银杏叶中总黄酮的提取

范文一：银杏叶中总黄酮的提取

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山东农业大学毕业论文乙醇浸提法、超声波法提取银杏叶中总黄酮的工艺研究院部专业班级届次学生姓名学号指导教师二О一sss 月

摘要 . .................................................................................................................................... 1

英文摘要 . ............................................................................................................................ 2

关键词 . ................................................................................................................................ 2

文献综述 . ...................................................................................................................... 3

1 银杏叶中的化学成分 . .................................................................................................... 3

2 银杏叶的药理及药效作用 . ............................................................................................ 3

2.1 银杏叶功效 ........................................................................................................................................4

3 黄酮类化合物的药理作用 . ............................................................................................ 4

3.1 降血脂作用 ........................................................................................................................................5

3.2 清除自由基、抗氧化作用 . ...........................................................................................................5

3.3 抗炎作用 .............................................................................................................................................5

3.4 增强免疫能力 ...................................................................................................................................5

3.5 镇痛作用 .............................................................................................................................................6

3.6 抗衰老作用 ........................................................................................................................................6

3.7 护肝作用 .............................................................................................................................................6

3.8 抗HIV 作用 . ......................................................................................................................................7

3.9 其他作用 .............................................................................................................................................7

4 中草药有效成分常用的提取分离方法 . ........................................................................ 7

4.1 溶剂提取法 ........................................................................................................................................7

4.1.1 溶剂提取法的原理 ......................................................................................................................7

4.1.2 溶剂的选择 . ....................................................................................................................................8

4.1.3 提取方法 .........................................................................................................................................8

4.2 水蒸气蒸馏法 ...................................................................................................................................8

4.3 超声波辅助提取 . ..............................................................................................................................9

4.4 微波辅助提取 ...................................................................................................................................9

引言 . .................................................................................................................................. 10

1 材料与方法 . .................................................................................................................. 10

1.1 材料与仪器 ...................................................................................................................................... 10

1.1.1 原料 ................................................................................................................................................. 10

1.1.2 仪器设备及化学试剂 . ............................................................................................................... 10

1.2 试验内容 ........................................................................................................................................... 10

1.2.1 总黄酮的含量测定 .................................................................................................................... 10

1.2.2 提取条件的优化 ......................................................................................................................... 11

2 结果 . .............................................................................................................................. 12

2.1 标准曲线 ........................................................................................................................................... 12

2.2 醇提法正交实验结果 ................................................................................................................... 12

2.3 超声波提取法正交实验结果 . .................................................................................................... 13

3 讨论 . .............................................................................................................................. 14

3.1 分析测定方法原理 ........................................................................................................................ 14

3.2 各因素对提取率的影响 .............................................................................................................. 14

3.2.1 提取时间对提取效率的影响 ................................................................................................. 14

3.2.2 提取液浓度对提取效率的影响 . ............................................................................................ 14

3.2.3 料液比对提取效率的影响 ...................................................................................................... 15

3.2.4 超声波对提取效率的影响 ...................................................................................................... 15

3.2.5 其他影响因素 . ............................................................................................................................. 15

4 结论 . .............................................................................................................................. 15

参考文献 . .......................................................................................................................... 16

致谢 . .................................................................................................................................. 18

Contents

Abstract in Chinese ............................................................................................................. 1

Abstract in English .............................................................................................................. 2

Key words ........................................................................................................................... 2

Review of the Literature . ..................................................................................................... 3

1 Chemical composition in herba plantaginis ..................................................................... 3

2 Pharmacological action of the herba plantaginis . ............................................................. 3

2.1 Ginkgo biloba efficacy of four ...................................................................................... 4

3 Pharmacological effects of flavonoids ............................................................................. 4

3.1 Hypolipidemic effect . .................................................................................................... 5

3.2 Free radical scavenging, anti-oxidation ........................................................................ 5

3.3 Anti-inflammatory role . ................................................................................................. 5

3.4 Enhanced immunity . ...................................................................................................... 5

3.5 Analgesic effect ............................................................................................................. 6

3.6 Anti-aging effects .......................................................................................................... 6

3.7 Hepatoprotective role .................................................................................................... 6

3.8 Anti-HIV effect . ............................................................................................................. 7

3.9 Other role . ...................................................................................................................... 7 4 The common method of extracting and separating effective components form Chines

medicinal herb ..................................................................................................................... 7

4.1 Solvent Extraction ......................................................................................................... 7

4.1.1 The principle of solvent extraction . ............................................................................ 7

4.1.2 Solvent choice ............................................................................................................ 8

4.1.3 Extraction Method . ..................................................................................................... 8

4.2 Steam distillation . .......................................................................................................... 8

4.3 Ultrasonic assisted extraction . ....................................................................................... 9

4.4 Microwave assisted extraction ...................................................................................... 9

Intoduction ........................................................................................................................ 10

1 Materials and methods ................................................................................................... 10

1.1 Raw material and Source . ............................................................................................ 10

1.1.1 The raw material . ...................................................................................................... 10

1.1.2 The equipment and chemical reagents ..................................................................... 10

1.2 The content of experiment . .......................................................................................... 10

1.2.1 The determination of content in herba plantaginis . .................................................. 10

1.2.2 Optimize the condition of extract . ............................................................................ 11

2 Result . ............................................................................................................................. 12

2.1 Standard curve . ............................................................................................................ 12

2.2 The orthogonal experiment result of extraction used alcohol ..................................... 12

2.3 The orthogonal experiment result of extraction used hypersonic ............................... 13

3 Discussion ...................................................................................................................... 14

3.1 The theory of assay determination method ................................................................. 14

3.2 The affection by the various factors ............................................................................ 14

3.2.1 Extraction time on extraction efficiency .................................................................. 14

3.2.2 Extract concentration on the extraction efficiency . .................................................. 14

3.2.3 Solid to liquid ratio on the extraction efficiency . ..................................................... 15

3.2.4 Ultrasonic extraction efficiency ............................................................................... 15

3.2.5 Other influencing factors . ......................................................................................... 15

4 Conclusion . ..................................................................................................................... 15

References ......................................................................................................................... 16

Acknowledgements ........................................................................................................... 18

乙醇浸提法、超声波法提取银杏叶中总黄酮的工艺研究

学生：林析导师：刘法孝

摘要：银杏树是中国古老的树种之一，它是神奇的医疗之树, 其叶、果实、种子均有较高的药用价值，其药理作用不断被认识，临床应用范围逐步扩大。银杏叶中含有天然活性黄酮及苦内酯等与人体健康有益的多种成份。本研究以银杏叶为原料，采用正交实验方法研究了乙醇浸提、超声波提取法中乙醇浓度、料液比、超声波处理时间对总黄酮提取效果的影响，并综合比较了各提取方法，结果表明银杏叶中总黄酮的最佳提取工艺条件是：40%浓度的乙醇，1：8的料液比，30min 浸提时间。

关键词：乙醇浸提；超声波；银杏叶；黄酮类化合物；正交试验

Study on the ethanol extraction,ultrasonic Extraction Technology

of Flavanones in Plantago asiaticaL.

Student :Linxi Tutor:Liu Faxiao

Abstract ：The ginkgo tree is one of China's ancient trees, it is a magical medical tree, its leaves, fruits and seeds have a high medicinal value, its pharmacological effects continue to be understanding of the clinical application range is gradually expanding. Ginkgo biloba contains a variety of

ingredients beneficial to human health of the natural activity of flavonoids and bitter lactone.In order to to find a efficience extraction method, a research using ginkgo leaf asiatica L. as raw material of total flavanone was carried out between reflux of alcohol method and enrichment of macroporous adsorption-resin. Compared each way of extraction, the optimum technological conditions is determined, which is 45% alcohol extraction, 1：8 Solid-liquid ratio, extract for 30minute.

Key words：ethanol extraction;ultrasonic wave;ginkgo leaf asiatica L.;flavanone;orthogonal test

文献综述

银杏（Ginkgo Liloba L. ）银杏科，银杏属，俗称白果，公孙树。银杏叶，是银杏科植物银杏的叶，又名白果叶。据《食疗本草》记载，银杏叶可用于心悸怔忡、肺虚咳喘等病症。现代科学研究证明：银杏叶含有200多种药用成分，其中黄酮类活性物质46种，微量元素25种，氨基酸8种。银杏叶提取物具有广泛的药理作用，如肝脏保护作用、抗毒作用、抗肿瘤作用、抗辐射作用、肾脏保护等作用以及抗氧化、促智作用、抗焦虑及镇静作用、调节血脂和减轻缺血再灌注损伤作用等，其中心血管系统和血液系统的保护作用尤为当前的研究热点。随着现代中药化学的不断发展, 从银杏叶中分离出许多有效成分, 揭示了部分传统药效的作用机制, 还发现了许多传统用药所没有的新的药理作用[1]。

1 银杏叶中的化学成分

银杏叶中的成分比较复杂，化学成分主要有黄酮苷类（flavonoidglycosides ）、萜内酯类（terpenes ）、聚异戊烯醇类（polyprenols ）、6-羟基犬尿喹啉酸

（6-hydroxykynurenic acid ,6HKA）、有机酸、银杏酚酸类（phenolic acids）及烷基酚、烷基酚酸、又称银杏酸（ginkgolic acids）、4’-甲氧基吡哆醇（4’-O-methypyridoxine ）等[2]。

银杏叶中黄酮类化合物由黄酮及其苷、双黄酮、儿茶素3类组成。到目前为止已分离出40种黄酮类化合物, 其中黄酮及苷类28种, 由槲皮素、山萘素、异鼠李素、杨梅皮素、木犀草素、洋芹素及其单、双、三糖苷组成, 包括桂皮酰黄酮苷。单黄酮类化合物主要是由山萘素、槲皮素和异鼠李素与各种糖基形成的苷, 它们的结构中均含有5, 7, 4′-三羟基和连接糖基的3-羟基, 而糖基可以是单糖、双糖、三糖, 大多数为葡萄糖和鼠李糖, 其中大多数是槲皮素、山萘素及其苷。

银杏叶中有许多有效成分:银杏叶含有黄酮及其苷、环烯醚萜、苯乙酰咖啡酰糖酯、三萜类、正三十一烷、β-谷甾醇、β-谷甾醇棕酸酯等主要成分。苷(Ⅸ, ⅫAucubin) 、Sepiloganicacid(Ⅹ) 和梓醇(catapolⅩⅢ) [3-4]。

2 银杏叶的药理及药效作用

药理研究表明，银杏叶具有抗氧化活性，抗血小板激活因子、降低血液黏度，改善微循环、改善记忆力，增加脑血流量，保护脑微血管平滑肌细胞、减轻脑损伤，对胃粘膜的保护作用、提高神经可塑性、改善神经退行性疾病等多种药理作

用。 [5]

2.1 银杏叶功效

1．降低人体血液中胆固醇水平，防止动脉硬化。对中老年人轻微活动后体力不支、心跳加快、胸口疼痛、头昏眼花等有显著改善作用

2．通过增加血管通透性和弹性而降低血压，有较好的降压功效。

3．消除血管壁上的沉积成分，改善血液流变性，增进红细胞的变形能力，降低血液粘稠度，使血流通畅，可预防和治疗脑出血和脑梗塞。对动脉硬化引起的老年性痴呆症亦有一定疗效。

4．银杏叶制剂与降糖药合用治疗糖尿病有较好疗效，可用于糖尿病的辅助药。

5．能明显减轻经期腹痛及腰酸背痛等症状。

6．用于支气管哮喘的治疗，也有较好疗效。

7．降低脂质过氧化水平，减少雀斑，润泽肌肤，美丽容颜。

8、预防冠心病心绞痛，银杏叶提取物对预防冠心病心绞痛有明显的作用，可改善心脏血流、保护缺血心肌的功能，可降低胆固醇、甘油三酯、升高高密度脂蛋白，改善血液流变学的某些指标，对预防心脑务管疾病有重要意义，可明显改善冠心病患者的临床症状，如对头晕、胸闷、心悸、气短、乏力均有较好的改善作用。

9、预防高脂血症

银杏叶提取物对高脂血症有预防作用，可明显降低血脂水平，降低中老年人冠心病的发病率。

10、预防脑血管疾病

通过对银杏叶提取物制剂的临床应用，发现它能够改善细胞血液循环、活化细胞代谢，因而对老年痴呆症、脑损伤后遗症、脑血栓等疾病的疗效显著。

11、抗癌作用

银杏叶提取物还能抑制亚硝胺等物质的致癌作用[6]。

综上所述, 中药银杏叶与银杏叶除传统中医用于清热解毒、利水通淋外, 尚有其他一些令人鼓舞的药理活性, 值得我们关注并有待于进一步的研究与开展。 3 黄酮类化合物的药理作用

黄酮类化合物是一大类天然产物, 广泛存在于植物界, 是许多中草药的有效分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇, 其它包括双氢黄(醇) 、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等[7]。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收, 能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能:消除疲劳、

保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能[8]。

3.1 降血脂作用

血脂升高与动脉粥样硬化, 心、脑血管疾病的发生、发展有着密切关系, 而血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度胆固醇(HDL)、肝脏胆固醇和肝脏甘油三酯水平是反映机体脂质代谢的主要指标。戴伟等用含银杏黄酮的饲料喂养大鼠4wk 后, 测得其TC 、TG 、肝脏甘油三酯、肝脏胆固醇含量与对照组相比明显降低。王丽等用银杏叶片联合来适可(氟伐他汀钠胶囊) 治疗肾病综合征高脂血症患者, 结果也发现其具有降低TG 和TC 、升高HDL 和降低低密度胆固醇(LDL)的作用。有很多黄酮类化合物都有很强的抗氧化作用能够软化血管, 改善微循环, 降低血脂。蜂胶中的一种黄酮类化合物还有明显的降血糖和胆固醇的作用[9]。

3.2 清除自由基、抗氧化作用

近年来, 黄酮类化合物的清除自由基、抗氧化作用越来越受到人们的重视。它的清除自由基抗氧化作用是黄酮类化合物许多生理活性的基础。吞噬细胞释放的氧自由基具有强大的杀菌作用, 但过量的氧自由基可引起膜脂质、蛋白质、核酸等的过氧化反应而受损[10]。许多病理生理现象, 如衰老、突变、肿瘤、炎症、变态反映、缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化等都与氧自由基有关, 银杏黄酮类的抗自由基作用, 与黄酮, 黄酮醇为氢的传递体有关; 并与过氧化物歧化酶的辅基血红素中Fe3+螯合, 从而与酶活性被抑制有关。

3.3 抗炎作用

张黎等对二甲苯致炎模型小鼠给予银杏黄酮100mg/kg后, 发现可明显抑制小鼠耳片肿胀; 给予50-100mg/kg治疗后, 也可明显抑制由蛋清诱发的大鼠足爪肿胀。上述实验结果表明, 黄酮对急性炎症有抑制作用, 与文献报道的银杏叶中所含的四羟基黄酮具有的抗炎作用较为一致。同时测定大鼠致炎因子MDA 和NO, 结果其含量均明显降低, 也说明黄酮类化合物能抑制炎性组织中脂质过氧化物的形成[11]。

3.4 增强免疫能力

免疫功能的增强表现为免疫防御、免疫自稳、免疫监视三方面功能的增强。于晓红等研究发现蜂胶黄酮能够增强免疫功能, 提高溶血含量, 增强单核吞噬细胞功能。这说明蜂胶有促进和调节机体体液免疫功能的作用, 并增加机体吞噬细胞的吞噬作用。贺海平等报道黄岑类黄酮能抑制甲酰基甲硫氨酰) 基苯丙氨酸激活的人多

形核细胞和单个核细胞或调理多糖激活的人多形核细胞产生的化学发光（化学发光是中性粒细胞呼吸爆发的标志，与毒性的氧衍生物O 2、H 202、-OH 的形成和释放有关），

浓度在时1.25×10-5×10－4－4时，显著地抑制植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖，这些作用可能与黄芩的抗炎症和抗过敏作用有关系。槲皮素在体外能抑制丝裂源刺激的IgM 、IgG 、IgA 的分泌。杨凤华等发现黄芪水溶性黄酮类能提高免疫功能低下小鼠T 细胞总数，并可恢复至正常水平；能促进刀豆素诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖，且本身具有丝裂原的作用。黄杞总黄酮能明显提高小鼠单核巨噬细胞对碳粒廓清功能。丹贝及大豆异黄酮提取物能抑制胸腺指数下降，提高单核巨噬细胞吞噬功能[12]。

3.5 镇痛作用

有关黄酮类化合物镇痛作用的研究报道较少, 但认为在其抗炎作用的同时有可能伴随镇痛作用。张黎等对同样的二甲苯致炎模型小鼠进行实验, 结果发现黄酮对小鼠热板反应、扭体反应、福尔马林反应等引发的致痛反应有明显的镇痛作用, 其机制可能与黄酮可抑制前列腺素E2(PGE2)的合成和脂质过氧化及促进脑组织中NO 释放有关。

3.6 抗衰老作用

老年人都有神经内分泌免疫网络功能的低下, 衰老与免疫功能的降低程度平

行。下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAA)的激活程度与老年性痴呆的发生率及记忆缺损程度密切相关。糖皮质激素在体外可促进氧化应激诱导的海马神经原死亡。淫羊藿总黄酮对老年大鼠神经内分泌有调节作用, 能明显增加老年大鼠下丘脑和皮质中β内啡肽(β-End) 的含量, 增加雄性老年大鼠血清中促性腺激素(FSH)和睾酮(T)的含量, 并增加IL-2、NK 细胞的活性, 证实淫羊总黄酮提高神经内分泌系统的整体功能而抗衰老, 与文献报道一致。随着机体老龄化, 下丘脑单胺类神经递质的量和动力学都有变化。淫羊总黄酮能提高老年大鼠下丘脑中单胺类神经递质NE 、DA 、5-HT 等的含量, 说明淫羊总黄酮对自然衰老动物下丘脑神经递质老年性变化有延缓作用。明亮、张艳、周兰兰等的研究发现, 银杏叶提取物能明显改善NaNO2造成的老龄前期小鼠和环磷酰胺诱导的小鼠学习记忆障碍, 利用原代培养的大鼠脑皮质神经细胞, 发现银杏叶提取物能增强神经细胞活力, 减少乳酸脱氢酶(LDH)释放, 减轻细胞核形态的改变及DNA 的断裂, 对神经细胞凋亡有抑制作用。有报道, 从银杏叶、夏枯草提取的黄酮能有效改善阿茨海默等退行性病变。目前已有银杏黄酮抗衰老化妆品面市。

3.7 护肝作用

目前已从多酚化合物中分离到的包括芒柄花黄素和颜料木素为主的共11种异黄酮类组分, 动物实验表明它们具有显著的保肝作用。研究保肝作用的一种常用动物模型是CCl4急性肝损伤模型。CCl4进入肝细胞后, 经肝微粒体细胞色素P-450酶激活后生成CCl3, 引起肝微粒体脂质过氧化反应, 损伤肝细胞膜的结构和功能, 导致肝脂变和肝坏死, 在血清中表现为转氨酶活性升高、TP 和Alb 含量下降。研究结果为动植物细胞工程技术可持续发展提供了理论依据。为异黄酮类物质作为保肝食品添加剂提供了实验依据, 其应用正在进一步研究[13]。

3.8 抗HIV 作用

研究发现，天然产物中的不同的黄酮类物质可以作用于HIV 的逆转录酶、整合酶、蛋白酶、启动子等关键部位，从而影响HIV 的合成。相对于现有的抗AIDS 药物, 黄酮是在自然界中分布广泛，呈现多种药理活性。具抗HIV 活性的天然黄酮类化合物具有结构多样性的特点，尤其是黄酮昔类，有单糖昔、双糖昔、多糖昔等，而且活性也更加显著。此外，黄酮类化合物的生物活性多样，使其可与其他的抗HIV 药物联合用药以克服该药物不良反应。然目前尚没有黄酮类抗HIW 药物应用于临床，然而与已批准上市的抗HIV 其他药物相比，天然黄酮类化合物活性明确，而且还具有全新的抗HIV 机制，这将为寻找和研发新型的抗HIV 药物提供新的途径和有益的启示。

3.9 其他作用

中药营实中的营实苷A 有止泻作用。异甘草素及大豆素均有类似罂粟碱解除平滑肌痉挛的作用。大豆苷、葛根黄素等葛根黄酮类成分可以缓解高血压患者的头痛等症状。此外有些黄酮类化合物具有止咳、平喘的作用。银杏黄酮对大鼠应激性溃疡有保护作用。植物黄酮类有抗糖尿病及其并发症的作用。黄酮类化合物对中枢神经系统具有多种生物活性, 其中以抗抑郁和抗焦虑等精神调节活性为主, 其作用机理涉及多种神经递质和途径。近来的研究证明蕨菜黄酮具有解铅中毒的作用[14]。 4 中草药有效成分常用的提取分离方法

4.1 溶剂提取法

4.1.1 溶剂提取法的原理

根据植物样品含有的各种化学成分在提取溶剂中的溶解度差异，选择对所要提取得成分即目的物质的溶解度大，而对其他无关成分通称杂质溶解度小的溶剂，将目的物质从植物组织中溶解出来的一种分离方法。根据“相似相容”原理，不同极

范文二：银杏叶黄酮的提取

本科生毕业论文(设计)

题目 : 银杏叶黄酮的提取研究姓名 : 石贤龙学院 : 生命科学学院专业 : 生物技术班级 : 07级 3班学号 : 1336070325

指导教师 : 孙玉军职称 : 副教授

2011年 06月 03 日安徽科技学院教务处制

摘要 ?? ?? ?? ?? ? ?? ?? ?? ?? ? ?? ?? ?? ?? ? ?? ?? 1 关键词? ?? ?? ?? ? ?? ?? ?? ?? ? ?? ?? ?? ?? ? ?? ?? 1 引言 ?? ?? ?? ?? ? ?? ?? ?? ?? ? ?? ?? ?? ?? ? ?? ?? 1 1材料与方法???????????????????????????? 2 1. 1 试验材料???????????????????????????? 2 1. 1. 1 银杏叶?????????????????????????????? 2 1. 1. 2 试剂??????????????????????????????? 2 1. 1. 3 仪器??????????????????????????????? 2 1. 2 试验方法 ?????????????????????????????? 2 1. 2. 1标准曲线的制备 ?????????????????????????? 2 1. 2. 2银杏叶总黄酮提取率计算方法 ???????????????????? 2 1. 2. 3银杏叶总黄酮的提取工艺 ?????????????????????? 2 1. 2. 4单因素试验 ???????????????????????????? 3

1. 2. 5正交试验 ????????????????????????????? 3

2结果与分析?????????????????????????????? 3 2. 1标准曲线 ?????????????????????????????? 3 2. 2单因素试验分析最佳酶解条件????????????????????? 4 2. 2. 1酶解温度的确定 ?????????????????????????? 4 2. 2. 2酶浓度的确定 ??????????????????????????? 5 2. 2. 3酶解时间的确定 ?????????????????????????? 5

2. 3最佳提取条件的确定 ????????????????????????? 6

3讨论? ?? ?? ?? ? ?? ?? ?? ?? ? ?? ?? ?? ?? ? ?? ?? 6 4结论 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 7 致谢????????????????????????????????? 7 参考文献?????????????????????????????? 7 英文摘要?????????????????????????????? 8

银杏叶黄酮的提取研究

07生物技术(3)班石贤龙

指导老师孙玉军

摘要:本旨在对银杏叶黄酮的提取工艺进行优化以及探讨最佳提取条件,试验以纤维素酶液,弱碱性乙醇溶液为提取液,采用酶解醇提相结合的方法,并与传统的单独酶解和单独醇提相对照,研究不同的酶解因素对银杏叶中黄酮提取率的影响。试验中对酶解温度,纤维素酶液浓度。酶解时间做了单因素试验,并在此基础上做了正交试验,找出了最佳提取条件为酶解温度 50℃,酶液浓度 0.3mg/ml,酶解时间 2.0h 。其提取率为 4.78%,与传统的提取方法相比,银杏叶黄酮的提取率有较大提高。

关键词:银杏叶;黄酮;纤维素酶;醇提

银杏(Ginkgo biloba ) ,别名白果、公孙树,属裸子植物,和它同门的所有其他植物都已灭绝,被称为“孑遗植物”。银杏树是我国古老的树种,它是神奇的医疗之树, 其叶、果实、种子均有较高的药用价值,而银杏叶在以往的本草之类药书中记载较少, 直到 20世纪 60年代, 国内外学者开发和筛选天然药物时才发现银杏叶可贵的药用价值, 在我国第 2000年版药典 (一部 ) 中,银杏叶已作为法定药物载入,谓其:性味甘、苦、涩、平,归心肺经,功能敛肺、平喘、活血化瘀、止痛,用于肺虚咳喘、冠心病、心绞痛、高血脂,药物学家在对银杏叶的研究中十分惊喜地发现,一片小小的银杏叶,所含成分之多,药理活性之强大出人们意料。

银杏叶中有重要药理活性作用的成分有两大类:银杏黄酮和银杏苦内酯。其中银杏黄酮具有许多重要的药理作用 [1]。 (1)银杏叶黄酮类化合物能扩张血管,增加外周血液循环的血流速度,降低血胆固醇,改善胆固醇和磷脂比例,抑制血栓的形成; (2)能促进大脑循环代谢,改善记忆功能; (3)具有抗菌消炎,抑制致癌启动因子 ( TPA) 及治疗过敏症和老年痴呆病等作用; (4)它能清除皮肤表面的过氧化物和自由基,减少黑色素的形成,延缓皮肤的衰老过程。银杏叶黄酮类化合物除用于医药和化妆品上外,近年来又拓展到食品、饮料和防治农作物病虫害等方面。

既然银杏叶黄酮有如此多的用途,那么进一步开发利用银杏叶具有重要意义。目前银杏叶黄酮的提取方法主要有 [2]:溶剂提取法,超临界流体萃取法(SFE 法) ,高速逆流色谱技术提取法(HSCCC ) ,微波提取法,超声提取法,酶提取法,分子烙印技术。因溶剂提取法操作简单,所需试剂廉价易得,故通常使用此法来进行大规模生产。

传统的提取工艺流程为 [3]:

银杏叶—→粉碎—→ 60%乙醇提取—→过滤—→滤液浓度—→提取物—→乙醇溶解 —→过滤—→滤液—→蒸馏—→提取物

本试验在此基础上改进工艺流程为:

银杏叶—→粉碎—→酶水解浸提—→ NaOH-乙醇浸提—→离心—→过滤—→二次醇提—→离心—→过滤—→蒸发浓缩 —→干燥—→提取物

1. 材料与方法

1. 1试验材料

1.1.1银杏叶

2010年 11月初采摘于安徽科技学院银杏路。

1.1.2试剂

纤维素酶, BR ,酶活力≥ 15000.0(U/g),国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇, AR ,上海振企化学试剂有限公司; NaOH , AR ,国药集团化学试剂有限公司;芦丁, BR , 国药集团化学试剂有限公司; NaNO 2, AR ,上海建信化工有限公司试剂厂。

1.1.3仪器

分析天平; HH-S 恒温水浴锅, 江苏国胜试验仪器厂; TDL-5离心机, 0~50×100rpm ; R205B 旋转蒸发仪;干燥箱;紫外分光光度计。

1. 2试验方法

1.2.1标准曲线的制备 [4]

精确称取芦丁 10mg(120℃烘至恒重 ) ,置 50mL 容量瓶中,以 30%乙醇溶解定容,即为 0.2mg/ml芦丁标准液。精确吸取 0、 1、 2、 3、 4、 5mL 分别置于编号为 1、 2、 3、 4、 5、 6的 10mL 具塞试管中, 以 1号作为对照组, 各加 30%乙醇 6mL , 先加 5%NaNO2溶液 0.3mL 摇匀,放置 6min ,再加 10%Al(NO3) 3溶液 0.3mL 摇匀,放置 6min ,加 4%NaOH溶液 2mL , 用 30%乙醇稀释至 10mL ,放置 15~20min ,在波长 510nm 处测定各试管中溶液的吸光度 (1号做空白 ) 以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘出标准曲线图,并得回归方程。 1.2.2银杏叶总黄酮提取率计算方法 [5]

精确称取提取物样品 0.5g ,用 30%乙醇溶液溶解,定容于 100mL 的容量瓶中,吸取 1mL 置于 10mL 具塞试管中,以 30%乙醇溶液作为空白对照,以下操作同标准曲线制作, 由对应的吸光度标准曲线查出相应浓度,并计算提取物样品总黄酮含量。

银杏叶总黄酮提取率 (%)=[提取物所含黄酮质量 (g)/银杏叶质量 (g)]×100%。 1.2.3银杏叶总黄酮的提取工艺 [6,7]

(1)酶解 :称取银杏叶粉末 5g , 液置于具塞锥形瓶中, 加入酶液, 在不同酶解条件下进行酶解;

(2)一次醇提 :在酶解液中加入弱碱性乙醇溶液 100mL(0.1g NaOH溶于 100ml 的 90%乙醇溶液 ) ,醇提 1h ;

(3)离心:在 3500r/min下离心 10min ;

(4)过滤:真空抽率,滤液收集;

(5)二次醇提:滤渣用弱碱性乙醇溶液进行二次醇提;

(6)浓缩:合并滤液并浓缩得浸膏;

(7)干燥;

(8)测定含量。

1.2.4单因素试验 [8]

1.2.4.1不同酶解温度对黄酮提取率的影响

称取 5g 银杏叶粉末 4份,各加入 100mL 浓度为 0.2mg/mL的纤维素酶溶液,分别置于 30、 40、 50、 60℃的恒温水浴锅中酶解 1.0h ,按 1.2.3银杏叶黄酮的提取工艺路线进行提取,并计算黄酮提取率。

1.2.4.2 不同酶液浓度对黄酮提取率的影响

称取 5g 银杏叶粉末 4份,分别加入 100mL 浓度为 0.1mg/mL, 0.2mg/mL, 0.3mg/mL, 0.4mg/mL的纤维素酶溶液,再置于 40℃的恒温水浴锅中酶解 1.0h ,按 1.2.3银杏叶黄酮的提取工艺路线进行提取,并计算黄酮提取率。

1.2.4.3 不同酶解时间对黄酮提取率的影响

称取 5g 银杏叶粉末 4份,各加入 100mL 浓度为 0.2mg/mL的纤维素酶溶液,置于 40℃ 的恒温水浴锅中分别酶解 0.5h , 1.0h , 1.5h , 2.0h ,按 1.2.3银杏叶黄酮的提取工艺路线进行提取,并计算黄酮提取率。

表 1 正交试验因素水平

Table 1 the levels of orthogonal experiments factors

水平酶解温度 A(℃ ) 酶浓度 B(mg/mL) 酶解时间 C(h)

1 30 0.1 0.5

2 40 0.2 1.0

3 50 0.3 1.5

4 60 0.4 2.0

1.2.5正交试验 [9]

通过对影响银杏叶提取率的几个因素:酶解温度,酶浓度,酶解时间的试验研究, 确定了各个单因素的最佳条件。在此基础上,进一步设计了三因素四水平 L16(43) 的正交试验来确定最佳试验条件 [10]。所选因素水平见表 1。

2结果与分析

2. 1标准曲线

根据芦丁比色法测得吸光值如表 2,由吸光值绘制芦丁标准曲线见图 1。

表 2 葡聚糖标准曲线的测定结果

Table 2 Dtermination results of rutin standard curve

编号 1 2 3 4 5 6 芦丁浓度 (mg/mL) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 吸光值 (A510nm) 0 0.117 0.210 0.293 0.359 0.443

根据表 3,可绘制芦丁标准曲线,得出回归方程为 y=4.32x+0.021, R 2=0.9915。

图 1 标准曲线 Fig.1 standard curve

2. 2单因素试验分析最佳酶解条件 2.2.1酶解温度的确定

不同酶解温度对银杏叶黄酮提取效果的影响见图 2

图 2 不同酶解温度对提取率的影响

Fig.2 Effect of different zymolysing temperature on the extraction rate

由图 2可知,在一定温度范围内,随着提取温度的升高总黄酮提取率明显增大, 当提取温度为 50℃时,总黄酮提取率达到最大值 3.14%,继续升温总黄酮提取率反而下降。这可能是由于温度升高,纤维素酶的活性增强,促使叶片的细胞壁快速水解,提取效率增加;但温度过高,纤维素酶被逐渐灭活,活性下降,细胞壁的水解程度降低,因而提取效果也相应降低,具体原因还需进一步探讨。

2.95

3.003.05

3.103.150

温度

C=0.2295A -0.0044

R 2 = 0.9915

0.000

0.1000.2000.3000.4000.5000.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

C(浓度mg/ml)

A(吸光度)

2.2.2酶浓度的确定

不同酶浓度对银杏叶黄酮提取效果的影响见图 3

图 3 不同酶浓度对提取率的影响

Fig.3 Effect of different enzyme concentration on the extraction rate

由图 3可知 , 在一定范围内,随着酶浓度的增大总黄酮提取率明显增大,当使用的酶浓度为 0.2mg/mL时, 得到的黄酮最多, 提取率为 3.36%, 但继续增加纤维素酶的浓度总黄酮提取率略有下降。原因可能是随着酶浓度的增大,底物与酶的结合更加充分,随着细胞壁被破坏,叶片内容物的溶出率也就增大,因此总黄酮的提取率增大;随着酶浓度的进一步增加,提取率反而下降有可能是因为酶浓度太高使得酶的活性下降。 2.2.3酶解时间的确定

不同酶解时间对银杏叶黄酮提取效果的影响见图 4

图 4 不同酶解时间

Fig.4 Effect of zymolysing time on the extraction rate

由图 4可知,在一定范围内,随着酶解时间的延长,总黄酮提取率明显增大,提取时间达到 1.5h 时黄酮提取率达到最大值 4.00%, 继续延长提取时间, 总黄酮提取率变化不明显,其原因可能是此条件下银杏叶细胞壁的破坏程度已达到最大化,再延长酶解时间对提取效率的影响不大。故实际提取中应以 1.5h 为宜。

2.95

3.003.053.103.153.203.253.303.353.400.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

提取率酶浓度

0.00

0.501.001.502.002.503.003.504.004.500.0

0.5

1.01.52.02.5

酶解时间

提取率

2. 3最佳提取条件的确定

表 3 正交试验结果与分析

Table 2 the results and analysis of orthogonal experiments

设计号 A (酶解温度) B (酶液浓度) C (酶解时间) 提取率 (%)

2 1 2 2 3.36

3 1 3 3 4.51

4 1 4 4 4.57

5 2 1 2 3.05

6 2 2 3 4.28

7 2 3 4 4.69

8 2 4 1 2.19

9 3 1 3 2.65 10 3 2 4 4.09 11 3 3 1 4.46 12 3 4 2 3.98 13 4 1 4 3.51 14 4 2 1 4.50 15 4 3 2 4.61 16 4 4 3 4.33 K1 3.808 3.000 3.965

K2 3.553 4.058 3.750

K3 4.238 4.568 3.463

K4 3.795 3.768 4.215

通过正交试验分析,由极差值 R 可见,酶浓度对银杏叶黄酮提取效果的影响最为显著,酶解温度和酶解时间对提取效果的影响相差不大,但都没有酶浓度的影响大。正交试验结果说明在以纤维素酶溶液对银杏叶进行酶解提取时,最佳酶解条件为 A 3B 3C 4,即在酶解温度为 50℃, 纤维素酶溶液的浓度为 0.3mg/mL时, 酶解 2.0h 为试验条件较合适。为了验证正交试验结果,对水平搭配 A 3B 3C 4进行了 3次平行试验,试验测得总黄酮提取率均介于 (4.78±0.25)%之间,结果能重复,表明试验工艺条件稳定可靠。

3. 讨论

银杏叶粉末经纤维素酶的处理,组成其细胞壁的纤维素即被酶水解,细胞壁遭到破坏,减少了细胞内的内容物向水解液中的扩散阻力,从而增加了内容物的溶出率,进而提高了银杏叶黄酮的提取率。

在不同酶解温度试验中,提取率先随温度的升高而增大,达到最大提取率时又随温度的升高而减小,这可能是因为在一定温度范围内,纤维素酶的活力随温度的升高而增强,致使提取率增大,而达到最适温度后,酶逐渐失去活性,导致提取率下降。

在不同酶液浓度试验中,提取率先随酶浓度的升高而增大,达到最大提取率时又随酶浓度的升高而减小,这可能是因为在一定酶浓度范围内,酶解效率随酶浓度的增加而增强,致使提取率增大,而达到最适酶液浓度后,提取率下降,可能是酶浓度太大反而导致酶解效率降低。

在不同酶解时间试验中,提取率先随酶解时间的增长而增大,达到最大提取率时又

随酶解时间的增长而减小,这可能是因为在一定时间范围内,随时间的延长,溶于酶解液中的黄酮含量逐渐增加,而达到一定时间后,提取率基本不变或者稍微下降,这可能是长时间酶解使得溶出的黄酮有进入细胞,提取率反而略有下降。

银杏叶黄酮常规的提取方法是用 60%乙醇提取,考虑到黄酮呈酸性,在碱性溶液中溶解度增大,故试验中采用弱碱性的 NaOH —乙醇溶液(用 0.1%NaOH溶液与 90%乙醇溶液等体积混合配制而成) ,通过与对照组单纯的醇提(提取率为 3.15%)相比较,提取率较传统工艺有很大提高。

4. 结论

本试验采用酶解醇提相结合的方法提取银杏叶黄酮,酶解正交试验中,所得较佳酶解条件为在酶解温度为 50℃, 纤维素酶溶液的浓度为 0.3mg/mL时, 酶解 2.0h 的提取条件下,银杏叶总黄酮提取率可达 4.78%,并且此提取工艺条件稳定可靠。

致谢 :

在进行此项试验的整个过程中,我因学识有限,在设计试验方案、查找文献以及仪器使用等方面遇到诸多问题,在孙玉军老师的指导和陈珊珊同学的帮助下,我克服了一个个难题,最终完成了整个试验,几个月以来,导师严谨的治学态度,可敬可亲的待人之道给我留下了深刻的印象,使我受益良多,在此,我表示衷心的感谢!也向所有指导、帮助和鼓励过我的老师和同学致以诚挚的谢意!

参考文献 :

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[4] 张梦军 , 覃仁辉 , 聂金媛 , 等 . 从银杏叶中提取银杏黄酮甙的工艺比较及试验优化 [J].第三军医大学学报 ,2004,26(14):12-16.

[5] 江德安 , 肖前春 . 乙醇 +NaOH提取银杏叶黄酮方法的研究 [J].林业科技 ,2005,30(6):38-41. [6] 赵钟兴 , 王飞 , 韦藤幼 , 等 . 解吸 -热提两步法提取银杏叶中的黄酮研究 [J].广西科学, 2005,12(2):76-79.

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Study on The Extracting Technology of Flavonoids

in Ginkgo Biloba Leaves

Student majoring in Biotechnology Shi Xianlong

Tutor Sun Yujun

Abstract: The experiment was designed to optimize the extraction process and discuss the best extraction conditions of flavonoids in ginkgo biloba leaves, the cellulose enzyme and alkalescent ethanol solution were used, and the methods of zymolysing and ethanol-extraction were combined within the experiment. and compared with the traditional methods of simple zymolysing or individual ethanol-extraction. Inaddition,the influence of different enzyme solution factors to the extraction effect of flavonoids in ginkgo biloba leaves was studied. Trials of enzyme solution temperature, cellulose liquid concentration, zymolysing time were did as single factor experiment. And the factors under optimum experimental conditions were found, when compared with the traditional method,the extract effect of flavonoids in ginkgo biloba leaves was greatly improved, and on the basis of that experiment orthogonal experiments were did, and the best extraction conditions were found.

Key words: ginkgo biloba leaves; flavonoids; Cellulose enzyme; ethanol-extraction

范文三：从银杏叶中提取银杏黄酮的研究

从银杏叶中提取银杏黄酮的研究

3 李艳丽黄强班春兰蒋元力

()郑州大学化工学院 , 河南郑州 450002

摘要 : 采用水 2乙醇作提取溶剂回流提取了银杏叶中的银杏黄酮。设计正交实验确定影响提取银杏黄酮的

显著因素为料液比、乙醇浓度、提取温度。单因素实验确定提取工艺的最佳条件为料液比 1 ?10,乙醇浓度 70% ,提

取温度 70?,粒度 40,80目 ,回流提取时间为 2 h。银杏黄酮的提取率达到 8615% 。

关键词 : 银杏黄酮 ; 乙醇 ; 提取

S tudy on Ex tra c t in g G in kgo F la von e G lyco s ide from L ea ve s of G in kgo

L I Yan 2li, HUAN G Q iang, BAN C hun 2lan, J IAN G Yuan 2li

( )Co llege of Chem ica l Enginee ring, Zhengzhou U n ive rsity, Zhengzhou 450002, Ch ina A b stra c t: Ginkgo flavone glyco side is extrac ted from leave s of ginkgo unde r reflux w ith wa te r and a lcoho l. The key

fac to rs fo r extrac tion p roce ss, such a s the ra tio of feed stock to so lven t, a lcoho l concen tra tion and extrac tion temp e ra tu re, a re

confirm ed by o rthogona l exp e rim en t. The op tim um cond ition s a re a s fo llow s: the ra tio of feed stock to so lven t is 1 ?10 , a lco2

ho l concen tra tion is 70% , extrac tion temp e ra tu re is 70 ?, size of leave s is 40,80 m e sh and the extrac ting tim e is 2h. The

ra te of extrac tion is up to 8615 %.

Key word s: ginkgo flavone glyco side; e thano l; extrac tion

) () () 近 10 年来 ,银杏叶的研究开发成为国内外瞩目 ;无水乙醇分析纯 ,硝酸铝分析纯 ; 柯仪器厂

的热点。目前国际上公认的银杏叶制剂的含量标准 (银杏叶黄酮类化合物提取物上海双基药业有限公为黄酮类化合物 ?24 % ,银杏内酯 ?6 % ,银杏叶开 ) 司。

发研究的关键是如何提高银杏叶提取物的质量。采 1. 2 工艺流程

用树脂法进行分离 ,不仅可以克服传统提取方法溶称取一定质量的银杏叶末 ,加入乙醇中 ,在一定〔1 〕剂残留、费用高、得率低等的缺点,而且能大大提的物料配比、温度、时间、乙醇浓度、pH 值、搅拌速度高银杏叶提取物中的黄酮含量 ,且操作简单 ,溶剂损及粒度下 ,加热回流 ,冷却 ,抽滤 ,得滤液。〔2,5 〕耗少。 1. 3 分析方法银杏黄酮提取液中黄酮含量提高是黄酮含量增〔6 〕 λ产品的分析方法采用分光光度法。在 = m ax 加的关键 ,也是银杏黄酮提取量提高的最基本一步。

415 nm 时测定吸光度 ,做工作曲线 ,得到黄酮类物质本文采用水 2乙醇溶液进行银杏叶提取 ,测定了提取

的浓度。液中黄酮含量 ,从而确定了提取工艺的最佳条件。

2 结果与讨论 1 实验

2. 1 提取银杏黄酮收率 1. 1 仪器和材料

提取银杏黄酮收率 Y的计算公式如下 : (UV 22102 PC型紫外可见分光光度计上海尤尼

3 收稿日期 : 2005212 212

作者简介 : 李艳丽 ,女 , 2003级在读硕士研究生 ,研究方向为精细化工与化学制药。

〃21〃 2006 年 2 月 21 日李艳丽 , 等 : 从银杏叶中提取银杏黄酮的研究

C 3 503 V 液提取时间为 2 h, 对显著性影响因素做单因素试 Y = m 3 10003 5154% 验。 V —提取液的体积 , mL 2. 3. 1 物料配比的影响 m —每次称取的银杏叶质量 , g (在 70 ?、乙醇浓度为 50 %的条件下 ,选取 m 银 (索氏回流提取银杏总黄酮含量为 5154 % 以干 ) () 杏叶 : m 乙醇 = 1 ?5、1 ?7、1 ?9、1 ?10、1 ?11 的条 ) 叶计。 () () 件 ,考察 m 银杏叶 ?m 乙醇对银杏叶中总黄酮 2. 2 正交试验含量的影响。不同物料配比的提取结果见表 4。 () () 选取 m 银杏叶 : m 乙醇、温度、时间、乙醇表 4 不同物料配比的提取结果浓度、pH 值、搅拌速度及粒度 7个因素 ,选择影响银

体积浓度提取率杏叶总黄酮提取效果各因素中有意义的 2个水平做 () ()m 银杏叶 ?m 乙醇吸光度 ()/mL / m g /mL / % 正交试验 ,并对结果进行极差分析 ,得出影响提取率 1820 11708 10 24 00371 ?5 显著性因素。提取条件研究的因素位级见表 1 , 正 1 ?7 01689 011432 6416 50 交试验结果见表 2。提取因素级差分析表见表 3。 1 ?9 01595 011234 7911 71 表 1 提取条件研究的因素位级 1 ?10 01557 011154 8514 82

pH 温度时间乙醇浓搅拌粒度 1 ?11 90 01513 011061 8612 () ()m 银杏叶 ?m 乙醇值 / h / ? /目度 / % 速度

40 50 1 5 50 1 ?5 慢 () () 从表 4可见 ,在 m 银杏叶 ?m 乙醇 1 ?11 时 1 ?9 快 70 3 8 70 80 总黄酮得率最高 ,但 m (银杏叶 ) ?m (乙醇 )为 1 ?10

() ()时的提取率与 m 银杏叶 ?m 乙醇为 1 ?11时相差 2 正交试验结果表不大 ,从节省原料的角度考虑 ,本试验选取 1 ?10 为

()体积 /mL 吸光度提取率 / % 浓度 / m g /mL () () 最佳提取 m 银杏叶 ?m 乙醇。

40 01360 1076 197 0252. 3. 2 乙醇浓度的影响 38 01363 01077 25100 在 m (银杏叶 ) ?m (乙醇 ) = 1 ?5 ,温度 70 ?下 , 45 00341424 1090 160

40 01434 01093 31178 考察乙醇浓度为 50 % 、60 % 、70 % 、80 % 、90 %的条

100 01414 01088 75119 件下对银杏叶中总黄酮提取率的影响。不同乙醇浓 112 01376 01080 76156 度提取结果见表 5。 109 01380 01081 75144 表 5 不同乙醇浓度提取结果 103 01420 01090 79120

() 乙醇浓度 / % 体积 /mL 吸光度浓度 / m g /mL 提取率 / % 表 3 提取因素级差分析表 1840 11750 15 005050 32 M1 j M2 j R j 01822 011712 4914 60 32 10477 11193 10716 1 00001943 011967 5816 70 33 010809 010861 010052 2 01706 011467 4510 80 34 3 010818 010852 010034 4 010843 010827 010016 01697 011449 3513 90 27 010862 010808 010054 5

6 010846 010824 010022 从表 5 可见 , 在乙醇浓度70 %时 , 银杏叶总黄 0 7 010835 010835 酮提取率达最大值。

由表 3可知 , 1、2、5 所代表的因素极差分别为2. 3. 3 提取温度

010716、010052、010054 ,影响最大 ,所以显著性影响选取温度 79 ?、70 ?、65 ?、60 ?、50 ?的条件 ,

() () 因素为 : m 银杏叶 ?m 乙醇、乙醇浓度、提取温考察温度对银杏叶中总黄酮含量的影响 ,不同温度度。下提取结果见表 6。

2. 3 单因素试验从表 6可见 ,温度为 70 ?时银杏叶黄酮提取率

每次称取粒度为 40 ,80 目银杏叶 10 g,中性溶最大 ,为 8615 % 。

〃22〃精细与专用化学品第 14卷第 3 /4

期

表 6 不同温度下提取结果 () () 银杏叶 ?m 乙醇 = 1 ?10、70 %乙醇、温度 70 ?、

温度提取率体积浓度回流 2 h。此工艺操作简便 , 提取全过程使用的化吸光度 () ()m 银杏叶 ?m 乙醇 () /mL / m g /mL / % / ? 学药品和溶剂对环境无污染 , 使用的乙醇可回收蒸 1571 11183 18 79 81 00681 ?10 馏后重复使用 , 故提取成本较低 , 适宜于工业化生 1 ?10 01473 010977 8615 70 78

产。 ? 1 ?10 01477 010985 7210 65 81

1 ?10 01480 010992 7116 60 80 参考文献 1 ?10 50 83 01511 017919 7912

〔1 〕姚渭溪. 银杏叶中活性成分的提取工艺、测定及其进展〔J 〕. 中 2. 4 放大实验草药 , 1995 , 26 ( 8 ) : 157 ,159 为了进一步确定乙醇浓度对总黄酮提取率的影〔2 〕卢锦花 ,胡小玲 ,岳红. 吸附树脂提取分离银杏提取物的研究进响及实验放大后的效果 ,每次称取 30 g银杏叶 ,在 m ( ) 展〔J 〕. 化工进展 , 2001 , 3 : 1 ,2

〔3 〕何琦 ,及元乔 ,丁立生 , 等. D140 大孔吸附树脂银杏黄酮提取纯 () () 银杏叶 ?m 乙醇 = 1 ?10、提取时间 2 h、温度控制

( ) 化性能的研究〔J 〕. 天然产物的研究与开发 , 2000 , 13 1 : 56 在 70 ?,在乙醇浓度分别为 50 %及 70 %下测定银〔4 〕韩金玉 ,李海静 ,楮巧伟 , 等. 天然产物银杏内酯研究进展〔J 〕. 杏叶的提取率 ,结果显示 , 在 70 %乙醇浓度下银杏化工进展 , 2000 , ( 2 ) : 23 黄酮提取率最高 ,为 8416 % 。〔5 〕姜国芳 ,谢宗波 ,乐长高. 银杏叶黄酮类化合物的研究进展〔J 〕.

时珍国医国药 , 2004 , 15 ( 5 ) : 306 3 结论〔6 〕刘成梅 ,游海. 天然产物有效成分的分离与应用〔M 〕. 北京 : 化学

乙醇法提取银杏叶黄酮的优化提取条件为 m 工业出版社 , 2003 , 174

()97 %以上的产品。得纯度为上接第 19 页

2. 5 溶剂用量的选择 3 结论反应条件确定后 ,改变溶剂用量 ,以确定溶剂的

利用盐酸羟胺与乙酸乙酯反应可合成出乙酰氧 () (适宜用量。分别实验 V 甲醇水溶液 ?V 乙酸乙 () (肟酸 ,较佳的工艺条件是 : n 盐酸羟胺 ?n 乙酸乙 ) 酯 = 2 ?1、213 ?1、312 ?1、415 ?1、515 ?1 的溶剂体系 , ) 酯 = 1 ?111 ,反应时间为 2 h,反应温度为 27,33 ?, 溶剂用量对产品产率和纯度的影响见表 2。所得 AHA 产率 84 % ,纯度 97 % 。

% 表 2 溶剂用量对产品产率和纯度的影响很多溶剂体系都可作为盐酸羟胺与乙酸乙酯的

() ()反应体系 ,效果较好的为碱性的甲醇水溶液体系 ,当 V 甲醇水溶液 ?V 乙酸乙酯产率产品纯度

() () V 甲醇水溶液 ?V 乙酸乙酯 = 213 ?1 时 ,产品的 95 83145 ?1 2

213 ?1 8212 97 产率及纯度均较好。选用乙酸乙酯作为萃取溶剂

312 ?1 6515 97 较经济、可行。 ? 415 ?1 6013 97

515 ?1 97 4515 参考文献

() (由表 2可看出 ,当 V 甲醇水溶液 ?V 乙酸乙〔1 〕王加启. 瘤胃微生物脲酶抑制剂的合成与应用〔P〕. CN1210853 酯 ) = 213 ?1时 ,产品的产率及纯度均较好。〔2 〕马新华 ,孔宪铭. 乙酰氧肟酸的制备工艺〔P〕. CN1384097A 2. 6 萃取溶剂的选择〔3 〕曾伟 ,曾贵玉 ,秦圣英. 异羟肟酸的合成与应用研究新进展〔J 〕.

有机化学 , 2003 , 23 ( 11 ) : 1213 ,1218 盐酸羟胺与乙酸乙酯反应生成 AHA 的同时 ,也

〔4 〕H a rryzy. the H yd roxam ic A c id〔J 〕. Chem. R ev, 1943 , 33: 209 ,249 有大量的盐生成 ,经过真空蒸发浓缩结晶后 ,盐与产〔5 〕宁国辉 ,刘树庆 ,张笑归. 脲酶抑制剂的研究进展〔J 〕. 河北农品混合 ,需选用合适的溶剂用以萃取提纯。经过多 ( ) 业大学学报 , 2003 , 26 : 137 ,138 次实验 ,选用热的乙酸乙酯作为萃取溶剂 ,经多次萃 ( ) ( ) 〔6 〕郑卫芳 ,常志远. 乙异羟肟酸的合成及其与 Pu ?, Np ?配取 ,并浓缩萃取剂 ,使 AHA 在低温时结晶析出 ,且精 ( ) 合物稳定常数的测定〔J 〕. 核化学与放射化学 , 2001 , 23 1 :

1 ,6 馏回收的乙酸乙酯可作为下次反应的原料 ,此法可

范文四：银杏叶中黄酮类化合物的提取

分离工程期末论文

银杏叶中黄酮类化合物的提取

THE EXTRACTION OF FLAVONOIDS IN THE LEAVES OF GINKGO BILOBA

学院：化学工程学院专业班级：化学工程与工艺化工081 学生姓名：周露学号： 050811113 指导教师：戴卫东（副教授）

2011年6月

1 绪论

银杏树Ginkgo bilobaL.又称白果树、公孙树,是我国古老的树种之一, 具有“活化石”的美称。由于其生长规律特殊,抗病能力强而受到国内外的重视[1]。有关银杏叶的有效成分及疗效的研究日益受到重视,已开发出保健品、化妆品、药品等多达100多种,形成国际市场上销售额20多亿美元的新兴产业[2]。银杏叶的化学成分有黄酮类、萜类、内酯类、酚酸类以及生碱、聚异戊二烯等化合物。黄酮类为银杏叶的主要有效成分之一,含量随品种、产地、树龄、不同的采摘时间而不同[3]。黄酮类化合物优异的抗氧化、抗病毒、防治心血管疾病、增强免疫力等作用而受世人瞩目。药学研究表明,有38种银杏黄酮类化合物从银杏叶中分离出来,其中黄酮类化合物主要有3类:黄酮(醇)及其苷28种:如槲皮黄酮等;黄烷醇类:如儿茶素等4种;双黄酮:如白果双黄酮等6种(儿茶素)[4]。 1 膜分离法

1.1 膜分离法

超滤是新兴的分离纯化技术，是利用膜的孔径特征，以物理手段将不同大小的分子进行分离，具有在分离过程中被分离成分稳定、分离率高、耗能低、无二次污染等优点[5]，目前在食品、生物、医药以及化工领域使用较多。

1.2 原料、仪器与设备

银杏叶:江苏邪州港上镇市售;芦丁标准品:上海化学试剂公司产品;无水乙醇:上海振兴化工一厂产品.722型光栅分光光度计:上海第三分析仪器厂产品;真空旋转蒸发仪:上海申顺生物科技有限公司产品;离心沉淀机:上海医用分析仪器厂产品;小型平板超滤装置:赛普(无锡)膜科技发展有限公司产品;超滤膜(截留相对分子质量分别为5000，10000，20000):美国Osmonies公司产品。

1.3 银杏叶中黄酮提取的工艺路线

银杏干叶一粉碎~乙醇(丙酮)水溶液浸提一抽滤后的滤渣重复提取一次~合并滤液一减压浓缩(除乙醇)~静置Zh~离心一超滤一减压浓缩一真空干燥~银杏叶黄酮产品。

1.4 黄酮化合物的定量测定

以芦丁为标准品，利用黄酮类化合物中的3一羟基、4一羟基、5一羟基、4一羰基或邻二位酚羟基与Al3+进行络合反应，在碱性条件下生成红色络合物，在波长510nm下测定，得到标准曲线方程为:y=12.973x一0.0101，r2=0.9996，线性范围0.02~0.10mg/mL.样品的测定方法相同[6]。

1.5 超滤工艺中相对通量的测定

将一定体积的提取液装入料槽中，开泵超滤并计时，间隔一定时间测定超滤

液体积.相对通量是对膜通量的间接表示方法，可准确地反映出膜通量的变化规律.超滤开始后以3min为单位测量通量J。，然后每隔一定时间测量通量Jt，直到相对通量(Jt /J。)相对稳定时停止[7]。

1.6 银杏叶黄酮提取工艺

1.6.1 溶剂对银杏叶总黄酮浸提效果的影响国外专利报道过使用丙酮溶剂提取银杏叶黄酮产品[8]，作者采用不同体积分数的乙醇、丙酮两种溶剂进行浸提对比实验，结果见图1.丙酮的提取效果优于同体积分数的乙醇，丙酮溶液的体积分数在60%时的提取效果最好，乙醇溶液的体积分数在50%时的提取效果最好.由于丙酮的价格昂贵，且有毒性，国内企业很少使用，从提取效果、生产安全性及成本等综合考虑，选择体积分数50%的乙醇溶液作溶剂较合适。

1.6.2 温度对银杏叶黄酮浸提效果的影响温度是对提取效果产生显著影响的因素之一从图2可以看出，温度越高黄酮的提取效果越好，在80℃时达到最大值，继续升高温度，黄酮质量分数有所下降，原因是黄酮贰在高温条件下长时间受热易发生氧化，而且温度过高会使叶绿素、单宁等杂质溶出量增大，导致分离纯化难度加大，造成黄酮的损失.因此，提取温度不应超过80℃。

1.6.3 固液比例对银杏叶黄酮浸提效果的影响在控制成本的前提下，为了达到最佳的提取效果，对固液比例进行实验.图3表明，在固液比1g:4mL一1g:10mL的范围内提取效果随溶剂用量的增加，黄酮质量分数显著增加。当固液比达到1g:10mL之后，黄酮质量分数的增加随溶剂用量增加趋势明显降低。因此，选取的最佳固液比为1g:10mL。

1.6. 4 浸提时间对银杏黄酮提取效果的影响为缩短生产周期，提高提取效率，现对浸提时间进行考察。图4可见，黄酮提取效果随时间变化趋势平缓，浸提时间2h与3h的提取液中黄酮质量分数分别为3.51%和3.56%，差异很小，因此，选定最佳提取时间为2h。

由上述实验确定了银杏叶黄酮的提取条件:乙醇水溶液体积分数50%，提取温度80℃，料液质量体积比1g:10mL，提取时间2h。在确定的提取条件下，产品中黄酮质量分数达到了5.96%.在超滤工艺中，将应用上述最佳提取条件。

1.7 银杏叶黄酮的超滤工艺条件研究

1.7.1截留相对分子质量不同的超滤结果膜的孔径或截留相对分子质量的选择虽然主要是根据被分离物的相对分子质量大小来确定的，但是分子的实际尺寸与分子的构型、分子的聚集状态有关，而且还与溶液的浓度有关[9]由于使用有机溶剂提取得到的料液粘度较大，高分子胶体物质较多，膜污染现象较严重.因此一般情况下，膜的截留相对分子质量应选择稍大一些的.故分别选用截流相对分子质量为5000，10000，20000等3种膜，对有效成分迁移率及产品得率进行比较，结果见表1，选用截留相对分子质量5000的膜所得到产品中黄酮质量分数最高，但黄酮的透过率只有80.58%;截留相对分子质量20000的膜得到黄酮的透过率最高，但所得产品中黄酮质量分数最低，这是由于杂质的透过量增大.综合黄酮的透过率和得率两方面考虑，选用截留相对分子质量10000的膜较合适。

1.7.2 时间与膜通量的关系通过对图5的分析，可得出相对通量随时间的变化规律.在压力为0.1MPa、温度为20℃条件下，开始超滤的45min里通量下降很快;在超滤过程中的1一2h间通量变化缓慢;在2h后相对通量变化基本稳定在35%左右。由于实验装置带有料液循环功能，因此实验过程中没有出现浓差极化的现象。

1.7.3 压力对膜通量的影响由图6可见，随着压力增大，膜通量也增加，且在30min内膜通量增加较快，但压力增加使得衰减幅度减小，以后衰减趋势相近.理论上，压力越高，膜通量越高，但实际压力不能太高，因会影响整个膜装置系统的密闭性，本实验中所使用的工作压力范围为0.10~0.40MPa，建议的使用压力为0.10~0.30MPa，因此实际操作中压力控制在0.20~0.30MPa间较为合适。

2.2.4温度对膜通量的影响由图7可见，温度对膜通量影响显著。30℃时的通量降低较20℃时缓慢。90min后，30，35，40℃下的通量基本达到一致。因此，选择料液温度30℃时进行超滤是合适的。

1.8 结论

1.8.1 银杏叶黄酮的提取条件为乙醇水溶液体积分数50%、提取温度80℃、料液质量体积比1g:10mL、提取时间2h，得到产品中黄酮质量分数达到5.96%。

1.8.2 选用截留相对分子质量10000的膜，得到的产品中黄酮质量分数为33.9%，黄酮类物质的透过率是89.45%，总提取物得率为3.1%.对比文献[11]的树脂提取法，超滤工艺的总黄酮得率是较高的。

1.8.3 膜通童2h后基本稳定在35%左右，压力范围在0.2~0.3MPa，工作温度取30℃较适宜。

1.8.4 从试验结果可以看出，超滤技术用于分离纯化银杏黄酮类物质效果理想.值得说明的是，目前本试验还处于使用小型试验阶段，下一步将进行放大试验，

以获得更多的数据。

2 银杏叶黄酮类化合物的研究进展

2.1 溶剂提取法

目前国内外掀起了研究开发银杏叶热。国内银杏叶常用溶剂例如乙醇、丙酮、醋酸乙酯、水以及某些极性较大的混合溶剂浸泡银杏叶进行提取,溶剂提取方法一般有:煎煮、冷浸、回流、渗漉等经典方法。

2.1.1 水提取树脂分离法有关水浸提银杏黄酮苷的文献报道不多。肖顺昌等报道了用16倍量沸水分3次浸提银杏叶,得到的水溶液,经冷藏、分离杂质得溶液,然后用D101型吸附树脂吸附得到浓度达38%的黄酮苷[12]。胡敏等研究水浸提银杏叶黄酮苷并用树脂精制的工艺,探讨了影响黄酮苷浸出的主要因素以及最适的精制方法,结果表明:水为提取剂,在90℃水溶回流浸提银杏叶2次,4 h/次,经沉淀,过滤,浓缩后,用树脂精制,冷冻干燥后,制得总黄酮苷含量高的提取物,产品得率为银杏叶干重的1.2%~1.5%[13]。

水提取成本低,没有任何环境污染,产品安全性高,但是水对有效成分的选择性差,提取率低。

2.1.1 有机溶剂浸提法一般的有机溶剂浸提法。田呈瑞等研究了乙醇浸提银杏叶黄酮的方法。通过单因素试验和正交试验,确定乙醇提取银杏叶总黄酮的最佳条件为:银杏叶粉碎至50~60目,以70%乙醇按照液固比6∶1的比例,于80℃条件下提取2次,1 h/次,银杏叶总黄酮提取率可达87.6%[14]。

醇(酮)提-铅化物沉淀法。张永恒等研究了乙醇回流提取银杏叶,浓缩液经蒸馏水提取,再经乙醚萃取,饱和醋酸铅沉淀法,制备银杏叶黄酮苷原[15]。

醇提-树脂吸附法。王成章等对黄酮含量较低的银杏叶的提取和纯化进行了研究,研究了不同的浸提溶剂(水、甲醇、乙醇、丙酮)、浸提温度(室温、400~500℃、600~700℃)、浸提时间对黄酮浸出率的影响,在以60%~70%的乙醇为浸提剂,液固比为8∶1~6∶1,60~70℃热浸泡,3~1 h两次,可以使黄酮的浸出率高达约85%,选用A-1和A-2混合树脂吸附分离,可以制得高含量的银杏黄酮苷[16]。吉云秀等研究了用35%的乙醇浸提银杏叶,液固比为10∶1,50℃浸提10 min,氨水调节pH除杂,浸提液用D101型树脂吸附分离的最佳条件,确定出最优的吸附—解吸工艺条件:吸附流速为3 ml/min。吸附原液pH值为8.3。采用2倍树脂床体积的70%乙醇解吸,解吸流速为1.5 ml/min,操作温度为室温。采用此提取纯化工艺所得黄酮类化合物的含量为26.2%,黄酮类化合物提取收率为64.4%[17]。

醇(酮)浸提-酮/铵盐萃取法。梁红等比较了不同溶剂提取银杏叶黄酮类化合物的效率,用70%的乙醇作为提取溶剂,结合用3%的(NH4)2SO4进行二次提取,提取液用饱和的(NH4)2SO4溶液两次浓缩,黄酮的提纯效果非常明显[18]。醇(酮)提取-硅藻土过滤法。熊远福等对银杏叶总黄酮提取精制技术进行了研究。试验

结果表明,在最佳浸提条件:浸提剂乙醇70%,银杏叶与浸提剂用量比1∶5,浸提时间3.5 h,60℃下浸提2次,最佳精制条件为:每100 g银杏叶用硅藻土2.5 g,丙烯酸树脂80 g,洗脱剂乙醇浓度70%,应用该工艺条件进行浸提与精制,精品收率>2.25%,总黄酮含量达28.8%19]。

以上方法获得的银杏叶提取物精品虽然总黄酮(或黄酮苷)含量较高,但由于使用了卤代烃、甲苯和铅化物等有毒物质,残留在产品中,影响产品质量,安全性低。

2.2 超临界流体(SFE)萃取法

超临界流体是最近几年才发展起来的一种新技术,超临界萃取和传统的溶剂萃取相比,超临界萃取在35~40℃进行操作,以CO2为萃取介质,具有溶质、溶剂

易于分离,萃取速度高等优点,特别适用于提取或精致热敏性和易氧化的物质。由于所用的萃取剂是气体,容易除去,所得产品无残留毒性,这种方法适用与医药和食品工业。

张从贵等探讨了乙醇提取,超临界CO2分离银杏叶中的药用成分,结果表明超临界CO2分离银杏黄酮的效果不是很好,萃余物得率仅为0.5%[20]。邓启焕等探讨了超临界萃取银杏叶有效成分的影响因素,在最佳条件下:萃取压力为20 MPa,时间90min,液体比3.5%,流量15 L,粒度5目,温度40℃,银杏黄酮的含量为28%,高于国际公认标准[21]。佳红等采用SFE-HPLC测定银杏叶粗提物中银杏黄酮的含量,确定了超临界流体萃取的最佳条件:压力为41 364 Pa,温度为60℃, 静态萃取时间为4 min,动态萃取体积为4 ml,改性剂加入0.2 ml的乙醇[22]。

因为超临界萃取的设备较大,操作困难等问题,难以用于大规模工业化生产。

2.3 超声波辅助提取法

近年来超声技术用于提取植物种的药效成分成为研究的一个方向。研究表明,利用超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等,都可以加速药物有效成分进入溶剂,从而提高提出率,缩短提取时间,并且免去温对提出成分的影响。

郭国瑞等研究了单因素温度和时间对超声提取银杏黄酮的影响,确定了超声提取银杏黄酮的最佳条件:时间55 min,料液比1/30,温度50℃,此时提取率为82.3%[23]。王廷峰等对连续热回流和超声法提取银杏黄酮做了比较性研究,连续热回流条件:70%的乙醇,液固比约6∶1,索氏提取器提取2次,1 h/次,提取率为80.9%,通过三因素实验研究了超声提取的最佳条件:50~60目的银杏叶,70%的乙醇,液固比约6∶1,超声频率40 KHZ,处理时间为10 min,静置时间为12 h,银杏黄酮的提取率为86.7%,连续热回流和超声法提取银杏黄酮的没有太大差异,但

是超声法提取明显缩短了时间,减少了溶剂用量[24]。

该方法提取速度快,提取率高,节省溶剂、能耗是一种理想的提取银杏黄酮的

方法。

2.4 微波法

微波技术是一种新的、有发展前景的新工艺,微波技术在提取植物有效成份中的应用,近年来得到了很大发展。微具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点。微波辐射(MWI)可以大大加快反应速度,反应时间以分、秒计。微波技术应用于植物细胞破壁,有效地提高了收率,亦取得了令人可喜的进展。李嵘等将微波法与传统水提法结合,缩短了提取时间,大大提高了银杏叶黄酮的提取率,液固比30∶1,时间30 min,提取率达到62.3%[25]。段蕊等确定了微波提取银杏黄酮的最佳条件:银杏叶用175 W微波强度处理5 min后,以体积分数80%的乙醇,在70℃下提取1 h,得到提取物中黄酮类物质的质量浓度比未经微波处理的高出18.8%[26]。

2.5 银杏黄酮类化合物的测定方法

目前,有关银杏叶黄酮类化合物的测定国内外没有公开普遍的控制质量标准,常用络合分光光度法、气相色谱法、HPLC-UV法、薄层扫描法、库仑滴定法、毛细管电泳法等。

2.5.1 络合分光光度法国内使用较多的是“络合-分光光度法”。黄酮母核在NaN02的碱性溶液中,与A1(NO3)3络合后产生黄色络合物,以芦丁为标准溶液,在UV510 nm处作紫外分光光度法的比色测定[27]。雷天乾等对分光光度法和高效液相色谱测银杏叶提取物总黄酮含量的测定方法,作了比较分光光度法的结果较HPLC偏高,如果乘以校正因子0.78,结果与HPLC接近[28]。此法的测试设备价廉,操作简便易学,但因样品组分复杂,受杂质干扰,定量测定误差较大。

2.5.2 HPLC-UV法 HPLC是测定银杏叶及制剂中黄酮类化合物的有效方法,多采用反相C18柱,梯度洗脱,紫外检测。秦燕等采用梯度洗脱,流动相10 mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH=2.0)-甲醇(50∶50),紫外检测波长:360 nm,外标法定量,建立了HPLC测定银杏提取物中三种黄酮类化合物的优化方法[29]。佳红等用SFE-HPLC测定银杏粗体物中黄酮的含量,流动相甲醇-0.4%的磷酸(60∶40),流速1 ml/min,检测波长:266 nm[30]。方子季等建立了高效液相色谱内标法测定银杏总黄酮的含量,以水杨酸为内标物,甲醇-0.4%磷酸(1∶1)为流动相,于254nm出测定银杏叶制品中总黄酮的含量[31]。

2.5.3 薄层扫描法李俊等利用苷元与苷的极性不同,采用高效硅胶薄层板二次展开法,扫描测定5种黄酮成分。将精制样品液点样于薄层板上,薄层板在层析缸内用展开剂Ⅰ∶石油醚(bp.60~90℃)-乙醚-甲酸-醋酸乙酯(60∶30∶6∶4)的上层饱和5 min,分离槲皮素、山柰素和异鼠李素,当样品都分离得较好时,取出薄层板,挥干溶剂,扫描测定槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量。以展开剂Ⅱ:氯仿-甲醇-水(6∶4∶2)的下层-乙酸(15∶1)对同一薄层板进行展开分离槲皮苷、异鼠

李苷,挥干溶剂,扫描测定槲皮苷、异鼠李苷的含量[32]。李吉来等用硅胶G薄层板点样精制样品,以氯仿-苯-无水乙醇-冰乙酸-水(5.5∶2∶1∶0.5∶1)4~10℃放置的下层溶液为展开剂,上行展开后,晾干,薄层扫描法测定异鼠李素、山柰素和槲皮素三种黄酮[33]。

2.5.4 库仑滴定法胡卫兵等探讨了库仑滴定法测定银杏叶中总黄酮含量的条件。银杏叶经乙醇回流提取,聚酰铵柱分离纯化,以2 mol/L HCl-1 mol/L KBr-无水EtOH〔v(HCl)∶v(KBr)∶v(EtOH)=3∶3∶2〕混合液为电解液,死停法确定滴定终点,以芦丁为对照品,计算出银杏黄酮的含量[34]。

2.5.5 毛细管电泳法毛细管电泳以高效、快速、用样量少、耗溶剂少、重现性好、不易污染等优点,近几年用于分析天然产物得到较大的发展。毛细管电泳的原理是在缓冲体系中引入表面活性剂,利用溶质在水相和胶束相中的分配差异进行分离。Pittea P对毛细管电泳(CE)和HPLC这两种方法分析银杏黄酮做了比较,作者认为用梯度洗脱的HPLC不但不简便而且速度慢[35]。Yuhua电极法测定银杏黄酮的方法,采用+30 kV工作电压,70 cm长、2.5μm内径的熔融石英毛细管柱,在毛细管的出口处装有一个直径为300μm碳盘工作电极,含有三电极(碳盘工作电极、铂辅助电极、饱和汞参比电极)的单元与BASLC-4C电流测定仪相连,通过记录图形完成电色层分析,在最佳条件下分离并鉴定了表儿茶素、儿茶素、芦丁、芹黄素、木犀草素、槲皮黄酮6种银杏叶黄酮类化合物[36]。

2.6 应用

银杏叶黄酮具有显著的药理活性,目前对银杏黄酮的药理活性进行了广泛的研究。银杏叶黄酮具有较强的清除活性氧自由基、抗脂质氧化的作用,能够调节超氧化物歧化酶、过氧化氢化酶,可预防和治疗与活性氧自由基有关的疾病,如心脑血管病、老年性痴呆、衰老、神经性疾病、帕金森病等;类黄酮是癌促进剂的拮抗物质,能消灭发癌因子,阻止癌细胞增生;银杏黄酮并可镇痛、治疗糖尿病等疾病,对肝组织损伤具有保护作用[37,38,39]。利用银杏黄酮类清除自由基、维持(SOD)水平、抗氧化、抗衰老、抗紫外线、高效杀菌的功效,已开发出多种护肤品和保健品,如银可络、百露达等[40,41,42,43,44]。

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范文五：银杏叶中黄酮的提取及其抑菌性检测

第一章绪论 4

1.1银杏叶功效成分简述 4

1.2 银杏叶主要成分研究情况 4

1.3黄酮类化合物 4

（1）组成及结构 4

（5）银杏黄酮类化合物的理化性质 5

第二章理论分析 6

2.1银杏叶采集分析 6

2.2 提取分析 6

第三章实验仪器及其材料 7

第四章实验方法及其过程 7

4.1银杏叶采集、干燥 7

4.2银杏叶中黄酮等物质的提取 7

4.3细菌培养 8

4.4制作菌悬液 9

4.5提取物的抑菌性检测实验 9

第五章实验结果分析 10

第六章结论 14

银杏叶中黄酮的提取及其抑菌性检测

摘要

银杏是我国的特有植物，又称公孙树。银杏叶为最古老的中生代孑遗植物银杏的干燥叶。银杏有裸子植物活化石之称。据《本草纲目》记载，银杏果具有敛肺平喘、止遗尿、白带的作用。在医药上有很高的利用价值。银杏所含黄酮类成分主要为银杏双黄酮、异银杏双黄酮，去甲基银杏双黄酮，其他还有二萜内酯、银杏内酯A 、B 、C 等，其中黄酮类和二萜内酯类物质具有捕获游离基和抑制血小板活化因子、扩张脑血管、促进血液循环、抗氧化等功能，从而广泛用于治疗冠心病、心绞痛、治疗老年痴呆症和增强记忆功能、防治皮肤病、脱发等多种疾病，随着深入的研究银杏的开发和利用，银杏所特有的医药、经济价值逐步受到重视。银杏叶的提取方法有有机溶剂萃取法、水提取法、碱性稀醇或碱性水提取法、超临界萃取法、超声波提取法、酶法等。本文采用有机溶剂提取黄酮类化合物，结果表明实验证明提取银杏叶黄酮等物质用乙醚3小时提取70℃下2次回流最佳。菌体浓度试验表明当实验用菌体浓度在OD 值为0.557，稀释到10-5和10-6比较适合，涂布能够成为单菌落，便于以后进行试验。提取抑菌性试验证明加入0.5ml 时对大肠杆菌就有明显抑制作用，其抑菌效果随着提取物浓度的增加而增强，当提取物加入2.0ml 时具有完全抑菌效果。

关键词：银杏叶，总黄酮，乙醇，抑菌性检测

第一章绪论

1.1银杏叶功效成分简述

银杏树是目前发现的当今世界上最奇特、对人类贡献最大的植物，特别是银杏叶具有五大成分五大功效，银杏叶将是世界上最有发展前景的中药材，能够治疗世界上很多的疑难杂症：

（1）黄酮苷类：对心脑血管疾病，高血脂，高血压，清除氧自由基具有显著的疗效，是目前世界上治疗该类疾病最显著的药物。

（2）银杏内酯A 、B 、C 、M 类：是血小板活化因子（PAF ）拮抗剂，是银杏叶中最重要的活

性成分，是治疗神经系统疾病的特效药物。

（3）白果内酯类：白果内酯有很强的生物活性，为神经精神病药物，对因年老的呆傻症有奇异的疗效，它能抗神经末梢的衰老，被誉为真正抗衰老化学物质。

（4）银杏酚酸类：可促进胃液和胆汗的分泌；具有抗细菌和消炎的作用；制成无残留农药；含有抗真菌物质，能够真正刺激促进造神经中枢系统的作用。

（5）聚异戊烯醇类：血功能，改善肝脏机能，对再生障碍性贫血（白血病），对各种肝病、糖尿病具有最显著的疗效，是治疗这类疾病最具有开发前景的药物。

1.2 银杏叶主要成分研究情况

自20世纪60年代开始，许多国家采用现代分离技术对银杏叶的化学成分进行研究，经药理实验和临床验证，发现银杏叶的多方面生物活性与其所含特定化学成分有关。德国Willamar Schwabe 首次注册了银杏叶的一种简单提取物，并于1972年申请了专利（W Schwabe DE 176708和DE 2117429），定名为EGb761，将其用于治疗心脑血管疾病和神经系统疾病，具有显著疗效，且无毒副作用；银杏内酯类化合物（ginkgolides ）具有显著疗效，且无毒副作用；银杏内酯类化合物具有增强血小板活化因子（PAF ）拮抗的作用。将银杏制剂列为治疗药物的国家有德国、法国和中国，其他国家均只将其用为保健食品或非处方用药。美国开发出的银杏保健食品已经获得FDA 的批准，使人们对银杏叶的保健药用价值更加重视，对银杏叶化学成分研究也越来越深入。最近不断从银杏叶中发现一些新的生物活性成分。

1.3黄酮类化合物

（1）组成及结构

黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。银杏叶中黄酮类化合物(flavonoids)可分为黄酮、双黄酮和儿茶素等三类化合物，共有36种，主要以苷的形式存在，是银杏叶的主要药理成分之一，含量较高，在银杏叶中含量变化较大。据对贵州等地330份样品及银杏叶生产发育期间黄酮苷含量的检测分析表明：不同地区、各单株之间变化幅度在0.2%～2.74%；叶中黄酮苷含量＞0.8%者占测定数的48.0%；不同生育期间叶中黄酮苷含量相差2倍左右，4月份含量最高，4～6月份呈下降趋势，6至10月含量变化不明显。

（2）银杏黄酮：

银杏黄酮的苷元有7种，即槲皮素（quercetin ）、山奈素（kaempferol ）、异鼠李素（isorhamnetin ）、杨梅素（myricetin ）、芹菜素（apigenin ）、木犀草素（luteolin ）、三粒小麦黄酮（tricetin ）等，前三种是其主要成分。银杏叶及其提取物（GBE ）的质量控制中主要检测这三种黄酮苷元的含量。

（3）双黄酮：银杏叶中的双黄酮是由两分子黄酮母核通过C —C 键聚合而成的一类化合物，一共有6种。

（4）儿茶素类：儿茶素类化合物具有治疗肝中毒的作用和抗肿瘤活性。银杏叶中的儿茶素类化合物有6种。

（5）银杏黄酮类化合物的理化性质

黄酮类为酚性成分，属多环多元酚类，由于含有苯并γ-吡酮而形成β-烯醇酮（β-enolone ）结构，这种烯醇酮结构所表现的特性是黄酮分子中的酚羟基的弱酸性与铁盐的显色反应；还能与铝形成配合物，使光吸收长移，显较深的颜色，可用于鉴定黄酮类化合物（即铝盐比色法）；同时酚羟基具有还原性，表现在提取加工过程中的氧化变色，在提取分离时可加入还原剂进行保护。

银杏黄酮类化合物的苷元多为结晶体、苷多为无定性粉末。黄酮苷类由于在结构中引入糖基，故均有旋光性，且多为左旋。银杏黄酮、黄酮醇及其苷类子含有7，4ˊ-位助色团，颜色为深黄色；在紫外光下产生荧光，可用于银杏黄酮类化合物的定性检验。

银杏黄酮类化合物的苷元一般难溶于或不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂及稀碱溶液中。银杏黄酮苷与糖结合成苷后，水溶性相应增大，一般可溶于热水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯中，难溶于乙醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂。银杏黄酮类化合物因分子中具有酚羟基而显弱酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺等。

第二章理论分析

2.1银杏叶采集分析

银杏秋季黄叶药用有效成份的含量，是春季绿叶的3.6倍，是夏季绿叶的4.1倍，是秋季绿叶的1.1倍。由此可见，采摘银杏叶的最佳时间，应是霜降前的10—15天，即10月上、中旬。这样，一方面不会影响银杏树的生长，另一方面也最大限度地保证了叶片的利用价值。因此在采集时要把当时的绿叶和黄叶分好标明，同时也要用细绳测出树干周长，以便估算出树龄。

2.2 提取分析

（1）溶剂提取法：国内外使用最广泛的方法，步骤多、周期长、产率低、产品中有机溶剂易残留。溶剂系统主要有乙醇，水溶液、丙酮-水溶液、NaOH-水溶液、NaOH-乙醇等。精提物常在粗提物制备基础上精制，常用液-液提取法、沉淀法和吸附．洗脱法。以60％丙酮为起始溶剂粗提取，再脱脂、去银杏酚酸等15道工艺制成提取物。NaOH-水溶液提取效果最好，NaOH-乙醇溶液次之，正丁醇萃取水溶液中银杏黄酮苷，获得最佳萃取条件为萃取5 min温度60℃4次，萃取物中黄酮苷含量为57％。V 水：V 正丙醇=1:25最佳。银杏叶精提物树脂吸附纯化法以石油醚回流提取，再以80％乙醇回流提取，减压浓缩，新型澄清剂沉降，树脂分级吸附，pH 值为3—4酸水和酸性25％乙醇洗涤，75％乙醇洗脱，喷雾干燥。

（2）超临界流体萃取法(SFE法) ：利用临界或超临界状态的流体及被萃取的物质在不同蒸汽压力下所具有的不同化学亲和力和溶解能力进行分离纯化的操作。最佳萃取实验工艺条件为萃取压力15 MPa、乙醇浓度90％、萃取温度55℃，此时，黄酮类化合物萃取得率较理想。

（3）高速逆流色谱技术提取法：是一种不用任何固定载体的液一液分配色谱技术W=70%的乙醇连续循环喷淋逆流6级萃取，m 乙醇：m 银杏叶=5:1，总萃取时间240min, 萃取温度50~55度，萃取率99%以上。

（4）微波提取法：微波提取法能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热，受溶剂亲和力的限制较小，可供选择的溶剂较多及热效率较高，升温快速均匀，大大缩短了提取时间，提高了萃取效率。以水为介质的条件下，对银杏叶进行微波处理。

（5）超声提取法：超声技术应用于天然活性产物的提取，具有速度快、提取率高、节省溶剂、节约能耗、不破坏有效成分的特点。最佳操作条件为超声波频率40kHz 处理时间10min 、静置时间12 h。以水为介质，在较低温度下。

（6）酶提取法: 加入淀粉部分水解产物及对葡糖基有转移作用的葡糖苷酶或转糖苷酶，使油溶性或难溶于水或不溶于水的有效成分转移到水溶性苷糖中，既提高了有效成分的提取率，又促进难溶于水或不溶于水的有效成分在体内的吸收. 在常规的醇一水浸提之前用纤维素酶对原料进行酶预处理(酶解时间为2h) 。

（7）分子烙印技术: 在极性溶剂中，以丙烯酞胺作功能单体，以强极性化合物槲皮素为模板，制备了分子烙印聚合物(MIP) MIP对槲皮素具有特异的亲合性，将该MIP 直接用于分离银杏叶提取物水解液。

第三章实验仪器及其材料

仪器：研钵、电子天平、索氏提取器、水浴锅、锥形瓶、量筒、平皿、移液管、试管、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台。

材料、试剂：银杏叶、60%乙醇、70%乙醇、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、石油醚。

第四章实验方法及其过程

4.1银杏叶采集、干燥

（1）银杏叶采集于2012年9月初河北化工医药职业技术学院内，直径10cm ，树龄20年左右，雌株。

（2）采集后的银杏叶于60℃烘干至恒重，置于研钵中碾压成粉末状用于之后实验。

4.2银杏叶中黄酮等物质的提取

（1）乙醇提取

用电子天平称取银杏粉末10g ，置于索氏提取器中加入70%乙醇60ml ，提取器下接圆底烧瓶，瓶中加30ml70%乙醇，于水浴锅中70℃—80℃恒温加热回流两次，蒸馏回收乙醇，得银杏叶黄酮提取物。乙醇浓度为50％一70％时, 提取率随浓度增加提高，当浓度70％时提取率达最大。随水浴温度升高总黄酮提取率快速增加。当温度80℃时提取率达最大。

（2）石油醚提取

用电子天平称取银杏粉末10g ，置于索氏提取器中加入石油醚70ml ，提取器下接圆底烧瓶，瓶中加30ml 石油醚，于水浴锅中70℃—80℃恒温加热回流两次，蒸馏回收石油醚，得银杏叶黄酮提取物。

（3）提取过程结束后将两组提取物置于水浴锅中蒸干。

4.3细菌培养

（1）培养基的制备

培养基配方: 牛肉膏0.3g ，蛋白胨1.0g ，氯化钠 0.5g，琼脂 1.5g，水 100ml

要配置2000ml 培养基，称取牛肉膏3 g 两份，蛋白胨10 g 两份，琼脂15 g 两份，分别加入到1000ml 大烧杯中。加蒸馏水至1000ml 搅拌摇匀。后用氯化钠和盐酸调节ph 至7.0. 。分装于4只锥形瓶中。

（2）所用仪器的灭菌

用报纸将所用到的仪器包好，平皿12个，移液管7只，培养基500ml ，10ml 无菌水试管6只，涂布器4个。再将包好的仪器放入高压蒸汽灭菌锅中120℃灭菌30分钟。

正确的操作流程：检查水位→加水→摆放物品→盖锅盖→接通电源→设置杀菌温度和时间→点击“work ”工作按钮→杀菌（升温→保温→降温）→切断电源→开盖取出物品。

操作注意事项：加水不可过多，不超过锅内平台，避免浸湿物品；每次杀菌前一定要检查水位；盖锅盖时应该对称拧紧三对螺母，避免一顺操作造成盖子一边紧一边松，不平衡而漏气；盖完盖子后要检查盖上的两个阀门是否都闭上了，切忌没关上就离开，否则杀菌过程中温度无法上升到100度以上；一定要按“work ”工作按钮，否则杀菌锅是不会开始工作的；杀菌锅报警后，没有特殊情况，不应过早放气，应该等待自然冷却；压力表指针回零后方能开盖。

（3）划线涂布培养

准备工作：应穿上白大褂，带上口罩，进入无菌室，先用酒精清洁双手，然后将物品合理摆放，左手用的东西放在左边，右手用的东西放在右手边，禁止跨过酒精灯取东西；然后用酒精棉球从中心到周围清洁台面，将酒精灯放在正中间，点燃酒精灯；再清洁一遍双手，才可以进行操作。

将灭菌后的仪器放到超净工作台上开始划线，涂布。

首先进行菌液的浓度梯度稀释，用移液管将原菌液吸取1ml 然后放入10ml 无菌水试管中，将试管置于手心中震荡摇匀，后依次分别用新的移液管取1ml 前一梯度的菌液放入下一梯度，共稀释6个梯度。

到平皿，首先将平皿标号分别为103104105106 划线、涂布。待培养基冷却到适宜的温度（50度左右，保持液态，而不烫手）时，解开三角瓶的包扎纸，右手拿起三角瓶，灼烧瓶口后在

无菌区开塞；然后将瓶口保持在无菌区，左手拿起一个平板，开盖前过一下火，在无菌区打开皿盖，往皿中倾倒15~20ml培养基，在无菌区盖上盖子，从台边缘将平皿快速放到台面，然后轻轻摇匀，放定，在凝之前不要再挪动平皿，否则培养基表面可能不平。注意无菌操作，每次到时都要靠近酒精灯。平皿倒好后平放于工作台上等待其凝固。

培养基凝固后开始划线、涂布，首先找出标有10-3, 划线的平皿然后用接种针在火焰上灼烧后，沾取103梯度的菌液在这3个平皿上划线，然后再找出标有10-3涂布的平皿，用涂布器在火焰上灼烧后，用梯度稀释时的移液管取0.1ml 到平皿上开始涂布。之后的梯度照此方法划线涂布。

划线时注意：等平板完全凝固后再划线，完全凝固后再多放几小时效果会更好、划线时，接种环要弄干净、接种环与平板的角度尽量小，划线时要快、准，避免重复划线！

涂布时注意事项：样液应该进行充分稀释，保证能分离得到单菌落；用涂布器时，若涂布器经过灼烧，应该待涂布器充分冷却后才能进行涂布，避免太烫破坏培养基；涂布时应该均匀，不要碰平皿边缘。之后将平皿放入培养箱中培养。

4.4制作菌悬液

将培养后的平皿取出观察挑选单菌落，用接种针挑取适量菌体放入无菌水中，制成菌悬液。制成菌悬液后用分光光度计测量其菌浓。

首先接通电源，打开电源开关，指示灯亮，打开比色皿暗箱盖，预热20分钟。波长选择旋钮，选择所需的单色光波长，用灵敏度旋钮选择所需的灵敏档。放入比色皿，旋转零位旋钮调零，将比色皿暗箱盖合上，推进比色皿拉杆，使参比比色皿处于空白校正位置，使光电管见光，旋转透光率调节旋钮，使微安表指针准确处于100%。按上述方法连续几次调整零位和100%位。

测出菌浓为：0.557。

4.5提取物的抑菌性检测实验

（1）实验仪器灭菌：6根移液管；6个装有10ml 蒸馏水的试管；24个平皿；1500ml 培养基；6个涂布器。

（2）将提取物用70%乙醇溶解：共3组提取物2组为石油醚提取，一组为乙醇提取。

（3）将灭菌后的仪器在超净工作台上倒平皿，标号10-5对照；10-5 0.5ml ；10-5 1.0ml ；10-5 1.5ml ；10-5 2.0ml ；10-6对照；10-6 0.5；10-6 1.0；10-6 1.5；10-6 2.0；分别标三组其中一组表明乙醇组。

标好号后就开始倒平皿解开三角瓶的包扎纸，右手拿起三角瓶，灼烧瓶口后在无菌区开塞；然后将瓶口保持在无菌区，左手拿起一个平板，开盖前过一下火，在无菌区打开皿盖，往皿中倾倒15~20ml培养基，在无菌区盖上盖子，从台边缘将平皿快速放到台面，然后轻轻摇匀，放定，在凝之前不要再挪动平皿，否则培养基表面可能不平。注意无菌操作，每次到时都要靠近酒精灯。平皿倒好后平放于工作台上等待其凝固。

（4）将制作好的菌悬液进行梯度稀释，稀释成6个梯度。

（5）在倒好的培养基实验组按照标号分别加入0.5ml ；1.0ml ；1.5ml ；2.0ml 提取物，然后用涂布器涂匀。

（6）实验组涂布完成后按照平皿上的标号分别滴加0.1ml10-5和10-6梯度稀释的菌悬液，涂布均匀后放入培养箱培养。

0ml

0.5ml

1.0ml

1.5ml

2.0ml

10-5（第一组）

200个菌落

30个菌落

10个菌落

8个菌落

0个菌落

10-6（第一组）

200个菌落

150个菌落

46个菌落

27个菌落

9个菌落

10-5（第二组）

200个菌落

50个菌落

36个菌落

12个菌落

4个菌落

10-6（第二组）

200个菌落

160个菌落

43个菌落

20个菌落

10个菌落

10-5（乙醇）

200个菌落

190个菌落

16个菌落

10个菌落

0个菌落

10-6（乙醇）

200个菌落

180个菌落

20个菌落

19个菌落

6个菌落

第六章结论

菌体浓度试验表明当实验用菌体浓度在OD 值为0.557，稀释到10-5和10-6比较适合，涂布能够成为单菌落，便于以后进行试验。提取实验证明提取银杏叶黄酮等物质用乙醚3小时提

取70℃下2次回流最佳。抑菌性试验证明加入0.5ml 时对大肠杆菌就有明显抑制作用，其抑菌效果随着提取物浓度的增加而增强，当提取物加入2.0ml 时具有完全抑菌效果。参考文献

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致谢

非常感谢李楠老师、崔润丽老师在我大学的最后学习阶段——毕业设计阶段给自己的指导，从最初的定题，到资料收集，到写作、修改，到论文定稿，她们给了我耐心的指导和无私的帮助。为了指导我们的毕业论文，她们放弃了自己的休息时间，她们的这种无私奉献的敬业精神令人钦佩，在此我向她们表示我诚挚的谢意。同时，感谢所有任课老师和所有同学在这三年来给自己的指导和帮助，是他们教会了我专业知识，教会了我如何学习，教会了我如何做人。正是由于他们，我才能在各方面取得显著的进步，在此向他们表示我由衷的谢意，并祝所有的老师培养出越来越多的优秀人才，桃李满天下！

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