955599
范文一：微生物功能基因组学 翻译
The polar clusters. R. sphaeroides cells typically have a chemotaxis cluster at each pole (FIG. 3). These clusters comprise the transmembrane chemoreceptors and the cheop2-encoded proteins CheA, CheW , CheW and CheR. Cluster formation depends on CheA, CheW, CheW and the 2232223
chemoreceptors. The cluster senses the periplasmic concentration of chemoeffectors and controls the rate at which CheA autophosphorylates. CheA-P is capable of phosphorylating all of 22
the R. sphaeroides chemotaxis response regulators, meaning that the polar cluster can influence the phosphorylation levels of all of the chemotaxis response regulators in the cell.
The cytoplasmic cluster. The cytoplasmic cluster comprises the cytoplasmic chemoreceptors and the cheop3-encoded proteins CheA, CheA, CheW and CheR (ReF.73). Cluster formation 3443
requires the cytoplasmic chemoreceptors along with CheW and either CheAor CheA (ReF.83). 43 4
As with the polar chemo-taxis clusters, there are >1,000 chemoreceptors and associated chemosensory proteins in the cytoplasmic cluster. The arrangement of the proteins is unknown, and it is unclear how they form a quaternary complex in the absence of a membrane scaffold. Newly divided wild-type cells typically have a single cytoplasmic cluster located approximately at mid-cell. Unlike the polar chemotaxis clusters, which are automatically segregated at cell division (as each daughter cell inherits one pole from the parent), the cytoplasmic cluster requires a spe-cialized mechanism of protein segregation to ensure that each daughter cell inherits a cluster (FIG. 3) . Before cell division, the single cluster located at mid-cell seems to become two clusters that migrate to about the one-quarter and three-quarter cell positions, one at each position, ensuring that each daughter cell inherits a single cluster. This intriguing mechanism uses PpfA, a protein encoded in cheop3 that is a homologue of the ParA family type I DNA-partitioning ATPases (which are involved in plas-mid and chromosome partitioning). PpfA controls the number and positioning of cytoplasmic clusters. ΔppfA mutant cells have aberrant positioning of
the cytoplas-mic cluster and rarely contain more than a single cluster; the two daughter cells inherit either a single cluster or no cluster at all. Although the daughter cell lacking a cluster eventually synthesizes a new one, the delay could explain the reduced chemotaxis phenotype of the ΔppfA mutant.
The cytoplasmic cluster, which is believed to sense the metabolic state of the cell, controls the activity of the two unusual CheA homologues, CheA and CheA. CheA is an N-terminally 344
truncated CheA homologue that lacks the P1 and P2 domains but retains the P3–P5 domains,
while CheA 3 has a P1 and a P5 domain separated by a novel 794 amino acid sequence that has phosphatase activity. On stimulation, CheA phosphorylates the P1 domain of CheA on His51. 43
Unlike CheA-P, which can phosphorylate all eight of the chemotaxis responseregulators, CheA-P 23
acts as a phosphodonor for only CheY, CheYand CheB (ReF.75). CheYand CheB are encoded 16 262
by cheop3 and are essential for normal chemo-taxis; however, CheY is encoded by cheop1 and is 1
not expressed in wild-type cells under laboratory conditions. The cytoplasmic cluster is therefore capable of directly influencing the phosphorylation state of only two of the five chemotaxis response regulators that are nor-mally expressed in wild-type cells, CheY and CheB. In addition 62
to its ability to act as a phosphodonor to these response regulators, CheAshows specific 3
phosphatase activity towards CheY-P; this activity depends on the novel 794 amino acid 6
sequence in CheA (ReF.88). CheA and CheA have different receptor-binding (P5) domains; 334
therefore, independent regulation of the kinase activity of CheAand the phosphatase activity of 4
CheA could be crucial for this pathway. The cytoplasmic cluster, which is believed to sense the 3
metabolic state of the cell, controls the activity of the two unusual CheA homologues, CheA 3
and CheA. CheA is an N-terminally truncated CheA homologue that lacks the P1 and P2 44
domains but retains the P3–P5 domains, while CheA has a P1 and a P5 domain separated by a 3
novel 794 amino acid sequence in CheA(ReF.88). CheAand CheA have different 33 4
receptor-binding (P5) domains; therefore, independent regulation of the kinase activity of CheA 4
and the phosphatase activity of CheA 3 could be crucial for this pathway.
Role of CheY. Wild-type R. sphaeroides expresses three of its six CheY proteins under laboratory conditions: CheY, CheY and CheY. CheY is essential for chemotaxis, but there is redundancy 3466
between CheYand CheY, with only one being required for chemotaxis. In the absence of 3 4
chemotaxis proteins, the flagellar motor rotates con-tinuously. CheY-P is capable of stopping the 6
flagellar motor alone, but without CheYor CheY, it is unable to support chemotaxis. All three of 3 4
these CheY homo-logues can bind the FliM component of the Fla1 flagellar motor in vitro, but the
effects of CheY-P and CheY-P binding on flagellar rotation are unknown. 34
范文二：宏基因组学_慧眼巧识微生物_王庆
工人日报 /2014年 /2月 /21日 /第 006版
科技时空
宏基因组学:慧眼巧识微生物
王庆
近来, H7N9禽流感病毒正在人际间传播,时而有新增病例出现。其实,人们的生活从未免 于来自细菌、病毒等各种微生物的威胁。
在回答如何应对之时, 或许我们首先应该问问它们是谁?事实上, 在种类庞杂的微生物当中, 人类只认识其中的 1%。而且,很多微生物实际上还是我们的朋友。更好地识别微生物,将有助 于人类对其趋利避害。
准确抓住“真凶”
目前,新兴的宏基因组学及其技术正成为巧识微生物身份的慧眼。
“我感染了什么病毒和细菌?”病人总会想当然地认定:“真凶”会被查出。
然而现实并非如此,医生并不总是能够搞清楚是什么有害的微生物正在患者体内肆虐,威胁 着他们的健康。
常规检测是利用分离培养的方式查明“凶手”的身份,而无奈的是,有相当比例的病原微生 物则是无法培养的。
“有些病菌是无法通过实验室培养的方法检测出来的,或者会漏掉其中某些起重要作用的种 类,这都会影响治疗效果。 ”北大人民医院呼吸内科主任高占成这样说。
然而,随着宏基因组学的介入,这一现状正在发生改变。
所谓宏基因组(Metagenome ) ,也称环境微生物基因组或元基因组,即环境中全部微小生物 遗传物质的总和。
中科院北京基因组研究所技术研发中心常务副主任任鲁风解释道,宏基因组学研究的就是一 个特定环境中所有微生物的核酸序列,分析这个环境中到底有哪些微生物存在,哪种微生物在这 个环境中当老大,它们对这个环境以及相互之间有哪些交流和互动。
“这个环境可以是大兴安岭的一块黑土,也可能是南极的一片浮冰,当然也可能是某个发热 病人的一口痰。 ”任鲁风说。
据他介绍,宏基因组学技术的操作步骤包括样品采集、核酸提取、大规模测序、数据比对检 索分析、生物学功能分析等,整个过程中无须对目标微生物进行分离、纯化和培养富集。
“也就是说,这一研究手段并不在乎样品中有何种微生物,也不在乎有多少,而是只要在样 品中,就统统把核酸序列测定出来,然后再通过和已有的核酸序列数据进行比对,判断已知种类 和对未知种类进行预测。 ”任鲁风表示。
应用前景广泛
由于上述特性,宏基因组学有着巨大的应用前景。
人们怀疑很多引起疾病的真正病原物存在于大量的不可培养微生物中。科学家正利用宏基因 组学研究无法培养的人体微生物,从而解开这些谜团,发现新发传染病病原以及未知病原。 高占成认为,宏基因组学可以帮助临床医生更有效地发现和分析致病微生物。
而且,通过宏基因组学方法,科学家还能清晰地描绘出各种特定环境中的病毒谱,有助于了 解病毒的分布动态,实时监测一些致病性病毒和潜在致病性病毒的变化情况,并有助于诊断一些 新发的或尚不明病原体引发的疾病,还能快速地侦检突发病毒性公共卫生事件。
不仅限于医疗健康领域,宏基因组学还可在发酵工业、农业、水产养殖业等领域大显身手。 中科院北京基因组研究所副研究员吴双秀表示:“以前要对复杂环境中的微生物逐一进行培
养测定,时间长,工作量大,而且最终还不一定能够培养出来。 ”而宏基因组学技术则可帮助人 们高效地分析和确定哪些微生物在发酵过程、作物生长的土壤以及水产养殖环境中起着关键作 用。
吴双秀正在研究沼气发酵中哪些是起关键作用的优势菌群,用哪些原材料更容易产生这些优 势菌群等等,从而提高沼气的产出效率。
此外,宏基因组学还被应用于酶制剂的开发。酶制剂作为生物催化剂广泛应用于生物医药、 食品、造纸等多个领域。据了解,科研人员正在利用宏基因组学技术开发更多新颖高效的酶类。 相关科技助力
随着研究的深入,宏基因组学的应用并不仅限于上述领域,它能够发挥出如此优异的表现, 很大程度上离不开高通量基因测序技术等相关科技的发展。
据了解,高通量测序技术的出现大大缩减了基因测序的成本,并使得基因组的高覆盖度成为 可能,从而使人们以更低廉的价格,全面、深入地分析基因组的各项数据。
而与宏基因组学策略相近的宏转录组学和宏蛋白质组学的发展,则弥补了宏基因组学检测基 因或代谢途径发挥作用的不足。
宏基因组学提供环境中总 DNA 的信息,宏转录组学提供实时的环境基因表达信息,宏蛋白 质组学可以提供表达产物的功能信息。把这些“组学”联系起来,有助于从基因到蛋白质的全面 研究。
此外,合成生物学、纳米技术等相关学科的发展,也从不同角度促进宏基因组学向前迈进。 推广瓶颈尚存
然而,如同其他科技领域的新事物一样,宏基因组学的大规模应用仍然面临不少问题。 高占成表示,宏基因组学技术的相关设备和试剂昂贵,应用成本高,而技术本身的稳定性和 灵敏度也有待进一步提高。
而且, 他以医疗领域的应用为例, 认为尽管宏基因组学具有传统培养法所不具备的临床优势, 但医生从熟悉到接受需要一个较漫长的过程。
吴双秀指出, 宏基因组学若要发挥更大作用, 就必须建立更加丰富的微生物基因数据库。 “现 在高通量测序效率很高,但 90%的结果缺乏相应的数据库作为比对参照。 ”
中科院北京基因组研究所楚亚男博士打比方说,数据库中的数据就像尺子,其刻度的准确精 细、种类的丰富,是衡量和分析测序数据的重要基础之一。
她表示,目前数据库资源有赖于各个国家不同研究中心之间共享,面对海量数据增长,如何 确保数据的准确性、避免数据更新滞后和冗余,都是数据库运行和管理所面临的难题。
范文三：微生物功能基因组学研究
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微生物功能基因组学研究
黄留玉王恒!史兆兴朱厚础苏国富
（军事医学科学院生物工程研究所北京2$$$02）
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（!
关键词：微生物功能基因组学，药物靶位，疫苗，生物功能图谱
中图分类号：J/
［2］自从2//3年流感嗜血杆菌的基因组序列测定完成之后，目前已有03种（株）微生物的基因组完成
［#］测序，（株）微生物的基因组测序正在进行中。随着各种微生物基因组测序工作的不断完成和2%$多种
序列信息的积累，微生物基因组学研究的重点已由结构基因组学向功能基因组学转移。微生物功能基因组学研究不仅要阐明微生物基因组内每个基因的作用或功能，还要研究基因的调节及表达谱，进而从整个基因组及其全套蛋白质产物的结构、功能、机理的高度去了解微生物生命活动的全貌，揭示微生物世界的各种前所未知的规律，并使之为人类和社会服务。
与真核生物相比，虽然微生物的基因组相对简单，但微生物基因组学研究仍具有重大的科学和经济意义。在细菌基因组中，既有编码在极端环境下起催化作用的酶的基因，也有编码分解化学污染物的酶的基因，这些基因在真核细胞是不存在的。通过微生物功能基因组学研究，还能发现药物靶位和疫苗抗原。微生物基因的功能及表达研究结果也能为研究复杂生物的基因功能提供参考。
近些年微生物功能基因组学研究受到了普遍重视。日本组织了十几所大学和研究机构，计划用3
［
［!］究。其它微生物的功能基因组学研究也在进行中。由于微生物的种类繁多，功能基因组研究的内容又较丰富，要全面介绍微生物功能基因组学研究是困难的。本文仅从未知功能基因的鉴定、药物靶位及疫苗抗原研究、致病机制研究、生物功能图谱研究!个方面进行简要的评述。
1未知功能基因的鉴定
一株微生物的基因组序列测定完成后，虽然对其基因组进行了功能注释，但仍有许多开放阅读框（LM-,N-9O8’P=，LN8）的功能不明确。例如，到序列发表时，仍有!#Q的流感嗜血杆菌、
［］是微生物功能
基因组学研究的重要方面，
也是深入开展微生物功能基因组学研究的基础。
基金项目：国家重大基础研究发展规划（/0
(：?+9,@(AB,>C)D=>)9C)C,;
收稿日期：修回日期：#$$#5225$0，#$$
3期黄留玉等：微生物功能基因组学研究-33未知功能基因的鉴定方法可分为两大类。一类是高通量的初步鉴定技术，另一类是系统分析技术。高通量的鉴定方法主要是生物信息学技术、基因芯片技术和蛋白质组学技术等。利用生物信息学技术研究未知功能的基因，主要依靠两个途径：一是在!
［］比较了热休克处理前后大肠杆$%&’()*+等,应用大肠杆菌的-./0个预测的1$2制备一个高密度芯片，
［6］菌的基因表达变化，结果显示30多个未知功能的基因可能与热休克有关。45等应用!
枯草杆菌在厌氧条件下($
［:］知功能的基因进行初步的功能分类。7588)9等应用蛋白质组学技术比较了大肠杆菌生长在36;和-;
时蛋白表达谱的变化，发现在-;时,0
克隆、突变体构建及表型分析等是鉴定未知功能基因的有效方法。通过克隆一方面能够纯化靶基因编码的蛋白，通过研究基因产物的功能及定位来确定基因的功能；另一方面通过克隆，可以为芯片制
［］备等研究提供!
逐一进行克隆。构建基因突变体并分析每个突变体的表型，已被用来系统分析大肠杆菌、枯草杆菌、脑
［/］［-］膜炎球菌等微生物基因的功能。1>?@?A?8?等利用质粒B=CDE
枯草杆菌的突变体，用于枯草杆菌基因组的功能分析研究。我们实验室应用自杀质粒构建突变体研究痢疾杆菌的体内表达基因的功能，也取得了较好的结果。在微生物功能基因组学研究中，最简单的表型分析是监测在不同条件下突变体在平板培养基上的生长状态。如在枯草杆菌的功能基因组学研究中，
［-］他们观察了温度、抗菌素、营养等对突变体的影响，在实验的6:/个突变体中，有3.:个有表型变化。
［］明确了300多个未知基因的功$)@@等F0用.0种不同的生长条件对:000株酵母菌突变体进行表型分析，
能。
（78)95%*H)8&5II@5B?8?9%)*)HJGK，基因的功能鉴定是一个研究未知功G型链球菌细胞分裂蛋白B&@G）
能基因的较好实例。!
该基因是单顺反发现它与单核细胞增生李斯特菌中的胞壁质水解酶有同源性。
子转录结构。应用插入失活突变体研究其在细胞中的作用，表型分析发现该突变体对抗生素及渗透压
［FF］敏感。综合上述研究结果，最后将!
由此可以看出，鉴定未知基因的功能是一项复杂的工作，需要多种技术综合应用。我国比较重视疾病相关基因的研究，在微生物基因的研究上相对较薄弱。我国虽然自己也进行了几个微生物基因组序列的测定，同时国家自然科学基金等基金管理部门都把微生物功能基因组研究放在优先资助的位置，但很少有单位开展大规模的微生物基因功能的研究工作。
!药物靶位及疫苗抗原研究
抗生素是控制传染病的有效武器，对传染病的治疗发挥了积极的作用。但随着耐药菌株的增多，特别是多抗性菌株的出现，给抗生素的应用提出了严峻的挑战。由于技术的限制及对微生物认识的局限，虽然世界各国都投入了大量的人力、物力开展新型抗生素研究，但近30年来仍没有新型的抗菌素出现。微生物基因组的研究，尤其是微生物功能基因组学研究为抗菌素研究提供了新的发展机遇。一方面是为抗菌素的研究提供了新的靶标和技术；更重要的是为抗菌素研究提供了新的研究思路。
新的研究思路是以微生物基因组为基础，利用微生物功能基因组学研究技术，高通量寻找药物靶标。主要技术路线是：首先应用生物信息学技术寻找微生物的保守基因；再用基因灭活技术从保守基因
;#;微生物学报;#卷中寻找微生物生长必需基因，并以此作为候选药物靶标；最后应用综合方法对这些靶标进行筛选，寻找
［!
［!#］。一类是革兰氏阳性和阴性菌共有而人类没有的从药物研究的角度，微生物的保守基因有#类
基因。这类基因是广谱候选靶标，用于广谱抗微生物药物的研究。可通过多种微生物基因组的比较而获得。第二类是在宿主体内有相同生长或感染部位的微生物共有的基因，如上呼吸道感染菌———肺炎球菌、流感杆菌、脑膜炎球菌等，用于治疗该部位感染的抗菌药物的候选靶标研究。这类基因可通过比较这些菌的基因组而获得。第三类是同一种属菌共有的基因，用于抗该微生物感染的药物研究候选靶标。这类基因可通过比较一个种内不同菌株的基因组而获得。后两种靶标既有利于防止耐药性的产生，又不影响人体的正常菌群。保守基因的寻找工作主要由生物信息学研究完成，目前已开发出了$%&’(、)*+,、-..等多种软件和方法。
必需基因也包括两种，一是微生物在体外生长必需的基因，另一是微生物在体内感染必需的基因。必需基因的常规研究方法是应用插入失活及基因敲除构建突变体等。/01234公司开发出了一种高通量
［!;］寻找细菌必需基因的技术———“鸟枪反义（’5627894921,:9,:）”技术。该技术是用一个诱导表达质粒构
建细菌染色体的随机文库，然后将这些重组质粒导入到待研究的细菌（可以是和文库相同的细菌，也可以是其它细菌），这些质粒表达产生的&可以阻断相反序列（与原基因相同的序列）的表达，进而抑
已经制细菌的生长。该公司应用这一方法，在一个细菌的染色体中平均一个月可发现!??个必需基因，
从微生物基因组中得到了;???多个必需基因。
对于筛选到的必需基因要明确其功能或作用。这主要依靠前面介绍的微生物功能基因组研究技术来完成。虽然有多种研究基因功能的方法，但仍有许多基因的功能尚不能确定。对于功能明确的基因，可直接用于生物活性抑制剂（候选药物）的筛选。对于暂时还不能确定其功能的基因，可用核磁共振技术、虚拟扫描技术以及基因扫描（+:9:@26@’A3::9）技术等进行药物筛选。/01234公司研究出了一种高通量
［!B］，其基本原理是，通过反义表达或直接调节启动子，选择性减少细胞内的必需靶蛋白的基因筛选方法
量，使其对靶蛋白抑制剂非常敏感，通过与野生株对抑制分子的敏感性进行比较，筛选出对靶蛋白具有抑制作用的化合物。该公司正在应用这一方法开展工作，也许是由于专利的原故，研究的结果尚不清楚。
疫苗是控制传染病的最有效措施。传统的疫苗主要是死疫苗、减毒活疫苗、类毒素等，这些疫苗在传染病预防方面发挥了较好的作用。但这类疫苗的研究本身存在着许多问题。基因工程技术的发展开辟了现代疫苗研究的新天地。基因工程疫苗研究的关键是选择有效的保护性抗原。传统上应用病人血清或动物免疫血清来筛选抗原存在着两个明显的不足：一是免疫原不一定都是有保护作用的抗原，即有的抗原能刺激抗体产生，但不具有预防作用。即使是保护性抗原，亦可因序列变异、表达纯化困难、或成本太高，而不能作为疫苗研究的抗原。二是这种方法一次只能研究分析少数抗原，研究周期又比较长（一般需要数年），一旦出现阴性研究结果，重新开始新的研究需要较长时间。
微生物基因组学研究给疫苗研究提供了新的发展机遇，同时也改变了保护性抗原筛选的研究策［!C］略。一般来说，保护性抗原多是毒力因子、分泌及膜相关蛋白。因此这种新策略是以微生物基因组为平台，应用生物信息学技术预测毒力因子、分泌及表面相关抗原，应用蛋白质组学技术寻找外膜抗原，应用体内表达技术（DE/(）、信号标签诱变技术（’(.）、F>&芯片等寻找侵袭及毒力相关抗原。对上述抗原基因进行高通量克隆、表达，纯化重组蛋白。然后，再对纯化后的抗原进行体内、体外评价，筛选出保护性抗原，进行疫苗研究。
［］选出了C??个编码表面蛋白的基因。G1HH4等!I对$型脑膜炎球菌的基因组进行生物信息学分析，
把这些基因克隆到大肠杆菌，有#B?个基因成功表达，并得到了纯化的表达产物。小鼠免疫保护实验表
［!K］明，有
保护性免疫反应的疫苗候选分子。利用微生物基因组，国外还正在进行结核杆菌、幽门螺杆菌、流感杆
*期
［!
这一类研究的基本特点可以概括为高通量、大规模。也有人形象地说这一研究是“撒大网，捞小鱼”。国外就是通过对成千上万个基因进行研究，才从中筛选到少量的药物靶位或疫苗抗原。我国开展这方面的研究明显不足，就疫苗研究来看，大部分还停留在已知功能的、有限的几个抗原上，很少有单位开展大规模的保护性抗原筛选研究。鉴于国外筛到的基因都进行了专利保护，我们如不加强这方面的研究，将严重影响我国的抗菌药物及疫苗的发展。
!致病性研究
病原菌致病性研究是微生物功能基因组学研究的重要领域。尤其是通过比较基因组学及微生物与宿主的相互作用研究，极大地加深了对微生物致病性的认识。
!
一直是发现病原微生物的基本标准。随着许多微生物基因组序列#$%&氏原则自!’
［)(］的完成和功能基因组学技术的发展，为适应致病基因的寻找，提出了分子#$%&氏原则：（!）这些基因
特异性失活这些基因能使病原菌减毒或失去毒力；（*）修复或的表型或特征必须与病原微生物有关；（)）
等位置换这些突变的基因，能使病原菌恢复毒力。对于遗传操作较难的基因，可以修改为：（+）这些基因的产物能诱导产生中和性抗体。
!
过去认为毒力基因就是编码直接引起宿主损伤因子的基因，因此认识的毒力基因非常有限。根据
［)(］有人把毒力基因被分为*类。（!）真毒力基因（,-./01-.2/3%/分子#$%&氏原则及功能基因组学研究，
，这些基因的编码产物既能与宿主相互作用，又能直接引起宿主损伤，且在非致病菌不存在。如各4/3/5）
种毒素基因。（)）毒力相关基因（61-.2/3%/7855$%189/:4/3/5），这些基因的编码产物能调节毒力基因的表
毒力辅助基因（61-.2/3%/达；或参与毒力因子的修饰、加工及分泌；或为真毒力因子发挥作用所必需。（*）
，这些基因的编码产物有利于病菌在宿主体内定居，或抵抗宿主的免疫系统，或使其能在21;/759
细胞内生存，或有利于病菌和宿主内的其它微生物竞争。
!
以微生物基因组序列为基础，应用表型分析、比较基因组学、蛋白质组学技术、体内表达技术
［)!］（=6>,）、信号标签诱变技术（?,@）、免疫学技术等寻找毒力基因和毒力相关基因。A8
了大肠杆菌B!CD：发现B!CD：且多编码!G*)个蛋白AD与#!)株的基因组，AD的基因组比#!)多’C
质，其中至少有!*!个蛋白质可能与致病相关。本研究室应用=6>,研究了痢疾杆菌福氏)8的体内表达
可以得基因，也找到了一些新的毒力相关基因。如果以“毒力因子和细菌”为关键词，在H.F@/:中收寻，
［)(］到!(((多个靶分子。这在一定程度上说明了毒力基因寻找研究的丰硕成果。!型分泌系统的发现
［))］是微生物功能基因组学研究的重要成果，在革兰氏阴性菌中!型分泌系统是一种多成分分泌系统，
高度保守，和细菌的致病性有关。当病原菌与宿主细胞接触时，病原菌才启动!型分泌系统，分泌效应分子。!型分泌系统的建立需要)C个左右的基因，且受多种因素的调节。如，温度、盐浓度、与宿主细
当温度上升到*DI时，类似于J-8K的转录激活因子胞接触等都能调节!型分泌系统。在痢疾杆菌，
［)*］再由61-M激活!型分泌系统。61-L激活另一个调节因子61-M，
!
主要是利用功能基因组学等综合手段研究病原菌与宿主的相互作用。关于病原菌如何影响宿主细
［］它的类似蛋白广泛存在于胞，B-9&等)+研究发现了一个很有意义的结果。N$OP是鼠疫杆菌的毒力因子，
动植物细菌中，它具有类似泛素的蛋白酶活性。当病原菌与宿主细胞接触时，病原菌通过!型分泌系统将其分泌到宿主细胞内，（@19$4/378%91089/:O-$9/13E1385/）、QL（Q.%2/8-;8%9$-E8OO8N$OP通过阻断@JH#M
等多条信号通路，抑制宿主的免疫反应、引起宿主细胞凋亡。关于宿主细胞对病原菌的反应，M）K$&/3
.)#微生物学报.)
卷［!
对微生物的致病性研究，过去主要是重视对微生物本身的研究分析，研究的重点主要集中到少量的毒力因子和传统的致病基因。由于研究对象有限，我国许多的微生物学工作者转向了免疫学、甚至肿瘤学研究。目前，致病微生物学研究的重点已转移到微生物与宿主的关系研究。利用微生物基因组和人类基因组的研究成果，开展微生物致病机理研究，使这一古老的研究领域“枯木逢春”，一个崭新的学科———细胞微生物学也应运而生。
!微生物生物学功能图谱研究
生物体是由成千上万个分子组成的复杂系统。基因组序列的完成及高通量技术的发展，使我们能够从整体上研究生物分子的作用和功能，从而全面揭示细胞的生命活动，这一直是生物学家的梦想。要在分子水平上了解生命活动，不仅需要知道单个分子的功能，更重要的是知道一个特定生命过程所涉及的全部分子的作用和功能。也就是说，要绘制出一张张生命的功能图谱。目前的研究现状是只给出了一个电子元件的清单，虽然一些元件的功能已经知道，但还没有联成电路图。生物学功能图谱研究，就是研究一个特定的生命活动，如蛋白合成、能量代谢、应激调节等所涉及的全部分子以及这些分子之间的相互联系。开展微生物的生物学功能图谱研究，不仅能推动微生物学的发展，也为高等生物的功能基因组学研究提供模型。
［!#］代谢网络图是微生物生物学功能图谱之一。重建代谢网络的基本实验策略是（：(）寻找构成某一
代谢网络或通路的所有基因、蛋白及其它小分子，尽可能地根据以前的研究结果，画出这一代谢通路的草图。（!）利用遗传学手段或改变生长条件等干扰该代谢通路中的某些成分，检测细胞的相应反应。结合代谢草图及细胞的其它已知的相互作用网络，综合分析*+,-及蛋白的变化。（.）提出新的假（)）
设或设计新的干扰实验。半乳糖代谢是研究基因调控机制的经典模型，因为转运和催化半乳糖的酶只在半乳糖存在时才表达。在利用酿酒酵母研究半乳糖代谢网络时，设计了!%个系统干扰实验，检测出了//0个*+,-有相关变化，在检测的!$/个蛋白中，有(
［!0］感噬血杆菌及枯草杆菌，已成功地重建了!%种氨基酸的生物合成通路。通过生物信息学技术可以直
接对基因组进行扫描分析，重建代谢网络，123系统或4566等软件都能从基因组中分析描述代谢通路，这种方法不仅可用于有完整基因组序列的微生物，也能用于仅有部分基因组序列的微生物的代谢通
［］路重建。目前已建成了几个代谢通路数据库，如5789:7、;’1等!$。
微生物要生存就要对复杂的环境变化做出迅速的反应。这些反应是受基因控制的。从理论上讲，微生物中的每个基因都有自己的调节物，换句话说，调节物控制着许多基因，有时还控制着其它调节物。
［!/］因此细胞对环境变化的反应存在着一个复杂的调控网络。研究调控网络有)个主要任务，一是要研
究调控网络的组成，二要研究其相互作用，三要研究反应的时间顺序。虽然环境的变化大多是多因素的，但为了便于研究，多采用单一因素刺激来研究微生物的反应。氮饥饿是研究反应调节网络的较好例子。当大肠杆菌感受到氮缺少时，将增加亮氨酸调节蛋白（）的合成，将激活或抑制相关靶操纵子的转录，进而影响其它基因、引起细胞的功能和代谢发生相应的变化。如将调节膜*+,-和蛋白质，
蛋白?（@*>?）的合成，使细胞膜孔道加大。
还有多种微生物功能图谱正在研究中，如核酸—核酸相互作用图、蛋白—核酸相互作用图等。+ABC［)%］等构建了幽门螺杆菌的蛋白质与蛋白质相互作用图。他们以!#(个幽门螺杆菌的蛋白基因构建诱饵文库，以该菌的随机染色体文库作为捕获文库，进行酵母双杂交试验，检测出了(!%%多个相互作用蛋白。
A期黄留玉等：
微生物功能基因组学研究BAW这一工作是相对基础性的研究工作，我国从事代谢工程研究的人员很多，但主要集中在工程菌的发酵培养上，对发酵培养条件及工艺研究较多，真正在微生物的代谢研究方面做的工作不多。结合微生物功能基因组研究，国外十分重视这一领域的研究。这一研究不仅具有理论意义，也能进一步推动我国代谢工程的发展，建议我国相关领域的研究者应重视这方面的研究工作。
!结束语
以目前的测序规模，估计在近!年内，主要病原微生物的基因组序列及其它有代表性的非病原微生物的基因组序列将完成测序工作。这将使微生物学研究全面进入后基因组学时代，即功能基因组学研究时代。一般来说，科学的发展要靠需求牵引和技术推动。虽然在实验及生物信息学方面已经发展了一系列的高通量功能研究方法，但方法学在一定程度上仍是制约功能基因组学发展的“瓶颈”。进一步发展高通量、尤其是自动化的基因组学研究方法（包括实验方法和计算方法）将是微生物功能基因组学研究的重点之一。在应用方面，虽然目前还没有真正的基因组学抗生素及疫苗问世，但可以确信，这只是个时间问题。利用微生物基因组研究药物靶标及疫苗，在相当长的一个时期内都将是微生物功能基因组学最诱人的研究领域。对于病原微生物来说，研究其致病性将是一个永恒的研究主题，这方面的研究将主要从基因及其产物的水平围绕微生物与宿主的相互作用开展工作，以发现新的毒力基因及致病机理，为传染病的防诊治提供更多的理论依据。微生物的代谢、调控、进化等研究也将更加深入，开展这方面的研究，不仅可以加深对微生物的认识，也为研究高等生命提供好的参考模型，为最终揭开生命的奥秘作出贡献。
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（北京海淀中关村中国科学院微生物
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出编办版李季伦中国科学院微生物研究所
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范文四：单细胞微生物基因组学研究_陆光涛
第20卷 第2期V ol. 20, No. 2广西农业生物科学J o urnal o f Guangx i Ag ric. and Bio l. Science 2001年6月 J une, 2001
文章编号:10083464(2001) 02012904
单细胞微生物基因组学研究
陆光涛, 何勇强, 唐纪良
(广西大学农业部农业分子遗传重点开放实验室, 广西南宁530005)
摘要:本文介绍了单细胞微生物基因组测序, 全基因组序列的注释, 以及基因组进一步研究的主要内容。
关键词:单细胞微生物; 基因组学; 测序
中图分类号:Q 751 文献标识码:A
Genomics research of the single cell microbes
LU Guang tao, HE Yong qiang, TAN G J i liang
(The Key Labo ra to ry o f Ag ric. M olecular Genetics of the Chinese Ministry
o f Ag ric . , Guang xi U niv . , Nanning 530005, China )
Abstract :It is a review paper w hich introdues the sing le cell microbes ’complete genome sequenc-ing , the sequence anno tation and the main contents o f the further resea rch o n g eno mics.
Key words :sing le cell micro bes ; genomics ; sequencing
1995年7月, 《Science 》首次刊登了TIGR (The Institude of Genomic Resea rch) 采用全新测序方法完成的流感嗜血杆菌(Haemopophilus influenzae Rd ) 的全基因组测序与组合的论文[1], 这是人类完成的第一个单细胞微生物的全基因组序列的测定, 标志着基因组时代的真正开始。
单细胞微生物基因组学研究主要源于人类基因组计划的实施。1990年10月开始实施的人类基因组计划, 是希望用15年时间, 完成人类全部23对染色体的遗传图谱、序列图谱和转录图谱, 同时还对大肠杆菌(Escherichia coli ) 、酵母(Saccharomy c es cerevisiae ) 、美丽线虫(Caenorhabditis elegans ) 、果蝇(Drosophila melanogaster ) 和老鼠(Mus musculus ) 等5种模式生物的全基因组序列进行测定。
人类基因组约有30亿个bp, 编码5-10万个基因, 以当时的技术水平要在15年内完成这一计划, 是相当艰巨的。如何采用新技术和新方法进行DN A 序列测定以及基因功能的表达模式的确定, 成为人们积极探索的问题。以J . C . V enter 领导的基因组研究所(TIGR ) 的科学家们于1991年首先提出了EST (ex pressed sequence tags) 的概念, 并利用这一方法成功地寻找和鉴定了在细胞组织中表达的基因, 即通过构建细胞组织的cDN A 文库, 随机选择cDN A 克隆, 利用载体引物一次测定插入片段的3′端和5′端约300～500bp , 这些cDN A 的部分序列即为EST , 通过与GeneBank 等数据库所收集到的基因的EST 比较, 可鉴定出细胞组织中的功能基因[2, 3]。由于专门计算机软件的发展, 已能够处理大量的DN A 资料并进行高质量的序列组合, 科学家们考虑能否借鉴EST 的策略来进行微生物的全基因组序列测定。1994年4月, Johns H o pkins 大学的H. O. Smith 和J. C . Venter 等人合作, 开始利用基因组鸟枪测序法对H . influenzae 进行全基因组序列测定, 不到1年时间, 即完成了这一项工作[1]。接着, ⒇收稿日期:20000817
基金项目:国家高技术“863”计划资助项目(863101020701) :
, , 。
130广西农业生物科学第20卷 T IGR 的Fraser 等人利用这一方法用不到6个月时间也完成了尿道支原体(Mycoplasm a genitalium ) 的全基因组测序工作[4]。这表明鸟枪测序法是成功的、快速准确的测序策略。
1 全基因组的测序鸟枪测序法基本原理是在基因组随机文库的基础上, 直接对随机文库的各个克隆进行测序, 即对质粒载体中所插入的DN A 片段, 同时从3′和5′两端进行测序, 获得大量的两端序列已知而中间部分未知的克隆群, 然后通过专门的计算机软件将测得的序列拼接成连续的序列图。各克隆片段中间未测定的总碱基数, 即缺口(g ap ) 与测定的总碱基数有关, 其规律遵从泊松(poisso n) 公式的一个推论:
-m P 0=e , P 0为基因组中某个碱基未被测定到的概率, m 为所测定的碱基总数与基因组碱基总数相比的倍数。m 越大, P 0值越小。那么, 当所测定的碱基数越大, 基因组中未被测定到的碱基数就越少。当
-1%的碱基未测定到。当m =5时, P 0=e -5=0. 0067, 即当所m =1时, P 0=e =0. 37即基因组中有37
测定的碱基数是基因组总碱基数的5倍时, 基因组中有0. 67%的碱基未被测定到。同时, 当基因组DN A 总长度为L, 测定的随机克隆的插入片段数为n 时, 总缺口长度为Le -m , 每个缺口平均大小为L /n 。
基于以上原理, 单细胞微生物基因组鸟枪测序法的主要过程为:第一, 基因文库的构建。基因文库的高度随机性是测序的基础, 构建的文库克隆数要达到一定数量, 以保证经末端测序的克隆片段的碱基总数大于基因组碱基总数的5倍以上。第二, 测序。利用正向及反向引物, 在质粒模板上进行测序反应, 对所测定的克隆的插入片段通过一次反应对3′和5′两端测序。第三, 序列拼接。将所测得的序列通过专门的计算机软件进行序列组合, 序列片段按严格标准连接成数个连锁群(contig ) , 然后对连锁群进行排序和缺口填补。物理缺口(没有模板DN A 与之对应的缺口) 的填补有4种策略:印迹法、肽链连接法、λ克隆排序法和PCR 确定连锁群等。序列缺口用引物步移法来填补。在填平缺口, 获得全基因组序列之后, 再用专门软件进行建立序列的图形交互界面、基因组数据组合编辑等工作[1,5]。与传统测序法相比, 鸟枪法测序省去了许多中间步骤, 能快速准确地对基因组进行测序。传统测序法是采用克隆到克隆(Clo ne by clo ne) 的策略, 即是对基因组BAC 文库中各克隆进行测序, 在每个克隆的测序过程中, 先对每一个克隆进行亚克隆, 然后对每个克隆的各个亚克隆进行直接测序, 将各个亚克隆的序列拼接成一个克隆的序列图, 然后再将各克隆的序列拼接成一个连续的序列图。这一方法中间步骤多, 测序速度慢, 在测序前要首先对拟测序的区域进行物理图谱的构建。
2 全基因组序列的注释
在基因组序列测序完成, 得到全基因组序列图谱后, 工作的重点即是分析这一条由数百万个4种碱基对线性排列而成的长链所包含的遗传信息。目前的工作主要是以下两个方面:
2. 1 G +C 含量的分析
获得全基因组序列图谱后, 首先是分析基因组中GC 含量百分比, 然后考察各个区域DN A 的GC 含量, 不同DN A 区域的GC 含量并非一致, GC 富含区或AT 富含区可能意味着该区域具有特殊功能。在H . influenzae 中, GC 富含区内对应着6个rRN A 操纵子(operon ) 和一个隐藏的类似Mu 噬菌体[1]。在M . genitalium 中, r RN A 操纵子的GC 含量为44%, t RN A 操纵子GC 含量为52%, 均较其基因组平均GC 含量的32%要高得多。这表明富含GC 对r RN A 和tRN A 形成正确的二级结构是必需的。在以后的单细胞微生物基因组分析中, 也发现类似情况。嗜热高温菌Aquifex aeolicus 和嗜热菌Thermotoga maritima 的16S 23S 5S r RN A 操纵子的GC 含量比其基因组GC 含量高得多, 16S 23S 5S rRN A 高GC 含量是嗜热细菌的特征之一
即A T 富含区, 则含有前噬菌体或其它插入序列[8]。[6, 7][4]。在B . subtilis 的几个GC 含量低的区域,
考察DN A 区域的G -C /(G +C ) 比率, 当这一比率发生显著变化时, 表明该区域可能含有DN A
[8][9].
第2期陆光涛等:单细胞微生物基因组学研究
[7]131链间核苷的组成不均匀。但在T . maritima 中却没有在具有这一特征的区域发现复制始点。
通过对基因组分析, 发现基因组内存在重复序列、插入因子、前噬菌体和前噬菌体部分残余DN A 。
B . subtilis 基因组中至少包含10个前噬菌体或前噬菌体的部分残余DN A [8]。E . coli 的基因组也发现多个前噬菌体。基因组中的前噬菌体已经失去溶源生长所必需的基因, 但仍然携带有具有一些其它功能的基因。这表明在物种进化过程中前噬菌体对基因水平转移起重要作用[8,10]。基因组中的重复单位的大小可以是由数十个bp 至数百个bp 不等, 重复次数也是大小不同[7,8]。
2. 2 ORF 的分析
在进行某种生物基因组的转录翻译水平分析前, 首先对该物种已知的基因所编码的蛋白质进行分析, 考察其密码表, 设定起始密码子和终止密码子, 然后利用专门软件, 从整个基因组中寻找开放阅读框(O RF) 即蛋白质的可能编码区域。在对H . inf luenzae 的O RF 的考察中获得令人惊讶的结果, 在1743个O RF 中, 通过与GenBank 数据库中其它物种的已知基因比较, 仅有1007个ORF 的功能是已知的, 另有736个O RF 所编码的蛋白质功能是未知的, 这些未知的ORF 一部分是在GenBank 等数据库找到相应的蛋白质序列与之匹配, 但蛋白质功能未知, 另一部分则是在数据库中找不到相应的蛋白质与之匹配[1]。在以后的基因组O RF 分析中, 均有相当一部分O RF 功能未知。E . coli 的4288个ORF 有1630个是功能未知的, 占其O RF 总数的38%; 而在B . subtilis 的4100个ORF 中, 有1722个
%[8]; 即使是基因组最小的M . genitalium , 在其470个O RF 中, O RF 功能未知, 占其O RF 总数的42
也有96个在GenBank 中没有找到任何其它生物体的已知的蛋白质序列与之匹配[4]。对于已知功能的O RF, 根据其生物学功能, 按Riley 分类法[1, 4][10][10]进行功能类群分类, 共分为14个类群, 或者按照COD 法(Clusters of Ortholog ous Groups) 将所有O RF 分为18个功能类群。
在O RF 的起始密码子中, 使用频率最高的是ATG , 78%的B . subtilis 和85%的E . coli 的ORF 均以ATG 为起始密码子, TTG 、GTG 的使用频率较低, 在B . subtilis 中这两种起始密码子的使用频率分别为13%和9%, 在E . coli 中则分别为3%和14%。另外, E . coli 中还发现有15个O RF 使用
[8,10]稀有起始密码子A TT 和CTG 。
3 基因组的进一步研究
人们通过对基因组的研究, 可以了解生物体各种代谢过程, 遗传机制和生命活动所需的基本条件以及生物特殊功能如致病性的遗传基础。在微生物全基因组序列的测定与注释完成后, 基因组学的研究工作主要集中在以下几方面内容:
3. 1 基因功能的研究
在全基因组测序和分析完成后, 人们最关心的自然是基因的功能问题。在所有的已完成测序的单细胞微生物基因组的O RF 中, 都有相当部分O RF 功能是未知的, 其中的一部分O RF 没有在GenBank 中找到任何与之匹配的蛋白质。如此之多的O RF 所编码的蛋白质结构和功能不为人所知, 究竟是这些O RF 所编码的蛋白质在生物体内存在的时间极短, 很快就被降解掉? 还是这些基因所编码的蛋白质及其功能一直未被人们发现呢? 如果是后者, 则表明尽管人们已经对细胞的结构与功能进行近一个世纪的研究, 但还有将近一半的细胞生物学和生物化学的功能仍未被人们所认识。全基因组序列的测定与分析以及功能基因组的研究, 为人们研究基因功能提供极好机会和手段。目前通过基因缺失和平行分析的方法, 正对S . cerevisiae O RF 的功能进行深入研究[11]。
3. 2 系统进化研究
基因组学研究的一个重要内容就是基因组间的比较研究。人们在DN A 水平上对不同生物体进行比较研究, 可以了解生物物种间的进化关系以及不同生物体生命活动的异同。70年代以前, 生物主要分为原核生物和真核生物两大类, 1977年, C . R . Wo se 等通过对200多种原核生物16S r RN A 和真核生物18S r RN A 的寡核苷酸序列分析比较, 从中发现了生命的第三种形式——古细菌。1978年, R. H. :
132广西农业生物科学第20卷 按照这一学说, 在生物进化过程的早期, 存在一类各种生物的共同祖先, 由它分三条路线进化分别形成三个原界。微生物全基因组的分析和基因组的比较研究, 为三个原界学说提供有力支持。通过对古细菌M . jannaschii [9]、真细菌H . influenzae [1]和真核生物S . cerev isiae [12]基因组的比较研究, 发现古细菌M . jannaschii 在产能、固氮以及细胞分裂方面的有关基因与真细菌H . influenzae 有很高的同源性, 而在转录翻译系统以及分泌系统方面的有关基因与真核生物S . cerevisiae 的关系更近。这说明古细菌与真核生物的亲缘关系较与原核生物的亲缘关系更近。可以预计随着越来越多的全基因组被分析和基因组间的比较研究, 人们将可以重新绘制生物的系统进化树。
3. 3 病原物致病性的研究
基因组学的研究, 使人们更全面深入地了解微生物致病性和致病机理。H . inf luenzae 全基因组的分析研究发现, 编码细胞膜上脂多糖的DN A 序列中至少有9个有关的位点含有多个衔接重复的4核苷酸, 这些重复序列的缺失或增加, 可导致转录信号或阅读框架的改变, 使其可以逃避人体免疫监视系统[1]。病原菌N . meningitidis 和H . influenzae 基因组的比较研究发现, 尽管两种病原菌均生长于人的鼻咽并能引起髓膜炎, 但它们的代谢方式有很大不同。H . inf luenzae 缺乏TCA 循环和ED 途径, 缺少吸收离子的运输系统, 与N . meningitidis 相比, 仅有少部分的基因与电子传递有关, 但却有相当多的基因与氨基酸和碳水化合物的吸收有关。这表明H . inf luenzae 更多地依赖底物磷酸化途径而不是氧化磷酸化途径获取生命活动所必需的能量。代谢途径的显著差别, 可能与这两种病原菌在人体寄主不同生理条件下而表现不同致病能力有关[1,13]。
3. 4 基因水平转移的研究
基因水平转移即基因在两个同时存在的物种之间转移, 但一直没有令人信服的证据。单细胞微生物全基因组测序的完成为人们研究基因水平转移提供了极好的研究机会。基因水平转移在多种微生物的基因组学研究中已得到证实。基因组中具有一些基因水平转移的辅助证据:基因的GC 含量突然与相邻区域的DN A 序列的GC 含量非常不同, 基因组中残存着插入序列的部分序列以及含有前噬菌体和前噬菌体残存的部分序列。通过对N . Meningitidis 基因组的分析, 已鉴定了三个主要的基因水平转移区域, 其中两个包含有与其致病性有关的基因[13]。对E . co li 基因组的进一步研究发现, 其4288个
[14]O RF 中的755个即与基因水平转移有关。
T . maritima 是从高温环境下的海底淤泥中分离到的一种进化非常缓慢的嗜热真细菌, 通过对其基因组的比较研究, 发现其52%的基因与真细菌非常相似, 24%的基因与古细菌非常相似, 并且其中的81个基因聚集在大小为4～20kb 的15个区域内, 其中的7个区域中保守的基因排列顺序, 以前仅见于古细菌中, 这表明在细菌和古细菌的祖先在进化过程中, 曾发生过基因水平转移。
基因组学的研究, 揭示越来越多的生命本质, 它使得常规的以基因为研究对象的分子生物学研究产生了一次飞跃。截止2000年7月底, 已有约50种微生物完成了基因组的测序, 其中一部分尚未发表相关研究论文, 另有100余种微生物目前正进行基因组的测序, 我国于1999年底也启动了数项微生物基因组测序计划。随着越来越多生物体完成基因组测序, 以及基因组的进一步分析研究即蛋白质组研究的开始, 人类对生命本质认识将更为全面与深入。[7]
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范文五：微生物宏基因组学及其在瘤胃微生物研究中的应用
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