范文一：绿色荧光蛋白质粒DNA作为活细胞标记基因的研究

绿色荧光蛋白质粒DNA作为活细胞标记基

因的研究 L}J华肿瘤杂志2901年5月第23卷第3期ChinJOn~o1.Mav2001.,23.No3

绿色荧光蛋白质粒DNA作为活细胞标记基因的研究 黄倚李川源

【主题词】绿色荧光蛋白:脱氧棱糖核酸;基

【s~jectwords】GreenNcor~scentprotein;DNA;Gene

绿色荧光蛋白(nflu~rescentproteinGFP)米源于可自

发荧光的海洋水母,其eDNA所编码的蛋白质受到蓝光或紫 外光照射时可白发的发出绿也荧光.我们将GFP质粒DNA 转染不同类型的细胞.利用GFP蛋白标记括细胞.

一

,方法

我们采用的GFP真棱表达质粒pEGFP-N1购自Clontex:h 公司,GFP由人巨细胞病毒即刻早期抗原基因启动子(cMv) 所罚控.此外,pEGFP-NI还有I1P'X)编码基因,其表达由猴肉 瘤病毒Sn~40抗原基因启动子控制

质粒pEGFP-IRESneo的骨架plRESneo亦为Clrmteeh公司 产品.莪们将EGFP的d)NA插八到CMV启动子下游的多 克隆位点处,其进,步的下游是一段内部核糖体进八位点 (IRES)和neo编码基因=因此.GFP与rI帅基因的表达共『司 受CMV启动子调控,理论上表达敛率相同.我们测试了多 种不同类型的细胞,包括大鼠乳腺癌细胞系R3230AC,小鼠 乳腺癌细胞系4T/,小鼠恶性黑色素瘤细胞系B16,人脉络膜 恶性黑色素瘤细胞系OCM-I,人胚胎肾细胞系293,人淋巴细 胞系TK6以及人成纤维细胞GM8333,GM5565等. 脂质体介导质粒DNA转染细胞采用GibeoBIlL公司的

DMRIE-C或lj【盹LAMl.于6cm盘中常规接种5×lo5细 胞,使用25.ug质粒DNA6DMRIF~C或lOliFofee一 ~AMINE.阳离子聚合物介导的细胞转染采用(~agen公司的 SuperFeet.6cm盘中接种5×l细胞,使用5.ug质粒DNA, 20Sup~rFect:电穿孔介导的细胞转染采用BXT公司的 EleetroporationSy~em,细胞按1×l07/trd重悬于无血清细胞培 养液内,每次采用400细胞悬液和?质粒DNA.按厂 家推荐的条件设置电穿孔仪的各项参数

受转染的细胞是否表达GFP,GFP表达强弱以及细胞在 体内外的形态,生长方式等的观察采用荧光显微镜,以蓝光 作为激发光.图像经与显微镜连接的摄相装置采集后,由计 算机储存并分析.肛半乳糖苷酶的表达采用x_州染色液孵 肓过夜.GFP513'眭细胞的检测和分选,GFP表达的半定量分 析等,采用BD公司的Facs~r流式细胞仪,激发光源为488 砌氩离子激光.筛选持续,稳定,高教表达GFP的阳性克隆 采用C418结合荧光显微镜及流式细胞技术.细胞生长速度 按细胞群体倍增时间计算,分别将稳定表达GFP的细胞与未 作者单位:200080上海市第一人民医院中心实验室【黄情);美国 杜克大学肿瘤中心放射肿瘤系【李川源,

.

方法.技术

转染GP的亲代细胞按2×Io4接种于6孔板中,24,48,72, 96,1?.148h时胰蛋白酶消化,细胞计数仪自动计数. 二,结果

GFP质粒DNA的转染效率与细胞类型和转染方法有 戈.脂质体对于大鼠乳腺癌细胞系R3230AC的转染效率较 高,达53%,电穿孔只有28%;小鼠乳腺癌细胞系4TI则以 电穿孔的转染效果为好.达12%,而脂质体仅为1.6%.细 胞开始表达GFP的时闸亦与转染方式及细胞类型有关,转染

时不去除血清,GFP表达出现的时间较早.莪们观察到的最 早的GFP表达出现于转染后3h,一般于24,48h达到高峰. 然后逐渐减弱,如果不加任何选择压力.1周后只有很少的 GFP阳性细胞.

GFP质粒DNA转染细胞后,经G418选择的抗性克隆中 约30%表选GFP.质粒pEGFP-IRES~eo转染相同的细胞, G418抗性克隆中表达GFP的也只有40%,?%:我们共挑 选r4十高水平表达GFP的阳性克隆,体外培养6个月后仍 然高水平表达GFP,其中3个克隆的生长速度和生物学行为 与亲代未转染GFP的细胞没有明显差异,仅1个克隆的群体 倍增时间延长.将表达GFP的大鼠乳腺癌细胞及人脉络膜 恶性黑色素瘤细胞注射到Fi~,er344大鼠或裸鼠后腿皮下,2 周后即长出肿瘤,6周后肿瘤仍持续表达GFP,括体内的肿瘤 及切除的肿瘤块荧光显微镜观察呈绿色.

i,讨论

多种基因转染方法均呵将GFP质粒DNA导人哺乳动物

表达GFP的细胞不 细胞内,转染后数小时GFP便开始表达,

需任何处理即可通过荧光显微镜观察,或被流式细胞仪所捡 测.一般情况下.GFP的表达不改变细胞的生长速度和生物 学行为.体外稳定表达GFP的肿瘤细胞,在动物体内没有选 择压力的情况下,仍然能够继续生长并持续表达GFP我们 利用GFP能动态观察肿瘤细胞在活体内生长,侵袭与转移 等有研究将GFP与其他目的基因融台.借助GFP观察目 的基因的表达水平,在活细胞内的定位和功能变化等=如利 用GFP观察细胞有丝分裂,细胞骨架运动和细胞分泌过程. 因此,GFP是体内外研究活细胞的理想标记,但GFP亦存在 某些缺点:(I)要分离到持续,高效,稳定表达GFP的克隆比 较困难.【2)当GFP表达水平特别高时,细胞的生长速度减 缓,提示过高水平的GFP表达对细胞仍然有一定的毒性.

(3)GFP的信号不能被扩增,检测低水平的表达比较困难.

收稿日期:1999~9—10

范文二：三种方法转染绿色荧光蛋白质粒的效果评价

基金项目 :科技部重大专项基金资助 (2008ZX10004-008) 作者单位 :102206 北京 , 中国疾病预防控制中心传染病预防控制 所 /传染病预防控制国家重点实验室 通讯作者 :海荣 , 电子信箱 :h ai rong @icdc . cn

三种方法转染绿色荧光蛋白质粒的效果评价

孙丽娜 魏建春 张慧娟 张恩民 俞东征 海 荣

摘 要 目的 比较 常见 的真 核细 胞转 染技 术 , 评 价采 用绿 色荧 光蛋 白为 报告 基因 来观 察细 胞转 染效 率 高低 的方 法。 方法 分别采用磷 酸钙法、 电穿孔法和脂质体法将 pEGFP -C1质粒转染 COS-7细胞 , 对每种方法的转染 效率及对 细胞的毒性 进行评价。 结果 脂质体法的转染率为 67%, 电穿孔的转染率为 43%, 磷酸钙法的转染率为 28%。脂质体法转染对细胞的毒性 最小。 结论 采用绿色荧光蛋 白为报告基因的真核细胞转染技术中 , 脂质体法是效 率高、 安全性大的方法。

关键词 绿色荧 光蛋白 转染 脂质体

Eva l ua ti on fo r Transfecti on E ffici ency of G FP R eport G ene in Three D ifferentW ays . Sun L i na , W ei J ianchun , Zhang H u i juan , Zhang En m in , Yu D ongzheng , H ai Rong. S t ate K ey Laboratory for Inf ectious D isease Contro l and Preventi on , Institute for Co mmunicab le D isease Control and P revention , Chinese Center for D isease C on t ro l and P revention, Beijing 102206, China

Abstrac t O b jective T o eva l uate t he effi c i ency for euka ryotic cell transfecti on by usi ng GFP as a report gene in comm on transfec -ti on w ay s . M ethod s CO S-7ce llwas transfected w ith pEGFP-C1by calc i u m acid phosphate , e l ec troporati on and li pofectam ine respec -ti ve l y . T he transfecti on e fficiency and cell surv i va l rate were eva l uated . Resu lts T he transf ec ti on effi c iency w as 67%, 43%and 28%by li pofectam i ne , electropo rati n and ca lci um ac i d phosphate . M ost cells surv i ved by transfecti on w it h li pofectam ine . Conc l usion U sing GFP as a repo rt gene i n euka ryotic ce ll transfecti on , the li po fecta m i ne m ethod cou l d get a h i gher transfecti on effic i ency and h i gher surv i va l ra te for cells .

K ey word s GFP ; T ransfecti on ; Iiposom e

基因转染技术是指将外源分子如 DNA 、 RNA 等导

入真核细胞的技术 , 它是研究基因表达、 调控、 突变分

析等的常规工具。在基因转染的载体中 , 绿色荧光蛋

白 (GFP) 载体已经成为一种新型荧光探针工具 , 以其

独特的生物学特性为活细胞内生物大分子在细胞内的

定位和相互作用的实时可视化研究提供了可能。此

外 , 增强型绿 色荧光蛋白 (E GFP) 是经过改造的 GFP , 使

其荧光增强 4~35倍 , EGFP 可以作为报告基因来反应

基因的转染效率 , 其表达产物非常容 易被鉴定 [1]。

目前 , 将外源基因导入细胞常用的方法有 :磷酸

钙法、 电穿孔法 和脂质体介导 法等 [2]。转染 技术的

选择对转染结果影响很大 , 本研究通过采用绿色荧光

蛋白为报告基因 , 瞬时转染 C OS -7细胞 , 比较磷酸

钙法、 电穿孔和阳离子脂质体法这 3种转染方法的转

染效率及它们对细胞生长的影响 , 来确定转染效率高

且对细胞毒性小的基因转染方法。 材料与方法 1. 材料 :绿色荧光蛋白质粒 pEGFP -C1由香港中 文大学 提供 , CO S-7(非 洲绿 猴 肾成 纤 维细 胞 ) 购 自武 汉 大学 细胞 库。 CaC l 2购自 T i angen 公 司 , 电穿 孔 仪购 自 eppendor f 公 司 , 阳离子脂质体 lipo f ec ta m i ne2000购自 i nv itrogen 公司。 2. 方法 :(1) pE G FP-C1质粒的大量提 取与纯化 :将 pEG-FP-C1质粒转 化入 DH 5A , 37e , 摇 床 220r /mi n , 过夜 培养细 菌 250m , l 按照试剂说明书 , 用 Q IAGEN -tip500柱 子大提质粒 并纯化。测 定质 粒浓 度 , 用 紫外 分 光光 度 计 分别 测 OD 260、 OD 280值 , 计 算 DNA 浓 度 , 并 检 测 其 纯 度。 (OD 260/OD280比值一定要在 1. 8~2. 0之 间 ) 。 (2) C O S -7细 胞 的培 养 :COS-7细胞培 养于 R P M I1640完 全 培养 基中 , 37e , 5%CO 2条件下培养 , 接种量为 1@105细 胞 /毫升 , 细 胞长满至 单层后 (约 2~3天 ), 用 胰酶 消化传 代 , 使细 胞保持 在对 数生 长期。 (3) 3种不同转染方法 :1磷酸钙转染 法 :指 数生长的细 胞 , 转 染时细 胞的汇合度 不能超过 80%, 于 5m l 灭菌塑料 管内混合 100L l 2. 5m o l/LCaC l 2与 25L g 质 粒 DNA, 用 0. 1@TE

(p H 716) 将 体积补 至 1m l 。 室温下 将以上 2@钙 -DNA 溶液

与等体积的 2@H EPES 盐溶液混合。迅速 敲弹试管侧 壁混匀

溶液 , 静置 1m i n 。立即将磷酸钙 -DNA 悬液 转移至上 述单层

细胞的细胞培养 基中。每 1m l 培 养基加 0. 1m l 悬 液。轻轻摇

动平皿混匀培养基 , 培 养基 会变成 浑浊 的桔 黄色。室 温下孵

育 15m i n , 再加 入 培养 液。 将转 染 的 细 胞置 于 含 5%CO 2的 27 医学研究杂志 2010年 1月 第 39卷 第 1期 #论 著 #

37e 温箱孵育 2~6h 后 , 吸 去培养 基与 DNA 沉 淀。加入 5m l 37e 预热的完全培养基 , 继续培养细胞 , 荧光显微镜 下观察转 染效 率 ; o电穿 孔转 染法 :细 胞生 长到 对数 期 , 用胰 酶消 化 , 4e , 1000g 离心 5m i n 。用 0. 5倍体积的电穿孔液重悬细胞 , 细 胞密度调至 3@106细胞 /毫升。将 400L l 的细 胞悬 液 (106~ 107细胞 ) 内加入 30L g 的质粒 DNA, 用吸 管将细胞 和 DNA 轻 轻混匀。将混合物加入电转化 池中 , 冰浴。注 意 :混 匀时不要 产生气泡。将电转化 池移至 电极间 放电 , 1~2m in 后 , 取出电 转化池 , 冰浴 , 立即进行下一步操作。用 灭菌的吸头 将电穿孔 的细 胞 转移 至培 养 皿中 , 加 入 细胞 完全 培 养液 , 置于 含 5% CO

2

的 37e 温 箱孵育 , 用于 转染效 率观 察 ; ?脂质 体转染 法 :转染前 24h , 用胰蛋白酶消 化收集 处于对 数生长 期的细胞 , 细 胞加入 12孔板 内 , 每 个孔 内加 2m l 已 调整 好浓 度 的细 胞悬

液 , 使每个孔内细 胞数 为 3@105, 37e , 5%CO

2

培养 箱孵 育 , 24h 后 细 胞 密 度 达 80%左 右 , 可 以 用 来 转 染。按 照 L ipo -fecta m i ne2000脂质体使用说明 书 , 取 3. 0L g 用 于转 染的 质粒 加入 100L l 无血清、 无抗生素的 O pti-M E M 液 , 轻轻混匀。取 2L l 脂质 体 加 入 100L l Opti-M E M, 轻 轻 混 匀 , 室 温 下 孵 育 5m i n 。 将稀释 的质粒和稀释的 L i pofectam ine2000混合 , 轻轻混 匀 , 室温下孵育 20m i n 。将混合物加到 12孔板的每个孔 内 , 每

个孔内加入混合 物的体 积为 200L , l 轻轻混 匀。 37e , 5%CO 2培养箱孵育 4~6h 后 将含有 脂质 体和 质粒的 培养 液换掉 , 代 之 以含有 10%小牛血清 1640培养液 , 置于 37e , 5%C O

2

培养 箱孵育 ; ?比较 3种转染方法对于 p EG FP -C1质粒的 转染效 率 :分别用 3种方法转染细胞后 , 利用倒 置荧光显微 镜观察绿 色荧光蛋白的表达 , 并 计数 细胞的 转染 效率。分 别用 3种方 法转染后的 24~72h , 观察细胞的生长状况。

结 果

1. 绿色荧光蛋白在 C OS-7细胞中的表达 :pEG -FP-C1质粒转染的细胞 , 在倒置荧光显微镜下蓝光 (~395n m ) 激发时 , 可以见到细胞内发射出均匀明亮 的绿色荧光 (封三彩图 1) 。

2. 绿色荧光蛋白在瞬时转染细胞中表达的动力 学 :将 pEGFP-C1质粒转染的细胞后 , 动态观察从转 染后 6~72h 内 , 绿色荧光蛋白在细胞内的表达随时 间的变化。在 20倍视野下 , 随机计数 500个细胞 , 绿 色荧光蛋白的水平用荧光强度来测定。结果显示 , 最 早在转染后的 6h 可见到 EGFP 蛋白的表达 , 它的表 达逐渐增高 , 在 21h 达到高峰 , 之后 , EGFP 的表达随 时间的延长而逐渐减低 (图 1) 。

3. 磷酸钙、 电穿孔和脂质体 法转染 pEGFP-C1质粒效率的评定 :(1) 3种方法转染效率高低的比较 :将 COS-7细胞培养至对 数生长期 , 经胰酶消 化传 代 , 以每孔 4@105细胞接种于 6孔板。 37e , 5%C O 2培养箱孵育 20h 后 , 细胞的汇合度约为 80%,

用上述

图 1CO S-7细胞在转染 pEGFP -C1后的

6~72h , 绿色荧光蛋白表达的水平

3种方法分别进行转染 , 每 1@105细胞中加入 pEG -FP-C1质粒 1L g , 具体操作过程同上。在转染后的 21h , 荧光显微镜下观察 , 并随机计数 500个细胞中 , 表达 EGFP 的阳性细胞百分比。结果表明 , 脂质体法 的转染最高 , 为 67%; 电穿孔的转染率较高 , 为 43%; 磷酸钙法的转染率相对较低 , 为 28%(图 2) 。 (2) 3种方法转染 pEGFP-C1质粒后 , 观察细胞的生长状 况 :结果显示 , 在用磷酸钙和脂质体法转染后 , 细胞的 生长状态良好 , 细胞较好贴壁。但是 , 用电穿孔转染 后 , 从转染后 24h 起 , 有将近一半的细胞漂浮 , 并可见 到细胞碎片。另外 , 在转染后的 24~72h , 采用台盼 蓝法计数活细胞。每种的细胞分别取 3孔进行计数 , 计算平均值 , 分析细胞的增长状况 (图 3) 。细胞计数 结果表明 , 采用脂质体法和磷酸钙转染法的细胞增长 状态与未处理的细胞相近 , 这两种方法对细胞的生长 没有明显影响。而电穿孔转染后 , 活细胞计数明显下 降 ,

表明有大量的细胞死亡。

#

#论 著 #JM ed R es , Jan 2010, V o. l 39N o . 1

讨 论 实验采用 3种不同的转染方法 , 将报告基因绿色 荧光蛋白瞬时转导入真核细胞 , 结果显示脂质体法的

转染效率最高 , 细胞毒性最小 , 是一种较为理想的转

染方法。

本实验 将绿 色荧 光蛋 白的哺 乳动 物表 达载 体

pEGFP-C1转导入真核细胞中 , 观察到 EGFP 发出明

亮的绿光 , 并且 EGFP 的表达 和转染的时间有 相关

性 , 即从转染后的 6h 开始表达 , 到 21h 到达高峰 , 之

后 , 其表达强度随时间延长而逐渐减低。这表明绿色

荧光蛋白是非常易于检测的报告基因 , 并且它的表达

具有时效性。

我们比较了磷酸钙法、 电穿孔法和脂质体法对于

绿色荧光蛋白瞬时转染的效率。结果显示 , 脂质体法

的转染效率最高 , 对细胞生长影响的不良反应最小。

综合比较这 3种转染方法 , 磷酸钙法是磷酸钙 -DNA

复合物黏附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细

胞质 [3]。电穿孔是通过将细胞暴露在短暂的高场强 电脉冲中转导分子的方法 [4]。阳离子脂质体转染是 带负电的 DNA 自动结合到带正电的脂质体上 , 形成 DNA -阳离子脂质体复合物 , 被俘获的 DNA 就会被 导入培养的细胞。通过实验 , 我们可以看到磷酸钙法 优点为价格低 , 细胞毒性小 , 但是 , 该实验对技术的要 求较高 , 且实验的重复性较差。每种试剂都必须小心 校准 , 保证质量 , 因为甚至偏离最优条件 1/10个 p H 值 , 都可能导致 磷酸钙转染的 失败 [5]

。电穿 孔法虽 然很多报道表明电穿孔转染效率很高 , 但是 , 一般情 况下成功的电穿孔过程都伴随高度 (50%或更高 ) 的 毒性 , 会引起细胞的死亡。另外 , 高强度的电场脉冲 也能引起细胞 融合 , 可能会影 响到细胞的性 状和生 长 [6]。阳离子脂质体介导的转染方法是因转染效率

高、 安全、 细胞毒性小、 无免疫原性、 操作简单 , 成为较

理想的转染方法 [7]。 此外 , 采用阳离子脂质体法为保证转染的成功 , 在操作的过程中需要注意选用对数期生长的细胞 , 尽 可能地提纯用于转染的质粒 DNA, 去除内毒素的污 染可保证理想的转染效果 , 应按照转染说明书适量配 比用于转染 DNA 量和脂质体量 , 并进行预实验找到 最佳的比例等。 总之 , 在以绿色荧光蛋白为报告基因的真核细胞 转染系统中 , 脂质体法是相对转染效率高、 毒性小的 理想的转染方法。 参考文献 1 W els h S , Kay SA. R eporter gene expression form on itori ng gen e tran s -f er . Cu rr Op i n B i otechno, l 1997, 8(5):616-6172 Colos i m o A , Goncz KK, H ol m es AR, e t al . T rans f er and expression of f oreign gen es i n m a mm ali an cell s . B i otechn iqu es , 2000, 29(2):314-3183 Fu H, H u Y, M c Neli s T, et al . A calci u m phosph ate-b ased gene de -

li very syste m. J B i om ed M ater Res A , 2005, 74(1):40-48

4 Odan iN, It o K, N aka m ura H. E lectroporati on as an effici en tm ethod of

gene transfer . Dev G ro w t h D iffer , 2008, 50(6):443-448

5 Ke j novs ky E, Kyp r J . M illi m ol ar con cen trati ons of z i nc and ot herm etal

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6 SandriM, Bortoloso E, NoriA , e t a l . E lectrotran sfer i n d ifferenti ated

myot ubes :a nove, l effici en t procedu re f or functi onalgene transfer . E xp

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7 Dass CR , W al ker TL , Bu rton M A . L i pos o m es contai n i ng cati on ic di m -

et hy ld ioctadecy l a mm on i um bro m ide :f or m u l ation , quality con tro, l and

li pofecti on effici en cy . D rug Deliv , 2002, 9(1):11-18

(收稿 :2009-09-16)

(修回 :2009-12-03) 基金项目 :/十一五 0国家科技支撑计划 /调肝方药干预经前期综合征肝气逆证的代谢机制 0(2006BA I08B05-10)

作者单位 :250355 济南 , 山东中医药大学中医药经典理论教育部重点实验室 (张惠云、 孙鹏、 乔明琦、 魏 盛 ); 100084 北京 , 清华大学生命科 学与医学研究院中药现代化研究中心 (罗国安、 黎莉 ); 300071 天津 , 南开大学药学院 (黄浩 ); 300071 天津 , 南开大学生命科学学院 (魏娜 ) 通讯作者 :张惠云 , 电子信箱 :z hhu i yun@163. co m

基于 UPLC-Q -TOF 的经前期综合征

肝气逆证大鼠模型代谢表征研究

张惠云 罗国安 孙 鹏 乔明琦 黎 莉 黄 浩 魏 娜 魏 盛

摘 要 目的 研究经前 期综合征 (P M S) 肝气逆证大鼠代 谢指纹 差异 , 以期为 PM S 肝气逆 证在代 谢层次 上的发病 机制寻 29 医学研究杂志 2010年 1月 第 39卷 第 1期 #论 著 #

范文三：α2巨球蛋白cDNA片段-增强型绿色荧光蛋白质粒的构建

α2巨球蛋白cDNA片段-增强型绿色荧光

蛋白质粒的构建

408西北国防医学杂志(MedJNDFNC)2006Dec.;27(6) 2巨球蛋白cDNA片段一增强型绿色荧光蛋白质粒

的构建

刘之荣,范文辉,李露斯

(第三军医大学西南医院神经内科.重庆400038)

?

论着?

摘要:目的:构建巨球蛋白cDNA片段(FP6)一增强型绿色荧光蛋白(pEBFP)质粒(pEBFP/FP6双表达质粒).方法:利用

PCR技术克隆出FP6,将其克隆至pMDI8一T载体中,再通过分子克隆技术将F插入pEBFP表达基因中,构建pEBFP/FP6

质粒,双酶切和测序鉴定.结果:PCR方法能克隆FP6,并成功构建pEBFP/FP6质粒,双酶切和测序结果表明构建的pEBFP/

FP6质粒完全符合设计要求.结论:利用PCR,酶切,连接反应等基因克隆手段,可以构建pEBFP/FP6双表达质粒.

关键词:质粒;巨球蛋白;增强型绿色荧光蛋白;基因克隆

中图分类号:Q782文献标识码:A文章编号:1007—8622(2006)06—0408—03 Constructionofalpha—-2macroglobulineDNA—-enhancegreenfluorescentproteinexpressionpla.~mid

LIUZhi—rong,FANWen—hui,LILu—si.(DepartmentofNeurology,XinanHospital,ThirdMilitaryMedical

University,400038,China).

Abstract:Objective:Toconstructthealpha一2macroglobulincDNA(FP6)一enhancegreenfluorescentprotein (pEBFP)expressionplasmid(pEBFP/FP6).Methods:FP6wasgeneratedusingPCRandclo

nedintopMD18一T

vector.TherecombinantplasmidofpEBFP/FP6wagconstructedusingmelecularcloningtec

hnique,andidentified

bydoubleenzymolysisandsequencinganalysis.Results:FP6wasgeneratedusingPCR.The

coexpressionplasmid

ofpEBFP/FP6wasconstructedandcompletelyconsistentwithrequirementofdevisebydou

bleenzymolysisand

sequencinganalysis.Condusion:pEBFP/FP6coexpressionplasmidCanbeconstructedbyg

enecloningmethods,

suchasPCR,enzymolysisandcoupledreaction. Keywords:Alpha一2macroglobulincDNA;Enhancegreenfluorescentprotein;Co—expressionplasmid;

fnelone

2巨球蛋白(Alpha一2macmglobulin,A2M)是

p淀粉样肽(A口)的一种高亲和力的结合蛋白,其c

末端的27个氨基酸可与AI3特异性结合.通过

A2M与Ap的相互作用,A2M可中和Ap的毒性,降

解并清除AB.增强型绿色荧光蛋白pEGFP,目前

已被用作多种科学实验的报告基因或标记基因.本

实验根据GFP报告基因的特性,将从A2M基因克

隆出来的FP6段插入pEGFP,构建FP6一pEGFP重

组质粒,以便通过pEGFP报告基因来研究FP6在活

体细胞上的功能.

基金项目:国家自然科学基金资助项目(NO:30100058) 收稿日期:2006—09—01

作者简介:刘之荣(1966一),男,博士,副主任医师(现在第四军医大学

西京医院神经内科工作)

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1菌株,质粒:大肠杆菌DH5et由第三军医大 学神经生物学教研室提供,A2McDNA购自ATCC, pEBFP购自Clontech公司,pMD18一T购自宝生物 公司.

1.1.2主要试剂:限制性内切酶(EcoRI,BamHI), Taq酶,T4DNA连接酶,一HindHIDNAMarker, DNAMarkerDL2000,DNA片段回收试剂盒购自宝 生物公司,MAXIPREPGFIITMKit质粒提取试剂盒

. 购自Q.BIOgene公司

1.1.3PCR引物:根据A2McDNA序列…,设计一 对引物.上游引物:5一CGGAATTCCAGAATG CCCAGGGCGG,rrTC一3(EcoRI);下游引物:5

西北国防医学杂志(MedJNDFNC)2006Dec.;27(6)

一

CGGGI1CCAI1CAI.AGACI1I'I'CACI1AI.GG一 3(BamHI),由宝生物公司合成.

1.2方法

1.2.1FP6的扩增:以A2MeDNA为模板,以1.1.3 引物进行PCR扩增.反应条件:预变性94?,3 min;变性94?,30s;退火56?,30s;延伸72?,45 s;共30个循环,再延伸72?,6min.PCR扩增产物 切胶回收..

1.2.2FP6插入pMD18一T载体:按TaKaRa试剂 说明书,行FP6和pMD18一T载体连接反应,构建 pMD18一T/FP6重组质粒.反应完成后将反应产物 热转化至DH5ot中,涂布含氨苄青霉素(5Og/Ill1) 平板过夜培养.从转化平板上挑取单菌落,以1.1.3 引物进行PCR扩增,检测菌体中插入DNA片段的

大小.证明扩增产物符合设计要求后,取单菌落于 含氨苄青霉素(50g/Ill1)的LB培养液中,振荡培 养过夜,提取质粒.

1.2.3双酶切反应:将pMD18一T/FP6基因质粒和 pEBFP载体质粒分别用EeoRI/BamHI进行双酶 切.切胶回收酶切反应目的片段.

1.2.4连接反应:按TaKaRa试剂说明书连接酶切 产物FP6与载体DNA(pEBFP).连接完后将反应 产物热转化至DH5ot中,涂布含氨苄青霉素(50g/ Ill1)平板过夜培养.从转化平板上挑取单菌落,以 5一AGCAAAGACCCCAACGAGAA一3/5一 A]1-I,I'CAGGTTCAGGGGGA一3引物进行PCR 扩增,检测菌体中插入DNA片段的大小.证明扩增 产物符合设计要求后,取单菌落接种于含硫酸卡那 霉素(30p~g/rn1)的LB,振荡培养过夜,提取质粒. 1.2.5重组质粒鉴定:将重组质粒用EeoRI/ BamHI进行双酶切反应,反应产物进行琼脂糖凝胶 电泳.重组质粒分别用引物5一AGCA从GAC CCCAACGAGAA一3和5一ATG1TrCACGTT CAGGGGGA一3进行测序.

2结果

2.1FP6的克隆:理论扩增FP6的产物为O.57kb, 电泳鉴定结果与理论值相符(图1).

2.2pMD18一T/FP6的构建:PCR扩增菌体中插入 DNA片段的大小结果符合预期(图2). 2.3pEBFP/FP6的构建及鉴定:PCR扩增检测菌 体中插入DNA片段的大小结果符合预期,双酶切鉴

定示片段大小与理论值大小相符(图3).测序显示pEBFP/FP6中的FP6的序列与A2M基因中FP6的

序列完全一致.

2Oo0

1o0O

5o0

250

1o0

1:PER产物(FP6)2:DNAMarkerDL2,000

图1A2M扩增产物(FP6) M12345

2oo0

1000

750

5o0

250

1o0

M:DNAMarkerDL2,0001,5:不同的克隆 图2pMDI8一T/中FP6的PCR鉴定 l23

2Oo0

1000

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5o0

250

100

1:DNAMarkerDL2.0002:FP6一pEBFP质粒

3:一Hind?DNAMarker 图3pEBFP/FP6双酶切反应产物 3讨论

1985年Kan等…利用寡聚核苷酸探针分析得

出人的A2M基因序列.A2M是一种泛蛋白酶抑制 剂,能与p一淀粉样肽(Ag)的特异性结合,可中和 Ap的毒性,降解并清除Ap.根据功能及不同

的酶切位点,A2M可被分成6个片段,即FP1 (aa99—392),FP2(aa341—590),FP3(aa591—

744),FP4(aa775—1059),FP5(aal030—1279),FP6 (aa1242—1451).体外实验证实Ap与FP6段选择

4lO西北国防医学杂志(MedJNDFNC)2006Dec.;27(6)

性结合j.绿色荧光蛋白分子量小,其融合蛋白

不影响结合蛋白的生物学功能,且对原核/真核细胞 没有毒性,转染的细胞可继续传代,是一种理想的报 告基因或标记基因.

本实验通过PCR成功获得目的基因A2M

eDNA的FP6区段,再将FP6插人高效载体pMDI8 一

T,采用定向克隆的方法,将目的基因FP6插人

pEBFP表达载体.在构建pEBFP/FP6的过程中,我 们从不同层次,不同侧面保证所获得的重组子完全 正确:?进行PCR鉴定,检测插人片段(FP6)的有 无和大小;?抗生素筛选;?双酶切鉴定;?测序分 析,进一步验证插人片段的序列,方向是否正确.最 后构建出pEBFP/FP6双表达质粒,插人片段序列, 方向完全正确,并且国内外文献未见报道.pEBFP/ FP6的构建成功,为A2M的FP6区段的功能,尤其 是在活体细胞上的功能研究创造了条件.

参考文献:

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ofeDNAencodinghuman2一macroglobulinandassignment

ofthechromosomallocus[J].PrecNatlAcadSciUSA,

1985,82:2282—2286.

[2]ClarkCandKarlawishJ.Alzheimerdisease:Currentcon. ceptsandemergingdiagnosticandtherapeuticstrategies [J].AnnIntemMed,2003,138(5):400—410.

[3]SelkoeDJ,SchenkD.Alzheimer~disease:molecularunder- standingpredictsamyloid—basetherapeutics[J].AnnRev

PharmacolToxicol,2003,43:545—584.

[4]LauerD,ReichenbachA,BirkenmeierG.Alpha2一macro-

globulin—mediateddegradationofamyloidbeta1—42:a

mechanismtoenhanceamyloidbetacatabolism[J].Exp Neurol,2001,167:385—392.

[5]WebbDJ,WenJ,KalllSLR,eta/.Localizationofthe bindingsitefortransforminggrowthfactor—-inhuman2—-

macroglobulintoa20一kDapepfidethatalsocontainsthe baitron[J].JBiolChem,1998,273:13339—13346.

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[7]CubittAB,HeimR,AdamSR,eta1.Understanding,im- provingandusinggr6~nfluorescentproteins[J].Trends BiochemSci,1995,20(11):448—455.

实性子宫妊娠分娩1例

冯桂萍,乔敏,程辉兰

(兰州军区鸟鲁木齐总医院,新疆鸟鲁木齐830000)

关键词:妊娠;实性子宫;分娩

中图分类号:R714.1文献标识码:D

患者,32岁,孕l产0,停经34+5周,右骶前,皮肤瘙痒

1月余,查胆酸23L(我院正常值0.23,1.72L),于

2003—08—13以"妊娠合并肝内胆汁淤积症,1/0妊34+5 周右骶前,单角子宫?"入院.产科检查:宫高29em,腹围87 em,骨盆外测量正常,胎心胎动正常.入院后给予促胎肺成 熟及保肝利胆中药等对症治疗.曾因婚后2年不孕,B超 示:子宫前位,大小4.0em×0.3emx4.9em,宫底形态失 常.右宫角显示角清,子宫输卵管碘油造影报告;宫腔呈柱 状,左侧单角子宫,边缘光滑,清晰,左输卵管全程显影,造影 剂进入盆腔顺利.意见:左侧单角子宫,左输卵管通畅.于 收稿日期:2006—05—10

作者简介:冯桂萍(1968一),女,主治医师

?

病例报告?

15日自然破膜,见胎粪样羊水,量少,无宫缩,复查B超:右 骶前,双顶径8.1em,羊水指数8.6em,胎盘?+,?级,脐 绕颈l周,S/D3.2,患者本人及家属要求剖宫产终止妊娠. 当日即行剖宫产术,术中见羊水?度污染,以右骶前顺娩单 活女婴,重2000g,Apgar评分lrain评9分(肤色扣1分),5 min评lO分,胎盘胎膜完整.娩出后见子宫外观形态正常, 双侧输卵管,卵巢外形正常,探查见宫腔右侧为实性的肌性 组织,厚约5em,左侧宫腔约6em,术后7d母婴平安出院. 讨论:实性子宫临床实属罕见,系两侧副中肾管会合后 形成子宫,但其部分或全部未贯通,如部分未贯通,则有部分 宫腔形成,因有子宫内膜形成,故可出现经血,多不孕,如全 部未贯通,则无宫腔,除原发性闭经外,无周期性腹痛.此例 属前者.

范文四：[doc] pYL-绿色荧光蛋白质粒在卡介苗中的表达

pYL-绿色荧光蛋白质粒在卡介苗中的表达

?

1024?中华实验外科杂志2006年8月第23卷第8期

ChinJExpSurg,August2006,Vol23,No.8

pYL一绿色荧光蛋白质粒在卡介苗中的表达

刘春雨韩瑞发马腾骧畅继武韩育植隋志芳

我们将绿色荧光蛋白(GFP)报告基

因利用pYL—GFP质粒转导到卡介苗

(BCG)内形成重组BCG-GFP,通过其在

BCG内部表达绿色荧光蛋白作为标记蛋

白,探讨BCG的作用过程和机制提供一

种新的方法.

一

,材料与方法

1.材料:大肠杆菌为DH5a.天津市

泌尿外科研究所保存.BCG购自北京生

物制品研究所.丹麦I型.载体质粒

DMOI)-12和含有所需GFPcDNA质粒均

由美国IOwA大学YiLuo教授提供.

pYL—GFP质粒PCR和测序用引物:质粒

载体上游引物(ATC1v1_CACCATAC—

GACGTCC)/下游引物(GTTAACTACG.

TCGACATCG)均由大连宝生物公司合

成.rBCG-GFP扩增,测序用引物:上游

引物(CGTCAGTCATGATGAGTAAAG-

GAGAAGAACTTTC)/下游引物(CGT一

行乃丁GGTT形

CATGC)均由大连宝生物公司合成.

2.方法:(1)GFPcDNA片段PCR反

应:引物为上述质粒载体上游/下游引

物;94?预变性5rain,94?变性30S,57

?退火50S,72?延伸50S,最后一次72

?延伸7rain.(2)pYL—GFP的构建:将

pMOD-12质粒与GFPcDNA分别采用

Nool/ClaI和BspHI/ClaI双酶切后进行

连接形成pYL—GFP质粒.(3)pYL.GFP

质粒的鉴定:?酶切:采用NIaIlI和ClaI

进行双酶切反应和电泳.?测序:定量

后制作模板,采用质粒载体引物进行测

序.(4)rBCG-GFP的转导和鉴定:rBCG-

GFP的转导:采用电转法将pYL—GFP质

粒转导到BCG内.rBCG-GFP的鉴定:

?PCR反应:引物为上述rBCG-GFP扩

基金项目:国家教委基金资助项目

(00138);天津市科委基金资助项目

(013180411)

作者单位:300211天津市泌尿外科研究

所

增,测序用上游/下游引物;94?变性30

s,57?退火50S,72?延伸50S,最后1

次72?延伸7rain.?测序:将上述

PCR产物电泳回收测定后制作测序模

板.采用PCR相同的上游/下游引物进

行测序.(5)rBCG-GFP表达产物的鉴

定:在长波紫外灯下观察固体培养基上

单菌落并照片,在荧光显微镜下观察重

组rBCG-GFP涂片,并摄片.

二,结果

1.GFPcDNA的PCR产物:以分别

含有BspHI酶切位点和ClaI酶切位点的

GFP上/下游引物进行PCR反应.电泳

后在700bp左右可见一条带.

2.pYL—GFP质粒酶切,PCR和测

序:pYL.GFP质粒电泳在5700bp处可

见一条带.酶切后电泳出现两条带,分

别在700和5000bp左右.前者为GF—

PcDNA片段,后者为质粒pMOI)-12片

段.以一对载体质粒引物进行PCR反

应电泳后条带出现在700bp左右.以该

对引物进行的测序反应证明重组质粒内

含有GFPcDNA序列,且完全正确.

3.rBCG—GFP的PCR及其产物测

序:将单菌落扩增后制作模板,以GFP

引物进行PCR反应,电泳后在700bp左

右可出现一条条带.再以该引物对PCR

产物测序,结果显示含有GFP,且序列完

全正确.

4,重组BCG—GFP表达产物的检测:

自从重组后单菌落形成开始,即可在紫

外灯下观察到GFP.BCG发出的绿色荧

光.紫外显微镜下可见绿色荧光自重组

BCG.GFP菌体内发出.

三,讨论

人们过去常采取放免标记,荧光染

色等方法探讨BCG的作用过程,但是,

上述方法需要对组织进行特殊处理或与

BCG进行共同培养,方法较繁琐,易出现

标记物丢失等问题,有时也会影响BCG

的特性.我们利用基因工程技术将GFP

转导到BCG中,使之在BCG内表达绿色

?

简丰艮?

荧光蛋白则将为探讨BCG在体内的作

用过程和机制提供一个理想的工具.该

重组BCG有以下优点:(1)不需要预处

理而直接将绿色荧光体应用到目的宿

主.(2)重组BCG表达的绿色荧光均匀

一

致,使对宿主吞噬病原体进行定量分

析时准确可靠.(3)GFP相当稳定,即使

在很强的光线刺激下也不易褪色.(4)

GFP的荧光在活细胞和固定后的细胞中

均可观察,尤其是适用于监测BCG在体

内的作用过程.(5)GFP的光学特性与

FITC相似,适用于标准荧光显微镜观察

和流式细胞计定量分析.

重组BCG能否保持野生型BCG的

生长特性也是值得注意的一个问题.有

文献报道,单拷贝BCG菌株与野生型

BCG生长,复制无明显区别,但是多拷贝

则复制明显降低….我们检测的结果显

示.重组BCG.GFP的生长情况与野生型

无明显差别.连续培养10代也未发现

GFP表达丢失,重组BCG仍能保持明亮

的绿色荧光,表明该质粒在BCG内可稳

定持续表达.对于重组BCG的具体生

物学行为以及更长时间的传代培养后表

达情况还需要进一步研究.

重组的BCG.GFP能够在BCG内部

表达绿色荧光蛋白,利用该特性可以很

方便地观测到BCG在体内的作用过程,

为探讨BCG在体内的作用机制提供了

一

种新的观测手段.同时该质粒载体还

有另外一套带有分泌功能信号肽的启动

子和多克隆位点,在目前所构建的重组

质粒基础上进一步插入其他细胞因子或

表达蛋白,利用GFP作为报告基因,可

探讨它们的各种作用方式和机制.

参考文献

1ZhuY,FennellyG,MillerC.etal,Recombi.

nantbacillecaImette?guerinexpressingthe

measlesvirusnucleoproteinprotectsinfant

rhesusmacaquesfrommeaslesviruspneumo.

nia,JInfectiousDiseases.I997.176:1445.

1453.

(收稿日期:2006—01.09)

范文五：山羊痘病毒RPO30基因绿色荧光蛋白质粒的构建及融合表达

,,,,,中 图 分 类 号 文 献 标 志 码 文 章 编 号 ,,,,,,,,,, , ,,,,,:,,:,::,,:,,,:,)))

山 羊 痘 病 毒 基因绿色荧光蛋白质粒的构建 ,,:,:

及 融 合 表 达

,，，，，，，赵 志 荀 吴 国 华 颜 新 敏 崔 力 凡 李健 朱 海 霞 张强

,中国农业 科 学 院 兰 州 兽医研究所 家畜疫病病原生 物 学 国 家 重点实验室 农 业 部 畜禽病毒学

,， 重点开放实验室 甘 肃 兰 州 :,::,,

,，摘 要 为 了研究针对山 羊 痘病毒 的 的 干 扰 效 果 构 建 了 基 因 与 增 强 型 绿 色 ,,:,: ,,,:,,,,:,:

荧

,,，。 ，光 蛋 白 基 因 的 融 合 表 达 质 粒 并 在 细 胞 中 表 达 通 过 对 基 因 进 行 扩 增 克 ,,,,,,,,,,,:,: ,,, )

，,，隆 入 表 达 载 体 并 进 行 双 酶 切 及 测 序 鉴 定 将 阳性重组质粒转染 细 胞 检 测 绿 色 荧 光 ,,,,:,,,,,, ,))

。 ，，蛋 白 的 表 达 和 基 因 的 转 录 水 平 结 果 显 示 获得的目的基因片段大小与预期 结 果相符 该 基 因 与 ,,:,:

。 数 据 库 中 基 因 序 列 的 同 源 性 为 荧 光 显 微 镜 和 流 式 细 胞 仪 均检测到细胞内绿色,,,,,,:,:,:,,,,)

荧光蛋 ，，,，白 的 表 达 转 染 后 第 小 时 阳 性 细 胞 率 达 到 经 检 测 细 胞 内 有 基 因 的 ,,,:,,,,,,,, ,,:,: )

。 ，，。转 录 证 实 已 成 功 构 建 了 基 因 与 基因的融合表达质粒 并 在 细 胞 中 获 得 了 表 达 ,,:,:,,,, ,,,,,)

,,,, 关 键 词 山 羊 痘 病 毒 基 因 增强型绿色荧光蛋白 融 合 表 达,,:,:

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,,,收 稿 日 期 修 回 日 期 :,,,,,,,,:,:,:,:))))

,,,,,,基 金 项 目 农业部转基因生物新品种培育重大专项 甘肃省重大科技专项 ):,:,,::,:,:,::,:,,:,,:,,

,。,,,，,,，，，，作 者 简 介 赵 志 荀 男 白 族 贵 州 毕 节 人 硕 士 生 主要从事动物病 通 讯 作 者 ) ,,,,,,,,,,::,,,,::,,,,,,,,,,

，,，,毒 学 研 究 ,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,:,,,,:,,,)),,,

，。 ,,,山 羊 痘 是 由 山 羊 痘 病 毒 目 的 片 段 长 度 为 上述引物均由 大 :,,:,:,,:,,,,,,′,,,,,

连宝 ，,、引起山羊和绵 羊 感染的一种急性 热 ,,,,,,,,

。 生 物 工 程 有 限 公 司 合 成 、，,,性 高 度 接 触 性 传 染 病 世 界 动 物 卫 生 组 织 :,, ,,病 毒 的 提 取,,,, ,:, 。，将 其 列 为 类 疾 病该 病 以 细 毛 羊 最 易 感 羔 ,

应 用 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 的 病 毒 ,:, ，，羊 的 发 病 率 和 死 亡 率 很 高 甚 至 可 达 妊 娠 ,::,

。提 取 试 剂 盒 直 接 从 细 胞 毒 株 中 提 取 ,:, 母 羊 极

基 因 的 扩 增,,, ,,:,:,,, ，，易 发 生 流 产 被 感 染 羊 群 生 产 力 大 大 降 低 皮 毛 品 ，以提取纯化的病毒 为模 板 进 行 扩 增,:, ,,, 质

,，，反应体系缓冲液模板,:×,,, ,,,:,,,,,μμ，，也 极 度 下 降 造 成 巨 大 的 经 济 损 失 严 重 影 响 国 际

，、，引物 各 聚 合 酶 ,,,,,,,,,,,:, :,,,),, , μμ。贸 易 和 养 羊 业 的 发 展

，超 。,,纯水补至反应 条 件 为,,:,,,? ,,,,μμ 基 因 位 于 基 因 组 的 ,,:,: ,,, ,,,,::，，，,。个 循 环 ,,,? ,,,:, ? ,,,,: :, ? ,:,,,,,? ,, ，。处 由 第 号 读 码 框 编 码 基 因 ,:,,,,:,, ,,:,: ,,。于的琼脂糖凝胶中电泳检测 产物 ,:,,,, ,

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，，，一 个 聚 合 酶 亚 基 而这 些 聚合酶亚基可能与 盒 回 收 后 直 接 连 接 入 载 体 并 转 ,:, ,,,,,,,,,,,),,,,。 ，。 ，病 毒 的 毒 力 及 宿 主 有 关因 此 笔 者 在 研 究 另 外 化 大 肠 杆 菌 经蓝 白斑筛选挑选白斑 小 量 ,,, α

，制 备 质 粒 以 一 个 高 度 保 守 的 毒 力 基 因 的 同 时 探 索 了 对 ,,,,,,,:,:,,:,,,,,,:,,,))? ? ,,,病 。双酶切和 方法鉴定阳性克隆并送大连宝生 物 工 毒 的 抑 制 作 用本 试 验 构 建 了 ,,, ,,,,,,:,,)材 料 与 方 法 ,表 。程有限公司测序 :

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及用 对 阳 性 、,,:,,,,,,,,,,,,:,:山 羊 痘 病 毒 甘肃古浪毒株由本实验室分离 鉴 ? ? )),

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，，兰 州 兽 医 研 究 所 家 畜 疫 病 病 原 生 物 学 国 家 重 点 实 大 片 段 上 并 转 化 入 大 肠 杆 菌 中 :,,,,,,,, )α ,

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的 相 对 表 达 率 ,,, ,,,,

，，经 流 式 细 胞 仪 分 析 转 染 后 第 小 时 ,,,,,,,) 重 组 质 粒 的 鉴 定 ,,,

，的 平 均 阳 性 细 胞 率 为 而 :, ,,,,,,,,, ,) 重 组 克 隆 质 粒 和 表 达 质 粒,,,:,: ,,,,)),

。的平均阳性细胞率为 ,,:,: ,:,,,,,,,:, 经 双 酶 切 和 鉴 定 ，均 可 见 大 于 ,),,,,,,:,:,,, ),

空 载 体阳性细胞的表 达 量高 于 试 验 组 ,,,,,) ,,。 小 于 的 目 的 基 因 片 段 见 图 ,::,:,:,,,,

，,而 未 转 染 的 阴 性 细 胞 没 有 ,,:,:,,,,, ),的 序 列 分 析 ,,,,,,:,: ,,,),

,,,。 荧 光 表 达见 图 将 重 组 质 粒 送 往 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ,,,

测 讨 论 ,，，序 所 得 结 果 完 全 正 确 测 序 结 果 与 数 ,,,,,,,

，据 库 中 基 因 序 列 的 同 源 性 在 以 上 ,,:,:,:, 基 因 是 羊 痘 病 毒 的 聚 合 酶 亚 基 基 ,,:,:,:,

最 高。， 因 由 于 其 具 有 较 高 的 保 守 性 各 毒 株 之 间 的 差 在 细 胞 中 的 表 达 ,,:,:,,,,, ,,,,,,,)),

。 达 将 转 染 后 的 细 胞 分 别 培 养 、和 异,,,,,,,,,,, ,,,, )

,,,,)，，，， 在 荧 光 显 微 镜 下 均 可 见 荧 光 其 中 以时 的 很 小 因 此 可 选 作 干 扰 的 靶 序 列对:,,,,,,:,

,,。表 达 量 最 高 见 图 基 因 序 列 的 干 扰 有 可 能 抑 制 基 , ,,:,:,:, ,,,

。转 录 后 的 检 测因 组 的 复 制 ,,, ,,:,:,,,,, )

、分 别 提 取 转 染 空 载 体 的 细 胞 转 染 经 紫外线照射时的自 发 荧 光 特 性 使 其 成 ,,,,:, ,),,,,

,,,),:。了 的 细 胞 和 未 转 染 质 粒 的 阴 性 细 胞 为 有 用 的 蛋 白 质 分 子 标 记载 体 的 ,,,,,,:,:,,,,:, ,),)，，的 进 行 同 时 对 上 述 细 胞 的 基 因 组 多 克 隆 位 点 位 于 增 强 型 绿 色 荧 光 蛋 白 编 码 序 列 ,:,,,,,,)

和，内 参 基 因进 行 扩 增 产 物 的 电 泳 结 ,,,,,,,,,,))β，，之 间 经 测 序 鉴 定 基 因 克 隆 ,,,::,, ,,:,: ,, ,,，果见 图 显 示 转 染 了 质 粒 的 细 胞 ,,,,,,:,: ,)

，，入 编 码 序 列 的 端 阅 读 框 没 有 改 变 可 与 ,,,, ,)

图 转 染 后 第 细胞中的表达情况 小 时 在 ,, ,,,, ,,,,,,)

,,,, ,,,,,,,:,:,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,:,,,,,,,,,,,,:, ,))),,,,、、,、,、、,分别为荧光观察的转染 空 载 体 和 空 白 对 照 的 表 达 效 果 分别为白光观察的转染 ,,,,,:,::,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,),)),)

、、空 载 体 空白对照的表达效果 ,,:,::,,,,,,,,,,,))

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图 转 染 后 第 小 时 细 胞 的 检 测 ,,,:,:,, ,,,,, )

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,,,,,,,,,基 因 的 产 物 内 参 基 因的 产 物 分 子 质 量 标 准 转 染 的 细 胞 转 染,,,:,:,,,,, ,,,,,, ,,,,, ,,:, ,,,,,:, ,,,,, ,))),)) β

的 细 胞 ,,没有转染任何物质的 细 胞 ,,,,,),,:,:,,,),,,,,),,,

,,,,,,,,,,,),,,),,,,,,,,,,,:,:,,,,,,,),,,),,,,,,,,,),,,,,,,,,,,,,:::,:, ,,,,,,,,,,),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,):, β

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图 表达情况的流式细胞仪检测 , ,,,,

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,,,,,的 细 胞 转 染 的 细 胞 未 转 染 的 阴 性 对 照转 染 ,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,)),))) ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,:,,,,,,,,,,,)))) ,,,

，，,,, ,,,,:,,:,,,,,,,,,,::,,,,,:),:,,，脂 质 体 具 有 很 高 的 转 染 效 率 适 用 于 细 ,::: ,, ，，,,,,,,, ,,,,,,,,,:,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,:, :,，胞 的 瞬 时 转 染 和 稳 定 表 达 但 转 染 效 率 受 很 多 因 素 ,,,,,::,,,,,,,,:,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,, ,:,:,,,:,,,, ,,,,。， 的 影 响 本 试 验 中的荧光表达量总 体 不是很稳 定 ,,,,) ，，,,,,,,,:,,:,,:,:,,,,,,,:,, ，，，,,,,,,: , ,,,::,: , ,,, :,,,,,,,,,,:,,,:, ,，笔 者 经 过 多 次 反 复 摸 索 确 定转染时质粒 和 脂质体 ,,，，,,,) ,,,,:,,,,:,,:,,,,,,,,:,:,,,:,,::,:,,,,:,,,,,, 的 最 佳 比 例 为 质 粒 和 脂 质 ,::: ,, ,,,,μμ,:,,, 。，体 为 排 除 转 染 过 程 中 的 不 确 定 因 素 可 利 用 ,, ，，，赵 志 荀 吴 国 华 颜 新 敏 等 山羊痘病毒古 浪 株 毒 力 蛋 白 ,,,,,

表 达 载 体上的抗性标记 筛 选 转 染 ,,:,:,,，，,,,:,,,,的结构模拟与分析 中 国 兽 医 科 学 ,) :,:::, ,:,:,:,::,)

，，，,,: :,,,,,,, ,,:,,,,,: ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,细 胞 的 阳))) ,:,,:, ,,,,, ,,,,,,, ,:,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,:, ,,，，性 克 隆 建 立 稳 定 转 染 细 胞 系 使 对 干 扰 ,,,:,,

效 。果 的 分 析 更 为 直 观 和 准 确 ,,，，,,, ,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,:,:,::,):::,,

,,， 本 研 究 发 现 重 组 质 粒 转 染 和 未 转 染 的 ,,,,,,,,,,,,),, ，，，,,,,,,,,,, ,,,,,:,,,:,,:,,,,,, ,,,,,,,,), ，细 胞 的 形 态 及 生 长 特 征 有 较 大 差 异 这 有 可 能 ,, ,:,, ,,,,,,, ,:, ,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,),,,,,:,,,，是 脂 质 体 本 身 对 细 胞 造 成 的 毒 性 也 有 可 能 ,:::,,，，,,,,,,,) ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,:,,,,,,::,,,,,,,,是 表,, ，， :,,,,,,,, , ,,,:,,,,,, ,,,,,,, ,,,:,,,,,,),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,:,,:,,,,,,)) ,。达 的 融 合 蛋 白 对 细 胞 有 明 显 毒 性 荧 光 显 微 镜 观 ，，,,,,,,,::,,,,,,,,::,) 察

，，显 示 转 染 细 胞 存 在 强 烈 的 绿 色 荧 光 表 明 ,,,,,, ，，，) ,,,,,,,,,, ,,,,,,:,::,,,,,:,:,,,,,,,,,,

,,,,,,:,,,,,,,:,:,,,,:,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,, 。，细 胞 可 表 达 融 合 蛋 白 另 外 内 参 ,,, ,,,,,,:,:),,，，,,:,:,,,,,,,,,:,,,,,,,,,:,,,,,:,,,,::,::,,: ,,,,因 的 检 测 结 果 表 明 细 胞 的 提 取 和 反 转 录 基 ,:, ,,,，，，,,,,, ,,,,,:,,:,:,,,,,,,,,:,: ,,,,,,::)成 ，，,,功 对 照 组 和 试 验 组 细 胞 的 鉴 定 表 明 ,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,:,,:,,,,,,,,,, ,,,,, ,) ,,),,,,,,,,,,,,:,, ,,,，，,,,,,,,,,:,,,,,:,,,,,,,,,,:,,::,,,,,, ) ,,,,,,,,,,,,,),,,) ,， 基 因 已 被 成 功 整 合 在 细 胞 中 ,,,,:,:,,,,, ))

，,, ，，，并 得 到 了 成 功 的 转 录 和 表 达 通 过 流 式 细 胞 仪 检 潘 国 栋 黄 永 章 郭 凌 郧 等 心 肌肌球蛋白重链启动 子 驱 动,:, α

,,的绿色荧光蛋 白 表 达 载 体 的 构 建 及 鉴 定 郧 阳 医 学 院 学 :,， 测 ，，,,,报 ,,,,::,,,,,,) 。 表 达 的 阳 性 细 胞 阳 性 率 达 重 组 质 粒 ,,,,,,,,) ，，， ,,: ,,:,:,,,,:, ,:,,,,,,,: ,,,,,,,,,,),,),,),,,参 考 文 献 的 构 建 及 其 在 细 胞 内 的 成 功 表 ,,,,,,,,,,,,,,:,:,,,,,)),:,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,, ,),, ，达 使 得 通 过 直 接 检 测 的 表 达 来 分 析 ,,,, ,,:,: ,, ，，，,,,,,:,,, , ,,,,,:: ,,,::,: ,,,,,,,,,,,:, ,,,,,,,:,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,:,,,,,,)) ,,,,,

,,,,,,,,,,,,,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,: ,,)，),,,,,,,,,,基 因 的 表 达 成 为 可 能 这为 在细胞水平上 快 速筛选 ,,， ,,,,,,:,,,,,:,:,::,,,,,:,,,,,,,,,,,,,:,,,,,, , ,，，,,,,,,:,,) ,:,,:::,,,:,,,,,。，,,,,,抑 制 基 因 的 提 供 了 便 利 ,,:,:,,,:,, ,::,,,,,,,,,,,,,,,,,,),, ，，，,,,,:,,,,,, ,,:,,,:,, ,,:,,,,:, ,,,,,,责 任 编 辑 左 翠 萍 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,,:,,,,,,,,:,,:,,,,,,,, ,,, :,

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