范文一：细菌生物膜
细菌生物膜
Post等于2001年首次在分泌性中耳炎的发病机制中提出细菌生物膜的致病
理论以来，细菌生物膜与中耳炎的关系迅速成为学者们关注的焦点，而且很快扩
展到对病程长的难治性感染性疾病如:慢性鼻- 鼻窦炎等的研究，其发病机理是
否也与细菌生物膜致病理论有关，学者们正在研究探索中。
1.概念：细菌生物膜是指细菌在不利于其生长的环境下，通过自身产生的胞
外多糖被膜多聚物相互粘连形成的细菌群落，粘附于无生命体或活体表面，可由
单一菌种形成，也可由多菌种形成。目前认为99%的细菌以生物膜的形式存在，
只有1%的细菌以浮游形式存在。人类感染疾病，65%涉及细菌生物膜，实验性
的中耳炎、鼻- 鼻窦炎都已证实有细菌生物膜的存在，国外扫描电镜观察慢性鼻
- 鼻窦炎粘膜生物膜的出现率在80~100%之间（图1.2）。
成熟三维结构细菌生物膜可见水通道及基 鼻窦粘膜有圆形，椭圆形小体埋于基质中，
质包被的椭圆形，球形小体.×6500 形成塔状结构，其间有水道分隔. ×8000
1.1、细菌生物膜组成及形态特征：生物膜组成的基本要素是细菌、胞外基
质(胞外多糖和蛋白质)和粘附面构成具有含开放水通道三维膜性复合体，其内可
见0.05μm~0.5μm细菌大小范围圆形或椭圆形小体埋于基质中构成塔状，其间有
水通道分隔，细菌在胞外多糖、邻近细菌和水通道组成的微环境中生长、繁殖（图
3）。
×6500
1.2、附着面：组织粘膜损伤，细菌才能粘附。正常粘膜覆盖一层粘液毯，
含有溶菌酶和分泌的免疫球蛋白A，加上粘膜纤毛运动，可抑制细菌的粘附和生
长，当粘膜受损，纤毛排列紊乱、倒伏或缺失，细菌才能粘附、定植、微菌落形
成、成熟的细菌生物膜形成，因此粘膜损伤是细菌生物膜形成的前提条件，同时
细菌亦可粘附于固定的或死亡的组织表面，如：植入体内的医疗器械或死骨形成
细菌生物膜。
1.3、水通道：开放于三维膜性复合体的水通道，贯穿于圆形或椭圆形小体
之间，成为调控生物膜的稳定性或pH梯度主要循环系统，协助转运其营养物质
和废物。
2.生物膜的临床特征：
2.1、细菌生物膜具有极强的抗药性：抗生素对浮游菌存在抗菌作用，可使
临床症状消失，但一般不能穿透细菌生物膜，其耐药性相当于浮游菌的500~1000
倍以上，由于这种抵御抗菌药物作用，致使其在宿主体内长期存在。
2.2、病程的长期性：细菌生物膜能间断释放浮游菌，导致感染，反复加重
或急性发作，常规感染药可杀灭浮游菌和表层菌，临床症状可控制，但由于生物
膜独特的耐药性，深层菌长能抵抗抗生素的作用，得以生存，停止抗生素治疗后，
存留细菌会利用死亡菌为营养迅速繁殖，只需数小时即恢复原有状态，在环境允
许时，细菌生物膜再次释放浮游菌，导致症状再次复发，成为急性感染发病的“细
菌孵化所”，故使病程长期迁延不愈。
2.3、可逃避宿主的细胞免疫和体液免疫，导致局部炎症反应。细菌生物膜
由于在宿主体内持续存在，其内细菌产生超抗原，影响宿主的免疫系统，刺激周
围粘膜，不时释放炎性介质，导致局部炎症反应：1L-8升高，中性粒细胞和B
细胞显著聚集，细胞粘膜肿胀，渗出增多，造成临床上难治性疾病原因之一。
3.细菌生物膜与中耳炎：
人们在治疗儿童分泌性中耳炎过程中发现大多数急性中耳炎的渗液中，细菌
培养阳性，而在慢性中耳炎渗液中呈阴性，对抗生素治疗不敏感且渗液中能检出
炎性介质。于是在2001年post等在分泌性中耳炎的发病机制中提出细菌生物膜
致病理论：细菌以生物膜的形式粘附于中耳粘膜表面，因此中耳积液或灌洗液中
很难培养到活的浮游细菌，膜内的细菌持续分泌内毒素，刺激粘膜，产生炎性介
质，导致局部炎症反应，使粘膜持续肿胀、渗出。Yokota等对一组反复复发的急
性中耳炎进行追踪观察，发现后续发作的急性中耳炎其中耳致病的菌种，属性均
与首次中耳炎的致病菌同源，说明后续的中耳炎急性感染很可能与细菌生物膜未
能彻底清除有关。国内外学者相继在灰鼠、大鼠中耳炎实验模型中发现细菌生物
膜的存在，说明慢性中耳炎反复发作迁延不愈是在中耳粘膜表面形成了细菌生物
膜为重要原因之一。
中耳粘膜无纤毛扁平细胞，细胞 成熟细菌生物膜形成特征性的 听泡注射肺类链球菌悬液后5d，中
嵌顿、紧密、界限清除. ×3000 “蘑菇状”“塔状”三维体结构. 耳粘膜表面可见成熟细菌生物膜.
×2000 ×500
4.细菌生物膜与慢性鼻- 鼻窦炎：
国外学者用扫描电镜观察慢性鼻- 鼻窦炎细菌生物膜出现率为80~100%，且
生物膜的出现率与细菌培养阳性率之间无相关性，细菌生物膜用一般培养方法细
菌为阴性，国内学者张孜等对6例慢性鼻- 鼻窦炎患者用鼻内镜取钩突，筛泡和
上颌窦粘膜样本用扫描电镜观察，其中5例有细菌生物膜存在，检出率为83.3%，
而对照组6例为阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合症。用上述同样的方法无一例有
细菌生物膜的存在，另熊高云等用同样方法对15例伴鼻息肉慢性鼻- 鼻窦炎患
者，其中11例发现细菌生物膜存在，对照组为无鼻- 鼻窦炎的鼻骨骨折患者11
例，其中1例发现有细菌生物膜存在，两者比较差异有统计学意义（p＜＜0.05），
而且其中5例（包括1例对照组）除具有典型的细菌生物膜同时还可见到粘膜纤
毛排列紊、缺失等现象。
排列整齐，鼻粘膜纤毛.×2000 ×6500
鼻窦粘膜表面有圆形或椭圆形小体埋于基质中， 鼻窦粘膜表面可见圆形或椭圆形细胞小体
形成塔状结构，其间有水通道分隔. ×8000 ×6000
参考文献：
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biofilms.Lancet，2001，358：135~138.
（2）Potera C.Forging a link between biofilms and disease.Science，1999，283：
1837，1839.
（3）.Post JC.D：rect evidence of bacterial biofilms in otitis media.Laryngos
cope，111：2083~2094.
（4）.于睿莉，董震.细菌生物膜在慢性鼻- 鼻窦炎发病机制中的作用.中华耳
病咽喉头颈外科杂志.2006，41（3）：228~230.
（5）.张孜，李云川，韩晔华，等.慢性鼻- 鼻窦炎细菌生物膜形态观察，中
华耳鼻咽喉头颈外科杂志.2008，43(11):840~844.
（6）.熊高云，陈海红，汪审清，等.细菌生物膜的电镜下特征及其与慢性鼻
- 鼻窦炎的关系，中华耳鼻咽喉头颈外科杂志.2010，45（1）：19~23.
（7）.柯朝阳，杨名保，龚桃根，等. 细菌生物膜在急性中耳炎大鼠中耳腔
的形成特点及意义.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志.2011，46（3）：220~224.
范文二：细菌生物膜口腔Biofilm
细菌生物膜
内容适合医学院3-5年级学生使用
“In a paper in Science in 1999, we said 65 percent of all diseases in the developed world are biofilms,” Costerton said. “Now the NIH says 80 percent. ”
Biofilms — matrix-enclosed microbial accretions/逐渐生长/增加 that adhere to biological or non-biological surfaces.
细菌生物膜广泛存在于自然环境中
on a contact lens
on a spider
细菌生物膜广泛存在于自然环境中
? Biofilm formation appears early in the fossil record (3.25 billion years ago) and is common throughout a diverse range of organisms in both the Archaea/ 单细胞生物 and Bacteria lineages. ? Biofilm formation represents a protected mode of growth that allows cells to survive in hostile environments and also disperse to colonize new niches.
回肠表面的细菌生物被膜
细菌生物膜广泛存在于自然环境中
人体植入导管表面的细菌生物被膜
真菌生物膜
Biofilms can be harmful ? Catheters and prostheses (may lead to systemic infection) ? Dental disease （牙菌斑、口腔味道？） ? Otitis media/中耳炎, inflammatory bowel disease/IBD, prostatitis/前列腺炎, sinusitis/鼻窦 炎, etc.
生物膜与疾病（总结）
细菌生物膜 进入体内的 可能途径
细菌生物膜的基本性质
生物膜1978年由J. William Costerton等通过电镜 方法首次观察到 Biofilm定义：指细菌自身产生的外部多糖基质、
纤维蛋白质、脂蛋白等包裹着的菌细胞的结构。
? 生物被膜是细菌的一种具有保护性的生长模式，是细胞间 相互协调作用的复杂的多细胞群体，具有结构和代谢复杂性。 ? 形成生物被膜的黏附细菌群也可以释放出浮游细菌，是潜 在的持续感染因素。
Biofilm 特点总结
Biofilms — matrix-enclosed microbial accretions/逐渐生长/增加 that adhere to biological or non-biological surfaces.
古老：fossil record (3.25 billion years ago) Common：a diverse range of organisms
Archaea/ 单细胞生物, bacteria，fungi
Represents a protected mode of growth
that allows cells to survive in hostile environments
Can disperse to colonize new niches/
可以释放出浮游细菌，生长迅速，是潜在感染因素
Biofilm 的形成过程- 体内过程
Biofilm 的形成过程- 从菌落角度
细菌的初始吸附与 其鞭毛、菌毛有关
生物膜的结构特点
像“铠甲”一样
Nature Rev Micro 2010
细菌生物膜的结构特点
化学组成
? 水分（97%）
? 胞外大分子
? 吸附的营养物质及代谢产物、细菌裂解物
? 蛋白质、DNA
生物膜的结构特点
成熟生物被膜模型
? 由外到内依次为： 生物被膜层（bulk of biofilm） 连接层（linking film） 条件层（conditioning film） 基质层（substratum) ? 细菌被大量的胞外多糖包绕形成微菌落，各微菌落之间充 满水通道,是细菌获取营养和排除代
谢废物的通道。
? All biofilms have a ‘matrix’ (EPS) to protect against the environment and hold colonies in place ? Different species, different biofilm development
– Mixes of polysaccharides, proteins, and nucleic acids
成分
The Biofilm Matrix
原理
成分
Nat Rev Micro 2010
细菌生物膜与抗性和特点
1、EPS的存在可以阻止抗生素 作用- 细菌耐药性； 2、抗免疫清除：屏蔽作用使吞 噬细胞和杀伤细胞及其所分 泌的酶不能发挥作用； 3、细菌生活微环境改变：比如 厌氧菌繁殖、H2S产生、pH 改变（口臭、龋齿等） 4、Quorum sensing：参阅 www.ted.com, by Bonnie Basler (普林斯顿大学)
临床意义
细菌生物膜 进入体内的 可能途径
临床意义
? 医疗器械表面、插入导管、植入医疗器具/hip replacement- 是医原性感染的主要原因之一 ? 生物造成细菌对抗生素不敏感/耐药性 ? P. N. R. Nair (2006) International Endodontic Journal. On the causes of persistent apical periodontitis: a review
P. N. R. Nair (2006) International Endodontic Journal. On the causes of persistent apical periodontitis: a review 与口腔的关系
Apical periodontitis is a chronic inflammatory disorder of periradicular tissues caused by aetiological agents of endodontic origin. Persistent apical periodontitis occurs when root canal treatment of apical periodontitis has not
adequately eliminated intraradicular infection. Problems
that lead to persistent apical periodontitis include:
inadequate aseptic control, poor access cavity design, missed canals, inadequate instrumentation, debridement and leaking temporary or permanent restorations. Even when the most
stringent procedures are followed, apical periodontitis may still persist as asymptomatic radiolucencies/ 射线 可透性, because of the complexity of the root canal system formed by the
main and accessory canals, their ramifications and anastomoses where
residual infection can persist.
Further, there are – located within the inflamed periapical tissue – that can interfere with post-treatment healing of apical periodontitis. The causes ……have not been well characterized, but
extraradicular factors
there are six biological factors that lead to asymptomatic radiolucencies persisting after root canal treatment.
? (i) intraradicular infection persisting in the complex apical root canal system; ? (ii) extraradicular infection, generally in the form of periapical
actinomycosis;
? (iii) extruded root canal filling or other exogenous materials that cause a foreign body reaction; ? (iv) accumulation of endogenous cholesterol crystals that irritate periapical tissues; ? (v) true cystic lesions, and ? (vi) scar tissue healing of the lesion
How are biofilms studied in the lab?
? Single-species vs. Multi-species ? Transparent flow cells
– Bacteria attach to glass and nutrients flow through the cell
? Microscopy ? Bacterial culture
生物被膜的观察研究方法
?扫描电镜: Costerton等人在70年代通过扫描
电镜观察到了细菌的生物被膜的存在。 ? 激光共聚焦显微镜:
?分子生物学方法：
Huth et al 2008
http://obgyn.ufl.edu/docs/schultz_eurowound.pdf
cocci SEM
bug
neutrophil
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范文三：细菌生物膜研究技术
47卷 3期
2007年6月4日
微生物学报ActaMicrobiologicaSinica47(3):558~561
4June2007
细菌生物膜研究技术
李京宝,韩 峰,于文功
*
(中国海洋大学医药学院 青岛 266003)
摘 要:细菌生物膜是细菌生长过程中为适应生存环境而在固体表面上生长的一种与游走态细胞相对应的存在形式。只要条件允许,绝大多数细菌都可以形成生物膜。一旦形成了生物膜细菌就具有极强的耐药性,在医疗、食品、工业、军事等诸多领域给人类社会带来了严重的危害,造成巨大的经济损失。因此,细菌生物膜已成为全球关注的重大难题,也是目前科学界研究的前沿和热点。本文结合细菌生物膜研究技术的最新进展,重点介绍了几种常用生物膜发生装置及检测量化技术,并对其原理及优缺点进行了讨论。关键词:细菌;细菌生物膜;耐药性
中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2007)03-0558-04 细菌生物膜是指由附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹着细菌的水合性基质所组成的结构性细菌群落[1]。细菌生物膜广泛存在于含水和潮湿的各种表面上,包括自来水管道,工业管道、通风设备、医疗器械甚至病理状态下的人体组织器官,据专家估计几乎所有的细菌在一定的条件下都可以形成生物膜[2~4]。生物膜中细菌的代谢活动除了能够腐蚀管道和金属表面外,更可导致动植物及人类疾病发生。由于细菌在生物膜状态有着比游走态高出千百倍的抗药性,使得生物膜在临床更易引发难治性慢性感染,严重威胁人类健康[5~7]。
虽然科学家们早在几个世纪以前就知道细菌可以在固体表面形成层膜状结构,但对于细菌生物膜或者说生物膜组织概念的形成及相关研究也只是在近30年来才有了重大的突破。从近十年来所检索到的细菌生物膜相关文献及专利数量的大幅提高可以看出,现在对细菌生物膜的关注程度更是达到了前所未有的高度并仍有上升趋势。一个新兴领域在初期的发展依赖于一系列有效方法的开发,而要想成为该领域的标准方法,则该方法所涉及的新知识就必须为大家所认可。细菌生物膜作为相对新兴的研究领域,并无多少被广泛认可的标准方法。本文将从细菌生物膜的人工发生装置和定性定量检测手段两方面来介绍近几年被普遍使用的生物膜相关技术。
快捷,至今仍在生物膜研究中发挥作用。
112 微孔板法
相对于试管而言,微孔板有着当然的批处理优势。尤其是在加快大批样品的操作速度同时还能保持试验一致性的优点,使得96孔板,乃至384孔板大量应用于细菌生物膜的研究[9~11]。在实际操作中,由于微孔板边缘孔中的液体更易于挥发,从而导致这些孔的结果数值过高。为避免这种系统误差,可以在边缘的孔中仅加水,或者在微孔板上盖湿毛巾用以保湿。
在生物膜处理试验中,加入的抗生素等物质往往在完成处理后仍有部分残留而影响试验的结果。为了消除这些化学物质的继续作用,就必须彻底洗涤孔内的细菌生物膜,这显然是一件非常繁琐的工作。加拿大卡尔加里大学生物膜研究小组使用一种上盖带有小柱子的微孔板,可以很方便地处理或洗涤生长在小柱上的细菌生物膜[12]。该装置已经商品化,称为卡尔加里生物膜装置(Calgarybiofilmdevice,CBD)或直接称其为MBEC,专门用于考察生物膜相对于其游离状态菌体的耐药性变化,以及寻找可以恢复生物膜对抗生素的敏感性的物质。该装置一经面世,立刻受到广大生物膜研究人员的欢迎,得到广泛应用[13]。113 置片法
置片法即在细菌培养液中加入玻璃片或其他片状、管状物静置共培养,以提供额外的可供生物膜附着并可移动处理的表面。Ghigo就曾用该方法分析了基因水平转移对生物膜生成的影响[14]。由于加入玻片较大,可以直观地比较细菌生物膜的生长状况,甚至可以将其上生物膜刮下进行研究。另外还可将有生物膜附着的小管植入小鼠体内,观察生物膜相关的细菌感染状况[15]。
114 平板膜片法
菌落在某种程度上也可以称为生物膜,即菌落生物膜(Colonybiofilm)。将菌液稀释至一定程度,涂布于固体培养
1 人工生物膜发生装置
111 试管法
将细菌稀释至适当浓度装入小试管等容器,于适当的温度下静置培养,则该细菌的生物膜将会在试管壁上形成。根据菌种厌氧好氧的不同,生物膜分别倾向形成于试管的底部或者气液交界面。O.Toole等[8]曾用该方法考察不同的材料包括聚苯乙烯,聚丙烯等对荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)生物膜生成的影响。由于该方法简单方便,灵活
*
通讯作者。Tel:86-532-82031680;Fax:86-532-82033054;E-mail:yuwg66@ouc.edu.cn
作者简介:李京宝(1979-),男,甘肃兰州人,博士研究生,从事微生物生物膜方向研究。E-mail:alginate798@hotmail.com收稿日期:2006-10-08;接受日期:2006-11-21;修回日期:2007-02-08
李京宝等:细菌生物膜研究技术.P微生物学报(2007)47(3)基,待长出成片的菌落即可。通常该方法多应用于生物膜的通透性研究,如Carmen等发现超声波可以使庆大霉素更易于通过铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)及大肠杆菌生物膜[16];Hatch等研究了褐藻胶裂合酶对铜绿假单胞菌生物膜的影响[17]。
115 管路法
同以上静置造膜的方法不同,管路法属于动态造膜方法:首先将适当密度的菌液注射入硅胶或其他材质管路中静置约1小时,使菌体可以贴附在管壁上,然后开启蠕动泵,使液体培养基以一定速度在管路中流动。流动的培养基使生物膜在生长过程中随时处在一种剪切力的作用下,而这种力对生物膜的发生、发育都起着相当重要的作用[18]。并且该模型更加贴近水管或医用导管相关生物膜的形成。Bagge等就用该方法分析了肺纤维化相关感染菌)铜绿假单胞菌在生物膜状态下B-内酰胺酶及其褐藻胶合成相关基因的表达差异[19]。
116 流室法(Flowcell)
流室法与管路法原理基本一样,唯一的不同在于:细菌生物膜附着的表面变成管路中嵌入的玻璃片,通过该玻片,研究者可以实时观测生物膜的生长状况,且不用损伤生物膜,这就是所谓的/在线观察0,如图1。起初的流室由不锈钢等材料制成,有一定规格凹槽,上面覆盖玻璃片,两端连接管路[20];为了使形制保持一致而增加实验的稳定性,Stapper等曾用微机化的机器工具制造流室的部件[21];现在该装置业已商品化,有数家公司生产,虽然外观结构略有不同,但其原理用途完全一致。由于在细菌生物膜结构观察方面的独到之处,流室法几乎成为目前在生物膜研究领域应用最广泛的生
物膜发生装置。
559
究目的的不同而选择一个恰当的模型对试验的顺利开展至关重要。就同一个模型来说,实际应用当中仍有许多关键参数需要关注或调整,比如选用的菌种、培养基,培养的温度,流速的大小,生物膜形成表面的材料性质等等。以上方法的应用在细菌生物膜的研究过程中提供了大量有用的资料,相信将来还会有更多、更巧妙的方法将生物膜的研究步步向前推进。
2 生物膜检测技术
211 菌体计数
即通过计算生物膜中菌体对生物膜进行量化。为了将生物膜与其黏附的固体表面分离,通常使用一些机械方法,比如超声或涡旋,得到的菌液常用平板菌落法,通过计算菌落形成单位(Colonyformingunits,CFU)对生物膜内的活菌计数。另外,生物膜中包括死菌的总菌体数也可以通过显微镜直接计数。Banin等[24]就通过计算活菌与总菌数的变化,来评估EDTA对生物膜的清除及杀灭作用。212 染色法
利用生物膜内物质对某些染料的结合,可以通过染色的办法对生物膜进行定量。最常用的就是结晶紫[8],先将1%的结晶紫溶液浸润生物膜生成的表面,静置30min后用水洗去未结合的染料,将剩余的水除去后,用乙醇或乙酸溶液溶解附着于生物膜上的染料,所得有色溶液用分光光度计或酶标仪测定590纳米处吸光值。该方法简便快捷,适用于试管及96孔板法造膜。Kaplan等也曾用该法对在聚亚氨酯软管上的生物膜进行定量[25]。213 荧光法
荧光染料的应用使生物膜的观察有了选择性。用Syto9及碘化丙锭(Propidiumiodide,PI)显示不同颜色的荧光可以区分生物膜中的死活菌,这对于生物膜的清除研究意义重大[26]。另外用荧光标记的抗体或凝集素,更可以特异性地识别生物膜中的某些成分而显色[27],进一步而言,荧光原位杂交(Fluorescentinsituhydridization,FISH)的应用使我们对生物膜内的物质分布有所了解[28]。除了外加荧光染料外,绿色或红色荧光蛋白,不论是质粒介导的还是重组入基因组的,都已成为生物膜检测领域中广泛运用的分子生物学工具[29]。214 激光共聚焦显微镜(Confocallaserscanningmicroscope,CLSM)
图1 构成流室模型的主要部件
Fig.1 Schematicrepresentingthemaincomponentsoftheflowcellsystem.
普通荧光显微镜下,许多来自焦平面以外的光使观察到的反差和分辨力降低。而激光共聚焦显微镜则通过检测器前的小孔保证只有来自焦平面的光成像,其他散射光被挡住,从而使显微镜的分辨力得以提高。这里之所以将其与一般的荧光显微镜分开来讲,更主要是由于激光共聚焦显微镜可对较厚的样品进行无损伤/光学切片0,再通过三维重构得到样品的立体结构,如图2为表达绿色荧光蛋白的铜绿假单胞菌在流室中所形成生物膜的三维立体图像。除了通过图象软件我们可以得到各个角度的生物膜三维视图外[30],更有一些计算软件可以将三维图象数据化,从而使生物膜的特征量化[31]。其中以丹麦的Heydorn撰写的COMSTAT最为常用,它运行于Matlab程序513以上版本,可以对生物膜的生物,[32]117 旋碟法(Rotatingdiskreactor,RDR)
旋碟法不同于以上两种方法,它是利用搅拌子搅动培养基,使其处于涡旋状态而提供剪切力。生物膜的载体是多个圆形的小碟,由不同材料构成。它们镶嵌于该容器的底部或者侧壁上,生物膜形成后可以取下观察,处理。Teitzel等曾用其考察重金属离子对生物膜细菌及其游离菌体的作用差别[22];Mah等在分析生物膜耐药的基因基础时用到了旋碟法[23]。
560LIJing-baoetal.PActaMicrobiologicaSinica(2007)47(3)
被发现,但是长期以来,科学家仅对浮游细菌(或游离细菌)进行了深入研究,却忽视了作为细胞群体存在的细菌生物膜
研究。近年来随着细菌生物膜研究的兴起,人们逐渐认识到与浮游的细菌相比,生物膜细菌有着更加复杂的结构、广泛的信息沟通、精密的调控机制和强化的社会效应,并且更多地影响着人类的生活。显然,数百年来建立的以浮游细菌为对象的经典微生物研究方法已经不能满足细菌生物膜研究的需要,因此生物膜研究方法的建立就显得尤为重要。随着相关技术的不断更新和发展,人们对细菌生物膜的认识和理
图2 由激光共聚焦显微镜得到的铜绿假单胞菌FRD1生物膜立体图像
Fig.2 Three-dimensionalviewofP.aeruginosaFRD1biofilmbyCLSM.ThestrainexpressingGFPwascultivatedinflowcellsystemandthebiofilmshowedcellclusterslikemushroom.Barfor20Lm
解将越发深入和透彻,也就可以更好地控制甚至开发生物
膜,造福社会。
参
[1]
考文献
215 电子显微镜
电子显微镜是用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜,使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器,其分辨力可达纳米级甚至更小。按照工作方式的不同分为透射电子显微镜(Transmissionelectronmicroscope,TEM)和扫描电子显微镜(Scanningelectronmicroscope,STM)。透射电子显微镜是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上,电子与样品中的原子碰撞而改变方向,从而记录产生的立体角散射成像。Kaplan等将伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)形成的生物膜固定并切片,观察到该菌的内部放散特征[33]。扫描式电子显微镜的电子束不穿过样品,仅在样品表面扫描激发出次级电子而成像,图像有很强的立体感,在生物膜研究初期提供了直接形象的外观资料[34]。
由于电子显微镜需在真空条件下工作,所以很难观察活的生物,而且电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。电子束在有结合水存在的真空条件下无法工作,但生物膜中95%的成分都是水,所以脱水的过程对样品的影响很大。另外昂贵的设备,相对繁琐的样品制备工作也使电子显微镜在生物膜研究领域的应用受到限制。
216 原子力显微镜(Atomicforcemicroscopy,AFM)
原子力显微镜通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。将一对微弱力极端敏感的微悬臂一端固定,另一端的微小针尖接近样品,这时它将与其相互作用,作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。扫描样品时,利用传感器检测这些变化,就可获得作用力分布信息,从而以纳米级分辨率获得表面结构信息。该技术诞生于1985年,近年来应用范围不断扩展[35],目前在生物膜研究领域也有所建树。Steinberger等[36]利用原子力显微镜对临界维度纳米级测量发现铜绿假单胞菌在低营养条件下,为适应饥饿状态而菌体长度增加。Landry等[37]的研究表明,粘液素(Mucin)与铜绿假单胞菌的相互作用加剧了该菌的生物膜形成及其耐药性的提高。
细菌生物膜是地球生命系统的重要组成部分,它影响着[2][3][4]
CostertonJW,StewartPS,GreenbergEP.BacterialBiofilms:A
commoncauseofpersistentinfections.Science,1999,284:1318-13221
CostertonJW,ChengKJ,GeeseyGG,etal.Bacterialbiofilmsinnatureanddisease.AnnuRevMicrobiol,1987,41:435-4641ParsekMR,SinghPK.Bacterialbiofilms:anemerginglinktodiseasepathogenesis.AnnuRevMicrobiol,2003,57:677-7011DonlanRM,CostertonJW.Biofilms:survivalmechanismsofclinicallyrelevantmicroorganisms.ClinMicrobiolRev,2002,15:167-1931
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Modelsystemsforbacterialbiofilmresearch
LIJing-bao,HANFeng,YUWen-gong
*
(SchoolofMedicineandPharmaceutics,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China)
Abstract:Contrasttoplanktoniccells,biofilmsarecomplexcommunitiesofmicroorganismsthatdeveloponbioticor
abioticsurfaces.Mostofbacteriacanformbiofilmsunderproperconditions.Oncebiofilmform,theinnerbacteriacellsoftenexhibitreducedantibioticsusceptibilitythantheirfree-floatingcounterparts,soconventionalmethodsofkillingbacteria,suchasantibioticsanddisinfectionsareoftenineffectivewiththem.Biofilmsmaycausehugeeconomiclossinequipmentdamage,productcontamination,energylossesandmedicalinfections.Therefore,bacterialbiofilmisevolvingasafocalproblemandanactiveareaofresearch.Asarelativelynewarea,theprogressofbiofilmsciencedependsonthedevelopmentofasatisfactorysetofmethods.Buttheclassicmethodstostudyplanktonicbacteriacannotfulfillthebiofilmresearch,oneforwhichtherearefewwidelyacceptedmethodologicalstandards.Eventhoughbiofilmsarecomplicatedphysica-lchemica-lbiologicalsystems,experiencedemonstratesthataccessibleresearchmethodsarefeasible.
Inthispaper,thetheories,principles,meritsandlimitationsofsomemethodscurrentlyusedinbacterialbiofilmresearches,involvingartificialbiofilmformingandbiofilmmeasurement,werediscussed.Keywords:bacterium;bacterialbiofilm;antibioticresistance
*
Correspondingauthor.Tel:86-532-82031680;Fax:86-532-82033054;E-mail:yuwg66@ouc.edu.cn
Received:8October2006PAccepted:21November2006PRevised:8February2007
范文四：细菌生物膜研究技术
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细菌生物膜研究技术
李京宝，韩峰，于文功
（中国海洋大学医药学院
青岛
$&&%%#）
摘要：细菌生物膜是细菌生长过程中为适应生存环境而在固体表面上生长的一种与游走态细胞相对应的存在形
式。只要条件允许，绝大多数细菌都可以形成生物膜。一旦形成了生物膜细菌就具有极强的耐药性，在医疗、食品、工业、军事等诸多领域给人类社会带来了严重的危害，造成巨大的经济损失。因此，细菌生物膜已成为全球关注的重大难题，也是目前科学界研究的前沿和热点。本文结合细菌生物膜研究技术的最新进展，重点介绍了几种常用生物膜发生装置及检测量化技术，并对其原理及优缺点进行了讨论。关键词：细菌；细菌生物膜；耐药性中图分类号：D@#
文献标识码：E
文章编号：%%%*1&$%@（$%%
快捷，至今仍在生物膜研究中发挥作用。!
微孔板法
相对于试管而言，微孔板有着当然的批处理优势。尤其是在加快大批样品的操作速度同时还能保持试验一致性的优点，使得@&孔板，乃至#(!孔板大量应用于细菌生物膜的
［@)**］
研究。在实际操作中，由于微孔板边缘孔中的液体更易
细菌生物膜是指由附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹着细菌的水合性基质所组成的结构性细菌群落
［*］
。细菌生物膜广泛存在于含水和潮湿的各种表面上，包
括自来水管道，工业管道、通风设备、医疗器械甚至病理状态下的人体组织器官，据专家估计几乎所有的细菌在一定的条
［$)!］
件下都可以形成生物膜。生物膜中细菌的代谢活动除
了能够腐蚀管道和金属表面外，更可导致动植物及人类疾病发生。由于细菌在生物膜状态有着比游走态高出千百倍的抗药性，使得生物膜在临床更易引发难治性慢性感染，严重威胁人类健康
［’)
于挥发，从而导致这些孔的结果数值过高。为避免这种系统误差，可以在边缘的孔中仅加水，或者在微孔板上盖湿毛巾用以保湿。
在生物膜处理试验中，加入的抗生素等物质往往在完成处理后仍有部分残留而影响试验的结果。为了消除这些化学物质的继续作用，就必须彻底洗涤孔内的细菌生物膜，这显然是一件非常繁琐的工作。加拿大卡尔加里大学生物膜研究小组使用一种上盖带有小柱子的微孔板，可以很方便地
［*$］
处理或洗涤生长在小柱上的细菌生物膜。该装置已经商
。
虽然科学家们早在几个世纪以前就知道细菌可以在固体表面形成层膜状结构，但对于细菌生物膜或者说生物膜组织概念的形成及相关研究也只是在近#%年来才有了重大的突破。从近十年来所检索到的细菌生物膜相关文献及专利数量的大幅提高可以看出，现在对细菌生物膜的关注程度更是达到了前所未有的高度并仍有上升趋势。一个新兴领域在初期的发展依赖于一系列有效方法的开发，而要想成为该领域的标准方法，则该方法所涉及的新知识就必须为大家所认可。细菌生物膜作为相对新兴的研究领域，并无多少被广泛认可的标准方法。本文将从细菌生物膜的人工发生装置和定性定量检测手段两方面来介绍近几年被普遍使用的生物膜相关技术。
品化，称为卡尔加里生物膜装置（G30:3H8I7
［*#］人员的欢迎，得到广泛应用。
!
置片法即在细菌培养液中加入玻璃片或其他片状、管状
!
!
人工生物膜发生装置
试管法
将细菌稀释至适当浓度装入小试管等容器，于适当的温
物静置共培养，以提供额外的可供生物膜附着并可移动处理的表面。OC7:
［*!］生成的影响。由于加入玻片较大，可以直观地比较细菌生
物膜的生长状况，甚至可以将其上生物膜刮下进行研究。另外还可将有生物膜附着的小管植入小鼠体内，观察生物膜相
［*’］关的细菌感染状况。
度下静置培养，则该细菌的生物膜将会在试管壁上形成。根据菌种厌氧好氧的不同，生物膜分别倾向形成于试管的底部
［］
或者气液交界面。F’/
!
菌落在某种程度上也可以称为生物膜，即菌落生物膜
生物膜生成的影响。由于该方法简单方便，灵活*+$&,#
涂布于固体培养
作者简介：李京宝（*@
李京宝等：细菌生物膜研究技术’S微生物学报（455.）（C）F.基，待长出成片的菌落即可。通常该方法多应用于生物膜的通透性研究，如!
［()］
于通过铜绿假单胞菌（!’
管路法
同以上静置造膜的方法不同，管路法属于动态造膜方法：首先将适当密度的菌液注射入硅胶或其他材质管路中静置约(小时，使菌体可以贴附在管壁上，然后开启蠕动泵，使液体培养基以一定速度在管路中流动。流动的培养基使生物膜在生长过程中随时处在一种剪切力的作用下，而这种力
［(/］对生物膜的发生、发育都起着相当重要的作用。并且该模
KK3
究目的的不同而选择一个恰当的模型对试验的顺利开展至关重要。就同一个模型来说，实际应用当中仍有许多关键参数需要关注或调整，比如选用的菌种、培养基，培养的温度，流速的大小，生物膜形成表面的材料性质等等。以上方法的应用在细菌生物膜的研究过程中提供了大量有用的资料，相信将来还会有更多、更巧妙的方法将生物膜的研究步步向前推进。
7
7
生物膜检测技术
菌体计数
即通过计算生物膜中菌体对生物膜进行量化。为了将
生物膜与其黏附的固体表面分离，通常使用一些机械方法，比如超声或涡旋，得到的菌液常用平板菌落法，通过计算菌落形成单位（!;=;&?
数。另外，生物膜中包括死菌的总菌体数也可以通过显微镜
［4F］直接计数。0
型更加贴近水管或医用导管相关生物膜的形成。0
［(3］异。!
流室法（%&’()*&&）
流室法与管路法原理基本一样，唯一的不同在于：细菌
评估GH@I对生物膜的清除及杀灭作用。7
染色法
利用生物膜内物质对某些染料的结合，可以通过染色的
［/］
办法对生物膜进行定量。最常用的就是结晶紫，先将(J
生物膜附着的表面变成管路中嵌入的玻璃片，通过该玻片，研究者可以实时观测生物膜的生长状况，且不用损伤生物膜，这就是所谓的“在线观察”，如图(。起初的流室由不锈钢等材料制成，有一定规格凹槽，上面覆盖玻璃片，两端连接管
［45］
路；为了使形制保持一致而增加实验的稳定性，6+
的结晶紫溶液浸润生物膜生成的表面，静置C5$9&后用水洗去未结合的染料，将剩余的水除去后，用乙醇或乙酸溶液溶解附着于生物膜上的染料，所得有色溶液用分光光度计或酶标仪测定K35纳米处吸光值。该方法简便快捷，适用于试管及3)孔板法造膜。L
［4K］
上的生物膜进行定量。
商品化，有数家公司生产，虽然外观结构略有不同，但其原理用途完全一致。由于在细菌生物膜结构观察方面的独到之处，流室法几乎成为目前在生物膜研究领域应用最广泛的生
物膜发生装置。
7
荧光染料的应用使生物膜的观察有了选择性。用6?+;3及碘化丙锭（M#;79N9D$9;N9N%，显示不同颜色的荧光可以区MO）分生物膜中的死活菌，这对于生物膜的清除研究意义重
［4)］大。另外用荧光标记的抗体或凝集素，更可以特异性地识［4.］别生物膜中的某些成分而显色，进一步而言，荧光原位杂
交（8=D;#%:,%&+9&:9+D-?N#9N9A
［4/］
膜内的物质分布有所了解。除了外加荧光染料外，绿色或红色荧光蛋白，不论是质粒介导的还是重组入基因组的，都
［43］已成为生物膜检测领域中广泛运用的分子生物学工具。
（:’0;’).&&.3*53).00/01
普通荧光显微镜下，许多来自焦平面以外的光使观察到
图!
891’(:?:+%$’
构成流室模型的主要部件
6,-%$
的反差和分辨力降低。而激光共聚焦显微镜则通过检测器前的小孔保证只有来自焦平面的光成像，其他散射光被挡住，从而使显微镜的分辨力得以提高。这里之所以将其与一般的荧光显微镜分开来讲，更主要是由于激光共聚焦显微镜可对较厚的样品进行无损伤“光学切片”，再通过三维重构得到样品的立体结构，如图4为表达绿色荧光蛋白的铜绿假单胞菌在流室中所形成生物膜的三维立体图像。除了通过图
［C5］
象软件我们可以得到各个角度的生物膜三维视图外，更有
!
旋碟法（,’-.-/012/345*.)-’5，,6,）
旋碟法不同于以上两种方法，它是利用搅拌子搅动培养
基，使其处于涡旋状态而提供剪切力。生物膜的载体是多个圆形的小碟，由不同材料构成。它们镶嵌于该容器的底部或者侧壁上，生物膜形成后可以取下观察，处理。@%9+A%=等曾用其考察重金属离子对生物膜细菌及其游离菌体的作用差
［44］
别；B
一些计算软件可以将三维图象数据化，从而使生物膜的特征
［C(］
量化。其中以丹麦的*%?N;#&撰写的!PB6@I@最为常用，
人工生物膜发生装置是生物膜研究的首要工具，根据研
它运行于B
［C4］
量，厚度，均一性，比表面积等十几个参数进行测定。
MPG（%GGQ）（J）KQ;WR
被发现，但是长期以来，科学家仅对浮游细菌（或游离细菌）进行了深入研究，却忽视了作为细胞群体存在的细菌生物膜研究。近年来随着细菌生物膜研究的兴起，人们逐渐认识到
与浮游的细菌相比，生物膜细菌有着更加复杂的结构、广泛的信息沟通、精密的调控机制和强化的社会效应，并且更多地影响着人类的生活。显然，数百年来建立的以浮游细菌为对象的经典微生物研究方法已经不能满足细菌生物膜研究的需要，因此生物膜研究方法的建立就显得尤为重要。随着相关技术的不断更新和发展，人们对细菌生物膜的认识和理
图!
!
由激光共聚焦显微镜得到的铜绿假单胞菌
&’())*+
解将越发深入和透彻，也就可以更好地控制甚至开发生物膜，造福社会。
参
考
文
献
物膜立体图像
:;(0
!&’电子显微镜
电子显微镜是用电子束和电子透镜代替光束和光学透
镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器，其分辨力可达纳米级甚至更小。按照工作方式的不同分为透射电子显微镜（&(0-.,
电子显微镜（
［JJ］
的内部放散特征。扫描式电子显微镜的电子束不穿过样品，仅在样品表面扫描激发出次级电子而成像，图像有很强的立体感，在生物膜研究初期提供了直接形象的外观资
［JK］料。
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［P］［Q］［O］
由于电子显微镜需在真空条件下工作，所以很难观察活的生物，而且电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。电子束在有结合水存在的真空条件下无法工作，但生物膜中所以脱水的过程对样品的影响很大。另LMN的成分都是水，
外昂贵的设备，相对繁琐的样品制备工作也使电子显微镜在生物膜研究领域的应用受到限制。!&(
原子力显微镜（)*+,-./+0.1,-.0+2.+34，)
［JM］
年，近年来应用范围不断扩展，目前在生物膜研究领域也
［JP］
利用原子力显微镜对临界维度纳有所建树。)
［L］
［7G］
［77］
［7%］
米级测量发现铜绿假单胞菌在低营养条件下，为适应饥饿状
［JQ］
态而菌体长度增加。;0-+(9等的研究表明，粘液素
（=DC
细菌生物膜是地球生命系统的重要组成部分，它影响着人类健康、工业效率乃至环境稳定。虽然生物膜与细菌同时
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李京宝等：细菌生物膜研究技术1b微生物学报（KLL
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范文五：细菌生物膜造模步骤
Polymicrobial infections in mice. Bacterial cultures were grown overnight and then subcultured the following day into fresh media appropriate for each
bacterium.Three milliliters of each culture was pelleted and washed three times with phosphate-buffered saline (PBS) to remove residual medium and toxins.
Bacterial suspensions were diluted in PBS to give a final concentration of 2×106 to 3×107 CFU/ml (as determined by serial dilutions and plating of the PBS
suspensions of bacteria). The polymicrobial infections for the young and aged diabetic mice were separated into eight experimental groups, as shown in Table2. One hundred-microliter samples of each bacterial suspension (2×105 to 3×106 CFU), singly or in combination, were injected subcutaneously into the inner thighs of the mice, as previously described (7). Each experimental group (Table2) was comprised of 24 mice. At 1, 8, and 22 days postinjection, eight mice from each experimental group were euthanized by cervical dislocation following the induction of deep anesthesia with 100% CO2 gas. Six mice were used for the determination of the number of CFU in the injection area; the remaining two mice were used to assess the pathology of the injection site. Blood from all mice was removed from the caudal vena cava and/or directly from the heart and placed in blood vials containing EDTA. These samples were sent to a reference labo-ratory (Ani Lytics, Inc., Gaithersburg, MD) for determining complete blood cell counts. From six of the mice, the tissue surrounding the area at the site of injection was excised and the spleens were removed. Each sample was homogenized using a tissue homogenizer and resuspended in a final volume of 1 ml of PBS.
Appropriate dilutions were plated on a selective medium specific for growth of each of the three organisms used. E. coli-containing samples were plated on eosinmethylene blue agar (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) and incubated aerobically at 37°C overnight. B. fragilis-containing samples were plated on
Bacteroides bile esculin agar (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) and incubated anaerobically at 37°C for approximately 2 days. C. perfringens-containing samples were plated on either tryptose-sulfate cycloserine agar base (EM Science, Gibbstown, NJ) or Shahidi Ferguson Perfringens agar base (Becton Dickinson, Sparks,MD) and incubated anaerobically at 44°C for 8 to 12 h.
The remaining two mice were necropsied, and the area of injection and spleens were examined for pathological changes in the infection. Five-micron-thick sections of the abscess area were stained with hematoxylin and eosin and mounted on microscope slides.
Experim ental protocols involving mice were examined and approved by the Virginia Tech Institutional Animal Care and Use Committee.
