切克闹21628686
范文一：信号肽
1. 前导肽
前体蛋白N 端有一段信号序列称为导肽、前导肽或转运肽（leader sequence 、presequence 或transit-peptide ），完成转运后被信号肽酶（signal peptidase）切除，就成为成熟蛋白，
拥有前导肽的线粒体蛋白质前体能够跨膜运转进入线粒体，在这一过程中前导肽被水解，前体转变为成熟蛋白，失去继续跨膜能力。
前导肽一般具有如下特性：带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量较为丰富，它们分散于不带电荷的氨基酸序列之间；缺少带负电荷的酸性氨基酸；羟基氨基酸（特别是丝氨酸）含量较高；有形成两亲（既有亲水又有疏水部分）α-螺旋结构的能力。
同时要注意的是前导肽不用于信号肽。后者是指引蛋白穿膜时的一段信号序列，可在蛋白质中间，也可以在开始，如果是前导肽就可以被剪切，如果在中间就不会被剪切。
前导肽是信号肽的一种，在蛋白质的N 端，引导蛋白穿膜，并且在后来被剪切掉。
范文二：信号肽
1.18-30个疏水氨基酸组成的一段序列，可指导蛋 白质多肽链在粗面内质网上合成。@@@2.6个多肽亚单位和1个
沉降值为7S的小分子RNA构成的复合体其一端与被翻译后的信号肽结合，另一端结合在
核糖体上。@@@3.O-连接糖基化：发生在高尔基体上的糖基化，其寡糖连接部位是蛋白质
多肽链中丝氨酸等氨基酸残基侧链的OH集团。@@@4.转位接触点：内，外膜之间形成的
接触点。是蛋白质出入线粒体的通道。@@@5电子传递链：内膜上有序排列的酶体系，接
受和释放H+和e-。@@@6基质导入序列，MTS：前体蛋白的N-末端存在的一段20-80个
氨基酸组成的序列，可指导前体蛋白进入线粒体。@@@7.微管组织中心，MTOC：微管聚
合的特异性的核心形成位点，微管装配的发生处。@@@8.收缩环：有丝分裂末期，两个即
将分离的子细胞之间质膜下产生的由微丝与肌球蛋白丝组成的腰带状束。@@@9中间纤维：
是一种直径约10nm的纤维状蛋白，因其直径介于微丝和微管以及粗肌丝和细肌丝之间而得
名。@@@10.核孔复合体，NPC：由多个蛋白质颗粒以特定的方式排列而成的蛋白分子复合
物，是核质间物质交换的双向选择性亲水通道。@@@11.核仁组织区，NOR：是含有rRNA
基因的染色体区域。@@@12.核纤层：附着于内核摸下的纤维蛋白网。@@@13.有丝分裂器：
由染色体，星体，中心粒以及纺锤体组成的结构。@@@14.细胞周期蛋白：是真核细胞中的
一类蛋白质，随细胞周期进程周期性地出现及消失。@@@15.细胞周期蛋白依赖性激酶，
CDK：是一类必须与细胞周期蛋白才具有激酶活性的蛋白激酶，可将多种与细胞周期相关
的蛋白磷酸化，在细胞周期调控中起关键作用。@@@16.DNA ladders：细胞凋亡时，内源
性核酸内切酶活化，特异地在相邻核小体的连接区切断DNA链，形成长度为180-200bp整
数倍的寡聚核苷酸片段，在进行琼脂糖凝胶电泳时，凋亡细胞表现出特征性的DNA梯状条
带。
简答 1.影响膜脂流动性的因素？？？胆固醇含量，脂肪酸链的饱和度，脂肪酸链的链长，
卵磷脂与鞘磷脂的比值，其他因素等。
2.溶酶体的功能？？？分解胞内的外来物质及清楚衰老残损的细胞器，物质消化与细
胞营养功能，参与机体防御保护功能，参与腺体组织细胞分泌过程调节，参与个体发生与发
育。
3.纤毛和鞭毛的结构及运动机制？？？由于ATP水解提供二联管的滑动力，如果二联
管间相互独立，那么就滑动运动。但是在纤毛或鞭毛中，受蛋白连接物的限制，所以滑动运
动——弯曲运动。
4.微管的功能？？？维持细胞的形态；构成纤毛鞭毛和中心粒，参与细胞运动；参与
染色体的运动，调节细胞分裂；参与细胞内物质运输；维持细胞器位置。中间纤维的除上述
外还有参与细胞分化，形成完整的网状骨架系统。微丝的除上述外还有构成收缩环。
论述 1.有丝分裂包括哪些时期？？各时期特点？？？
前期：染色质凝集形成的染色体，有两条染色单体通过着丝粒连在一起，核被膜解体。
中期：染色体在赤道面上整列，并于两级伸出的染色体微管连接。
后期：后期A，染色体向两级运动。后期B，纺锤体级的分离。着丝粒分开染色体分
离，染色体移向纺锤体两极
末期：染色体开始分散解聚，核被膜在簇集染色体周围重新装配。
2.分泌蛋白在内置网上合成及转运过程？？？
@核糖体由信号肽引导结合于内质网膜上。
@核糖体合成的多肽链经膜穿入内质网腔内
@分子伴侣可在内质网腔内对蛋白进行折叠
@新合成的蛋白质在内质网腔内进行糖基化
@内质网合成的蛋白质可经由高尔基体被分泌出细胞
范文三：抗体信号肽基因的克隆和序列测定及真核表达载体的构建
V01(27(No(3 中国预防兽医学报第27卷第3期 C}linese Journal of Preventive Medicine 2 0 0 May，(20055年5月 Veterinary
抗体信号肽基因的克隆和序列测定及真核表达载体的构建
陈金顶，赵明秋，索青利，黄青云，廖明
(华南农业大学兽医学院，广东广州510642)
摘要:根据抗体重链与轻链基因的核苷酸序列设计并合成了1对引物，以猪外周血淋巴细胞基因组mRNA为模板， 通过RT-PCR方法获得了一大小约85 bp的DNA片段，并将其克隆到oGEM—T载体上进行序列测定，测序结果显示，猪抗 bp，编码19个氨基酸，核苷酸及推导的氨基酸序列与已发表的抗体信号体信号肽基因核苷酸序列长度为57 肽基因序列 ,致，同时在信号肽基因3’端下游提供可供肽酶切割的窗口和外源基因的克隆位点。然后将信号肽基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3(1(+)中，成功构建了一含信号肽序列的真核表达载体3(1一sFc，为外源基因在pcDNA3(1(+)中的表
达 与分泌提供了一有效的信号肽，也为研究基因的功能奠定了基础。关键词:抗体信号肽;基因克隆;序列测定;载体构建 中图分类号:$852(65+9(5; 文献标识码:A 文章编号:1008(0589(2005)03(0164(03 Q78
and of Molecular the for encoding cloning signal gene peptide sequencing of swine and construction of vector its eucaryotic expression antibody CHEN Jin—cling，ZHAO Qing-li，HUANG Qing-yun，LIAO MingMing-qiu，SUO China (Faculty ofVeterinary，South Agricultural University，GumCnou 510642，Chirm)
from from 85 the of Abstract:A about WaS RT-PCR mRNA fl-agment bp amplified by technique genome lymphocyte swine，using to for of and the swine(The primers sequence signal amplifed designed synthesized according encoding peptide antibody fragments gene
determination were into vector and then of nuclectide showed that the cloned signal pGEM—T sequenced(The sequence gene encoding for of swine 57 19 amino acids and the nucleotide and amino acid of the cloned WaS pe曲de antibody spanned bp，encoding sequence gene for the same as the in 3’end tmderstream of the of swine the reported sequences，and signal peptide antibody signal pepti— gene encoding could dnse site and sites for be the recombinant then the cleavage foreign gene provided by plasmid(and gene encoding signal cloning
for subcloned into verified PCR and restriction endonuclease recom— of swine was pe两de antibody pcDNA3(1(+)and by digestion，the binant vector of the WaS constructed(This msult laid foundation for tiirther of the re— eucaryotie expression p3(1-SFc study successfully
combinant vector to and secrete cells and of the function of a from,lying eucaryotic expression produce foreign protein study gene(for of vectorpeptide antibody;gene Key words:signal clone;sequencing;construction
细胞内合成的蛋白质释放到胞外的机制是多 以前体形式存在，它的N末端比成熟的轻链多
样的，其中信号肽引导蛋白质的分泌是蛋白质释 一段约由20个氨基酸的多肽，这段多肽使IgG出 放的主要方式之一 1。信号肽参与引导蛋白质的 链通过内质网分泌到细胞之外，具有信号肽的作 轻 用引3。国外进行基因表达所采用的分泌信号大致 分泌，它对蛋白质的分泌效率起主导作用怛j。初 有以下几种情况:?与表达蛋白质同源的分泌信 生蛋白质在细胞内正确定位后，信号肽被信号肽 号肽;?与宿主表达细胞同源的分泌信号肽;?机 酶识别、水解，然后被释放出细胞，同时经过折叠 体内表达的分泌蛋白的分泌信号肽。为研究信号 等立体构象的变化，转变为成熟的蛋白质。1972
肽在真核细胞中的表达分泌作用，我们利用反转 年研究首次发现免疫球蛋白(IgG)轻链在合成时
录(聚合酶链式反应技术，对在哺乳动物体内具有基金项目:广东省自然科学基金资助项目(项目编号: 表达分泌作用的猪抗体信号肽基因进行扩增及序
020095) 列分析，并将其克隆人真核表达载体pcDNA3(1作者简介:陈金顶(1964,)，男，副教授，博士，主要从事动 (+)中，构建含哺乳动物抗体信号肽基因的真核 物微生物学与免疫学及动物病毒分子生物学表达载体，为基因功能及DNA免疫的研究开拓新 教学与研究工作( 的思路。收稿日期:2004—03—02
万方数据
第3期 陈金顶，等(抗体信号肽基因的克隆和序列测定及真核表达载体的构建
辅助下，对抗体信号肽基因s—Fc核苷酸序列及推 1材料和方 法导的相应氨基酸序列进行分析，并与已在Gen( 1(1材料菌种E(coil TOP 10株为本实验室 Bank中注册的一些抗体信号肽基因相应序
(GenBank ID分别为AF062384，M81769和 自存。pcDNA3(1(+)真核表达载体为,nvitmgen 列 M81771)进行同源性比较。利用Biomolecular 公司产品;pGEM(T Easy载体质粒系统为Promega Mod(
IS PLOTl(0，Reagent、SU(公司产品。核酸抽提试剂TRIzol elling服务器K}r豫OPHOBICITY
根据DNA聚合酶为h1( Kytet-Doolittle方法，对抗体信号肽基因推导出的 PERSCRIP-pTM?反转录酶、Taq DNA 氨基酸序列进行HYDROPHOBICITY分析。 vitrogen公司产品;T4 Lgase为USB公司产
1(8信号肽基因重组载体的构建对1(6获 品;限制性内切酶Hind?和Bam I为AmershamPharmacia Biotech公司产品:琼脂糖凝胶DNA回收 的含抗体信号肽基因的重组质粒T-SFe得 进行Hind?和BamH I酶切，回收、纯化后，酶试剂盒为Promega公司产品:Oligo(dT)、Random
primer为Invitrogen公司产品:淋巴细胞分离液购 过相同酶切处理的切产物与经 coli 自华美公司。 TOPl0感受态细菌，提取重组质粒，用胁以 pcDNA3(1(+)连接。转化E( 1(2引物设计与合成根据已发表的猪抗体基 ?和BamH I双酶切、PCR鉴定和序列测定，筛
含信号肽基因s(Fc的重组质粒。因核苷酸序列，设计了s(Fe一5和s—Fc(e一对引物， 选
其中S。Fc一5的5’端带有哦砌?和Xho I酶 的识 2结果别序列。s—Fc一3的5’端带有BamHI酶的识 别序
以淋巴细胞2(1信号肽基因RT-PCR扩增 列。引物序列如下:S—Fc(5:5’(GCAAGC，IfI?TC一
基
因组总RNA为模板，用引物—GA—GATGGAGTITCGGCTGAACT-3’;S—Fc一3:5’一rI?生
Oligo(dT)RandomGATCCAAAGT?ACCCrllGGACACC，I’I研 AGA一3’。A primer进行cDNA合成，用s(Fc(5,S—Fcf_3一
对引1(3外周血淋巴细胞的制备用口蹄疫灭活苗免 物对所获得的cDNA模板进行PCR扩增，成功地 疫猪，ELISA检测抗体，无菌取血清抗体效价较高 扩增出一条长约85 bp的特异条带，其大小与
mL，50 U肝素钠抗疑，然后轻轻叠 计的相吻合(图1)。这初步表明s(Fc基因预 猪的外周全血5 500 加到密度为1(077的淋巴细胞分离液上层，1 扩增。 g 已得到 离心15 mL离心管中，rain;取界面层细胞，置50
用500 minj弃上清，调1×PBS悬浮细胞，3 g离心3
整 细胞浓度，制成细胞悬液，一80?保存。1(4淋巴细胞总RNA的提取与cDNA的合成
LS RNA提取参照Invitrogen公司’mIzol Reagent
剂盒的使用说明，提取淋巴细胞总RNA，将试 获得的RNA溶于DEPC处理水中，根据
SuperscriptTM? 反转录酶系统的使用说明，用primer引物对淋巴细胞总Oligo(dT),Random RNA进行第一链cDNA
合成。 M(1 Kb Plus DNA Alddeff;1(淋巴细胞mRNA RT-PCR产
物RT-PCR of (mRNA products Lomphocyte) 1(5信号肽基因cDNA的PCR扩增根据Invit— 图1 RT-PCR产物的鉴定 DNA聚合酶使用说明，取淋巴mgen公司的Taq 细Identification of RT-PCR Fig(1 products 胞总RNA的cDNA产物，使用S—Fc一5和S—Fc一3引 2(2信号肽基因的克隆及鉴定 将经纯
化的抗物进行抗体信号肽基因的PCR扩增，CPR产物用 体信号肽基因插人封载体质粒pGEM(T Easy的 万方数据 外2,琼脂糖凝胶电泳检测。 源基因位点中，构建了重组质粒T-SFc。鉴定表
2005正中国预防兽(医学报
GenBank中注册的相应基因序列比较后发现，它 肽的第6—16位氨基酸残基处形成1个疏水核 区，分别在第3—6位氨基酸残基处与16。18们的同源性为100,(图3)。通过HYDROPHO—心 BICITY PI_(YFl(0服务器，对抗体信号肽氨基酸序 基酸残基处形成1个亲水核心区(图4)。 氨 列进行HYDROPHOBIC?Y分析发现，在编码信号
ATG TTT GAG CGG CTG AAC TGG GTG GTC TTG TTT GCT CTC TTA CAA GGT GTC CAG GGTM E F R L N W V V L F A L L G V GQ Q
图2猪抗体信号肽基因核苷酸序列及推导的相应氨基酸序列 nucleotide of The fllllino acid the anddeduced swinefor of Fig(2 8equences gene encoding sisnal peptide antibody
型上堕坚型斗业旦三丛旦({业坠旦生丝掣三坠旦王韭翠丛丛!!! (譬llajeri蕾ltU ? ? ? S? 工((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((1U工11(1( 工(((((((((((((((((((((((((((((I-1(‘ 工((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((NIJ(Ti! 工((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((1lrlilllt
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图3猪抗体信号肽基因核苷酸序列的比较 of for of the swine Fig(3 Coiiipal[iSOll nucleotide?qudlo鼯of gene目IcodiIIg sig,血peptide antibody 较高。目前，原
核表达的蛋白质较难满足实验要 求HJ，为解决这
些问题，常采用真核表达和融合分
泌表达以获得蛋白质【5』5。融合分泌表达可提高表 达效率，增加表达产物的稳定性，并可利用生物化 厂、 学专一性结合作用，使得重组蛋白质得到有效回 收和纯化，且外泌可使表达产物避免胞内蛋白酶 的降解，利于产物的纯化。本研究利用反转录一聚 厂、(((( J(((((((((?(((
合酶链式反应技术，对猪的外周血淋巴细胞的 订矿““n6Vi mRNA进行扩增，获得了抗体信号肽基因片段，经 证实没有碱基错配，将其克隆入真核表达载体
pcDNA3(1(+)内，完成了含抗体信号肽基因真核
载体的构建工作，这为开展蛋白质功能研究提供 图4猪抗体信号肽的疏水性预测
for Fig(4 Hydrophobicity the啦州peptide plot 一种可选用的表达系统。0f the of swine antibody 真核或原核细胞，分泌性蛋白质在合成完成
2(4重组质粒p3(1(SFc的构建及鉴定将重组 后，或者出胞或者在细胞内积累?]。一般而言，决
质粒T_SFc经过饿蒯?和BamH I酶切，纯化、 定蛋白质分泌和转运的是蛋白质N端一段额外
回收后插入到盒Hind m和BamHI缺口的pcD— 氨基酸序列，即信号肽一J。信号肽一般由20,30
NA3(1(+)载体质粒中，构建了重组质粒p3(1( 个氨基酸组成，N端1—5个氨基酸中含1个或
几
I酶切、 SFc。对p3(1(SFc进行饿以?+BamH 个带正电荷的氨基酸(亲水性氨基酸)，引导新生PCR扩增与序列测定，结果表明，S(Fc基因已成功 肽链向膜转移;中喘部分由7,16个氨基酸形成
3(1(+)内。 一段a螺旋结构的疏水区;C端4,6个氨基酸重组于真核表达质粒pcDNA 由
少数亲水性氨基酸组成信号肽酶的切割位点 [8]8。3讨论
信号肽的疏水区决定其对蛋白质的分泌效率，其基因的功能是通过表达的蛋白质来实现。对 分泌加工能力随疏水性增加而提高[9]9。我们对重
蛋白质功能研究多是先提纯蛋白质，再用于实验， 组载体p3(1(sFc中的抗体信号肽氨基酸序列分
蛋白质的提取、纯化等步骤较为繁琐，且条件要求 (下转第170页)
万方数据
中国预防兽医学报 2005年 170
Avian?seases 1983:27(1):255-660?里，外源基因的表达均主要以包涵体形式表达(图 [3]殷震，刘景华?动物病毒学[M]?第2版，北京:科学出版 略)，而且都得到了较高表达，达到28,。表明融
合表达载体pGEX一4T-1是表达ARV国基因理想 avi。删。;i让N,119Y97 ，’:嚣c(A。删ve岫of载体。该实验结果也为进一步深入研究ARV国 inducti。n。l。(州h啦renjcii:、，i。。 sp瑚d 二叫i咖。n-舳d
蛋白的功能奠定了基础。表达的国蛋白，经 。i。n[J](Avi。Disease，1995，39:554—566(
R M c(identification encode [5]NI ofProteins Westem Y，Raming byblot分析证实表达产物与抗ARV血清产 F，Kemp 撕“删“ses锄d硎8enoe胁posl—trouslational删ic撕on 生特异性反应，而ARV阳性血清不与GST反应，
所以GST-RI-a3蛋白可作ARV抗体检测抗原(，可 [6]蒜。竺篡!:ati。?tll。，瓜ei。0f用于探索以表达产物作为诊断抗原的ARV检测 vi(avi。二。。 vi。。andicedfu of。eu[J]。i。(蛐二。 nof方法的建立。 mlogy。1999，144:193—197(
[7]廖敏，谢芝勋，刘加波，等(鸡呼肠孤病毒分离与鉴定[J]( 参考文献:中国家禽，2002，24(1):12(14( [8]谢芝勋，廖敏，庞耀珊，等?禽呼肠孤病毒S1基因的扩增w(卡尔尼克(禽病学[M]，第10版，高福，苏敬良，译(北 [1]B 克隆与鉴定[J]?中国兽医科技，2000，30(8):3-京:中国农业大学出版社，1999，902(908( and5? [9]ShapoudMR，KsaneM，betarteM，眦al?Cloning，Sequencing S(Characteristics and of [2]DdeR，pedIoKH(Kleven pathogenicity of s1 of avian the reovirus[J](Gen Virol，1995，expression genetw0 avim reoviruses isolated from chickens with 1eg problems[J]( 76，1515—1520( 趟;开?出亦{!;行R!;尔趟;:蒋趟;乔{!矫?!;尔出寄出乔出尔{!;
尔趟;尔牝尔出乖趟f帘出尔也幂也乖出尔出尔也乖出乖出乖出零出尔出乔牝尔出尔趟钸巡矫也乔也幂也币巡;(奢也不牝不牝不道;(替出布也乖出尔也尔趟钸
[2]Gunnar vonH(Life and deathofa (上接第166页) si殍1al peptlde[J](Nature，1998， 396:111—112? 疏水核心区，具有分泌性信号肽的析发现，在多肽的6,16位氨基酸残基处有一个
结构特点，这使 [31竺需‘控制蛋白质传输的“邮政编码”一信号肽[J]?生物学 得外源基因在该重组载体中表达分泌成为一种可 笔耋嚣=i:二ch。础。?ich( Bi。alvtical。h。。俩枷。n能。 of of proteins[J](J01m磕I B，2001，756:113一112(Chromatography 目前研究认为，信号肽是引导蛋白质分泌的 [5]张利永，白云，姜曼，等(GPI锚固型CD46,CD55嵌合分子的 设计及构建[J]免疫学杂志，2002，18:33—36( 重要因素之一，带有信号肽的分泌型表达载体在
大肠杆菌、酵母表达系统中已得到了一定的应用，
在应用中发现，信号肽被信号肽酶正识别和切割:
bacill“in [6]Harold T，舭僦B?peptide-dependent pratei“transport
=:::=三芝蒜?卜?出。蛔时，能促进产物的分泌，提高蛋白质的分泌效率 [7]Ni。l。H，B诎s，HeijneG(Machinel一崦。pp—h磊fortIl。other sj删s[J] (等【10,11]。但是，分泌型的真核表达载体在哺乳动predi。ti?of signal peptid?and protein sorting
Eng，1999，12:3-9( 物组织细胞中应用，信号肽是否被识别和切割没Protein A R H?1nfluence of on the[8]?ong 8，Peng 8ignal pepti88 sequence 有直接的证据。为了进一步证实信号肽在哺乳动
物组织细胞中对表达产物的活性和分泌效率是否三i:::::::篙羞，in，:H，c54hi(a。嚣咖札川?A咖Bi0一有影响，能否提高产物的分泌效率以及能否被哺 [9]I。珂J B，融。dall D w，DoL 蒜MA(Phy。 ical舳d。棚i妇乳动物组织细胞的信号肽酶正确识别和加工，为 thei。bi。( propeni。of syntheti。idealized。ignal sequ。。。。parallel
function[J](Biochemistry，1995，34:9904—9912( 此，本研究进行重组载体构建时，在抗体信号肽基lomcal and se‘J，SteynA J，PretoriusI S，咖l-Expression [10]SouthgateV 因3’端下游增加可供肽酶识别的位点，以达到优
化真核表达载体的目的。 。毗“?龇mu8(8myl?1讲埘”咖mplla’?17姆“n8岫and leader myeast pheromone alpha-factor sequence promoter Environ Saccharomyces cerevislae[J]?Appl Micmbiol，1993，59: 参考文献: 1253(1258( G(Genome—wide of WaUin mel,lbrane [1] integral E，Heijne analysis [11] 章美云，杨青，赵莉，等(原核分泌型表达载体的构建及癌 from eubacterial，archaean，and eukaryotic organisms[J]( proteins 胚抗原单链抗体的表达[J](中华微生物学和免疫学杂志， Protein Sci，1998，7:1029—1038( 1998(8:72(75(
万方数据
范文四：抗体信号肽基因的克隆和序列测定及真核表达载体的构建
抗体信号肽基因的克隆和序列测定及真核
表达载体的构建
第27卷第3期
2005年5月
中国预防兽医
C~neseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine
Vo1.27.No.3
May,.2OO5
抗体信号肽基因的克隆和序列测定及真核表达载体的构建
陈金顶,赵明秋,索青利,黄青云,廖明
(华南农业大学兽医学院,广东广州510642)
摘要:根据抗体重链与轻链基因的核苷酸序列设计并合成了1对引物,以猪外周血淋巴细胞基因组mRNA为模板,
通过RT-PCR方法获得了一大小约85bp的DNA片段,并将其克隆到pGEM—T载体上进行序列测定,测序结果显示,猪抗
体信号肽基因核苷酸序列长度为57bp,编码I9个氨基酸,核苷酸及推导的氨基酸序列与已发表的抗体信号肽基因序列
一
致,同时在信号肽基因3'端下游提供可供肽酶切割的窗口和外源基因的克隆位点.然后将信号肽基因亚克隆到真核
表达载体pcDNA3.1(+)中,成功构建了一含信号肽序列的真核表达载体3.1-SFc,为外源基因在pcDNA3.1(+)中的表达
与分泌提供了一有效的信号肽,也为研究基因的功能奠定了基础. 关键词:抗体信号肽;基因克隆;序列测定;载体构建
中图分类号:S852.659.5;Q78文献标识码:A文章编号:1008.0589(2005)03.0164-03
Molecularcloningandsequencingofthegeneencodingsignalpeptidefor
antibodyofswineandconstruction0fitseucaryoticexpressionvector
CHENJin-ding,ZHAOMing?qiu,SUOQi.g-li,HUANGQing?yun,LIAOMing
(FacultyofVeterinary,SouthClfinaAgriculturalUniversity,GoangzhoLi510642,China) Abstract:Afragmentabout85bpwasamplifiedbyRT-PCRtechniquefromthegenomemRNAoflymphocytefromswine,l】sing
primersdesignedandsynthesizedaccordingtothegenesequenceencodingsignalpeptideforantibodyofswine.Theamplifedfragments
wereclonedintopGEM-Tvectorandthensequenced.Thedeterminationofnucleotidesequenceshowedthatthegeneencodingsignal
peptideforantibodyofswinespanned57bp,encoding19aminoacidsandthenucleotideandaminoacidsequenceofthegeneclonedWas
thesameasthereportedsequences,andin3'endunderstreamofthegeneencodingsignalpeptideforantibodyofswinethesignalpepti—
dasecleavagesiteandcloningsitesforforeigngenecouldbeprovidedbytherecombinantplasmid.andthenthegeneencodingsi
peptideforantibodyofswineWassubclonedintopcDNA3.1(+)andverifiedbyPCRandrestrictionendonucleasedigestion,therot2om—
binanteucaryoticexpressionvectorofthep3.1-SFcWassuccessfullyconstructed.Thisresultlaidfoundationforfurtherstudyofthere?
combinanteucaryoticexpressionvectortoproduceandsecreteaforeignproteinfromlivingceilsandstudyofthefunctionofgene.
Keywords:signalpeptideforantibody;geneclone;sequencing;constructionofvector 细胞内合成的蛋白质释放到胞外的机制是多
样的,其中信号肽引导蛋白质的分泌是蛋白质释
放的主要方式之一…l.信号肽参与引导蛋白质的
分泌,它对蛋白质的分泌效率起主导作用L2J.初
生蛋白质在细胞内正确定位后,信号肽被信号肽
酶识别,水解,然后被释放出细胞,同时经过折叠
等立体构象的变化,转变为成熟的蛋白质.1972
年研究首次发现免疫球蛋白(I)轻链在合成时
基金项目:广东省自然科学基金资助项目(项目编号: 020095)
作者简介:陈金顶(1964,),男,副教授,博士,主要从事动 物微生物学与免疫学及动物病毒分子生物学 教学与研究工作.
收稿日期.2004—03—02
以前体形式存在,它的N末端比成熟的轻链多出 一
段约由20个氨基酸的多肽,这段多肽使I轻 链通过内质网分泌到细胞之外,具有信号肽的作 用l.国外进行基因表达所采用的分泌信号大致 有以下几种情况:?与表达蛋白质同源的分泌信 号肽;?与宿主表达细胞同源的分泌信号肽;?机 体内表达的分泌蛋白的分泌信号肽.为研究信号 肽在真核细胞中的表达分泌作用,我们利用反转 录.聚合酶链式反应技术,对在哺乳动物体内具有 表达分泌作用的猪抗体信号肽基因进行扩增及序 列分析,并将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1 (+)中,构建含哺乳动物抗体信号肽基因的真核 表达载体,为基因功能及DNA免疫的研究开拓新 的思路.
第3期陈金顶,等.抗体信号肽基因的克隆和序列测定及真核表达载体的构建
1材料和方法
1.1材料菌种E.coilTOP10株为本实验室
自存.pcDNA3.1(+)真核表达载体为Invitrogen 公司产品;pGEM.TEasy载体质粒系统为Pmmega 公司产品.核酸抽提试剂TRIz0JLSReagent,SU.
PERSCRIPTTM11反转录酶,TaqDNA聚合酶为In.
vitrogen公司产品;T4DNALigase为USB公司产
品;限制性内切酶?和BamI为Amersham PharmaciaBiotech公司产品:琼脂糖凝胶DNA回收 试剂盒为Pmmega公司产品:Oligo(dT),Random primer为Invitrogen公司产品:淋巴细胞分离液购 自华美公司.
1.2引物设计与合成根据已发表的猪抗体基
因核苷酸序列,设计了S.Fe.5和S.Fc.e一对引物, 其中S.Fc.5的5'端带有胁?和XhoI酶的识
别序列.S.Fc.3的5'端带有BamHI酶的识别序
列.引物序列如下:S.Fc.5:5'.GCAAGCTI'CTC. —
GA—
GATGGAGTITCGCA:TGAACT-3';S?Fe?3:5'-TC
塑AAAGTCACCC咖ACACCTI?TAAGA?3'. 1.3外周血淋巴细胞的制备用口蹄疫灭活苗免
疫猪,ELISA检测抗体,无菌取血清抗体效价较高
猪的外周全血5mL,50U肝素钠抗疑,然后轻轻叠
加到密度为1.077的淋巴细胞分离液上层,1500g 离心15min;取界面层细胞,置50mL离心管中,用
1×PBS悬浮细胞,3500g离心3min;弃上清,调整
细胞浓度,制成细胞悬液,一80?保存.
1.4淋巴细胞总RNA的提取与cDNA的合成
参照Invitrogen公司rrfolLSReagentRNA提取试
剂盒的使用说明,提取淋巴细胞总RNA,将获得
的RNA溶于DEPC处理水中,根据SuperscriptTM11 反转录酶系统的使用说明,用Oligo(dT)/Random primer引物对淋巴细胞总RNA进行第一链cDNA 合成.
1.5信号肽基因cDNA的PCR扩增根据Invit. rogen公司的TaqDNA聚合酶使用说明,取淋巴细 胞总RNA的cDNA产物,使用S.Fc.5和S.Fc.3引 物进行抗体信号肽基因的PCR扩增,CPR产物用 2%琼脂糖凝胶电泳检测.
1.6信号肽基因的克隆与序列测定应用琼脂 糖凝胶DNA回收试剂盒对PCR产物进行分离纯 化,纯化的PCR产物克隆到pGEM.TEasy载体上, 转化TOP10感受细胞,提取质粒筛选阳性克隆. 挑取2个阳性重组质粒利用ABI377型全自动测 序仪,读取猪抗体信号肽基因核苷酸序列. 1.7信号肽基因序列分析在DNAstar软件的 辅助下,对抗体信号肽基因S.Fc核苷酸序列及推 导的相应氨基酸序列进行分析,并与已在Ge. Bank中注册的一些抗体信号肽基因相应序列 (GenBankID分别为AF062384,M81769和 M81771)进行同源性比较.利用BiomolecularMod.
elling服务器KHYROPHOBICn1YPIDT1.0,根据 Kytet-Doolittle方法,对抗体信号肽基因推导出的 氨基酸序列进行HYDROPH0BICn1Y分析. 1.8信号肽基因重组载体的构建对1.6获得 的含抗体信号肽基因的重组质粒T-SFe进行 ?和BamHI酶切,回收,纯化后,酶切产物与经 过相同酶切处理的pcDNA3.1(+)连接.转化E. coliTOP10感受态细菌,提取重组质粒,用胁 ?和BamHI双酶切,PCR鉴定和序列测定,筛选 含信号肽基因S.Fc的重组质粒.
2结果
2.1信号肽基因RT.PCR扩增以淋巴细胞基
因组总RNA为模板,用引物Oligo(dT)Random primer进行cDNA合成,用S.Fc.5/S.Fcf-3一对引 物对所获得的cDNA模板进行PCR扩增,成功地 扩增出一条长约85bp的特异条带,其大小与预 计的相吻合(图1).这初步表明S.Fc基因已得到 扩增.
M.1KbPlusDNAAldderf;1.淋巴细胞mRNART-PCR产物 (mRNART-PCRproductsofLomphocyte)
图1RT-PCR产物的鉴定
Fig1IdentificationofRT-PCRproducts
2.2信号肽基因的克隆及鉴定将经纯化的抗 体信号肽基因插入到载体质粒pGEM.TEasy的外 源基因位点中,构建了重组质粒T.SFc.鉴定表 明,S.Fc基因已正确插入到载体质粒pGEM.T Easy中.
2.3信号肽基因序列的生物信息学分析对测 定序列编辑后,获得抗体信号肽基因的核苷酸序 列,其长度为57bp,由该核苷酸序列推导出的相 应氨基酸序列包含19个氨基酸(含有起始密码子 ATG)(图2).将抗体信号肽基因的核苷酸序列与
中国预防兽医2OO5正
GenBank中注册的相应基因序列比较后发现,它 们的同源性为100%(图3).通过HYDROPHO— BICITYPI.DT1.0服务器,对抗体信号肽氨基酸序 列进行HYDROPHOBIc?Y分析发现,在编码信号 肽的第6,16位氨基酸残基处形成1个疏水核心 区,分别在第3,6位氨基酸残基处与l6,l8氨 基酸残基处形成1个亲水核心区(图4). ATGGAGTTTCGGCTGAACTGGGTGGTCTTGTTTGCTCTCTTACAAGGTGTC
CAGGGT
MEFRLNWVVLFALLQGVQG 图2猪抗体信号肽基因核苷酸序列及推导的相应氨基酸序列 Fig.2ThenucleotideanddeducedaminoacidsecIIlence8ofthegeneencodinggnalpepfidefo
r~ntik,,tyofswine
^TG'^GTTTcGGcTG^^cTGGGTGGTcTTGTTTGcTcTcTT^c^^GGTGTIt,~eri乞f
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图3猪抗体信号肽基因核苷酸序列的比较
Fig.3~lpslJsonofnucleotide.$~lllenee$ofthegeneencodingsi1alpepfideforantibodyofsw
ine
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图4猪抗体信号肽的疏水性预测
FIg.4Hydrophobicityplotforthesignalpepfide
0ftheantibodyofswine 2.4重组质粒p3.1一SFc的构建及鉴定将重组 质粒T.SFc经过胁?和BarnHI酶切,纯化,
回收后插入到盒胁?和BamHI缺口的pcD— NA3.1(+)载体质粒中,构建了重组质粒p3.1一 SFc.对D3.1一SFc进行Hindm+BamHI酶切, PCR扩增与序列测定,结果表明,S—Fc基因已成功 重组于真核表达质粒pcDNA3.1(+)内.
3讨论
基因的功能是通过表达的蛋白质来实现.对
蛋白质功能研究多是先提纯蛋白质,再用于实验,
蛋白质的提取,纯化等步骤较为繁琐,且条件要求 目的-ri々Ir
较高.目前,原核表达的蛋白质较难满足实验要 求l4],为解决这些问题,常采用真核表达和融合分 泌表达以获得蛋白质l5].融合分泌表达可提高表 达效率,增加表达产物的稳定性,并可利用生物化 学专一性结合作用,使得重组蛋白质得到有效回 收和纯化,且外泌可使表达产物避免胞内蛋白酶 的降解,利于产物的纯化.本研究利用反转录一聚 合酶链式反应技术,对猪的外周血淋巴细胞的 mRNA进行扩增,获得了抗体信号肽基因片段,经 证实没有碱基错配,将其克隆人真核表达载体 pcDNA3.1(+)内,完成了含抗体信号肽基因真核 载体的构建工作,这为开展蛋白质功能研究提供 一
种可选用的表达系统.
真核或原核细胞,分泌性蛋白质在合成完成 后,或者出胞或者在细胞内积累J.一般而言,决 定蛋白质分泌和转运的是蛋白质N端一段额外 氨基酸序列,即信号肽[.信号肽一般由2o,30 个氨基酸组成,N端1,5个氨基酸中含1个或几 个带正电荷的氨基酸(亲水性氨基酸),引导新生 肽链向膜转移;中喘部分由7,l6个氨基酸形成 一
段a螺旋结构的疏水区;c端4,6个氨基酸由 少数亲水性氨基酸组成信号肽酶的切割位点J. 信号肽的疏水区决定其对蛋白质的分泌效率,其 分泌加工能力随疏水性增加而提高J.我们对重 组载体p3.1一SFc中的抗体信号肽氨基酸序列分
(下转第170页)
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l7O中国预防兽医2005正
里,外源基因的表达均主要以包涵体形式表达(图 略),而且都得到了较高表达,达到28%.表明融 合表达载体pGEX一4T_1是表达ARV?基因理想 载体.该实验结果也为进一步深人研究ARVo3 蛋白的功能奠定了基础.表达的鸭蛋白,经 Westernblot分析证实表达产物与抗ARV血清产 生特异性反应,而ARV阳性血清不与GST反应,
所以GST-R1一蛋白可作ARV抗体检测抗原,可
用于探索以表达产物作为诊断抗原的ARV检测
方法的建立.
参考文献:
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尔!;尔乖!矫希带看乖出希许希何芥钎帘钎钎钎;
(上接第166页)
析发现,在多肽的6,16位氨基酸残基处有一个
疏水核心区,具有分泌性信号肽的结构特点,这使
得外源基因在该重组载体中表达分泌成为一种可
能.
目前研究认为,信号肽是引导蛋白质分泌的
重要因素之一,带有信号肽的分泌型表达载体在
大肠杆菌,酵母表达系统中已得到了一定的应用,
在应用中发现,信号肽被信号肽酶正识别和切割
时,能促进产物的分泌,提高蛋白质的分泌效率
等[10,11].但是,分泌型的真核表达载体在哺乳动
物组织细胞中应用,信号肽是否被识别和切割没
有直接的证据.为了进一步证实信号肽在哺乳动
物组织细胞中对表达产物的活性和分泌效率是否
有影响,能否提高产物的分泌效率以及能否被哺
乳动物组织细胞的信号肽酶正确识别和加工,为
此,本研究进行重组载体构建时,在抗体信号肽基
因3'端下游增加可供肽酶识别的位点,以达到优
化真核表达载体的目的.
参考文献:
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三三…
范文五：信号肽分析
信号肽预测工具SignalP中文说明
SignalP大名鼎鼎的信号肽预测服务器，它的功能是预测给定的氨基酸序列中是否存在潜在的信号肽剪切位点及其所在，原核生物和真核生物都可以进行预测。目前服务器提供的是SignalP 3.0版本。
这个是我们输入序列的界面，我们来简单的说一下使用（基本是翻译的O(∩_∩)O哈哈~不用去看英文的了）：
提交序列中的选项
A．序列输入方式：
有两种方式：一种是直接输入FASTA格式的氨基酸序列，可以是一条也可以是多条；另一种是本地上传包含含有FASTA格式序列的文件。
这里要注意我们必须输入氨基酸序列，看过有的朋友用核酸序列去预测的；输入的氨基酸序列为单字母简写形式。除了20中氨基酸外，仅允许使用X代表未知氨基酸。所有序列中的其他字母（非20种氨基酸简写和X的）被视为X；所有的非字母字符将会自动忽略。
还要注意的是对序列长度和多少的限制：每次最多提交2000条序列进行分析；总氨基酸残基不能超过20万；每条序列不能超过6000残基。其实一般来讲我们都不会有这么多序列一起去预测的O(∩_∩)O哈哈~
B．物种选择：
根据你预测的蛋白质来源选择革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或真核生物。
C．方法选择：
可选神经网络法（neural network，结果中简写NN）；隐马可夫模型（hidden markov models，结果中简写HMM）以及联合两种方式。默认为两种一起预测。
两种方法各自的优势：HMM主要在于预测是否含有信号肽；NN主要为预测信号肽位点。
D．是否输出图表：
图表方式显示的界面要直观一些，默认为GIF格式，不用改了。
E．输出格式：
默认为标准模式，输出的结果中含有预测的图表，序列的总体分析数据如是否含有信号肽及其位点；Full模式除Standard中含有的数据外还有每个氨基酸对应的相应分析数据；Short的结果仅有序列的总体分析数据。同样建议默认不要改变。因为
full模式中数据对我们来说意义不大。
F．分析长度：
一般来讲，信号肽在蛋白质N端，极少超过45个氨基酸残基。所以在序列中仅N端部分序列对信号肽的分析预测具有重要作用。默认为分析N端70个氨基酸，后面的不做分析。如果你想要全部的分析将此值设置为0即可。
G．隐私声明：
分析结束后会删除你提交分析的数据。
结果显示
神经网络法NN中结果主要主要涉及3个值：C、S和Y。
S值：每个氨基酸对应1个S值，在结果显示的图表中有一个曲线显示S值的变化趋势，（在full模式中可以看见具体数值），信号肽区域的S值较高。
C值：剪切位点值。每个氨基酸会有一个C值，在剪切位点处C值是最高的。
Y值：Y-max综合考虑S值和C值的一个参数，其比单独考虑C值要更精确。因为在一条系列中C值可能有不止一个较高的位点，但是剪切位点只有一个；此时的剪切位点就由Y-max值来推测的，为S值是陡峭的位置和具有高C值的位点。 在现在的3.0版本中还有两个值S-mean和D值。
S-mean是从N端氨基酸开始到剪切位点处各氨基酸的平均S值。
D值是S-mean和Y-max的平均值，对区分是否为分泌蛋白具有重要作用。
隐马可夫模型（HMM）主要计算序列中是否含有信号肽，在真核生物的预测中还有signal anchor的一个参数（相当于信号肽），并进一步分为n-region、h-region和c-region三个部分。
这里我就直接用服务器中提供的结果说明为例。
在分泌蛋白的预测结果中，NN法Signal peptide列中结果为yes，并根据C值、S值和Y值等给出潜在的剪切位点；图表右上角处有C值、S值和Y值的曲线颜色指示，图表中有各值的变化趋势曲线。
HMM法文本结果显示其含有信号肽的可能性以及潜在的剪切位点；图表中给出信号肽不同区域划分的预测。
如果在输入序列时选择输出格式为“short”，显示结果如下，结果看起来就不是很直观了，建议还是不要选择short输出类型。
