr 周期信号则较弱 。Bea ufo r t 等 1997对赤道印 量的变 化 实 际 反 映 了 赤 道 东 风 的 强 弱 。 F. p ro 2 度洋 MD900963 孔 910 kyr 以来钙质超微化石的研
f u n d a 百分含量高时 ,反映赤道东风弱 ; F. p ro f u n2究 ,发现 F. p ro f u n d a 百 分 含 量 变 化 的 周 期 为 23 d a 百分含量低时 ,则反映赤道东风强 。 由于在轨道kyr 。Bea ufo r t 等对赤道印度洋 、赤道太平洋多个钻
尺度上 ,当近日点在冬季时赤道东 孔的研究则又显示 , F. p ro f u n d a 百分含量变化的
风强盛 , 当近 日点 在 夏 季 时 经 向 成 分 强 纬 向 成 分周期除 23 kyr 、100 kyr 外 ,还有 41 kyr 和 30 kyr 的
( ) 弱 ,赤道东风弱 ,所以赤道东风的强弱实际上是受地 周期 Bea ufo r t et al . , 2001 。我 们 对 南 海 南 部 球轨道变 化 的 岁 差 周 期 所 驱 动 。而 F. p ro f u n d a OD P1143 站 1 . 6 Ma 以来钙质超微化石的研究则显 百分含量频谱分析表明其变化 也是 以岁 差周 期 为 示 F. p ro f u n d a 百 分 含 量 除 23 kyr 、41 kyr 、100 主 ,23 kyr 周期的峰占去变量的 52 % - 53 % , 这说 kyr 的周期外 , 还有更长的周期 即 400 kyr 的周 期
() 明 F. p ro f u n d a 百分含量也可以用来探索气候变 刘传联等 ,待发表。
各个海区钙质超微化石演变周期的不同是由于 这指示它不是高 纬冰 盖 体积 变化 的 结果 。进一 步
其 所 处 的 气 候 条 件 不 同 所 造 成 。如 O ka da 等说 ,赤道大洋钙质超微化石演变既有高纬海区的影 () 1996认为印度洋 F. p ro f u n d a 百分含量在间冰 响又有低纬海区 的控 制 。因此 Bea ufo r t 等 从钙 质 期高 、冰期时低 ,是由于南亚季风在间冰期时强 、营 超微化石的角度证实了高纬海区和低纬海区都在全
球气候变化中起着重要作用 。Bea ufo r t 等人的工作 养 跃 层 深 , 冰 期 时 弱 、营 养 跃 层 浅 所 造 成 。而
( ) Bea ufo r t 等 1997认为 910 kyr 以来赤道印度洋钙 还发现赤道印度洋和太平洋 F. p ro f u n d a 百分含 质超微化石演变除受日射率岁差周期控制以外 , F. 量反映的初级生产力有 30 kyr 的周期 ,这一周期与 p ro f u n d a 百分含量反映的初级生产力变化周期与 南极冰芯记录的大气 CO变化周期一致 ,从而进一 2
步说明了赤道生物生产力对全球大气 CO所起的有孔虫氧同位素反映的地球轨道周期在相位上并不 2
调节作用 。南海的情况则不同 ,它即处于西太平洋完全一致 ,从而指出热带海区可能在全球气候中有
() 着独特作用 。Bea ufo r t 等 2001还认为赤道大洋钙 暖池区 ,又受亚洲季风的影响 ,因此在钙质超微化石 质超微化石演变受冰期 —间冰期旋回和岁差两种机 演变周期上与其它热带海区既有相同之处 ,也有差 制所驱动 。岁差控制的生产力变化与厄尔尼诺 —南 异 。
( ) 方涛动 EN SO有关 ,而领先于氧同位素比值变化 ,
表 1 低纬大洋第四纪沉积中 F. p r o f u n da 百分含量变化周期对比表
F. Ta ble 1 Periodical change in percentage of p r o f u n d a in the Quaternary sediments f rom tropical ocean
最老年龄 F. p ro f u n d a % 地 区 钻 孔 经纬度 资料来源 ( )周期 kyr ( )kyr
2?0 . 5′S 1 赤道大西洋 RC2427 200 23 Molfi no & Mc Int yre ,1990 115?3 . 3′W
0?3 . 30′N 5 赤道印度洋 MD900963 910 23 Beaufo rt et al . , 1997 735?3 . 60′E
5?6 . 0′N 4 赤道印度洋 OD P 716 700 100 O kada & Mat suo ka , 1996 731?7 . 0′E
赤道 印度N? —5N? 0 M74 , T29 , M63 , M49 , M41 , 100 , 41 , 30 , 23 —19 , 240 Beaufo rt et al . , 2001 洋2太平洋 50E? —90W? M40 , M38 , W84 , R13 5?0 . 2′N —252?0 . 7′N 23 RN892PC3 RN872PC4 西北太平洋 100 为主 ,41 和 23 弱 320 A hago n et al . , 1993 1242?4 . 1′E —1272?8 . 9′E KT84214 P1 2?1 . 72′N 9 南海南部 刘传联等 ,待发表 OD P1143 1560 392 , 41 1131?7 . 11′E
微化石的绝对丰度 、堆积速率等研究初级生产力的
变化已在赤道大西洋古海洋学研究中得到应用 。此 4 结 语
外 ,钙质超微化石氧 、碳稳定同位素和微量元素分析
F. p ro f u n d a 作为中低纬大洋晚中新世以来最 也是近年来蓬勃发展的一个新领域 。通过室内饲养常见的一种钙质超微化石 ,在古海洋学研究中有着 ,发现它们与海水温度 、 钙质超微化石同位素的分析
营养有极大的关系 。地质记录中的钙质超微化石同 重要的作用 。利用 F. p ro f u n d a 百分含量可以定
性推测海水上层结构的变化 位素分析揭示它们的变化与有孔虫同位素相比具有 ,可以定量计算海水初
级生产力 ,可以探索古气候变化及其机制 。由于这 鲜明的特征 ,可在古生产力再造 、古气候恢复方面发
一方法方便快速 ,现在已经成为利用钙质超微化石 挥独特作用 。因此 ,在利用钙质超微化石研究古海研究古海洋 、古气候最常见的手段 。最后需要指出 洋 、古气候 时 除 充 分 利 用 F. p ro f u n d a 百 分 含 量 的是 ,随着研究的深入 ,利用钙质超微化石研究古海 外 ,还要综合考虑其它指标 ,这样得出的结论才更加 洋 、古气候的新手段也在不断出现 。如根据钙质超 合理 。
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O N PAL AEOCEA NO GRAP HIC SIGNIFICA NCE OF FL O R I S P HA ERA
P RO FU N DA ( CALCA REO US NA NNOFOSSILS)
Z H A N G Shi2yi ng a nd L IU Ch ua n2lia n
( )S t ate Ke y L aborat or y o f M a ri ne Geol o g y , T on g j i U ni ve rsi t y , S han g hai 200092
Fl o ris p h ae r a p ro f u n d a , calca reo u s na nnofo ssil s , upp er ocea n st r uct ure , p ri ma r y p ro2 Key words
ductivit y , p alaeocli mat e
Fl oris p hae r a p ro f un d a i s o ne of t he lo wer eup hotic zo ne sp ecie s of calcareo us na nnofo ssil s , and it i s widely used i n t he p alaeoceano grap hy and p alaeocli mat e re search . U si ng of t he percent age of F. p ro f un d a , we can reco n2 st r uct t he variatio ns i n t he upper ocean st r uct ure such a s t he dep t h of t he nut ricli ne . The relatio nship bet ween t he percent age of F. p ro f un d a and p ri mar y p ro ductivit y ha s al ready been e st abli shed , so we ca n calculat e t he p ri mar y p ro ductivit y of t he upp er ocea n wat er . The variatio ns i n t he upper ocea n st r uct ure and p ri mar y p ro ductivit y were
co nt rolled by t he cli mat e , t herefo re , we ca n explo re t he cli mat e change s and t heir fo rci ng dyna mics by mea ns of t he
percent age of F. p ro f un d a. In t hi s pap er , we review t he applicatio n of F. p ro f un d a i n palaeocea no grap hy a nd
palaeocli mat e research by so me ca se st udie s .
范文二:塔玛亚历山大藻对罗非鱼肝及鳃组织ΑΤ∏酶活性的影响
研究
塔玛亚历山大藻对罗非鱼肝及鳃组织ΑΤΠ酶活性的影响?
周立红
陈学豪
水产生物技术研究所厦门 集美大学水产学院
提要
研究了罗非鱼 Τιλαπιαμοσσαμβιχα 腹腔注射塔玛亚历山大藻 Αλεξανδριυμ
结果显示低浓度毒 ×° 活性的影响?ταμαρενσε 毒素粗提液对鳃及肝组织的
高浓度则有抑制作用?素粗提液对罗非鱼鳃及肝组织 ×° 有激活作用 关键词中图分类号
塔玛亚历山大藻 Αλεξανδριυμταμαρενσε 麻痹性贝毒 ×°
÷
文献标识码
文章编号
水产养殖业在沿海国家中通常占据重要地位?近几
十年来 作为对捕捞业的重要补充 水产养殖业的发展十分迅速?但有害赤潮的发生使养殖业受到严重的威胁?其中麻痹性贝毒是一个重要因素?在亚太地区 从 年到 年间发生的赤潮对养殖业的危害事件中 麻痹性贝毒 °≥° 事件占了 导致这些事件的主要是Πψροδινιυμβαηαμενσε√ χομ?πρεσ2
συμ,
Αλεξανδριυμ
≈
1 1
材料与方法
ταμαρενσε, Γψμνοδινιυμ
≈
χατενατυμ等甲藻?其中又以塔玛亚历山大藻
Αλεξανδριυμταμαρινσε 分布最广?
麻痹性贝毒是一类四氢嘌呤的衍生物?现在已经发现的毒素有 多种 根据 基团的不同可以分为 类 分
包括石房蛤毒别是氨基甲酸酯类毒素 ≤ ?
素 ≥×÷ 新石房蛤毒素 ≥×÷ 膝沟藻毒素
∏ 2 ×÷ 磺酰氨甲酰基类毒素
? 包括 ≤ 脱氨甲酰基类毒素 ? 包括 ≥×÷ ≥×÷
? ×÷ 脱氧脱氨甲酰基类毒素
? 包括 ≥×÷ ×÷ 最近又在一种蟹Ζοσιμυσαενευσ中检出了石房蛤毒素和新石房蛤毒素的 羟基衍生物 ? √ 2 √ ≥×÷和 ≥×÷ 可能是一类新的麻痹性贝
毒毒素≈ ?由于 ×° 在低等! 高等生物体
具有广泛的生态意义 在机体中起到至关重要内普遍存在
并且是多种毒物攻击的靶点≈ ?因此在本次实验中的作用
作者采用检测染毒生物体兴奋性和分泌性组织中
对塔玛亚历山大藻对该酶的影 活力的方法 ×°
响及机理进行分析?
塔玛亚历山大藻毒素粗提液
塔玛亚历山大藻由本实验室培养 培养条件为非无菌培养 培养基 温度 ε? ε 光照
光暗比为 Β ?取培养 的藻液离心 ?
加入等量 弃去上清液
醋酸与藻细胞沉淀混匀后 冻融多次 再以
得到毒素粗提液? 离心 去除藻壳
1 2仪器设备与试剂
仪器 ? 型紫外分光光度计 高速冷冻离心机 玻璃匀浆器 电子天平 解剖器?
牛血 试剂 甘露醇
清蛋白 蔗糖 ∞?×
× ≤ 缓冲液
×° ≤ ≤ ≤
三氯醋酸×≤ ° 硫酸亚铁 钼酸铵≈ 硫酸亚铁 硫酸钼酸铵 硫酸钼酸铵用 的溶液配制 水稀释成
福建省教委 类科研基金项目 号?
第一作者 周立红 出生于 年 硕士 副教授?目前在研课题有/塔玛亚历山大藻对海洋生态系统能量传递的影
响0! /养殖污水处理0等?∞ ∏ ∏ ∏
收稿日期 修回日期
≥ ?
考马斯亮蓝 考马斯亮蓝溶于
加入 磷酸定容于 容量瓶 乙醇
过滤 ε保存 ?
1 3实验方法
罗非鱼 Τιλαπιαμοσσαμβιχα 的染毒处
采自集美大学淡水养理罗非鱼体质量 尾左右
挑选健殖场?在染毒前于曝气自来水中暂养 以上
壮! 活跃的个体随机分配到各个实验组中 每一浓度梯度组选取 尾罗非鱼?实验分为 个浓度梯度组和一个对照组 对照组每尾鱼注射 的醋染毒组分别注射 浓酸 不同浓度的毒素粗提液?
以毒素粗提液度设置为 组
为 浓度 其余百分比为毒素粗提液以蒸馏水稀释后的浓度?注射后暂养 ?解剖取其鳃及肝脏并测定
其中 ×° 活力?
≈
分别在 样品蛋白质含量的测定
两组试管中 各加入 牛血清蛋白 Λ 以 ≤ 补足至 Λ 同时以两管 Λ 的 ≤ 作空白对
振荡混照? 每管加入 考马期亮蓝染料溶液
室温放置 匀 后进行比色测定 波长 以消光值为纵坐标 蛋白质含量为横坐标 绘制标准曲线? 取 Λ 的样品加入 考马期亮蓝染料 振荡混匀 室温放置 后 于 处测吸
在标准曲线上查得相应蛋白质浓度?光度Α
≈
活力的测定 ×°
制作磷标准曲线 分别在两组试管中各加入
°
粗提液原液的毒性为 鼠单位 由此算出每
尾鱼注射液相应的毒性大小并列于各浓度下?从表 可见 在注射毒素浓度为 的情况下 肝脏的
平均值达 当 ×° 比活性最高 ?
毒素的浓度继续增加时 活性反而降低?而鳃中
×° 的比活也有类似现象 见表 及
染毒组个体肝脏 图 ?经统计分析 ×2
而鳃的比活 ° 比活与对照组差异显著 Π
差异不显著 Π ?
图
?
罗非鱼肝组织 ×° 活力比较
√ ×° √ Τιλαπιαμοσσαμβιχα ∏
讨论
加双蒸水使各管体积均为 依次加入三 氯醋酸 硫酸亚铁 钼酸铵
后 于波长 处测Α值 以消光值为纵坐标 磷
的含量为横坐标 绘制标准曲线? 样品
×° 活力的测定 取 样品加入
加入 酶反应液 ε保温
三氯醋酸终止反应 加入 硫酸亚铁 钼酸铵
于波长 处测光密度?在标准试液 后
曲线上查得相应磷浓度? ×° 比活的计算 酶活力以每小时每毫克蛋白水解 ×°释放出的无机磷微摩尔数≈Λ # 表示?
结果
根据小白鼠法测得本实验塔玛亚历山大藻毒素
实验罗非鱼经注射 毒素粗提液 其肝脏!
鳃组织 ×° 活性高于对照组?而注射 ? 浓度则酶活性均低于对照组?这说明塔玛亚历山大藻毒素粗提液可造成实验罗非鱼鳃! 肝
而且 在较脏等组织 ×° 活性改变?
低的浓度下往往是增加酶活性 较高浓度则能抑制酶
我们认为这是因为毒素进入动物体与钠离子通活性?
道结合 阻断钠离子内流≈ 而生物的应激反应促使酶超常活动以抵消危害 因此使得低浓度组鱼组织 ×° 的活力增加?这种生物在不良环境下的应激反应在不少研究中已被证实≈ 如某些藻类在低浓度石油影响下会增加光合作用强度和分裂速度 但随着石油浓度的加大 二者均被抑制而降低 低剂量的??×引起蟹的神经兴奋 激素分泌增多 因而促进其蜕皮和附肢的再生?但随着注射毒素
塔玛亚历山大藻的毒性使得动物 浓度的增加
活性越来越低 动物的生理 受到抑制 ×°
机能最终受到破坏?
海洋科学 年 第 卷 第 期
表1 塔玛亚历山大藻对罗非鱼鳃及肝脏Να+?Κ+?ΑΤΠασε活力的影响
Ταβ.1 ΕφφεχτσοφΑλεξανδριυμταμαρενσεονοναχτι?ιτψοφΝα+?Κ+?ΑΤΠασεινγιλλσανδλι?ερσοφΤιλαπιαμοσσαμβιχα
组别及毒性
鼠单位
鼠单位
实验鱼号
鳃的比活
鳃比活平均值? ≥?
?
肝的比活
肝比活平均值? ≥?
?
鼠单位
?
?
鼠单位
?
?
对照组
鼠单位
?
?
数据结果仅供参考? 注 组罗非鱼死亡较多
在本实验中各组罗非鱼鳃中 ×2° 的比活差异不显著 这可能因为实验采取腹腔
毒素未经过鳃而直接侵入肝脏组织注射毒素的方法
也有可能因为麻痹性贝毒在鱼体内的不同组织中中?
含量各有差异 通常在消化器官中的含量最高 而其
他组织中的含量相对较低≈ 因此 ×2° 所受影响可能也不同?
是一组在细胞内离子转运和 ×°
能量代谢过程中起重要作用的酶系统?它从水解 ×°
分子中获得能量 逆电化学梯度转运 也称钠 和 ≈ 泵? ×° 广泛分布于各类细胞质膜上 其活性在不同的组织内差异很大 在兴奋性和分泌性组织中酶活性很高?麻痹性贝毒的毒理机制是在分子层级上 阻断钠离子内流 其对钠离子通道具有特殊亲和性?当毒素与钠离子通道结合后 将会使神经传导发生
使细胞不能提供正常活动所需要的能量 严重情困难≈ ?
况下 可导致生物死亡?目前国内外在塔玛亚历山大藻
对海洋动物的影响方面进行了较多研究≈ 而本文就毒素引起生物生化参数变化的研究则将有助于阐明其作用的分子机制 并且已有的研究表明毒物对 ≈ ×° 抑制的浓度! 时间具有依赖性?本实验
证明塔玛亚历山大藻对养殖动物重要的 ×° 活性有明显影响 这对研究其对水生动物的亚致死研究十分重要 也显示该酶作为检测塔玛亚历山大
藻的指标有一定前景?
结论
塔玛亚历山大藻毒素粗提液对罗非鱼鳃及肝脏组织 低浓度使 ×° 活力有一定影响
高浓度使酶活性降低?酶活性增加
用动物肝! 鳃组织 ×° 活力的变化作为监测塔玛亚历山大藻的亚致死研究将具有一定价值?
参考文献
∏ ? ? ≥ ? ∏ √ ? ≥ × ?
于仁诚 周名江 麻痹性贝毒研究进展 海洋与湖沼
袁锦芳 陈叙龙 环境因素对海洋动物 ×°酶的影响概述 海洋环境科学
奥斯伯? 金斯顿 ∞ 塞德曼 精编分子生物学实验指南 北京 科学出版社 南京大学环境生物学教研室 环境生物学实验技术与方法 南京 南京大学出版社 刘安西 细胞膜离子通道 北京 中央民族学院出版社 李永琪 丁美丽 海洋污染生物学 北京 海洋出版社
≥ ?
研究
≠ × ∏ ?∏ ∏ √ ∏ √ √ Χηλαμψσφαρρερι ? ∏ Αλεξανδριυμταμαρενσε × ?
周宏农 水产品藻源毒素检测操作手册 台湾 水产出版社 傅萌 颜天 李钧 等 塔玛亚历山大藻对墨西哥湾扇贝幼体发育的影响 海洋科学
ΕΦΦΕΧΤΟΦΑλεξανδριυμταμαρενσεΟΝΑΤΠασεΑΧΤΙ?2ΙΤΨΙΝΤΗΕΛΙ?ΕΡΑΝ?ΓΙΛΛΟΦΤιλαπιαμοσσαμβιχα
≤ ∞ ÷∏
ΦισηεριεσΧολλεγε&ΙνστιτυτεοφΑθυαχυλτυρεΒιοτεχηνολογψ, ?ιμειΥνι?ερσιτψ, Ξιαμεν,
Ρεχει?εδ:
Κεψ?ορδσ:Αλεξανδριυμταμαρενσε, ° ×°
Αβστραχτ
× ×° √ √ Τιλαπιαμοσσαμβιχα ∏ ∏ ? ? Αλεξανδριυμταμαρενσε √ √ × ∏ × ? ×°
2 √ ×°
刘珊珊 本文编辑
(上接第74页)
ΣΤΥ?ΨΟΝΠΡΕΠΑΡΑΤΙΟΝΟΦΛΟ?ΓΕΛΛΙΝΓΠΟΙΝΤ
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ΙνστιτυτεοφΟχεανολογψ, ΤηεΧηινεσεΑχαδεμψοφΣχιενχεσ, Θινγδαο,
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张培新 本文编辑
海洋科学 年 第 卷 第 期
范文三:应用qPCR方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究_高岩
第 33卷第 8期 2013年 8月
环 境 科 学 学 报 Acta Scientiae Circumstantiae
Vol.33, No.8Aug., 2013
基金项目 :国家自然科学基金面上项目 (No.41176100) ; 国家重点基础研究发展 (973) 计划项目 (No.2010CB428705) ; 国家自然科学基金委创 新研究群体基金项目 (No.41121064)
Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.41176100) , the National Basic Research Program of China (No.2010CB428705) and the Innovation Research Group Program of Natural Science Foundation of China (No.41121064)
作者简介 :高岩 (1988— ) , 女 , 博士研究生 , E-mail :gaoyan0109@mails.gucas.ac.cn ; *通讯作者 (责任作者 ) , E-mail :rcyu@ms.qdio.ac.cn Biography :GAO Yan (1988— ) , female , Ph.D.candidate , E-mail :gaoyan0109@mails.gucas.ac.cn ; *Corresponding author , E-mail :rcyu@ms.qdio.ac.cn
高岩 , 于仁成 , 张清春 , 等 .2013.应用 qPCR 方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究 [
J ].环境科学学报 , 33(8) :2256-2263Gao Y , Yu R C , Zhang Q C , et al .2013.Application of qPCR method in detection of Alexandrium tamarense species complex in China [J ].Acta Scientiae Circumstantiae ,
33(8) :2256-2263应用 qPCR 方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种
的研究
高 岩 1, 2, 于 仁成 1, *, 张 清 春 1, 周 名 江 1
1.中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室 , 青岛 2660712.中国科学院大学 , 北京 100049收稿日期 :2012-11-30
修回日期 :2013-03-13
录用日期 :2013-03-13
摘要 :亚历山大藻属的部分藻种 (Alexandrium spp.) 能够产生麻痹性贝毒毒素 (PST ) , 是重要的有害藻华 (HAB ) 原因种 .由于亚历山大藻属中 的有毒和无毒藻种形态相似 , 且海水中亚历山大藻的细胞密度通常很低 , 因此 , 高灵敏度 、 高特异性的分子生物学方法在亚历山大藻检测方面 具有重要的应用前景 .塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻是中国近海主要的有毒亚历山大藻藻种 , 大多属于塔玛亚历山大藻复合种第四类核
糖体型 (Group Ⅳ ,
以往称为 “ 亚洲温带核糖体型 ” ) .因此 , 本研究尝试将实时荧光定量 PCR (qPCR ) 方法用于我国近海塔玛亚历山大藻复合种 (Group Ⅳ ) 的快速检测 , 并对方法的特异性和灵敏度进行了检验 .研究表明 , 所建立的 qPCR 方法能够特异性地检测我国近海不同海域分离的
塔玛亚历山大藻复合种 (Group Ⅳ ) , 方法具有良好的线性响应关系和较高的灵敏度 , 最低可检出 5个藻细胞 , 具有良好的应用前景 .然而 , 实验 也发现 , 自我国近海分离的塔玛亚历山大藻复合种的不同藻株之间 , 以及处于不同生长阶段的藻细胞之间 , qPCR 检测结果存在显著差异 , 反映 了目标藻核糖体 RNA 基因拷贝数的差异和变化对 qPCR 检测结果的影响 .因此 , 建议在将 qPCR 方法用于不同海域亚历山大藻样品检测时 , 应 采用该海域分离的藻株专门构建标准工作曲线 , 以减小定量分析误差 .关键词 :亚历山大藻 ; 有害藻华 ; 实时荧光定量 PCR 文章编号 :0253-2468(2013) 08-2256-08中图分类号 :X835, X171.5
文献标识码 :A
Application of qPCR method in detection of Alexandrium tamarense species
complex in China
GAO Yan 1, 2, YU Rencheng 1, *
, ZHANG Qingchun 1, ZHOU Mingjiang 1
1.Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences , Institute of Oceanology , Chinese Academy of Sciences , Qingdao 2660712.University of Chinese Academy of Sciences , Beijing 100049Received 30November 2012;
received in revised form 13March 2013;
accepted 13March 2013
Abstract :Several species in genus Alexandrium can produce paralytic shellfish toxins (PST ) , and are important causative species of harmful algal blooms.Due to the similarity in morphological features between toxic and non-toxic species and the relatively low cell abundance of toxic Alexandrium cells presented in water column , molecular biological methods with high specificity and sensitivity have great potential in detecting toxic Alexandrium cells.A.tamarense and A.catenella are the two major toxic species presented in the coastal waters of China , and most of the strains identified so far were assigned to the Group IV ribotype (previously named as “ Temperate Asian ” ribotye ) of the A.tamarense species complex.In this study , we developed a real-time quantitative PCR (qPCR ) method to detect the A.tamarense species complex (Group Ⅳ ) in China.The method showed high specificity and sensitivity for the detection and quantification of A.tamarense species complex (Group Ⅳ ) .The detection limit was as low as 5cells.However , significant differences in quantitative results were noticed among different isolated strains of A.tamarense species complex as well as the cells collected at different growth stages.This reflected potential interference from the difference or variation of rRNA gene copy number in Alexandrium cells.Thus , the strain of A.tamarense species complex isolated from a targeted area should be used to develop the standard calibration curve when applying the qPCR method in quantitative detection of A.tamarense species complex in the specific area.Keywords :Alexandrium ; harmful algal bloom ; real-time quantitative PCR
8期 高岩等 :应用 qPCR 方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究
1引言 (Introduction )
有害藻华 (Harmful Algal Bloom , HAB ) 是近海 常见的灾害性生态现象 , 能够通过不同途径危害人 类健康和生态安全 (Landberg , 2002; Zingone et al., 2000) .亚历山大藻 (Alexandrium ) 属中的部分藻种 能够 产 生 麻 痹 性 贝 毒 (Paralytic Shellfish Toxins , PST ) , 是一类重要的有害藻华原因种 .在目前已知 的 30种亚历山大藻中 , 已证实能够产生毒素的有 16种 , 其中 , 12种可产生麻痹性贝毒毒素 (Anderson et al ., 2012; Balech , 1995) .水体中的亚历山大藻 在被双壳贝类等滤食性动物摄食后 , 麻痹性贝毒会 在动物体内累积 , 导致水产品消费者中毒 , 严重时 甚至会导致死亡 (Picot et al ., 2011) .在全球范围 内 , 因麻痹性贝毒导致的中毒事件分布最广 、 危害 也最为突出 , 因此 , 亚历山大藻藻华问题受到了密 切关注 .
海水中亚历山大藻细胞的密度通常较低 , 即便 在藻华期间 , 亚历山大藻也很少在浮游植物群落中 占据优势 .但亚历山大藻的危害效应非常突出 , 即 使在 102 103cells ·L -1的低密度下 , 也有可能产生 潜在的危害效应 (GEOHAB , 2001) .而且 , 亚历山大 藻属中的部分有毒藻种和无毒藻种形态特征相似 , 甚至同一藻种也存在有毒和无毒藻株 , 仅依靠形态 学特征难以鉴别 .因此 , 在亚历山大藻藻华研究中 , 灵敏度高 、 特异性强的分子生物学方法近期得到了 快速发展 , 并逐渐应用于亚历山大藻的藻华监测和 研 究 中 .其 中 , 实 时 荧 光 定 量 PCR (Real-time quantitative PCR , qPCR ) 是一种很有前景的方法 , 已在欧洲 、 日本及美国近海的亚历山大藻藻华研究 中得到应用 (Dyhrman et al., 2006; Galluzzi et al., 2004; Hosoi-Tanabe et al., 2004) , 也被成功用于亚 历 山 大 藻 孢 囊 的 检 测 (Erdner et al., 2010; Kamikawa et al., 2007) .
亚历山大藻广泛分布于我国近海 , 目前已发现 了塔玛亚历山大藻 (Alexandrium tamarense ) 、 链状亚 历山 大 藻 (A.catenella ) 、 微 小 亚 历 山 大 藻 (A.minutum ) 、 相关亚历山大藻 (A.affine ) 等藻种 .近年 来 , 有关我国近海亚历山大藻藻华的报道逐渐增 多 , 自 2002年以来 , 长江口及其邻近海域连续多年 爆发亚历山大藻藻华 , 部分海域亚历山大藻细胞密 度高达 106cells ·L -1.同时 , 贝类中也经常检测到 PST 毒素 , 中毒事件多次发生 .2008年 , 因食用染毒 杂色蛤 , 江苏连云港发生了七人中毒 、 一人死亡的 中毒事件 (庞中全 , 2009) ; 2010年 , 养殖池塘海水中 的亚历山大藻引发了毛蚶 (Scapharca subcrenata ) 中 毒事件 , 造成 14人中毒 (赣榆县疾控中心 , 2010) ; 同 年 , 香 港 发 生 了 食 用 虾 夷 扇 贝 (Patinopecten yessoensis ) 引起的麻痹性贝毒中毒事件 , 共有 28人 出现中毒症状 (广东省卫生厅 , 2010) .有毒亚历山 大藻的藻华对我国沿海的海水养殖和水产品消费 者的身体健康构成了巨大威胁 .
塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻是我国近 海最为常见的麻痹性贝毒产毒藻 , 这两种亚历山大 藻与芬迪湾亚历山大藻 (Alexandrium fundyense ) 的 形态特征相似 , 核糖体 RNA 基因序列相近 , 因此 , 这 3种亚历山大藻也被合称为塔玛亚历山大藻复合种 (Alexandrium tamarense species complex ) (Lily et al., 2007) .但在塔玛亚历山大藻复合种中 , 基于 核糖体 RNA 基因序列划分的核糖体型与形态种却 不能一一对应 .以往研究表明 , 目前我国近海分离 的塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻藻株大多属 于塔玛亚历山大藻复合种第四类核糖体型 (Group Ⅳ ) , 或称亚洲温带核糖体型 (Wang et al ., 2008; 唐 祥海等 , 2006) , 可以采用相同的分子生物学方法进 行检测 .目前 , 针对塔玛亚历山大藻复合种 (Group Ⅳ ) 已建立了荧光原位杂交方法 (于仁成等 , 2006) , 并对海水中的亚历山大藻样品进行了检测 .结果表 明 , 该方法具有良好的定性鉴别能力 , 但在定量分 析方面还有所欠缺 .近年来 , qPCR 方法也开始应用 于我国的有害藻华研究 , 目前已针对我国近海多种 有害藻 华 原 因 种 建 立 了 qPCR 检 测 方 法 (Yuan et al., 2012; 石彦红等 , 2010; He et al., 2009; 何 闪英等 , 2007) , 并尝试将该方法应用于海水样品中 东海原甲藻 (Prorocentrum donghaiense ) 、 米氏凯伦藻 (Karenia mikimotoi ) 和 中 肋 骨 条 藻 (Skeletonema costatum ) 的检测 , 取得了良好的效果 (Yuan et al., 2012) .然而 , 到目前为止 , 对我国近海亚历山大藻复 合种的 qPCR 检测方法尚未见研究报道 .因此 , 本研 究针对我国近海的塔玛亚历山大藻复合种 (Group Ⅳ ) , 尝试将实时荧光定量 PCR 方法用于亚历山大藻 的快速识别和计数 , 并对方法的特异性 、 灵敏度 , 以及 影响 qPCR 结果准确性的因素进行分析和研究 .
2材料与方法 (Materials and methods )
2.1实验藻株及培养条件
实验所用藻株及其分离地如表 1所示 , 实验中 7522
环 境 科 学 学 报 33卷
将分离自东海的链状亚历山大藻 (ACDH 藻株 ) 作
为目标藻构建标准曲线 , 以其它藻株进行对比研究 .
表 1实验中采用的微藻及其核糖体 RNA 基因在 GenBank 数据库
的序列号
Table 1Microalgal species used in the experiment and the GenBank
accession number for their rRNA gene
种名 株系 分离地 LSU rRNA 基因 D1 D2区
Alexandrium catenella ACDH 东海 DQ176647
A.tamarense ATCI02南海 DQ176650
A.tamarense ATCI03南海 DQ176651
A.tamarense AT5-3南海 DQ176649
A.tamarense ATHK 南海 DQ176652
A.tamarense AT-6欧洲 DQ176655
A.minutum AM 台湾地区 DQ176657
A.minutum AM-LYG 连云港
A.affine AC-1南海 DQ176654 Skeletonema costatum SC-1胶州湾
所有实验藻株均在中国科学院海洋研究所海 洋生态与环境科学重点实验室内保种培养 , 培养液 采用 f /2营养盐配方 .培养用海水系取自青岛汇泉 湾附近的自然海水 , 经过海洋所水族楼的海水处理 系统过滤和消毒 , pH 值为 7.9? 0.1, 盐度为 30? 1.进入实验室后首先以 0.45μm 混合纤维滤膜过滤 , 并煮沸灭菌 , 室温冷却后添加营养盐备用 .所有保 种用具均经高压蒸气灭菌 20min.实验藻类培养温 度为 (21.0? 0.5) ? , 光 照 约 为 4000lx , 光 暗 比 (L ? D ) 为 14h ? 10h.
2.2qPCR 方法的建立
本研究中所用的 qPCR 方法参考 Kamikawa 等 (2007) 建立的 Taqman qPCR 方法 .该方法采用一对 引物对提取 DNA 样品进行靶序列扩增 , 并以一条荧 光标记的特异性探针对扩增产物进行标记 , 以便定 量分析 .引物和探针系针对日本近海链状亚历山大 藻核糖体大亚基 RNA 基因的 D1 D2区设计 .2.2.1引物和探针的设计与合成 根据本实验室 以往研究中得到的中国近海塔玛亚历山大藻复合种 28S rDNA 的序列信息 , 结合 GenBank 中已知亚历山大 藻的 LSU rDNA 的序列信息 , 参考 Kamikawa 等 (2007) 引物和探针设计的靶区 , 以 Primer 5软件设计探针 , 并 手工对比优化 , 设计了一对引物与一条特异性探针 , 分 别命名为 cat F :5'-CCTCAGTGAGATTGTAGTGC-3' 和 cat R :5'-GTGCAAAGGTAATCAAATGTCC-3' , TaqMan cat :5'-FAM-ATGGGTTTTGGCTGCAAGTGCA-TAMRA- 3' , 目标片段长度为 106bp.引物及探针由大连宝生 物公司合成 .
2.2.2目标藻 DNA 模板提取 DNA 的提取参考 Shoko Hosoi-Tanabe 的 方 法 (Hosoi-Tanabe et al., 2005) .收集的藻细胞采用 400μL TE 缓冲液 (10 mmol ·L -1Tris-HCl , pH =7.5; 1mmol ·L -1EDTA , pH =8.0) 重悬 , 100? 煮沸 5min.加入 400μL 苯 酚 -氯仿 -异戊醇 (25? 24? 1) 混合液 , 室温振荡后 , 经 离心将上清液转至干净的 Eppendorf 管中 .然后加 入 15μL 3mol ·L -1醋酸钠 (pH =5.2) 与 400μL 无 水乙醇 (-20? ) , 于 4? 静置 20min 以上 .离心后 以 70%乙醇清洗 DNA 两次 , 干燥并溶于 20μL TE 缓冲液中 .
2.2.3qPCR 扩 增 与 检 测 采 用 Eppendorf Mastercycler ep realplex 实时荧光定量 PCR 仪进行 qPCR 反 应 , 反 应 体 系 为 :Premix Ex Taq TM 12.5μL , 双蒸水 8.5μL , 正反向引物 (10μmol ·L -1) 各 1μL , Taqman 探针 (5μmol ·L -1) 2μL (TaKaRa Bio Inc.) , DNA 模板 2μL.PCR 程序 :95? 预变性 30s ; 95? 变性 5s , 60? 退火 30s , 共 40个循环 .
2.3方法验证与样品分析
2.3.1引物特异性验证 分别选择 :① 链状亚历山 大藻 (ACDH 藻株 ) , ② 链状亚历山大藻 (ACDH 藻 株 ) +微小亚历山大藻 (AM 藻株 ) +相关亚历山大 藻 (AC-1藻株 ) +中肋骨条藻 (SC-1藻株 ) 的混合藻 样 , ③ 添加 ACDH 藻株的天然海水样品 , ④ AM 藻 株 , ⑤ AC-1藻株 , 以及 ⑥ AM 藻株 +AC-1藻株 +SC-1藻株的混合藻样等 , 进行 qPCR 反应 , 将反应产物 进行琼脂糖凝胶电泳 , 根据电泳图和 qPCR 反应图 , 分析引物的特异性 .
2.3.2qPCR 方法的线性响应 取 9000个 ACDH 藻细胞 , 按照 2.2.2节方法提取 DNA , 并对提取的 DNA 样品进行逐级 2倍梯度稀释 , 以稀释后样品进 行 qPCR 分析 , 每一样品重复 3次 , 分析每一样品 C q 值 (Quantification Cycle ) 与 DNA 模 板 量 的 线 性 关系 .
2.3.3qPCR 方法的标准工作曲线与检出限 以 分离自东海的链状亚历山大藻 ACDH 藻株作为目 标藻 , 以同一培养阶段的藻细胞构建分析的标准曲 线 , 分别取 5、 10、 50、 100、 500、 1000、 5000、 10000个 链状亚历山大藻细胞 , 其中 , 5、 10个细胞组通过毛 细管 挑 取 单 细 胞 获 得 , 50、 100、 500、 1000、 5000、 10000个细胞组通过显微镜计数后并逐级稀释获
8522
8期 高岩等 :应用 qPCR 方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究
得 , 所有样品均取 1mL 藻液 , 离心后提取 DNA , 每 一浓度做 3个平行 .将 qPCR 反应所得 C q 值与细胞 数的对数值通过线性回归拟合作为标准曲线 , 以最 低细胞密度的响应情况来代表其检出限 .
2.3.4对中国沿海分离的塔玛亚历山大藻复合种 不同藻株的检测结果对比 选取 5株分离自中国沿 海不同海域的塔玛亚历山大藻或链状亚历山大藻 (表 1) , 取处于对数生长期的藻细胞 , 用灭菌海水稀 释至 3000cells ·mL -1.每一样品重复测定 3次 , 每次 取 1mL 稀释藻液离心收集藻细胞 , 提取 DNA , 并以 所建立的 qPCR 方法进行定量分析 .
2.3.5不同生长阶段亚历山大藻 qPCR 检测结果 对比 分别培养链状亚历山大藻 ACDH 藻株和塔 玛亚历山大藻 ATCI03藻株 , 培养条件如 2.1节所 述 , 初始接种密度均为 500cells ·mL -1.自接种日起 , 每隔 3d 采集一次样品 , 在显微镜下计数细胞密度 .同时 , 取样进行 qPCR 分析 , 每次采集 3个样品 , 每 一样品收集 3000个藻细胞 , 置于 -20? 冻存 , 直至 两株藻进入衰亡期 .将冻存的细胞提取 DNA , 并进 行 qPCR 检测 .
2.3.6qPCR 方法对自然海水模拟样品的分析 自青岛汇泉湾取自然海水样品 , 经 200#m 筛绢过滤 后 , 显微镜下观察确认无亚历山大藻细胞存在 .取 一定数量室内培养的链状亚历山大藻 ACDH 藻株 添加到自然海水样品中 , 作为自然海水模拟样品 , 用所建立的 qPCR 方法对亚历山大藻细胞数进行检 测 .实验共设置 2个浓度 , 分别含有 500个和 3000个亚历山大藻细胞 , 每一浓度设 3个平行 .将样品以 碘液固定后分级沉降至 10mL , 离心收集藻细胞 , 提 取 DNA , 进行 qPCR 反应 .
2.4统计分析
采用 SPSS 软件 , 通过对样品的描述性统计分 析 、 方差齐性分析及多重比较 , 分析塔玛亚历山大 藻复合种不同藻株和不同生长阶段样品的 qPCR 检 测结果之间差异的显著性 .
3结果与分析 (Results and analysis )
3.1qPCR 方法引物的特异性验证
以 qPCR 方法中设计的引物扩增 2.3.1节中 6个藻 类 样 品 的 DNA , 结 果 发 现 , 仅 在 含 有 目 标 藻 ACDH 藻株的 3个样品中扩增到了大小约 100bp 的片段 , 其他样品中均未检测到扩增的 PCR 产物 (图 1) .结果表明 , 该引物能够对塔玛亚历山大藻复 合种 的 目 标 序 列 (LSU rRNA 基 因 ) 进 行 特 异 性 扩增
.
图 1应用 qPCR 方法中的引物对不同藻类样品扩增产物的电 泳分析 (M :D500Marker (Takara Co.) ; 1 6对应 2.3.1节中的藻样 ① ⑥ ; 7、 8、 9均为空白对照 )
Fig.1Electrophoresis analysis of the amplified products of different algal samples using the primer pairs designed for the qPCR method (M :D500Marker (Takara Co.) ; 1 6present algal samples ① ⑥ in section 2.3.1; 7、 8、 9:blank
)
图 2qPCR 反应的 C q 值与 DNA 模板稀释倍数之间的关系 Fig.2The relationship between C q value and dilution rate of template DNA
3.2qPCR 方法的线性响应
将从 ACDH 藻株中提取的 DNA 模板逐级稀释 后 , 经 qPCR 检测 , 其结果与 DNA 模板稀释倍数之 间的关系如图 2所示 .结果表明 , qPCR 的 C q 值与 DNA 模板量 (以稀释倍数表示 ) 之间具有良好的线 性响应关系 , R 2值为 0.999, 可见该 qPCR 方法对添 9522
环 境 科 学 学 报 33卷
加的目标藻 DNA 模板量具有良好的线性响应 .3.3qPCR 方法的标准工作曲线
按 2.2节所述方法提取亚历山大藻模板 DNA , 以细胞数为横坐标 , 以实时荧光定量 PCR 方法分析 得到的 C q 值为纵坐标 , 绘制标准工作曲线 , 结果如 图 3所示 .受到样品 DNA 提取效率及细胞之间的差 异等因素的影响 ,
方法的拟合度略低 , 但两者之间 仍具有良好的线性关系 ,
R 2值可达 0.
978.图 3针对链状亚历山大藻 ACDH 藻株构建的 qPCR 标准工作 曲线
Fig.3
qPCR calibration curve established with cells of Alexandrium catenella (strain ACDH )
3.4不同塔玛亚历山大藻藻株 qPCR 定量检测结
果对比
图 4中国近海塔玛亚历山大藻复合种 5个藻株 qPCR 定量检 测结果对比
Fig.4
Comparison of quantitative analytical results with qPCR on 5
strains of A.tamarense species complex isolated from China
对实验室培养的 5株塔玛亚历山大藻复合种
(ATCI02、 ATCI03、 AT5-3、 ATHK 为分离自南海的 塔玛亚历山大藻藻株 , ATCI02为分离自东海的链状 亚历山大藻藻株 ) , 各取相同数量的对数生长期藻
细胞 , 应用所建立的 qPCR 方法进行定量检测 , 结果
如图 4所示 ,
分析结果表明 , 在 5株塔玛亚历山大藻 中 , 有 4株检测结果基本一致 , 而分离自南海海域的
ATCI03藻 C q 值明显偏低 .Duncan 检验 结 果 也 显 示 ,
ATCI03组 的 C q 值 与 其 它 4组 存 在 显 著 差 异 (p <0.05) , 5株 藻 之 间 的 组 间 差 异 主 要 来 自 ATCI03, 其它 4株藻的扩增结果没有显著差异 .
3.5不同生长阶段亚历山大藻 qPCR 定量检测结
果对比
对链状亚历山大藻 ACDH 藻株和塔玛亚历山 大藻 ATCI03藻株不同生长阶段的藻细胞进行检 测 , 结果如图 5所示 .可以看出 , 处于不同生长阶段 的亚历山大藻得到的检测结果存在明显差异 , 对于 细胞数相同的样品 , 在对数生长初期采集样品的 C q 值明显低于对数生长中期及稳定期的样品 .相同藻 细胞密度下 ,
ATCI03藻株样品的 C q 值低于 ACDH 藻株 , 这两个藻株间的差异并不能用生长阶段的差 别来解释
.
图 5对不同生长阶段塔玛亚历山大藻复合种藻细胞 qPCR 定 量检测结果对比
Fig.5
Comparison of quantitative analytical results with qPCR on cells of A.tamarense species complex collected at different growth phases
3.6
自然海水模拟样品检测结果
应用 qPCR 检测方法 , 对制备的自然海水模拟
样品进行了分析 , 所得到的检测结果如表 2所示 .可
622
8期 高岩等 :应用 qPCR 方法检测中国近海塔玛亚历山大藻复合种的研究
以看出 , 根据 qPCR 所得到的检测结果低于真实细
胞浓度 , 两组链状亚历山大藻细胞的检测回收率在
60% 70%之间 .对自然海水样品沉降浓缩 、 离心浓
缩及 DNA 提取过程的逐步分析表明 , 回收率偏低的
原因主要来自沉降浓缩过程中目标藻细胞的丢失 ,
这是造成检测结果偏低的主要原因之一 .
表 2添加链状亚历山大藻 (ACDH 藻株 ) 的 自 然 海 水 模 拟 样 品
qPCR 检测结果与计数结果对比情况
Table 2Cell-counting and qPCR results of the natural seawater samples
supplemented with cells of A.catenella (strain ACDH )
亚历山大藻 添加数量 /cells
qPCR
检测结果
回收率
500410
34975%
368
30002037
188764%
1796
4讨论 (Discussion )
在有害藻华研究中 , 由于有毒藻种和无毒藻种 的形态学特征相似 , 而且海水中有毒藻类的细胞密 度通常很低 , 因此 , 基于形态学特征的传统显微观 察等方法往往难以满足有毒藻类的研究需求 .与传 统方法相比 , 分子生物学方法快速 、 灵敏 、 特异性 高 , 特别适应于对低密度的有毒藻类进行检测 .许 多分子生物方法 , 如基因序列测定 、 荧光原位杂交 、 三明治杂交 、 实时定量 PCR 等开始逐渐应用于有害 藻华研究 (Zhen et al., 2009; 梁斌等 , 2009; 于仁成 等 , 2006; 张宝玉等 , 2005) .同时 , 基于分子生物学 技术的有毒有害藻类监测仪器和设备也开始逐渐 投 入 使 用 , 如 美 国 研 发 的 环 境 样 品 处 理 器 (Environmental Sample Processor , ESP ) , 是一种全自 动赤潮藻类与藻毒素监测设备 , 可实现自主化采 样 、 检 测 、 数 据 分 析 和 信 息 传 递 (Scholin et al., 2006) .目前该设备已开始在美国缅因湾等海域布 设 , 用于亚历山大藻的现场调查及毒性检测工作 .同时 , 欧盟资助的基于基因芯片的有害藻类检测技 术 (ALGADEC ) 也取得了重要进展 , 已经开发出一 种可 用 于 有 害 藻 华 监 测 的 半 自 动 化 检 测 设 备 (Diercks-Horn et al., 2011) .
与其他分子生物学方法相比 , qPCR 方法具有 良 好 的 特 异 性 和 灵 敏 度 (Yuan et al., 2012; Dyhrman et al., 2006; Galluzzi et al., 2004; Hosoi- Tanabe et al., 2004) .本研究中建立的 qPCR 方法 , 可以将塔玛亚历山大藻复合种 (Group Ⅳ ) 与其他亚 历山大藻藻种区分开来 , 具有良好的特异性 .同时 , 根据本文的检测结果 , 低至 5个藻细胞即可被检出 .Galluzzi 等 (2004) 根据其建立的标准工作 曲 线 计 算 , 最低可检测到 0.2个细胞 , 完全可满足实际检测 工作的需求 .
在以往研究中发现 , 与其 它 微 藻 检 测 方 法 相 比 , qPCR 方法得到的检测结果与藻细胞密度显著 相关 , 但其结果的准确性相对较低 .qPCR 方法的准 确性受到许多因素的影响 , 其中 , 用于构建标准工 作曲线的目标藻与实际样品中的目标藻靶基因拷 贝数差异是一个重要原因 .目前 , 有害藻华研究中 常选用核糖体 RNA 基因作为 qPCR 方法的靶基因 , 其拷贝数在不同藻种甚至同一藻种的不同藻株之 间会存在显著差别 .Prokopowich 等 (2003) 分析了细 胞 DNA 含量在 0.12 54.7pg ·cell -1之间的一系列 微藻 , 发现不同微藻核糖体 RNA 基因拷贝数存在很 大差异 .同一藻种的不同地理株之间也存在核糖体 拷贝数的差异 .Galluzzi 等 (2004) 对分离自地中海 的 A.catenella 和 A.taylori 的核糖体 RNA 基因拷贝 数研究发现 , 不同藻株的核糖体 RNA 基因拷贝数有 明显差别 .本文研究也发现 , 分离自我国沿海不同 海域的塔玛亚历山大藻复合种各藻株之间也存在 核糖体拷贝数的差异 , 这会影响到 qPCR 检测结果 的准确性 .对此 , 建议在应用 qPCR 方法时 , 应尽可 能针对目标藻的当地藻株建立标准工作曲线 , 以消 除不同地理株间核糖体 RNA 基因拷贝数差异造成 的系统误差 .此外 , Dyhrman 等 (2006) 曾提出采用不 同藻株的混合样品作为标准品建立标准曲线 , 可在 一定程度上降低不同藻株间核糖体 RNA 基因拷贝 数差异所带来的误差 .
除不同地理株间靶基因拷贝数的差异之外 , 不 同生长状态和生活史阶段微藻细胞内靶基因拷贝 数的变化也会对 qPCR 检测结果造成影响 .受细胞 周期 DNA 合成的影响 , 处于不同生长期的微藻靶基 因拷贝数会有显著变动 .本研究结果表明 , 处于对 数生长初期的亚历山大藻核糖体 RNA 基因拷贝数 显著高于对数生长后期和衰亡期的藻类 , 这与以往 对不同生长期的 A.taylori 细胞的分析结果基本一 致 (Galluzzi et al., 2010) .此外 , Penna 等 (2005) 还 发现 , 亚历山大藻营养细胞的核糖体 RNA 基因拷贝 数远高于孢囊中的核糖体 RNA 基因拷贝数 , 说明亚 1622
环 境 科 学 学 报 33卷
历山大藻细胞内核糖体 RNA 基因拷贝数会受到其 生理状态和生活史阶段的显著影响 , 可能存在核糖 体 RNA 基因拷贝数的调节机制 .不同生长阶段藻细 胞中核糖体 RNA 基因拷贝数的变化可能与其有丝 分裂活动有关 .在对数生长初期 , 多数藻细胞 DNA 合成和细胞有丝分裂活动旺盛 , 藻细胞中核糖体 RNA 基因拷贝数较高 ; 而在对数生长后期 , 受到营 养盐 、 光照等因素的限制 , DNA 合成和细胞有丝分 裂活动下降 , 藻细胞中核糖体 RNA 基因拷贝数也相 应下降 .有关核糖体 RNA 基因拷贝数变动的机制目 前尚难以完全解释 , 但不同生理阶段亚历山大藻核 糖体 RNA 基因拷贝数的变化无疑会对 qPCR 检测 准确性带来影响 , 这一点目前还没有好的解决方 法 .除此之外 , qPCR 的检测结果还会受到样品 DNA 提取效率及 PCR 效率的影响 .对此 , 可进行多个平 行样品降低分析误差 , 也可考虑在 DNA 提取前加入 已知细胞浓度的控制样品 (Dyhrman et al., 2006) , 对标准曲线进行校正 .
5结论 (Conclusions )
1) 本文所建立的 qPCR 方法具有良好的特异性 和线性响应 , 可以用于中国近海塔玛亚历山大藻复 合种 (Group Ⅳ ) 的快速检测 .
2) qPCR 检测结果受到目标藻种核糖体 RNA 基因拷贝数变动的影响 , 分离自我国沿海不同海域 的塔玛亚历山大藻复合种各藻株之间核糖体 RNA 基因拷贝数也有明显差异 .因此 , 建议在应用 qPCR 进行检测时 , 需针对当地海域分离的亚历山大藻构 建标准工作曲线 .
致谢 :本研究在实验仪器和设备方面得到了中国科学院海洋 研究所杨红生研究员课题组的大力支持 , 特此致谢 .
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范文四:链状亚历山大藻的背景资料
我国东南沿海有毒亚历山大藻的定量检测方法及其应用的研究
对我国东南沿海代表性海域(北海、香港、福州、宁德、温州、宁波、舟山)分离得到的10株塔玛亚历山大藻和2株链状亚历山大藻的转录间隔区(ITS )序列进行了研究,结果表明ITS1序列完全相同,ITS2的第14个碱基上有模糊,G 和T 同时存在,出现比例约为1:1,他位置的序列完全相同。ITS1 和ITS2的碱基数分别是166和190,系统进化分析表明它们属于典型的温带亚洲株系。在ITS1序列上设计了1个正向的引物, 反向引物采用大亚基上的保守序列, 建立了基于PCR 的检测方法。对24株从研究海域分离得到的藻类进行了PCR 检测,其中硅藻和裸藻各1种,甲藻中的斯氏藻、原甲藻、膝沟藻和裸甲藻属各有1种,它们均没有扩增条带产生;亚历山大属有20株,其中阳性结果9株, 都能产生约1200bp 的目标条带, 但是个别株系除了产生目标条带外, 还产生一条淡淡的条带, 大小约为900bp, 测序结果证明它们也是目标种。扩增其大亚基发现, 除产生一条正常的700bp 的带外, 还有一条很淡的约400bp 的带, 而其他株系产生大小相差仅100bp 的两条带或单一的带, 这些结果说明我国东南沿海塔玛和链状亚历山大藻的大亚基有较复杂的结构。9株没有扩增条带的株系鉴定为Alexandrium affine 和微小亚历山大藻(A. minutum )。另外还对采集自厦门港和湄洲湾的8个水样用该方法进行了检测,其中有2个样品扩增出了1200bp 的目标条带,测序结果证明属于目标种,这些样品中鉴定出82种硅藻,11种甲藻,但都没有出现假阳性反应,验证了该方法的可靠性。
我们建立的PCR 检测方法不仅具有很好的可靠性,而且有很高的灵敏性。单细胞直接扩增即可产生清晰的条带,随着细胞数增加到3个和5个,条带逐渐加深。0.05ng 的DNA 便可以有效地扩增出可见的条带,0.1ng 的DNA 扩增出的条带已经非常清晰。0.05ng 的DNA 相当于用CTAB 法提取0.5个细胞的量,由于试剂盒提取的效率较低,需要约1.2个细胞才能得到相同的DNA 量。对鲁哥氏液固定的样品也可以有效地提取适合于PCR 反应的DNA ,这使得本方法具有良好的应用前景。
在PCR 检测方法的基础上,我们构建了特征序列的内参照质粒,为建立能定量检测塔玛和链状亚历山大藻的QC-PCR 法奠定了基础。此外,我们还测定了7株Alexandrium affine和1株微小亚历山大藻的转录间隔区序列,这7株Alexandrium affine 分别分离自北部湾、香港和台湾海峡, 微小亚历山大藻分离自台湾海域, 这些结果对今后建立基于PCR 的快速检测亚历山大藻的方法打下了良好的基础。
有毒亚历山大藻种群识别与计数方法课题通过验收
海洋所
日前,由中国科学院海洋研究所于仁诚研究员承担的“十五”“863”计划资源环境领域海洋监测主题“有毒亚历山大藻种群识别与计数方法的
研究”青年基金课题,在青岛通过了“863”专家组的验收。
“有毒亚历山大藻种群识别与计数方法的研究”课题在系统分析中国沿海亚历山大藻各藻株的毒素产生特征及部分遗传序列信息的基础上,结合GenBank 中其他已知亚历山大藻的序列信息,针对中国沿海有毒亚历山大藻设计了特异性的遗传探针,建立了基于荧光原位杂交检测技术的有毒藻全细胞检测方法,并通过实验室内单种、混合种以及野外模拟样品的试验,确定了所构建的遗传探针能够在种的水平上识别中国沿海的有毒亚历山大藻;对荧光原位杂交检测方法的实验结果表明,计数结果的准确性与真实值相比误差低于30%,多次计数结果的变异系数低于20%;这一方法能够通过藻细胞显色反应标记特定的藻细胞,可以作为参考用于设计有毒藻的自动识别和计数仪器。此外,通过课题的研究工作,进一步明确了中国沿海亚历山大藻的毒素产生状况,以及中国沿海有毒塔玛(链状) 亚历山大藻复合种的分类地位。“有毒亚历山大藻种群识别与计数方法的研究”研究成果,不仅具有较
好的实用价值,而且对赤潮毒素监测提供了有力的依据。
验收专家组听取了课题组的工作报告和技术报告的汇报,审查了课题组提供的技术资料,认为该课题验收资料完整,内容翔实,技术类资料归档证明、集成与示范应用协议、检测检验结果审查报告等文件齐全,符合课题验收文件管理规定,并按合同计划完成了研究任务,专家们一致同意通过验收。 中科院海洋所:赤潮973项目取得一系列创新成果
一是以赤潮多发并成因复杂的东海为重点研究区域,开展了对我国近海典型大规模赤潮原因种东海原甲藻和链状亚历山大藻的形态学、分子特征、生态分布、生理特性、生长动力学、生活史、种间竞争、孢囊的分布、萌发及其与浮游动物的关系研究。率先就东海赤潮高发区的营养盐组成、分布、通量及其与赤潮发生的关系、富营养化与赤潮发生的关系展开研究。首次较为系统地研究了东海大规模赤潮形成的环境特征及水文学影响因素,探讨了影响赤潮形成的关键物理海洋学因子。
范文五:微小亚历山大藻 微小亚历山大藻中麻痹性贝类毒素的冻融法提取优化
, ,
,广东业农 学
科
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小亚历山微大中藻麻痹性贝类毒 的素冻融 法提取 化优
丹毛卉 解,万 翠, 杨 锡洪 。 ,章 桦超 , 李 彩 ,媚莫星 比
( , ( 广东 洋大学海食科技品院, 广学省水产东品工加安与全重试点室,验水产 深品加工广东普
通 高学等校重 点 验试室, 国家 贝 类工加 术技 发研 分中心( 湛江 ) ,广 湛东江 , ,,, , , ;
1
,( 岛青科大技学工学化,院山东 岛 青 ,, ,, , ;,
, ( 岛科青技 学大 化学与 分 子 工学 程院 ,东山青 岛,, , , , ,)
要摘: 增加微小亚历为山大 的细藻胞壁率 ,破降 提低取程过毒素组中成的变 , 提改麻高痹性贝毒类素
(
,,, 提)取液的毒 力 ,选 用冻融法 行 进 , ,,取 提并 进方 行法优化 。 首 先对提取 液 , , 、 冷 冻温度、 冻解温度、 冷 冻
时
和间融次冻数等行单进素试验因, 考察冻融程中藻过胞细破壁和相率荧对值光以确定优化围; 再范以对相光荧 值为应值进行响, , , —, , , , , ,,中心合响应组优化面,得到 佳最艺工条为: 冻件次数 融, (, , , 解 温度 冻 ,,( ,,, ,, ,, , ( , ,,该条 下预测相件荧光值对为, ,, ( , ,, 毒力为,, , , , , , 验证试验。
2
定藻设破毒素壁提条取件为:冻融 次,, 解温度冻 , ?,, , , ( , , ,该件条下相荧光对值为, , , ( , , (,? , , , , ) ( ,提取液的力毒为, ,, ,( ? , ,,) ,, , 与测值基预 本 相
。符 关 键词 冻融法:; 微小历亚山大藻 ; 麻 痹 贝类性 素 ;毒提取 ; 优 化 中图类号分: , ,, , , , 文献标 识,, ,? :, 文 编号:章 ,,, , — , ,,,( , , , , ) , — ,,, , , ,—,
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收, 日 稿: , ,期 , ,—
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基
金项 目 : 家 国自然 科学 基 ( 金 , ,,, ,
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, , ,); 国家 现 农 代业产业 技术 体系 设建专 项 贝( 类 ,一, ) 作 者介简 :丹卉 (毛 , , , , 一 ) ,, 女在读士生硕, —, , , , ,
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通讯 者作 : 锡 杨洪 ,( , ,, 一) , 男, 博 , 教授,士 ,—, ,, ,: ,
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痹麻贝性毒类素( ,, , ,,, , ,; , , , ,,, , , , , ,, , , , ,,, ,
, , , )是一 来源 于种有 赤潮 毒 藻,如 裸藻 甲 属
, , (, ,,, , ,, ,) 、 ,藻甲 属( , ,, , , ,,, , ,) 、 亚 历 山大藻
试
试 剂验: 试 验 所 试用 均剂 为 分 纯 析; 酸化
剂:, , ,, , , , ,磷 酸二 氢的钾, ,
10
, , , ,, , ,, , 液溶 (
,, , ,( , ) , 化剂: 氧, (, , ,, ,,乙酸溶的液。 主 仪要 设器备 :,, , , ,,, , , , 显 微 镜 , 本日 尼
属( ,, , , , , , , , ,), 蓝绿、属藻 ( ,, , , ,, ;, , , ,, ), 等 ,
的,毒素。, , ,具有经毒神,性 体液当中浓达度 , 到(, , , , , , ,,, , 就时会细与膜上离子通胞道结合, 表现 神经中
毒状症 ? , 。 前报道目的 , , 大,多是通培过养 有 藻毒从细藻中提胞获得 取 , 。因此 , 对细胞藻 中 ,,, 取方法提研究具重有意要
义。
细藻 胞壁 和破 ,,,提 取 方法 主要 有 超声法 、
;康 ,, 一 , , ,, ,,光荧分 光 光度 ( 计 ,,, , , ,,,, , ,, ,, , ,, 发;狭缝射别为 , 、 ,分, ,, ), ,, 本岛;
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, ,津, 超 低温冰箱, ,, , ,, , ; , , 一 ,, ,, , , , , 冰 箱 海尔
, 集。团 ( , , 试 验 法 方
,
( (,, ,, ,检测
样
制品备: 取密 度 ,为 (, , , , ,, ,,( ,
融冻 法 、波微 法、酶 等法 , , , , ,, ,,其 中 最用常的是 超
声 法,, , ,,, , 。 超声 微 等方波 提法取 过 中程均 有热量
, ,, , , ; , , , ,藻液 ,,, ,, , , , , ,, , 心离, , , , , ,以质 量比, : , , , , 在, ,(, , , , , , , , 中重,悬, 复冻反 融, ,次
产
生,加 热件条下发生的磺脱基酰应会反使毒 素 组 发 生成变改, , 。 陈勇等 , ,, ,各对个 生长
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的塔期玛 历亚山大藻 , ,,提取时 发现,冻 法对毒力融没有 影 响
,而超 法 的声热辐 却能 射低 毒降力。, , 的常, 用检
方 法测 小 鼠法有 (,, ,) ,,:, , , ,, ( ,, 高效 和 液
,
, , , , , ,, , , 离心 , , ,, , ,取上清,过, ( , , , 维纤
滤, 膜 得到母液。 分吸别取, 、 , 、, , 、 ,、 , ,液母定容 , 于 ,,,容量 瓶工作得曲线待测液 分别,用小采
鼠法白和 光 荧进 行法 检 测
。,,
法 : 试, 验 鼠为 雄 性小 明系 昆 ,重 体,, ( ?
, ) ,, 参照 ,, ,, 准标方法 进行检,测 。 , , ,法 :照文献 , , 参 , , 。 , ( , (, 因素试验 单相取同 批 次培 养微 的小历 亚 山藻,大密度 , (为 ,, , , , , ,, ( , ×, , ; , ,,, , , , , , , , , , ,, ,,下 心 ,离 ,, , ,,, 质以
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比为 ,量 : , , , 在,菌无 培 养液 中重新 悬 浮 得 到悬,浮液 , 。 。取, 。分装于 ,, ,, 心管离中, 分别考 察 ,, , (、 , 、,、 , 、 , , ) 、
相
谱色 ( , ,法 ,, — ,, , :), , , , ,, , , ,( ,。 , ,,法 的重
性复差较 ,并灵 且度较低 敏 , ;, , —,, , 法的,
准标 品难 得获 ,仪 器贵 、 昂成 高本 , 均不 用于适
快 速便的简毒检测力 本。研 究用冻选 融法对微亚历小 山 大藻 , ,, 进提取及 行化 , 优一步结进 合, ,,和 ,
,,, —,, , 研, 究 荧光检 测 (法 ,, ) 与 ,, ,定 ,
量关系 以,期建 立 藻,, ,有 提效取 及 快速 测检 的 方
法。
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冻冷 温度 一(, , 、 ,一, 、 一, , ? 、 解)冻温 度 (, 、 ,,、
,,、 , , 、 ,,、 , , ,? )、 冻冷间 时 , (( , 、 ,、 , ( 、, ,、 ,。 、, , , ) 、 冻融数次( , 、 , 、, 、 ,、 次,) 藻破 壁率对 毒和
,
材 与料方法
, ,( 试 材验料
素的响影 。 , ( ( , , 响 面应化优 于单 基因素验结果 试 ,采用响 应面
法建立数模学 型优化提取工 艺, ,,, — , , , , , , ,
中 组心合 试验 设 计见 表 ,。
表, 响应面优化 , ,, — , , , , ,,,试 验 具体因素 及水平
微
小亚 山历大 藻( , ,,,) 来 和培源方养法 同
文献 ,, ,,; 雄 昆性小 鼠,明购 中山大学自试验动 物 中心
。
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, 果结 与 分 析
,(, 检测 ,,, 工 作线曲
羹 萎 (
明 。
得
以相对荧,光 为值, 、 轴毒鼠力为,轴 通过,线
,,数 ,,, ,, , , 回 方程归 为,, , , (,, 一 ,,, , ( , , 。明在 说, , , ,, , 的,对相光值荧范内围相 荧光对 值与鼠毒 力
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之 具 间 线性 关 系有。
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, 因单素试验 , 、 ,冻温冷 度、解冻温度 、 冻冷时间、 融次数冻 对微小 亚 山历大藻破及毒壁素 提取影 的见响图 , 。
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、图 由,,可 知 , ,值为 , ,时壁破率最低 ,由 藻于细胞 壁是由 维纤等素分成 组, 碱性条件成造易纤维成 素的降 解 ,此随着 ,因 ,增加 ,值 细胞易更壁破 , ,,, 。 , ,
值为 , , ,时, 相 荧对光较高值,鼠毒力较好 。 , ,,?
、一
静
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时, 虽然藻
细胞壁破仍率在上升 但是,, ,提取率 ,在下。
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降 据道报 ,, ,,酸性条件在稳下 定 ,碱在加
性相对
光荧值
图, 微 小 历亚山 藻麻痹 大性贝毒类素 工作曲
线, , , ,, ,
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解冻 温度 ( ? ) 冻冷时间 (, )
簧
冻次 融 (数次)
图, , ,( ) , 、 冻温度冷 (,) 、解 温冻 度( ),、 冷 时间冻 (), 冻、 次数 融 ,) 对(藻破 率壁及素毒 提取影 的
响 ,, ,
热 条件 下会发生 解 降 , , 。 本试验在低 下温行进 说, 明, , ,在 性碱条件下 , ,?(, ) 即使 不 热也会加发
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生降解 。
图 ,由 可知 , ,随着冻融 次数 增加 , 的 破壁率 先升上,, 次冻 融 后后趋 平于缓 , 相 荧对 值 光有
相 趋同势 本。结 果 与,, ,, ,,, ,, 的研,究 相一 致, ,
图, ,中
, , 冷冻个温度对 藻破壁影较小响 , 由 于微亚小 历山藻属大于单细生胞,物 传 导热速度 较
或 次者 更高的冻融 次数 使 会, , , 上的以, , , 被 取 提。 ,, , ,等,, , , 报 道,,次 后的冻以 可以提融取
快, 冻
融法 用的利冷 冻是和解冻中 产生的热效应使
细壁破碎 胞, 所一 , 以 ?已达, 到冻 速 与一 , ,, 、 一 , , 冷?冻度下温的差别大不 ,,, , 。 从图, 可以看,,出随着 解温度冻上升 , 藻细胞
出,
, , ,, ,, 的毒 。素与 陈等 勇 ,, ,
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报, 道 只需 ,的 次及 可 到较好达的破 效壁果 , 增加次数 仅不会增
大 工量 , 作 甚导致至 毒素分 子 破坏 研的 结究果 相
一
。 致
破壁率
相对和光值荧下 降,说 毒素明在温度 较高时
部分 损有 失,由 此于选时 择是的 ,, , 行进 取提, 属
单 因素
试 验,中 最 高细胞藻破 壁和毒力分 率别 可达 ,
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于碱弱 范性, 这围同样符 合碱性 加热条件下降 解的
理 ,论, , 。, 陈勇等 , ,, ,在 比较 声超 法、冻 法融 微对小
可知 , 响影大的较条为件 , ,、解冻 温 度 、融冻次数。 因此 , 相对以光荧值为响值应, 择该 选,个 素
22
因进行
应 响试 验 设 面 计 。
亚历
山大 ,藻, , 提时取指出 ,热条件加下毒 发生 素降 。解因 在高于而 , ,时,,提取 液的相 荧对光值下 降加
剧 。
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( ,, , ,提取件条化优
冻融 法提 取 微小 历 山亚大 藻中 , ,的 , , ,, —
, , , ,, , 响,应面验试设和计果结见表 。, 进行对相荧
由图, ,知可 随着冷,冻时间 延 , 长藻细破壁胞
率
变化明不,显 仅有先上后升降下再上升趋势的。这
与冰 晶不同在增长间内的形时相态关。
光
值冻与融次 ,数、 冻解度 ,温和, 值 ,,的次二
23
多 元归拟合, 回得方 程:
表 , 冻法提融取 小 微亚山大藻历, , , 应面试 验设计 响数和据处理
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析分结果, 结 果 表, )(表 ,明 该回模归型显 ,著失拟
项 , , (, ,, ,,, ,( ,, 失拟,性 验检 果不结显 。著
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采用
小最二法显著乘性检验得述方上的方差 程
由
图可,知, 应响 面 椭为 ,圆说 明 因三之 素
间
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( , 证验试 验
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合结际实操作选最择佳工艺: 冻融为次 数 ,, 解
冻温度 ,, ? , ,, , ( , 。 在 条此 件下, 相对得荧 光为 值,
, , ( , ,(,? , ,( , ,) ,毒 力为 ,,, (, ?, , , ,)。 说 ,重明
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复好性 优,化取提条件行。可
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, ,结语 本
研 究 在 单 因素 试 的验 基础 上 通,过 ,, , — , , , ,, ,, 应响 设面计 对并 结果行进证验, 得到融冻 法提 取微 亚历小山 大中藻 , ,,的最佳工 艺条件 为:
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冻 融次 数 , , 冻温解度 , ,,, , , (, , 。此条 件下, 测 得 提液取相的 对于荧光为值 , , ( ,,, , , 毒力 , 为 , ,, , ,, 高相关于献 ,文 ,, ,, , , 记 载的 ,, , 提取液毒力。 由 于 件条限制,本 试 验有针对没融过冻程中 毒素成组 变化的 究研, 有待进还一完善。步
参 考文 献:
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储霞 玲)
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