纯冰柠檬茶
范文一：TG酶活性检测
一、
Govardus等采用β–酪蛋白交联的定量分析方法对不同来源的TGase的活性进行了比较，研究结果表明，来源于微生物的MTG较来源于哺乳动物血浆和血红球中的tTG，酶活性更强，催化蛋白质底物的反应活力更高。
Govardus A H,Wijngaards G,Boumans H,et al.Purification and substrate specificity of transglutaminases from blood and Streptoverticillium mobaraense[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,200l,49(7):3389–3393
二、谷氨酰胺转胺酶酶活测定
比色法[35]测定酶活：以N-α-CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-γ单羟胺酸做标准曲线。1个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为：37℃时每分钟催化形成1μmol L-谷氨酸-γ单羟胺酸的酶量(U/mL)。
底物试剂A：100 mg的Nα-CBZ-GLN-GLY溶解于2 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液中，加入0.2 mol/L pH6.0的Tris-HC缓冲液4 mL，0.1 mol/L羟胺2 mL，0.01 mol/L的还原型谷胱甘肽2 mL，并调节pH至6.0。
终止试剂B：3 mol/L的HCL，1 2%TCA，5%FeCL3按1：1：1混合。配制0～4μmol/mL的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液。取1mL试剂A与0.4 mL不同浓度的L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸标准溶液混合，37℃水浴10分钟。加0.4 mL试剂B终止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以0.4 mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100℃加热10分钟的离心后的上清液为空白。
酶活力(U/mL)=稀释倍数×(1.645×(样品OD525-空白OD525)-0.0007)
[35]Kleerebezem M,Tommassen J.Expression of the pspA gene stimulates efficient protein export in Escherichia coli.Mol
Microbiol,1993,7(6):947–956.
三、
凝胶实验[86]
1g酪蛋白用少量NaOH湿润后,加入磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH=6.5)使酪蛋白浓度达到12%。酪蛋白溶液与发酵上清液按一定比例混合均匀,于37℃反应3h后，置于4℃冰箱中过夜观察，根据有无凝胶现象确定上清液有无酶活。
[86]黄六容,刘梅芳,何冬兰等.微生物MTG的筛选及产酶条件的研究[J].华中农业大学学报,2005，24(5):368-372
四、
谷氨酰胺转胺酶活力测定
关于谷氨酰胺转胺酶的活力测定到目前为止，还没有制定统一的、标准的方法大致上可以依据以下原理进行测定：胺反应法是依据14C标记的丁二胺做底物以比色法测定其交联反应的速率；氨基消去法是用三苯基磺酸盐测定剩余氨基的数量；分子量法是用SDS聚丙烯凝胶电泳测定分子量；氨释放法是用氨选择性电极检测氨的生成量。此外，还可通过测定蛋白质的功能性、粘度及凝胶强度的变化来测量酶的活力。以上各种方法之间没有必然的联系，测定结果受酶的来源、底物类型及具体反应条件的影响[18]。
目前应用最广的是Folk1957年提出的单
氧肟酸法，在TG含量极低的情况
下，可考虑采用荧光法或同位素原子示踪法等更为灵敏的检测手段。
(1)以分光光度计测活性：最常见的活性测定方法为Folk and Cole(1966)提出的hydroxylamine呈色法，利用酶作用时，底物与羟胺形成联结，再以三氯化铁呈色，测525nm吸光值，进而求得酶活性。
(2)以荧光测活性：Lorand等（1971）利用具荧光的monodansyl-cadaverine作为底物，经酶作用后，以紫外光照射可测到酶的存在。
(3)放射线分析：Lorand等（1972）提出放射线标记的胺，如putrecine、cadaerine等，可经TGase与含有υ-glutamyl的蛋白质形成键结，可用于分析酶活性。
(4)凝结稳定分析：factor XIII的作用可使纤维蛋白不溶于尿素及稀酸，Lorand和Gotoh(1970)以不同浓度纤维蛋白原加入酶反应，再以1%monochloroacetic acid测其稳定性。
(5)产物分析：Griffin等（1982）及Motoki(1983)以HPLC G-3000SW column测定ε-（γ-谷氨酰基）赖氨酸共价交联；Sakamoto等（1995）以HPLC定
量测定127个食品中的ε-（γ-谷氨酰基）赖氨酸共价交联。以酶反应后生
成的胺分子用于活性测定也有相关研究，Backer-Royer等（1992）及Faergemand(1993)利用酶反应产生一分子氨加入β-ketoglutamate经
glutamate dehydrogenase作用生成glutamate的过程中使NADPH转成NADP+原理来测定TGase的活性。Nielsen(1995)也提出利用氨的选择性电极测定TGase的活性。
(6)反应物残留分析：Ikura等（1980）提出以tri-nitrobenzenesulfonate测定酶反应后未反应的胺基团，用以判断酶的活性。
(7)分子量的测定：TGase催化酰基的转移反应，使蛋白质形成分子内及分子间的联结，使分子量增加，Ikura等（1980）利用SDS测定酶反应后分子量的
增加，可用于酶的定性分析。
(8)物性分析：Faergemand(1993)提出当以酪蛋白为TGase的基质时，氨的释放使黏度增加，可用黏度计来测酶活性。
[18].Perez-Mateos Miriam;Montero Pilar;Gomez-Guillen M Carmen.Addition of microbial transglutaminase and protease inhibitors to improve gel properties of frozen squid muscle[J].European Food Research&Technology.2002.214(5).377-381.
转谷氨酞胺酶活力测量方法根据测定原理可分为氨的导入、氨基酸基的消失、分子量的增加、NH3的形成，或者功能性质的测量，如粘度或凝胶强度。氨的导入分析已由较多学者采用，主要测量[14C]腐胺的导入。剩余氨基酸基分析是根据转谷氨酸胺酶催化前后自由氨基酸的差别来确定该酶的活力。而分子量的增加是利用SDS一APGE来测量，与其它方法相比，此方法一般只作为定量分析。而检测NH3的释出可用NH3电极来测量，但该法仅局限于一些底物。另外，也有分析方法利用转谷氨酸胺酶的交联反应，如测量凝胶的强
度。总之，转谷氨酞胺酶活力测定方法较多，然而相互之间的相关性不强。
相关程度取决于转谷氨酞胺酶类型(动物来源，还是微生物来源的)、底物以及条件。对于一个特定的体系，有必要建立一种适合于该体系的酶活测定方法。综观近期有关转谷氨酸酶相关的文献，不难发现其活力测量方法大多是根据Fofk等(1966)建立的分光光度法。不同学者引用都会有所改动，然而采用的底物基本相同，都为
范文二：TG酶活性检测
上海统益生物科技有限公司
Shanghai Topyum Biotechnology Co.,Ltd.
谷氨酰胺转氨酶活性检测方法
1 原理
这个实验是用来检测从 Streptoverticillium mobaraense 的发酵液中用乙醇提 取所得酶的酶活力。谷氨酰胺转氨酶的活性,可通过测定 CBZ-Gln-Gly 与羟胺反 应生成氧肟酸的量来计算。
2 待测酶液的制备
2.1 将适量的样品溶解于大约 45ml 0.2M 的 Tris-HCl 缓冲液 (pH6.0)中, 室温搅 拌 30min 混合均匀;
2.2 将上述溶液用 0.2M 的 Tris-HCl 缓冲液 (pH6.0)定容至 50ml ;
3 检测方法
3.1 样品管
3.1.1 取 0.2ml 待测溶液于试管中, 37±1℃ 恒温水浴预热 1min ;
3.1.2 加入 2ml 底物溶液(37±1℃ 恒温水浴预热 10min ),并立即混匀; 3.1.3 37±1℃ 条件下准确反应 10min ;
3.1.4 加入 2ml 显色溶液终止反应;
3.1.5 反应终止后,将反应混合液 3,000rpm 离心 10min ;
3.1.6 取上清, 以水作对照, 于 525nm 波长处测定其吸收值, 为待测酶液吸收值。 3.2 空白管
3.2.1 将 0.2ml 反应溶液和 2ml 显色溶液混合均匀,在 37±1℃ 恒温条件放置 10min ;
3.2.2 加入 2ml 底物溶液,并混匀,混合液于 3,000rpm 离心 10min ;
这是我们所了解到最精确的信息。我们不对任何与实验结果相关的建议及陈述做任何承诺。所有的信息、 建议或意见必须遵循在优先考虑到商业用途的前提下且在自身实验室里的测定做出的。我们对所有由于保 证书违约,疏忽、或其他原因承担责任,但仅限于从上海统益生物科技有限公司购买的产品。
3.2.3 同样品管测定方法测定其吸收值,为酶空白吸收值。
3.3 计算:酶吸收值 = 待测酶液吸收值 - 酶空白吸收值。
4 标准曲线
4.1 称取 64.8mg L-谷氨酸 -γ-单异羟肟酸,溶解于 10ml 0.2mol/L 的 Tris-HCl 缓
冲液(pH6.0),即为标准溶液;
4.2 用 0.2mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液,将标准溶液稀释为每毫升分别含 8.0、 16.0、
20.0、 24.0 和 32.0umol L-谷氨酸 -γ-单异羟肟酸;
4.3 分别取上述标准溶液 0.2ml 于试管中, 准确加入 2ml 底物溶液于各试管, 振 荡混合均匀, 37±1℃ 水浴 10min ;
4.4 加入 2ml 显色溶液;
4.5 同检测方法,去除沉淀,在 525nm 处以水为对照,测定上清液的吸收值; 4.6 根据上述方法,可绘制出关于吸收值与 L-谷氨酸 -γ-单异羟肟酸浓度 (umol/ml)关系的标准曲线。
5 酶活力的计算
酶活力通过下列公式计算:
U/g = ( C×D ) / ( W×10 )
C :从标准曲线查得对应氧肟酸的浓度 (umol/ml)
D :待测溶液的稀释倍数 (ml)
W :待测样品重量 (g)
10:反应时间 (min)
酶活力定义:一个单位的酶活定义为,在上述反应条件下,每分钟催化底物 生成 1umol 氧肟酸的酶量。
6 试剂制备
6.1 底物溶液
精确称取 2.42gTris , 0.7g 盐酸羟胺, 0.31g 还原型谷胱甘肽, 1.01g CBZ-Gln-Gly , 溶解于 80ml 水中,用 6N 的盐酸调节 pH 至 6.0,最后用水定容至 100ml ,该溶 液需保存于 5℃冰箱,一周内有效;
这是我们所了解到最精确的信息。我们不对任何与实验结果相关的建议及陈述做任何承诺。所有的信息、 建议或意见必须遵循在优先考虑到商业用途的前提下且在自身实验室里的测定做出的。我们对所有由于保 证书违约,疏忽、或其他原因承担责任,但仅限于从上海青瑞生物医药技术有限公司购买的产品。
6.2 0.2M Tris-HCl 缓冲液 (pH6.0)
精确称取 24.22gTris 溶解于 800ml 水中,用 2.8N 盐酸调节 pH 至 6.0,最后 用水定容至 1000ml ,该溶液贮存于 5℃冰箱;
6.3 显色溶液
溶液 1:3N 盐酸
溶液 2:12g 溶解于 100ml 水中
溶液 3:5g 六水三氯化铁溶解于 100ml 0.1N 的盐酸中
在使用前将溶液 1、 2 和 3 等比例混合即得显色溶液,贮存于 5℃冰箱。
范文三：酶活性检测
④分光光度法 利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：
1. β一半乳糖苷酶
β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。自1969年Mccord等人首次发现了SOD生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃ 4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。同时测定Sigma公司的SOD标准品，对所测样品SOD活性进行校正。
【酶活定义】在lml反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个酶活单位， 即325nm 0.035OD/min为一个酶活单位。
3. 多酚氧化酶
多酚氧化酶(PPO)是一类由核基因编码在细胞质中合成的含铜质体的金属酶，其作用机理在于铜的氧化-还原作用。大麦中的多酚物质经过PPO的催化氧化后，具有单宁性质，易和蛋白质起交联作用而沉淀出来，进而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。大
麦中部分PPO以“潜伏”状态存在，在浸麦过程中，可通过去除一些酶抑制剂、蛋白酶作用或其他的一些方式使其活性在浸麦过程中提高。在大麦发芽过程中，PPO的活力较高，影响着麦芽的质量。因此，在制麦过程中应该降低PPO活性。
【酶活测定】0.1mL酶液与lmL 0.1 mol/L邻苯二酚(用pH 8.4柠檬酸-磷酸缓冲液配制)80oC反应3min，用2mL 20%TCA终止反应，于波长450nm处用分光光度计测定吸收值。
【酶活定义】上述条件下，将每分钟OD值增加0.01定义为1个酶活力单位。
4. 葡萄糖氧化酶
上世纪60年代以前，葡萄糖氧化酶主要用于蛋品加工业，除去葡萄糖，防止发生Maillard反应，稳定产品质量，延长保质期。80年代末，又陆续开发了去除啤酒溶解氧和瓶颈氧改善风味延长保质期、果汁果酒除氧护色稳定质量、面粉品质改善、海产品和肉类保鲜、饲料添加去氧平衡畜禽胃肠代谢等用途，并建立了葡萄糖氧化酶专业生产车间。
【酶活测定】采用-联(二)茴香胺分光光度法。在有氧存在条件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶(POD)作用下，氧供体即邻一联(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色产物。于436nm处测量吸光率的变化，即可换算为葡萄糖氧化酶的活性。
【酶活定义】一个酶活性单位定义为在26℃下每分催化释放一微克分子H2O2所需的酶量。
5. 果胶酶
果胶酶可以改善葡萄酒的色泽、增加酒香，并提高葡萄酒出汁率等，对提高红葡萄酒的品质有重要作用。
【酶活测定】向具塞试管中加入1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液(用0.05 mol/L
Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液配制，调节pH 10.0)，于55℃水浴下保温5 min，然后加入一定稀释倍数的酶液0.2 mL反应15 min，加入DNS试剂1.5 mL，混匀，在沸水中加热10min，立即用自来水冷却，再加入21.5 mL蒸馏水，混匀，于分光光度计上520 nm测定吸光度。空白用煮沸失活的酶液代替。
【酶活定义】在上述试验条件下，以每分钟分解底物产生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量为1个酶活力单位。
6. 胰α-淀粉酶
【酶活测定】用移液管将0.5 mL酶溶液移入试管，并在水浴中调温至25℃。加0.5 mL已同样预热到25℃的1%淀粉溶液。3 min后加1.0 mL DNS显色剂。置试管于沸水中5 min，冷却后用10 mL蒸馏水稀释。用分光光度计于540 nm处以空白作对照测定吸光度。以0.5 mL磷酸盐缓冲液代替酶液测定空白值。
7. 植酸酶
【酶活测定】 以植酸钠为底物，采用钒钼酸铵法测定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l的植酸钠(酶作用底物，用0.25 mol/l、pH值5.50醋酸-醋酸钠缓冲液配制)1.0 ml，37 oC预热5 min后，准确加入适当稀释的酶液0.5 ml(对照组先加反应终止液)，37 oC水浴反应
30min后，再加入4 ml反应终止液(现用现配)冷却至室温，在415 nm处测定OD值，利用无机磷标准曲线计算出酶活。
【酶活定义】在37℃，每分钟从1 mmol/l植酸钠溶液中(用pH值5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制)释放出1 nmol无机磷所需要的酶量为一个酶活单位。
8. 羧甲基纤维素酶
【酶活测定】在0.5mL适当稀释的酶液中加入质量分数为0.625%的羧甲基纤维素钠溶液，于50℃水浴中保温30min，加2.0 mL质量分数为10%的NaOH溶液终止反应，再加入2.5mLDNS试剂，于沸水浴中煮沸15min，冷却，在550 nm波长处比色，要求光密度读数尽可能在标准曲线的0. 5 mg葡萄糖处。每次测定均设立空白对照，对照管先加入0.5mL酶液，然后加入2. 0 mL质量分数为10%的NaOH溶液将酶灭活，再依次加入质量分数为0.625%的底物2. 0 mL，与待测管一起保温，加入DNS，煮沸、冷却、稀释比色、与标准曲线对照。
【酶活定义】在上述条件下，每30min产生0.5mg还原糖为1个Cx活力单位，即每1 h产生1.0mg还原糖为1个Cx活力单位。
9. 木聚糖酶
木聚糖酶能水解不可溶戊聚糖(阿拉伯木聚糖)，使其成为水溶性的，水解率达65%。面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖，能提高面团的持水性和机械强度，使面团具有更好的持气能力和操作耐力，进而提高馒头和面包的品质。
【酶活测定】以木聚糖为底物，用DNS法测定还原糖的生成量。取稀释酶液0.1ml，加1%木聚糖液0.9ml，置50℃水浴保温30min后，加DNS 2ml于沸水浴中显色3min，用自来水冷却后，加蒸馏水定容25ml，测O.D值。
【酶活定义】每毫升酶液每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所相当的酶量。
10. 蛋白酶
【测定原理】中性蛋白酶在一定的温度和pH条件下,水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸,在碱性条件下,将福林试剂还原,生成钼蓝与钨蓝,其颜色深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660 nm测定其吸光度,可得到酶解产生的酚基氨基酸的量,计算出蛋白酶活力,以此代表蛋白酶的总酶活力。
【酶活测定】取3支试管(一支空白管,两支样品管),分别向3支试管中准确加入稀释好的待测酶液1.0 mL,将3支试管放入40℃水浴中预热5 min,同时将测定底物(1%酪素)置同一温度水浴中预热5 min。分别向两只样品管中加入1%酪素溶液1.0 mL,准确计时,反应10 min取出。迅速准确向两只样品管加入0.4 mol/L三氯乙酸2mL,于空白管中加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL和1.0 mL 1%酪素溶液,摇匀。3支试管中反应液用滤纸过滤。另取3支试管,分别吸取上述相应滤出液1.0 mL,0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL和稀福林试剂1.0 mL,摇匀,置40℃水浴中放置20 min(显色),取出,迅速冷却置室温。以空白管调仪器零点,在分光光度计波长660 nm处分别测两支样品管吸光度,取平均值。通过查标准曲线求出生成酪氨酸的含量。
11. α-淀粉酶
α-淀粉酶是第一个应用于面包制作的微生物酶，它取代了麦芽是由于麦芽中的淀粉酶含量不稳定而且含有蛋白水解酶。
【酶活测定】在10 mL 试管中依次加入0. 5%可溶性淀粉溶液1 mL , pH 4. 2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2. 5 mL, 40 ℃预热10 min。然后加入多倍稀释的0. 5 mL 酶液, 40 ℃保温5 min后,加入0. 1 mol/L H2 SO4 1 mL 终止反应。再取2 mL 反应液与0. 5% KI - I2 溶液0. 5 mL显色,测定OD620。与淀粉梯度标准曲线对照得反应液淀粉浓度后,计算酶活力。
【酶活定义】在pH 4. 2、温度40 ℃下, 5 min水解可溶性淀粉1 mg所需的酶量为一个酶活力单位 。
12. 脂肪酶
利用脂肪酶作用后释放出的链较短的脂肪酸，增加和改进食品的风味和香味;利用脂肪酶催化的醇解和酯化反应来生产各种香精酯，作调料剂;用有专一性的微生物脂肪酶提高食用油营养价值和增加食用油的花色品种，制备代可可酯等高档油脂;另外，脂肪酶还可以用于酒类的去浊除渣、改善面包质量、改善蛋白的发泡等方面。
【酶活定义】在40℃、pH 7.5，以每分钟从橄榄油中释放lμmol脂肪酸的酶量定义为一个酶活力单位。
13. 漆酶
【酶活测定】3.0mL反应液中含20 mmol/LABTS 0.7mL，酶液0.lmL和25 mmol/L琥珀酸缓冲液(pH4.5)，在25℃下反应2min后立即用冰浴终止反应，测定436nm处吸光度的增量。
14. 木质素过氧化物酶
【酶活测定】30℃条件下反应体系中含酶液，浓度为0.2mol/L，且pH值为2.4的酒石酸缓冲液及浓度为0.008mol/L的黎芦醇各lmL，加人浓度为0.016mol/L的H2O2 lmL 启动反应，测定反应最初4min内在310nm处的吸光度，以灭过酶活的酶液作对照。
15. 锰过氧化物酶
【酶活测定】室温下反应体系中含有50mmol/L pH4.5的乳酸钠缓冲液3.4mL，
1.6mmol/L的MnSO4溶液0.lrnL，酶液0.4rnL，加人1.6 mmol/L的H2O2 0.lmL启动反应。测定反应最初4min内在240nm处的吸光度。
【酶活定义】每分钟使1μmol的Mn2+转化成Mn3+所需要的酶量为一个酶活单位。 仪器配置
Thermo公司Genesys系列、Helios系列和Evolution系列紫外-可见分光光度计均可进行食品酶分析。EnzLab软件是Thermo公司研制的专业食品酶分析软件，具有智能提示功能，可以一步步引导操作员完成酶活测定。即使不是酶分析专家，也能获得准确、可靠的数据。而且该软件支持手动输入模式，即使实验室使用的是其它品牌的分光光度计，也能享受EnzLab软件带来的智能和便捷
酶活性的测定方法
动物实验中常见的一些需要测定的酶包括丙氨酸氨基转氨酶、天冬氨酸氨基转栘酶、乳酸脱氢酶、肌酸脱氢酶、7γ-谷氨酰转肽酶等。
（一）丙氨酸氨基转氨酶的测定：丙氨酸氨基转移酶（ALT），即谷丙转氨酶(GTP)，主要分布于肝脏、心肌，骨骼肌及其他组织中含量轻低。ALT的测定有酶联-紫外连续监测法和比色法。酶联-紫外连续监测法首先由ALT催化丙酮酸与α—酮戊二酸反应，生成丙酮酸与谷氨酸，第二步以乳酸脱氢酶（LD）为指示酶催化丙酮酸与NADH反应，产生乳酸与NAD＋，由于反应平衡点偏向乳酸及NAD＋的生成，因此可在340nm连续监测NADH被氧化的速度。根据单位时间内NADH的减少量及摩尔吸光系数计算ALT活性。比色法首先亦为ALT使丙酮酸与α—酮戊二酸反应，生成丙酮酸与谷氨酸，继而使丙酮酸与2，4－二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯肼，其在碱性溶液中显棕红色。根据色泽深浅计算出丙酮酸含量，再换算转氨酶的活性单位。
（二）天冬氨酸氨基转移酶的测定：天冬氨酸氨基转移酶(AST)，即谷草转氨酶(GOT)，分布于心肝及骨骼肌的胞浆与线粒体中。测定方法也包括酶联-紫外连续监测法和比色法。酶联-紫外连续监测法首先由AST催化天冬氨酸与α－酮戊二酸反应生成草酰乙酸与谷氨酸，第二步以苹果酸脱氢酶为指示酶催化草酰乙酸与NADH反应，使草酰乙酸生成苹果酸，而NADH氧化成NAD＋，反应平衡点偏向草酰乙酸的消耗与NAD＋的产生。因此可用类似ALT的连续监测法计算AST活性。比色法是通过AST作用于天冬氨酸与α－酮戊二酸产生草酰乙酸与谷氨酸，草酰乙酸在体系中自行脱羧或加入柠檬酸苯胺脱羧生成丙酮酸。在酶促反应达到规定时间后，加入2 ，4－二硝基苯肼终止酶反应，用ALT同样的比色法测定AST的活性。
（三）乳酸脱氢酶的测定
1．乳酸脱氢酶的测定：乳酸脱氢酶（LD）的测定可利用以乳酸为底物的顺向反应，或利用以丙酮酸为底物的逆向反应，顺、逆向反应均可应用比色法及分光光度法测定酶活性。比色法的原理是利用产物丙酮酸与2 ,4－二硝基苯肼作用生成丙酮酸、二硝基苯肼，后者在酸性环境中呈草黄色，在碱性溶液中呈红棕色。颜色深浅与丙酮酸浓度成正比，与标准浓度丙酮酸生成的苯肼进行比色，可推算LD活性。分光光度法是利用顺向反应或者逆向反应，在340nm连续监测NADH的生成速度或消失速度，再根据NADH的吸光系数即可计算出LD的活性单位。比色法中以丙酮酸与2,4－二硝基苯肼反应为最常应用，但只能利用其顺向反应。分光光度法优点较多：顺向反应中以NAD＋、乳酸为底物都比较稳定，过量乳酸对LD的抑制作用小于过量丙酮酸；逆向反应NADH的用量只有正向反应NAD+的3%，酶促反应速率快于正向反应，所以应用样品量少且可在短时间内完成测定。
2．乳酸脱氢酶同工酶的测定：LD是由H亚基和M业基组成的四聚体。从LD同工酶的组织分布来看，LD同工酶的测定具有—定的器官组织特异性。目前主要检测方法有电泳法、层析法、免疫化学法、热稳定法和抑制剂法。电泳法是利用LD同工酶肽链结构不同及等电点的差异，以醋酸纤维薄膜、淀粉胶、聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶做支持介质，在电场中使各种LD同工酶得以分离。由于醋酸纤维薄膜电泳方法简便、快速，使用最为普遍。
（四）肌酸脱氢酶的测定 肌酸脱氢酶（CK）测定有比色法和酶偶联-紫外连续监测法两种。比色法包括无机磷酸法、酶偶联-丙酮酸测定法和肌酸显色法。无机磷酸法是利用正向产物磷酸肌酸在酸性溶液中释放无机磷，用钼酸铵与无机磷反应生成磷钼酸，再使用氨基萘磺酸使磷钼酸还原成钼蓝，之后进行比色测定计算磷酸量的多少推算CK活性。酶偶联-丙酮酸测定法是利用CK催化的正向产物ADP可与磷酸烯醇式丙酮酸作用，在工具酶丙酮酸激酶的催化下生成丙酮酸和ATP，再用2，4-二硝基苯肼与丙酮酸反应。利用生成的丙酮酸苯肼推算CK活性。肌酸显色法是利用逆向反应产物测定CK活性的一种方法，即肌酸与双乙酰
及α－萘酚结合生成红色化合物，在一定范围内红色深浅与肌酸含量成正比。酶偶联-紫外连续监测法是利用逆反应产物ATP与葡萄糖在已糖激酶催化下产生6-磷酸葡萄糖．再偶联6-磷酸葡萄糖脱氢酶使体系产生NADPH，通过340nm测定NADPH的生成速度计算CK活性。比色法中的无机磷酸法、肌酸显色法是比较常用的方法。前者底物和试剂易得，反应过程稳定；后者反应速度较快，灵敏度高，不受血中无机磷的干扰。酶偶联-紫外连续监测法是国际上最常用的方法。
（五）7γ-谷氨酰转肽酶测定 谷氨酰转肽酶(7γ－GTP)，又称γ－谷氨酰转移酶（γ－GT），γ-GT在机体中分布比较广泛，如肝、胆、胰、小肠等组织的细胞膜上，参与氨基酸向细胞内的转运，在许多疾病时γ-GT可表现升高。γ-GT活性测定主要有比色法及连续监测法。γ－萘胺比色法是利用γ-L-谷氨酰-γ-萘胺作为γ-谷氨酰的供体，以双甘肽为受体，在γ-GT催化下，产生γ-萘胺与重氮试剂(重氮苯磺酸)反应，生成红色的γ-萘胺-对-偶氮笨磺酸，其色泽深浅与酶活性成正比。本法要求37℃保温15分钟即可进行比色测定。对-硝基苯胺连续监测法是以γ-L-谷氨酰-对-硝基苯胺为γ-谷氨酰基的供体，双甘肽为受体，在γ-GT催化下生成γ-谷氨酰双甘肽与对-硝基苯胺。在碱性pH条件下对-硝基苯胺呈现黄色，可用405nm波长连续监测对-硝基苯胺的形成速率。根据单位时间内吸光度的增加及对-硝基苯胺的摩尔吸收系数（＝9870），推算Y—GT活性。γ-萘胺比色法不需要去除蛋白质，操作简便．线性关系好．颜色稳定，但底物水溶性较差。对－硝基苯胺连续监测法简便快速、灵敏，重复性好，自动生化分析仪测定已采用其原理与程序。但本法底物溶解性较差且要求临用前配制。测定时可做一不加酶的对照，消除底物因不稳定引起的自动水解。
（六）磷酸酶的测定
1．碱性磷酸酶测定：碱性磷酸酶(ALP)是一组在碱性条件下具有较强活性的酶类。该酶对底物的专一性较差。因此，实验所用底物种类较多，如α－甘油磷酸、磷酸对硝基酚、磷酸苯二钠、磷酸酚酞等。ALP催化上述底物并使其产生无机磷酸和羟基化合物。测定ALP的方法主要有两种：一是测定底物解离下来的游离磷酸根来计算酶活性；二是测定产物羟基化合物计算酶活性。常用方法有α—甘油磷酸法、磷酸苯二钠法、磷酸对硝基酚法三种。磷酸对硝基酚法操作步骤较多，已不采用。磷酸苯二钠法反应速度快，灵敏厦高，不需去蛋白，又因血中很少有酚及酚类化合物，故用试剂空白代替标本空白即可。磷酸对硝基酚法中的酶促反应所需时间短，结果准确。ALP的最适pH随着各种条件的改变而有所不同，缓冲液的组成是影响活性的主要原因。血清ALP受热会迅速变性，Mn2＋为ALP活性剂，而Zn2＋、磷酸盐等均有抑制作用。
2．酸性磷酸酶：酸性磷酸酶（ACP）也是一组对底物专一性较差的酶类。在pH5的环境中可水解各种磷酸酯。ACP催化的底物和反应原理基本上与ALP相似，因此也有甘油磷酸法，磷酸苯二钠法，磷酸对硝基酚法等。但ACP不稳定，在37oC，Ph> 7.0条件下活性丧失较快。因此，应将其保存在酸性环境中并置于冰箱内存放。红细胞含有大量ACP，故溶血标本不能用于ACP测定
范文四：活性酶检测：明胶酶谱MMP活性检测实验
酶谱法(Zymography )是基于SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法检测MMP-2、MMP-9活性，其灵敏度可达10pg ，高于ELISA 方法。其基本原理和程序是:以加有胶原酶底物的SDS-PAGE 凝胶分离含蛋白酶的样品，电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer 孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，能同时指示MMP-2、MMP-9的位置(酶谱) ，可检测样本有血液、渗出液、细胞提取物等。
实验具体收费、标本的收集、实验试剂的定购等事宜，请联系嘉美生物。
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范文五：尿素酶活性定性检测
尿素酶的测定（定性）
1. 试剂:
1.1 0.62%苯酚红乙醇溶液
2、测定方法:
将试样粉碎,称0.2g试样转入试管中,加入0.2g结晶尿素,3-5滴苯酚红指示剂，加20-30mL蒸馏水摇动10秒钟，于30度水浴中观察溶液颜色，记录呈现粉红色时的时间。
3、尿素酶活性的结果表示：
1min内呈粉红为:活性很强;区
1-5 min内呈粉红为:活性强;
5-15 min内呈粉红为:有点活性;
15--30 min内呈粉红为: 无活性;
美国大豆协会方法：
1、 原理：在有指示剂酚红存在的条件下，豆粕中的尿素酶活性可按尿素转变成氨
的方法定性测定。
2、试剂 ：
2.1 稀硫酸（H2SO4）0.2N或更稀些，带滴管。
2.2 尿素—酚红试剂 ：
a、将1.2克酚红溶解于30毫升0.2N的NaOH中；
b、用蒸馏水将之稀释至300毫升；
c、加入90克尿素并溶解之，用蒸馏水稀释至2升；
d、加入14毫升1.0N的H2SO4（或0.2N的H2SO4），用蒸馏水稀释至3升； e、溶液应具明亮的琥珀色。
3、测定步骤：
3.1 在一个150毫升的烧杯中到入少量试剂，注意溶液必须呈明亮的琥珀色。若溶液
已转为深橘红色，滴入稀硫酸溶液并搅拌之，直至溶液再度呈琥珀色。
3.2 量一汤匙粉碎好的豆粕粉，放置于培养皿中，在样品上加入两汤匙试剂，轻轻搅
拌，将样品平铺于培养皿中。若仍有干豆粕斑点，则再加入试剂，直至将豆粕浸湿。
3.3 放置5分钟后观察：
No.1 没有任何红点出现：再任其放置25分钟，若仍无红点出现，说明豆粕过熟。 No.2 有少数红点：少量尿素酶活性，豆粕可用。
No.3 豆粕表面约有25%为红点覆盖：少量尿素酶活性，豆粕可用。
No.4 豆粕表面约有50%为红点覆盖：有尿素酶活性。
No.5 豆粕表面约有75-100%为红点覆盖：尿素酶活性很高，不应该接受这种原
料，因为豆粕过生。
