渐渐地贱贱
范文一：死活细胞的鉴别
（一）、死活细胞的鉴别
生活细胞近似无色透明，用普通光镜无法观察其形态，需用相差显微
镜来观察。 染色排除法：组织培养中检查死活细胞最常用的是“染色排除法”这类方 法简单但不甚严格，它只能判断细胞的代谢死亡，不反映细胞能否增殖。由于未 经过固定、专门染色，所以看不到死活细胞的形态差别。
所用染料的分类：
一般的生物染料不能穿过活细胞膜只有细胞被固定或细胞膜被破坏，染
料才能进入细胞膜。
第一类 ：死细胞着色，使死细胞着色的大部分是酸性染料。它们不容易
穿透活细胞的质膜，进入胞内，但却能渗透死亡的细胞，使之着色。如①台盼兰 （Trypan blue）：0.5-1%的台盼兰，pH7.0-7.2，每毫升细胞悬液加 0.1ml 染液，2 分钟后镜检，活细胞没有染上，死细胞全部被染成蓝色。②苯胺兰(Aniline’ black)： 0.05%的苯胺黑以 1：10 的量与细胞悬液混匀，1-2 分钟后，死细胞被染成黑色。 ③伊红 Y ：细胞悬液与细胞悬液混喝，2 分钟后死细胞被染成桃红色。等。 第二类：活细胞着色，多为碱性染料，如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯
胺蓝等。它们是一些无毒或毒性很小的染料，由于电性吸引而堆积在细胞中某一 特定的结构上从而显色，即它们解离后带正电，其中有的染料可与胞内某些结构 专一性的结合。
①1%结晶紫染色生理 1%结晶紫盐水与细胞悬液 1：2 混合，立即镜检，或细胞被染成
蓝紫色，而死细胞不着色。属于活细胞染料。活细胞染料无毒，无物理、化学变 化，基本上不影响细胞的生命活动。
②用呀啶橙染色可以鉴别出细胞固定前的死活状态。
丫啶橙是一种与 DNA 和 RNA 都能结合的荧光染料，在兰光或紫外光激发
下，DNA 可激发出 530nm 的荧光发射峰，RNA 可激发出 640nm 的荧光发射峰， 它与双链 DNA 的结合方式是潜入双链之间，而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸 引堆积在磷酸根上。在蓝光的激发下，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质
RNA 质发生变形，其核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色。但丫啶橙的阳离子也可以结合 在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但由于经过细胞固定抑制了这种结合，从而主 要显示出的是 DNA 和 RNA 两种核酸。
本次实验即选用活细胞染料健那绿来显示线粒体。
（二）细胞核和染色体的染色
Giemsa 染色：姬姆萨是常用的染料，可观察核、染色体。
醋酸地依红染色：可显示有丝分裂染色体的微细结构，如次缢痕、染色质
丝的螺旋化等。该染料同时具有固定和染色的作用，因此也可用来坐快速检查有 丝分裂指数。（细胞涂片，0.075 mol 的 KCI 低渗 5-10 分钟，使细胞膨胀，染色 体分裂；甲醇固定 10 分钟，空气干燥，滴加 2%醋酸地衣红，染 10-20 分钟后即 可观察。
（三）细胞器的特殊染色
1、内质网的显示
早在 1945 年，有人用电子显微镜就观察到了小鼠成纤维细胞的内质网。之
后，观察内质网基本是采用电子显微镜。在 80 年代中开始发展了一些活细胞荧 光染料，又称“荧光探针”，为显示细胞内的模型结构，包括内质网，提供了新 的途径。
DiOC 6(3):是一种亲脂性的阳离子荧光染料，可选择性的与负电性的膜结构
结合。在低浓度时仅能染出线粒体，细胞界限不清，较高浓度时（0.5-2.5μg/ml） 内质网染色最佳，而容媒体、高尔基体等均然浅色。 2、高尔基体的显示
在光镜下观察高尔基体可用景点的固定染色，也可用活细胞荧光染料。由于高尔 基参与分泌这一动态过程，对糖蛋白、糖脂进行加工、分选和运输，所以在活细 胞中研究其动态和三维结构具有重要的意义。
Baker 苏丹黑染色法：可用于组织块、体外培养的单层细胞的染色。染色结 果：高尔基体呈黑色囊泡，细胞核呈红色。
法来现实。比如，酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶。这部分内容在下学期讲。
3、线粒体的显示
线粒体（mitochondrin ）:是细胞内一个极为重要的细胞器，是细胞内物质 氧化磷酸化产生能量的重要结构。
线粒体的形态结构和功能定位
光镜：多为粒状、杆状、线状。不同的细胞类型，不同的生理状况，其形 态大小也有所不同。
电镜：是由二层单位膜围成的膜性囊，
⑴．
⑵．
⑶．
⑷． 外膜与内膜不连接。 内膜是皱褶的。 内膜表面不光化的膜结构向内凹陷，形成嵴。 嵴上有基体微粒（上面有 ATP 酶，是偶联磷酸化的关键装置）。 ⑸． 嵴间为基质，含蛋白质、脂类、DNA 、RNA 和核
蛋白体。有关催化线粒体内各种生命活大过程所需的酶和辅酶，都分布在线粒体 的基质中。
细胞生命活动中需要的大约 95%的能量来自线粒体。所以说线粒体是一个重 要的细胞器。细胞的内外环境因素的改变，可引起线粒体结构和功能的异常。发 现和检查线粒体就显得十分重要了。但线粒体在动物死后极易产生变化，故取材 必须新鲜。
实验三 健那绿染活细胞线粒体
原理：健那绿（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，具有脂溶性， 能跨过细胞膜，解离后，有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜 上。内膜上的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈蓝绿色。而在胞质内染料
被还原成无色。
线粒体浸泡在染液中能维持活性数小时，使我们能够直接看到生活状态的线 粒体的外形，分布及运动。
试剂：0.2%Janus green B 0.1g 加温到 30-40℃，充分生理盐水
50ml 溶解。
（需新鲜配置，以保持被氧化的能力）
染色：1. 培养的细胞或用牙签刮下口腔粘膜上皮细胞；
2. 涂在干净的载玻片上；
2. 滴加 0.2%Janus green 液，室温染 10 分钟，盖上盖玻片观察，注意在 盖玻片下放两根头发丝，避免细胞被压迫，并可存有较多的液体。
结果：线粒体呈蓝绿色，细胞质接近无色。
实验四 过氧化物酶的显示
微体:早在 50 年代初有人发现在动物的细胞内存在有一种微小的颗粒，它
多见于肝细胞和肾小球上皮细胞内，但也广泛分布在小肠、心肌、骨骼肌、肺、 肾上腺、附睾、神经、脊髓、脑等。在不同的组织中微体所含的酶也不同，如苹 果酸合成酶、过氧化氢酶、天东氨酸氨基转移酶等，过氧化氢酶是微体的标志酶。 在过氧化氢酶分子中，有两种酶活性，即过氧化氢酶活性和过氧化物酶活性。过 氧化物酶和过氧化氢酶两者具有相似的化学性质，它们像血红蛋白和肌红蛋白一 样，都属于血红蛋白素蛋白，具有相同的辅基，即铁卟啉或血红素。
过氧化氢酶可使过氧化氢分解成水和氧，
2H 2O 2=2H2O+ O2
这个分应称为过氧化氢酶反应，过氧化氢酶因有这种分解作用而被划分为 分解酶类，也可把它看作是转移酶或岐化酶。
过氧化物酶对纯过氧化氢没有分解作用，但如果有合适的受体存在，则能催 化氧转移到受体上，而使受体被氧化，
H 2O 2+AH2=2H2O+A
这个反应称为过氧化物酶反应。过氧化物酶：又称过氧化酶（peroxidase ）
过氧化物酶是一种氧化还原酶，它除了分布在髓性白细胞外，还广泛的存在于各 种组织细胞中。它的种类很多，如在牛奶中有乳-过氧化物酶、红细胞中的谷胱 甘肽过氧化物酶、酵母中的细胞色素 c 过氧化物酶等。
过氧化物酶的功能：是机体中的抗氧化酶，在防止氧代谢物的损伤中具有重要的 作用。
⑴ 过氧化氢对细胞有毒害作用，通过过氧化物酶的作用可清除过氧化氢，防止 其在细胞内聚集。
⑵ 参与肝、肾对有毒物质的解毒。
⑶ 对细胞的氧张力具有调节作用。
⑷ 可能参与核酸、脂肪和糖代谢。
反应原理:
过氧化物酶在分解H 2O 2的过程中，必须由过氧化物而来的氧进行氧化作用
的 。在反应中有两种底物，即受氢体与供氢体，前者的代表是过氧化氢，后者 的代表是联苯胺类的药。过氧化物酶的反应通式如下：
AH 2（供氢体） +H2O 2受氢体= A（供氢体的氧化物）+ 2H2O
过氧化物酶可将底物中的H 2O 2分解，产生新态氧，使无色的联苯胺蓝氧化为
蓝色的联苯胺蓝。
实验： 过氧化物酶的显示
原理：同上。
材料和方法：
材料：0.5%硫酸铜、1%联苯胺（含有 30%的H 2O 2）、0.5%藏红花、玻片、滴管、剪
子、小鼠。
操作方法：
⑴ 涂片：剪小鼠尾部，取血涂片，晾干备用。
⑵ 在晾干的涂片上滴一滴 0.5%硫酸铜，染 2 分钟。
⑶ 倾去硫酸铜，滴加联苯胺冲掉硫酸铜，在加一滴新的联苯胺，染 2-5 分钟。 ⑷ 1%的藏红花复染。
⑸ 流水冲洗，晾干、镜下观察。
结果：粒细胞的过氧化物酶反应阳性，呈蓝色颗粒，细胞质为红色。 临床意义：主要用于定性、定位观察急性白血病及其鉴别诊断。
在正常血骨髓中：过氧化物酶阳性的主要是中性粒细胞。
中性粒细胞：原粒时 POX 为阴性，早幼粒时开始出现阳性反应，以后逐渐反 应增强。 嗜酸性粒细胞：P0X 可成团块状。
嗜碱性粒细胞：反应多为阴性。
单核细胞：阳性反应颗粒多为细小弥散。
病理：在急粒、慢粒时 POX 增强，在急单时 POX 减弱。
而在急性淋巴型白血病时，POX 是阴性，因此可以与急性粒细胞性白血 病和单核细胞型白血病进行鉴别。在慢性粒细胞性白血病中嗜碱性粒细 胞的 POX 反应呈阳性反应。
范文二：实验七 死活细胞鉴别
实验一 死活细胞鉴别
目 的 要 求
学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。
实 验 原 理
死活细胞鉴别有许多不同的方法，其中最常用方法是染色排除法。其原理是:许多酸性染料不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。也可以用荧光排除法来鉴别，其原理是:由于活细胞内有较强的酯酶活性，可将二丙酸酯荧光素分解出来，从而使细胞发出强烈的黄绿色荧光。而死亡的细胞，由于酯酶活性丧失，不能分解二丙酸酯荧光素，则完全没有荧光，从而区别死活细胞。
实 验 用 品
(1) 器材:显微镜、荧光显微镜、离心机。
(2) 试剂:1,台盼蓝溶液(生理盐水配制)、0.05,苯胺黑Hanks溶液、0.02,赤藓红B
染液、0.15,伊红Y染液(生理盐水配制)、丙酮Ph5,6的生理盐水、0.65mol/L甘
露醇、二丙酸酯荧光素染液(取二丙酸酯荧光素10mg溶于5ml丙酮中，将此溶液
逐滴加入5ml生理盐水或0.65mol/L甘露醇溶液中直至出现永久性乳白色沉淀为
止)。
(3) 材料:培养细胞。
方 法
台盼蓝(Trypan Blue)法。
(1) 试剂:用生理盐水配成0.4,台盼蓝染液。
(2) 染色制片:取0.5ml细胞悬液放入干净试管中，加入约0.1ml(1,2滴)染液，混合，
2min后立即制成临时装片，镜检。
(3) 结果:死细胞染成蓝色，活细胞不着色。根据下式求细胞活力:
细胞总数,死细胞数
细胞存活率(,), ×100,
细胞总数
观 察 结 果
生活力强的细胞能发出强烈的黄绿色荧光;生活力弱的细胞发出荧光也较弱;死亡细胞
则无荧光。
作 业
书写实验报告，计算所测细胞成活率。
思 考 题
细胞活力检测有何用途,
范文三：死活MSCs细胞的鉴别
来自:C:/细胞生物学实验技术
方法(一) 染色排除法
实验原理和方法:
组织培养中检查细胞死活最常用的方法是染色排除法, 即以死活细胞对色素的不同吸附 能力来鉴别,这种方法简单,适用。但严格地说,它只能判断细胞的代谢死亡,不反应细胞 能否增殖。由于未经固定、染色,所以不能看到死、活细胞的形态差别,样品也不能保留。 本实验介绍动物细胞染色排除法常用的染料及染色方法:
第一类死细胞着色:使死细胞着色的大多是酸性染料,它们不容易穿透活细胞的质膜 进入细胞内,却能渗进死亡的细胞,使之着色。
1. 台盼兰(Trypan Blue ) :将台盼兰溶于被检测细胞所需的生理盐水中,配成 0。 5— 1。 0%溶液,调 PH7。 0— 7。 2,每毫升细胞悬液约加 0。 1毫升染液,混合后约 2分钟即可镜检。 死细胞被染成兰色。 因台盼兰有轻度的毒性, 染色时间不宜太长。 染色时间 15分钟以上,活细胞也会因为受损而着色。台盼兰染液不宜久存,陈旧 者有毒性。
2. 苯胺黑(Aniline black ) :0。 05%苯胺黑 Hanks 溶液以 1:10量与细胞悬液混合 1-2分钟后,镜检,死细胞着黑色。此染料毒性很小。
3. 赤显红 B (Erythrosin B ) :细胞先用 Hanks 液或 PBS 溶液洗,以除尽培养基中的 或细胞周围的血清,取适量细胞与 0。 02%的赤显红 B 混合,两小时之内镜检,死 细胞着红色。
第二类:活细胞着色法
0。 1%的结晶紫生理盐水溶液与细胞悬液 1:2混合,立即镜检,活细胞染成兰色。 此外使活细胞着色的染料还有亚甲基兰(Methylene blue ) 、甲苯胺兰(Toluidine blue ) 。
方法(二) 吖啶橙法
[一 ]实验原理:
细胞经甲醇 -乙醚固定后,用吖啶橙染色,能鉴别出固定之前细胞的死、活状态。吖啶 橙(Acridine Orange , AO )是一种与 DNA 和 RNA 都能结合的荧光染料,在兰光或紫外 光激发下,原来的活细胞经固定,染色后细胞呈绿色,核仁和散布在细胞质中的 RNA 呈桔 红色, 细胞质其余部分为淡红褐色。 而死亡的细胞因物质发生变性,其核呈暗绿色,细胞质 整个呈这铜色。染色后的标本可存放 14天以上。此法用于观察药物杀死的细胞的形态特征 等。
[二 ]试剂和器材
试剂:
1. 0。 1%的吖啶橙染液:吖啶橙 0。 1g ,溶于 100ml 蒸馏水中。
2. 磷酸盐缓冲液
1/15M Na 2HPO 4 700ml + 1/15MKH2PO 4300ml
3. 10%缓冲的中性甲醛固定液
36%甲醛 100ml (加入足量的碳酸镁,强力振荡后放置 24小时,以中和甲醛 中的少量甲酸,取上清液使用) 。
NaHPO 4(无水) 7。 83g + NaH 2PO 4(无水) 4。 21g
待充分溶解后,加生理盐水至 1000ml 。
器材:
清洁玻片,荧光显微镜。
[三 ]实验步骤
1. 细胞培养在盖玻片上,或细胞涂在清洁的载玻片上,用 Hanks 液轻轻洗两次, 再甲醇 -乙醚(1:1)固定 10分钟以上。
2. 下行以无水乙醇、 70%、 50%、乙醇名 2分钟,以置换出乙醚,蒸馏水充分冲 洗。
3. 滴加吖啶橙染液,室温下,暗处浸染 5分钟,蒸馏水洗 2次。
4. 磷酸盐缓冲液(pH7。 0— 7。 2)分色 1-2分钟。
5. 加一滴甘油 -水(1:1)封片,四周用指甲油封固。
结果观察:置荧光显微镜下观察, 蓝光激发。 活细胞的核呈亮绿色, 其中散布着桔红 色斑点,是 RNA 。核仁因有 RNA 也呈桔红色,细胞形态完整。死细胞的核通常呈暗绿色, 胞质亮铜色,内有空泡, 呈破渍状。 其具体形态随细胞致死的原因而异。例如用不同的药物 处理, 死亡细胞的形态便不尽相同。 如药物使染色体凝聚, 能观察到核区有很亮的染色体凝 块。
实验报告:
1. 观察并详细描述死、活细胞的形态差异、染色差异,试解释之。
实验十五 细胞固定染色法
一、实验目的
掌握 H ·E 染色法和 Giemsa 染色法的原理及染色特征。
二、实验原理:
细胞固定染色法是用一定的化学物(固定剂)迅速杀死细胞,再进行染色观察。 固定的目的是使细胞内的蛋白质,脂肪,核糖等转变为不溶性物质。从而避免自溶及 腐败。 经过固定的细胞, 在相当大的程度上保持了原有的结构, 这样的制版一般能保持很长 时间。我数固定剂并具有媒染作用,使细胞容易着色。清楚地显示细微结构。
固定剂不同,其性能也有差异,一种固定剂对某种结构保存效果好,对别的结构不一 定适合, 染色剂更是对细胞内的各种化学成分有不同的亲和力。 所以每种组织通常有其特定 的固定染色方法。
本实验介绍两种常用的基本染色法。
①常规苏木精 -伊红染色法(HE 法) :
HE 法是组织学技术的基本方法,适用于各种组织,各种包埋方式的切片以及培养的组 织、细胞。 苏木精是从苏木中提取的天然物质,是染细胞核的优良染料。而苏木精对组织亲 和力很小,不能单独使用,需配以氧化剂如高锰酸钾、过氧化氢、碘酸钠。等使其脱氢成为 苏木红;或令其在空气中自然氧化,并加入带强正电荷的复盐如:铁明矾、铬矾、钾矾等配 成混合液使用。在细胞核染成兰色之后,用伊红复染细胞质。
② Giemsa 染色法:
Giemsa 染料(细胞遗传学家 Gustav Giemsa 配成此种染料)不是一种单一的染料,而 是数种染料的混合物,它们是甲基蓝及其氧化产物——天青(azure )和伊红 Y 。其染色的 质量随所用染料的比例不同而异。
天青 A 和天青 B 都是噻嗪系列的成员,是甲基蓝和重铬酸钾一起氧化的产物。天青 A 是一种碱性染料,分子式是 C 14H 14N 3SCl ,分子量 291。 799,它对染色质 DNA 的反应与雪 夫试剂(Schiff )一样,实际上是一种醛反应,所以它能使 DNA 和光华着色,着色的染色 体和 DNA 的色泽明亮。
伊红 Y 是一种酸性染料,玫瑰红色,属吨(xanthene )系列。
Giemsa 染色液一般是将上述这些粉剂混合物溶解于甘油和甲醇中;经染色后,染色质 呈现红色,而细胞质为蓝色。
三、试剂和器材
方法①:
试剂:
1%NaHCO3水溶液、 95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、中性树胶、酸化乙醇分色液(含 0。 5%浓盐酸的 70乙醇) 。
FAA 固定液:70%乙醇 70ml + 冰醋酸 5ml + 36%甲醛 5ml
Mayer 酸性苏木精明矾染液:
苏木精 0.5g 铵明矾(NH 4) 2SO 4Al 2(SO 4) 3·24H 2O 0.5g
NaIO 30.1g 甘油 30ml 冰醋酸 2ml
依次加入 70ml 蒸馏水中溶解后过滤备用。
伊红染液:
伊红 Y 0.5g加水 100ml
Hanks 盐溶液:
10×母液配制:
NaCl 80.0g MgSO 4·7H 2O 2.0g
KCl 4.0g Na 2HPO 4·12H 2O 1.2g
KH 2PO 40.6g 葡萄糖(无水) 10.0g
*CaCl21.4g (先单独用 100ml 三蒸水另溶后合并)
Hanks 工作液配法:取 100ml 母液 +900ml三蒸水+1%酚红(单独配置) 2ml , 10磅 20分钟高压消毒,后用消毒的 NaHNO 3调 PH 至 7.0-7.2.4℃保存备用。
器材:
体外培养细胞(或各种组织切片) 、立式染缸。
方法:
试剂:
甲醇-冰醋酸(3:1) ,现配现用。
Giemsa 原液:
Giemsa 色素 1g 甘油 66ml 纯甲醇 66ml
将 Giemsa 色素置研钵中用甘油研磨至无颗粒为止,移入 55-60℃水浴内 2小时,不时 摇动使其溶化, 待冷后加入甲醇。 贮于棕色瓶内。 室温下放置 2-3周后, 以粗滤纸过滤备用。 磷酸盐缓冲液(pH6.8) :
1/15M Na2HPO 4 50ml + 1/15M KH2PO 4 50ml
器材:
培养人外周血细胞、清洁玻片、吸管、量筒、烧杯、
实验步骤:
方法 1:
本实验以单层培养细胞 HE 染色为例:
1、细胞培养在盖玻片上,取出后用 Hank s液轻轻洗两遍。
2、入 FFA 液固定 15-30分钟,蒸馏水漂洗。
3、入 20:1水稀释的 Hayer 酸性苏木精明矾染液浸染 10分钟,自来水冲洗。
4、入酸化乙醇至核变紫色。
5、入 1%NaHCO 3溶液碱化,漂洗至核呈兰紫色,自来水冲洗。
6、入伊红染液浸染 1分钟,水洗。
7、入 95%乙醇对伊红分色,至胞质桃红色。此时即可做临床镜检。
8、如欲做长期保留的标本,上述细胞样品再入 95%乙醇,无水乙醇各 2分钟脱水,两 次二甲苯透明,每次 5分钟,滴加中性树胶,封片。
结果:细胞核兰紫色,细胞质桃红色。
方法 2:
1、细胞培养在盖玻片上,取出经 Hank s液轻轻洗两次,半小时入纯甲醇固定 5分钟, 或者甲醇-冰醋酸(9:1)固定 10分钟,如果着重显示染色体,则可用甲醇-冰醋酸(3:
1)反复固定 10分钟(具体方法见前面的实验) 。充分晾干。
2、将 Giemsa 原液用磷酸缓冲液(1/15M pH6.8)稀释 10-20倍, 、滴在载玻片上,染 色 5-15分钟。
3、流水冲洗,晾干,即可镜检,若需长期保存,则充分干燥后,用甲苯透明,树胶封 片。
实验结果:细胞核红紫色,细胞质蓝色。
范文四：Calcein-AM和PI鉴别死活细胞
PI 可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色
钙黄绿素 -AM(Calcein-AM)和碘化丙啶 (PI)溶液,它们分别可对活细 胞和死细胞染色。 Calcein -AM 的乙酸甲基酯亲脂性很高,使其可透 过细胞膜。尽管 Calcein -AM 本身并不是荧光分子,但通过活细胞内 的酯酶作用, Calcein -AM 能脱去 AM 基, 产生的 Calcein 能发出强绿 色荧光(激发:490nm ,发射:515nm ) 。因此 Calcein -AM 仅对活细 胞染色。 另一方面, 作为核染色染料的 PI 不能穿过活细胞的细胞膜。 它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核, 并嵌入细胞的 DNA 双螺旋 从而产生红色荧光(激发:535nm ,发射:617nm ) 。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490nm 激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和 死细胞。用 545nm 激发,仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最 佳染色条件不同,我们建议个别确定 PI 和 Calcein -AM 的合适浓 度。 I .试剂 Calcein-AM PI
II .用荧光显微镜观察细胞形态
以 HeLa 细胞染色为例 , 请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的 观察条件。 根据细胞条件, 摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓 度的配制等最佳条件。 1.染色溶液的配制
1)用 1ml 无水 DMSO 溶解 1mg Calcein-AM ,制备成 1mmol/l的 Calcein-AM 储备液, -20℃下密闭冷冻保存。
2)用 1ml ddH2O 溶解 1mg PI ,制备成 1.5mmol/l的 PI 储备液 (1mg PI/1ml H2O ) , -20℃下密闭冷冻保存。
3)将 Calcein-AM 储备液和 PI 储备液放置于室温。
4)加 10μl Calcein-AM 储备液和 15μl PI 储备液至 5ml PBS 中配 制成染色溶液。 Calcein-AM 的终浓度为 2μmol /l , PI 的终浓度 为 4μmol /l 。
2.细胞染色
1) 染色 HeLa 细胞等贴壁细胞时 , 先用 Trypsin-EDTA 等消化细胞, 制 备成细胞悬液。
2)将细胞悬液离心 3分钟 (1,000rpm) 。
3)去除上清液,加入 PBS 缓冲液,细胞数量调整至 105– 106个/ ml 。再用移液器充分混匀。
4)由于培养基中的血清等含有酯酶, Calcein-AM 遇水会分解,会导 致空白上升,所以需要离心数次,用 PBS 洗涤数次直到完全洗净。 5)将 200μl 细胞悬液移至小试管中,加入 100μl 染色溶液,在 37℃下孵育 15分钟。
6)在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。
7)在荧光显微镜下,先使用 490±10nm 波长激发,观察黄绿色的活 细胞,还可以同时观察到红色的死细胞,然后用 545nm 波长激发, 能够看到红色的死细胞。 *在荧光显微镜下观察时,如果背景高,可 以用培养基清洗掉细胞外的染料后再观察。
*Calcein-AM溶液和 PI 溶液可以混合在一起染色,也可以分开进行 染色,加入的先后顺序没有影响。
3.染色试剂的最佳浓度
Calcein-AM 和 PI 的最适浓度是根据不同的细胞种类而定,通过以下
的操作,我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。
1)通过在 0.1%皂苷或 0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育 10分钟或通过在 70%乙醇中孵育 30分钟制备死细胞。
2)用 0.1-10μM 的 PI 溶液对死细胞染色,以便找到仅对细胞核染 色而不对细胞质染色的 PI 浓度。
3)用 0.1-10μM 的 Calcein-AM 溶液对死细胞染色,以便找到不对 细胞质染色的 Calcein -AM 浓度。接着用该浓度的 Calcein -AM 对活 细胞染色以检验活细胞可否被染色。
范文五：实验四 死活细胞鉴别
实验四 死活细胞鉴别
目 的 要 求
学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。
实 验 原 理
死活细胞鉴别有许多不同的方法，其中最常用方法是染色排除法。其原理是：许多酸性染料不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。也可以用荧光排除法来鉴别，其原理是：由于活细胞内有较强的酯酶活性，可将二丙酸酯荧光素分解出来，从而使细胞发出强烈的黄绿色荧光。而死亡的细胞，由于酯酶活性丧失，不能分解二丙酸酯荧光素，则完全没有荧光，从而区别死活细胞。
实 验 用 品
（1） 器材：显微镜、荧光显微镜、离心机。
（2） 试剂：1％台盼蓝溶液（生理盐水配制）、0.05％苯胺黑Hanks 溶液、0.02％赤藓红B
染液、0.15％伊红Y 染液（生理盐水配制）、丙酮Ph5～6的生理盐水、0.65mol/L甘露醇、二丙酸酯荧光素染液（取二丙酸酯荧光素10mg 溶于5ml 丙酮中，将此溶液逐滴加入5ml 生理盐水或0.65mol/L甘露醇溶液中直至出现永久性乳白色沉淀为止）。
（3） 材料：培养细胞。
方 法
台盼蓝（Trypan Blue）法。
（1） 试剂：用生理盐水配成0.4％台盼蓝染液。
（2） 染色制片：取0.5ml 细胞悬液放入干净试管中，加入约0.1ml （1～2滴）染液，混合，
2min 后立即制成临时装片，镜检。
（3） 结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。根据下式求细胞活力：
细胞存活率（％）＝
细胞总数
细胞总数－死细胞数 ×100％
观 察 结 果
生活力强的细胞能发出强烈的黄绿色荧光；生活力弱的细胞发出荧光也较弱；死亡细胞则无荧光。
作 业
书写实验报告，计算所测细胞成活率。
思 考 题
细胞活力检测有何用途？
