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范文一：培养基的制备与空气细菌
培养基的制备与空气中微生物的检测
一、 实验原理
在我们周围的环境中，包括空气中都存在着种类繁多、数量庞大的微生物。因为气流、灰尘和水沫的流动，人和动物的活动等原因，即使空气不是微生物栖息的良好环境，但仍有相当数量的微生物存在。将固体培养基暴露在空气中一段时间，空气中的微生物会随机落到在适合于微生物生长繁殖的培养基表面，在培养箱适温下培养一段时间后，每一个分散的菌体或孢子就会形成一个个肉眼可见的细胞群体即菌落。通过观察菌落大小、形态和数量，就可大致鉴别空气个存在的微生物的种类和数量。
二、 实验器材
1. 实验药剂：
牛肉膏蛋白胨培养基本配方：牛肉膏1g, 蛋白胨2g ，NaCl 1g, 琼脂4g, 水1000ml
2. 仪器：
高压灭菌锅，锥形瓶，电子称，培养皿，培养箱，超净工作台
三、 实验步骤
1. 配制培养基：
称量4g 琼脂到锥形瓶，然后再称1g 牛肉膏、2g 蛋白胨、1g 氯化钠和200mL 水到烧杯中搅拌溶解，再倒进锥形瓶。将锥形瓶和培养皿放进高压灭菌锅内灭菌25min 。
2. 倒平板与取样：
待营养冷却到50℃左右时，在超净操作台内，迅速将锥形瓶内还未凝固的培养基倒到培养皿内。在倒培养基之前，要用酒精消毒双手，待酒精挥发完后再点燃酒精灯，整个倒液过程都要在酒精灯火焰旁完成。在三楼将两个培养皿盖打开，在空气中暴露5min ，时间一到，立即合上皿盖。
3. 培养观察：
放进培养箱培养24h 后，观察菌落形态与数量，然后计算空气中的细菌数 X =N ?100?100
πr 2
X ：每m 3空气中的细菌数
N ：平板暴露5分钟，置37℃培养24小时后生长的菌落数
r ：平皿底半径（㎝）
四、 实验结果
观察到三楼两个培养皿的菌落数都是两个，但是一个培养皿的菌落很大，另一个就很小，而且两个培养皿相邻很近的，而一楼的是一个是两个，另一个是三个；五楼是两个也是三个；
3七楼的是五和三班。由些可以算出每m 空气中的细菌数为一楼：451， 三楼：361， 五楼：
541， 七楼：721。估计是当天晚上是冷空气南下第一天，再加上下雨，部分细菌凝聚成团状，所以才一个培养皿里的细菌菌落是大，另一个是小的。
五、 思考题
为什么每个楼层的空气中细菌数有如此差异？
空气中的细菌数是受到气流、灰尘和水沫的流动，人和动物的活动等原因影响的，在高楼层，离地面远，气流大，人流少，细菌数自然相应地没那么多，低楼层的近地面，人流大，地表的细菌很容易被带到空气中，让空气中的细菌数大大地增加。但是做实验的当天晚上，刚好遇上下雨，低楼层的悬浮物沉降得很快，空气中的附着在悬浮物上的细菌和漂浮的细菌都相应地减少了很多。相反高楼层当天所扬起的悬浮物和细菌受到的影响较小，在空气中飘浮数量变化不大，所以显得高楼层的细菌比低楼层的要多，所以当天晚上的细菌数是高楼层的比低楼层的要多。
范文二：4培养基灭菌与空气净化
第三章 培养基灭菌与空气净化
第一节培养基灭菌
一、灭菌的原理和方法
消毒(disinfection )与灭菌(sterilization )的区别?
消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只 能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢或非病源微生物。 例如, 巴氏消毒法, 是将 物料加热至 60℃维持 30min ,以杀死不耐高温的微生物营养细胞。
灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物,包括营养细胞、细菌 芽孢和孢子。包括全部病源和非病源微生物。
消毒不一定能达到灭菌要求,而灭菌则可达到消毒的目的。
抑菌(bacteriostasis ):抑制体内或体外细菌的生长繁殖。
无菌:不存在活的细菌。
为防止杂菌的污染,哪些需要灭菌? 培养基,发酵设备,空气,菌种制作 关于灭菌和消毒的不正确的理解是()
A.灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子
B.消毒和灭菌实质上是相同的
C.接种环用灼烧法灭菌
D.常用灭菌的方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法
防腐(antisepsis )
防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖, 从而达到防止食 品等发生霉腐的措施。
(1)低温 (4)高渗
(2)缺氧 (5)高酸度
(3)干燥 (6)防腐剂
除菌的方法
-培养基的加热灭菌
-空气的过滤除菌
-紫外线或电离辐射
-化学药物灭菌
1. 化学试剂灭菌法
方式:浸泡,添加,擦拭,喷洒,气态熏蒸
甲醛、乙醇、过氧乙酸、酚类(苯酚)或新洁尔灭、高锰酸钾等
①高锰酸钾:氧化 0.1%-0.25%
②漂白粉:氧化, 对细菌和 phage 均有效, 是发酵工业中最常用的化学杀菌剂。 ③75%酒精:杀菌作用在于使细胞脱水,引起蛋白质凝固变性。
适用范围:环境、皮肤及器械的表面消毒
2. 电磁波、射线灭菌法
电磁波、紫外线或放射性物质。以紫外线最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都 能起作用, 但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。 紫外线的穿透力低, 仅 适用于表面灭菌和无菌室, 培养间等空间的灭菌。 波长在 260nm 左右灭菌效率最 高。
适用范围:无菌室、接种箱
3. 干热灭菌法
细胞的氧化作用是导致死亡的主要依据。由于微生物对干热的耐受力比对湿热 强的多,故干热所需温度高,时间长,一般 160-170℃, 1-1.5h.(对要求保持干 燥的物品可用 )
常用烘箱,灭菌条件:160℃下保温 1h
适用范围:金属或玻璃器皿
4. 湿热灭菌法
利用饱和蒸汽灭菌,条件:121℃, 30min
热能使蛋白质变性。由于蒸汽有很强的穿透能力,来源方便,灭菌可靠,是常 用的方法。
适用范围:生产设备及培养基灭菌
5. 过滤除菌法
利用过滤方法阻留微生物 。适用于澄清液体和气体的除菌。
适用范围:制备无菌空气
6. 火焰灭菌法
方法简单,灭菌彻底,但适用范围有限。
适用范围:接种针、玻璃棒、三角瓶口
谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌方法是()
A .高压蒸汽灭菌
B .高温灭菌
C .加入抗生素灭菌
D .酒精灭菌
二、培养基的湿热灭菌
湿热灭菌原理
蒸汽具有很强的穿透能力, 而且在冷凝时会放出大量的冷凝热, 很容易使蛋白 质凝固而杀死各种微生物。
灭菌条件:121℃, 30min 。
灭菌不利方面:同时会破坏培养基中的营养成分, 甚至产生不利于菌体生长的物 质。
(一)间歇灭菌 (常用)
又称分批灭菌, 是将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中, 通入蒸汽 将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程,也称实罐灭菌或实消。
过程包括:升温、保温和冷却三阶段。
各阶段对灭菌的贡献:20%、 75%、 5%。
培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况:图
(二)连续灭菌(又称连消)
将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温和冷却而进行灭菌。 连续灭菌的基本设备有哪些 ?
配料罐→泵→加热塔→维持罐→冷却管→发酵罐
连续灭菌的流程与设备
(1)配料预热罐,将配制好的料液预热到 60-70 °C ,以免连续灭菌时由于料液与 蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声;
(2)连消塔,用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度(126-132°C );
(3)维持罐,使料液在灭菌温度下保持 5-7min 。因为:连消塔加热的时间很短,光 靠这段时间的灭菌是不够的;
(4)冷却管,使料液冷却到 40-50°C后(冷水喷淋) ,输送到预先灭菌过的 罐内。
连续灭菌过程中温度的变化 (虚线 ) :由图可看出连续灭菌可在短时间内加热到 保温温度,由于灭菌温度很高(比间歇灭菌高),保温时间可相应缩短,有利于 减少培养基中营养损失。
(三)间歇灭菌与连续灭菌的比较
罐头食品在很长时间内不会腐败变质 , 是因为 ( )。
A.罐头密封很严,细菌无法侵入
B.罐头密封很严,细菌无法呼吸
C.罐头在封罐前经过高温高压灭菌,封罐后罐内没有细菌
D.罐头在封罐前经过高温高压灭菌,封罐后罐内细菌无法生存
第二节空气净化(除菌)
发酵对空气无菌程度的要求:
一般要求 1000次使用周期中只允许有一个菌通过,即经过滤后空气的无菌 程度为 N=10-3。
-空气中微生物 (包括细菌、酵母、霉菌和病毒 ) 含量一般为 103~ 104个/米 3。 一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上。
-灰尘粒子的平均大小约 0.6μm 左右,空气除菌主要去除空气中的微粒
(0.6~1μm )。
一、空气除菌的方法
(一) 辐射杀菌:紫外线, γ、 β射线,使 DNA 分子产生胸腺嘧啶二聚体,导致细胞 死亡,一般可用于无菌室,手术室杀菌。
(二) 热杀菌 :将空气加热到一定温度后保温一定时间,使微生物蛋白质(酶)氧化 而致死。 (培养基灭菌利用的是蛋白质的凝固)。热杀菌是有效的,可靠的杀菌 方法, 但是如果采用蒸汽或电热来加热大量的空气, 以达到杀菌目的是十分不经 济的。工业上是利用空气压缩时放出的热量进行杀菌。
(三) 静电除菌:利用静电引力来吸附带点粒子而达到除菌除尘的目的。 悬浮于空气中 的微生物, 微生物孢子大多带有不同的电荷, 没有带电荷的微粒在进入高压静电 场时都会被电离成带电微粒。 对于一些直径很小的微粒, 所带电荷很小, 所以静 电除菌对很小的微粒效率很低,迄今为止这种方法在无菌空气制备中并不多见。 (四) 过滤除菌 :是目前工业上最常用的获得大量无菌空气的方法。
二、空气过滤除菌的原理与介质:
原理:使空气通过高温灭菌的介质过滤层, 将空气中的微生物等颗粒拦截在介质 层中达到除菌的目的。
1.过滤除菌的种类
绝对过滤:过滤介质的滤孔小于细胞和孢子。 孔径<0.3 μm="" ,菌体大小一般为="" 0.5="" -5μm="" 。如聚乙烯醇缩甲醛树脂(pvf="" )制成的="" 0.3="" m="" 的微孔滤膜。纤维素,="" 聚四氟乙烯,="" 聚乙烯醇缩甲醛树脂经热处理后均可作为过滤介质。="" 一般用于医疗="">
深层介质过滤:介质的孔隙一般大于微生物细胞。
如用棉花、玻璃纤维和颗粒活性炭填充的过滤器。
2. 深层介质过滤的原理
微粒随气流通过滤层时, 由于滤层纤维的层层阻碍, 使气流出现无数次改变 运动速度和方向的绕流运动, 引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、 拦截、 布朗 扩散、重力沉降、静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上,实现过滤的目的。 目前工厂和实验室大多采用该方法。
3. 空气过滤除菌介质
(1)纤维状或颗粒状过滤介质
-棉花:常用(脱脂棉),有弹性,纤维长度适中,填充密度 130-150kg/cm3。 -玻璃纤维:直径小,不易折断,过滤效果好 , 填充密度 130-280kg/cm3。 -活性炭:要求质地坚硬,颗粒均匀。常用小圆柱体的颗粒活性碳。对 0.3 μm 以下颗粒的过滤效率仅为 99% ,需多次过滤。
缺点:体积大,装填费时费力,松紧度不易掌握,空气压降大。介质灭菌和 吹干耗用大量蒸汽和空气。
(2)纸类过滤介质——玻璃纤维纸属于深层过滤技术。
纤维间空隙约为 1-1.5μm ,将 3-6张叠在一起使用,过滤效率高,压降小。对 0.3 μm 以上颗粒的过滤效率为 99.99% ,而且阻力小,压力降较小。
缺点:强度不大(特别是受潮后)。可在纸浆中加 7-50%的木浆或其他化学处 理。
(3)微孔滤膜类过滤介质
空隙<>
发酵生产中制备无菌空气的大致过程 :
空气→ 空压机→ 贮气罐→ 冷却→ 除油水→ 加热→ 总过滤器→ 分过滤器→ 无菌空气
空气预处理 空气过滤 除菌流程分析:
要有一系列冷却,分离和加热设备保证空气的相对湿度在 50%-60%的条件下过 滤。
三、空气的预处理
目的:
-提高压缩前空气的洁净度
-去除压缩后空气中的油和水
1. 提高压缩前空气的洁净度
措施:
(1) 提高空气吸气口的位置 (高度每上升 10m, 空气中微生物量下降一个数量级)
(2) 在空气入口处设置粗过滤器 (或前置高效过滤器) ——捕集较大的灰尘颗粒, 并保护空压机。
高空取气管
-为远离地面几十米的管子。
-每升高 10米, 空气中杂菌降低一个数量级。 因此从高空取气要比从低空取气有 利得多。
高效前置过滤除菌流程
1——高效前置过滤器 2——压缩机 3——贮罐 4——冷却器 5—— 丝网分离器 6——加热器7——过滤器
2. 空气压缩和压缩空气的冷却
(1)空气压缩:克服输送过程中过滤介质的阻力并维持一定的气流速度。用空 压机:涡轮式,往复式。
(2)压缩后空气温度显著上升,需冷却。
因为若直接通入过滤器会:
-压缩后的高温空气能引起过滤介质的炭化或燃烧
-增大发酵罐的降温负荷
-增加培养液水分的蒸发
一般用列管式冷却器进行冷却。还有翅板式换热器。
空气贮罐 (结构图)
-消除压缩机排出空气量的脉冲,维持稳定的空气压力。
-利用重力沉降作用除去部分油雾。
-紧接空压机安装。
-有些装有冷却管。
3. 压缩空气的除油除水
冷却降温后的空气湿度增大,会使过滤介质受潮失效。
两类设备:
m 以上的微粒分离效率较高。 μ旋风分离器——利用离心力进行沉降,对于 10
m 的细小颗粒。 P251μ丝网分离器——利用惯性进行拦截, 分离效率较高, 能 除去 2~5
采用惯性拦截等机理,有效去除空气中的水、油雾、尘埃,不锈钢丝网可清 洗,使用寿命长。
4. 空气的加热
压缩空气冷却除去油和水后,空气的相对湿度仍为 100%。若不加热,只要温 度稍有降低,可再度析出水分,使过滤介质受潮。所以将除油水的空气加热(温 差在 10~15°C 左右),降低相对湿度(达 50%~60%)后,输入过滤器。 用列管换热器。
空气过滤除菌设备流程
粗过滤 空压机 储罐 二级冷却 加热器 空气 过滤
四、空气过滤器
过滤除菌的关键设备 (结构图:介质层过滤器和超细玻璃纤维纸过滤器) 180M 3发酵罐车间
大型空气压缩机
发酵车间的空气过滤器
空气净化的流程
-吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤
-进入空气压缩机(120-150°C)
-冷却(20-25°C),除去油、水,再加热至 30 -35°C。
-最后通过总过滤器和分过滤器,获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的 无菌空气。
范文三：第五章 培养基灭菌及空气除菌
第 5章 培养基灭菌和空气除菌
教研室:生物工程 教师姓名:余有贵
教学过程
一、灭菌的意义和方法
1、灭菌的意义
采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施, 称为灭菌,例如各种高温灭菌措施等。
保证纯种发酵,防止杂菌和噬菌体污染。
消毒是一种采用较温和的理化因素,仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原 菌,而对被消毒的物体基本无害的措施。
2、灭菌的方法
(1) 火焰灭菌:接种时使用 , 灼烧是一种最彻底的干热灭菌方法, 但它只能用于接种环、 接种针等少数对象的灭菌
(2)干热灭菌法:适于灭菌后要求保持干燥状态的物料,将金属制品或清洁玻璃器皿 放入电热烘箱内,在 150~170℃下维持 1~2小时后,即可达到彻底灭菌的目的。在这种条 件下,可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥,以及各种细胞成分发生氧化。
(3)湿热灭菌法:多数细菌和真菌的营养细胞在 60℃左右处理 5~10min 后即可杀死; 酵母菌和真菌的孢子稍耐热些,要用 80℃以上的温度处理才能杀死;而细菌的芽孢最耐热, 一般要在 120℃下处理 15min 才能杀死。
工业生产上广泛使用,常用 120℃, 20-30min 。
(4)射线灭菌法:适于表面灭菌,紫外线波长在 2600埃左右灭菌效力最强,一般用 30瓦紫外灯照射 20-30min
(5)化学药剂灭菌:
1) 0.1%-0.25%的高锰酸钾溶液 :皮肤消毒
2) 2%-5%漂白粉 :用具和车间环境的灭菌
3) 70%-75%酒精溶液 :皮肤和玻璃器皿表面灭菌
4) 0.25%新洁尔灭 : 皮肤、小器皿表面和车间的灭菌
5) 0.5%甲醛 :用于无菌室、空罐和车间空间的灭菌, 10ml/m3,6-12h
(6)高压静电灭菌:应用于空气的灭菌
(7)介质过滤除菌:滤除血清和抗生素溶液内的微生物和空气过滤除菌。
二、培养基和设备的湿热灭菌
1、湿热灭菌的原理
1.1概念
致死温度:杀死微生物的极限温度。
致死时间:在致死温度下,杀死全部微生物所需要的时间。
热阻:微生物在某一特定的条件下的致死时间性,表示微生物对热的抵抗力。
1.2原理
湿热灭菌的基本原理:湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌。 蒸汽冷凝时释放大量潜热, 并具有 强有强大的穿透力, 在高温和水存在时, 微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变 性,致使微生物在短时间内死亡。
用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求是:既要达到一定的灭菌程度, 又要尽量减少营 养成分的破坏。
1.3微生物的热死规律 ----对数残留定律
对数残留定律:微生物的死亡速率 d N /dθ与任何一瞬间残存的活菌数成正比 , 即
d N /dτ=KN
式中:N----活菌数 (个/ml )
τ----受热时间(S )
k----比死亡速率(S -1),与微生物种类和加热时间有关
在恒温下,当 τ=0,N=N0时,可得:
理论灭菌时间
τ =(2.303/k)log(No/Ns)
τ-- -灭菌时间(秒)
k---比死亡速率,与菌的种类和加热温度有关(s -1)
No---灭菌开始时,污染的培养基中杂菌个数(个/ml )
Ns---经过灭菌时间 τ后,残存活菌个数(个/ml )
1)杂菌虽然是一个复杂的高分子体系,但其受热被杀死,主要原因是高温能使蛋白质 变性,这种反应属与单分子反应,因此杂菌在一定温度下受热死亡也遵循单分子反应方程。 2) 从上式可知:要做到绝对无菌, 即 N=0, 则时间 τ将无限大。 故在实际计算中取 N=10-3, 即每处理 1000批中只残留一个活菌数,该值在工程上已足够了。
1.4 灭菌温度与菌死亡反应速度常数的关系
k=Ae-⊿ E/RT
式中:K ——菌死亡的速度常数(s -1),当反应物的浓度为单位浓度时,则反应速度常数在数值上 等于反应速度
△ E —活化能, J/mol
A ——阿累尼乌斯常数(s -1)
R ——气体常数(8.314J /mol.K )
T ——绝对温度(K )
1.5培养基成分受热破坏规律(看作一级反应)
-d c /dt =kd c
式中:C 为对热敏性物质的浓度; k d 为分解速率常数(s -1),
1.6高温快速灭菌法优于低温长时间灭菌法:当灭菌温度升高时,菌的比死亡速率增加较培 养基成分分解速率常数快,因而在较高的温度下可以缩短灭菌时间而保留较多的营养物质。 2、影响培养基灭菌的因素
(1) 培养基中的颗粒与物理状态 培养基中的颗粒物质大, 灭菌困难, 反之, 灭菌容易。 一般说来, 含有颗粒对培养基灭菌影响不大, 但在培养基混有较大颗粒, 特别是存在凝结成 团的胶体时,会影响灭菌效果,必须过滤除去。
培养基的物理状态对灭菌具有极大的影响, 固体培养基的灭落时间要比液体培养基的灭 菌时间长, 假如 lOO ℃时液体培养基的灭菌时间为 1h , 而固体培养基则需要 2~3h 才能达到 同样的灭菌效果。其原因在于液体培养基灭菌时,热的传递除了传导作用外还有对流作用, 而固体培养基则只有传导作用而没有对流作用, 另外液体培养基牛水的传热系数要比有机固 体物质大得多。
(2)培养基中的微生物数量 不同成分的培养基其含菌量是不同的。培养基中微生物 数量越多, 达到无菌要求所需的灭菌时间也越长。 天然基质培养基, 特别是营养丰富或变质 的原料中含菌量远比化工原料的含菌量多, 因此, 灭菌时间要适当延长。 含芽孢杆菌多的培 养基,要适当提高灭菌温度并延长灭菌时间。
(3) 培养基成分 油脂、 糖类、 蛋白质都是传热的不良介质, 会增加微生物的耐热性, 使灭菌困难。高浓度的盐类,色素则削弱其耐热性,故较易灭菌。 浓度较高的培养基相对需
要较高温度和较长时间灭菌。如大肠杆菌在水中加热至 60~65℃便死亡,在 10 %的糖液中, 需 70℃处理 4~6 min , 而在 30%的糖液中则需 70℃处理 30min. 低浓度 (1%~2%) 的 NaCI 溶液对微生物有保护作用,但随着浓度的增加,保护作用减弱,浓度达 8%~10%以上,则 减弱微生物的耐热性。
(4)培养基 pH pH 值对微生物的耐热性影响很大, pH 为 6.0 ~ 8.0时微生物最不易 死亡, pH <6.0时 ,="" 氢离子易渗入微生物的细胞内="" ,="" 改变细胞的生理反应促使其死亡。所以="" 培养基="" ph="">
表 5-1 pH对灭菌时间的影响
(5)泡沫 泡沫中的空气形成隔热层,使传热困难,对灭菌极为不利。因此对易产生 泡沫的培养基进行灭菌时,可加入少量消泡剂。
3、消除高温有害影响的措施
(1)采用特殊加热灭菌法
(2)对易破坏的含糖培养基进行灭菌时,应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并;
(3) 对含 Ca 2+或 Fe 3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌, 然后再混合, 就不易形成磷酸盐 沉淀;
(4)对含有在高温下易破坏成分的培养基(如含糖组合培养基)可进行低压灭菌(在 112℃即 0.57kg /cm2或 8磅/英寸 2下灭菌 15分钟)或间歇灭菌;
(5)在大规模发酵工业中,可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌
4、培养基灭菌方式
4.1分批灭菌
1)概念:将配制好的培养基置于发酵罐中,通入蒸汽将培养基和所用设备一起加热灭 菌的操作过程,叫做实罐灭菌,又称分批灭菌。包括:加热、维持和冷却三个阶段。
2) 操作要点
三路进汽:直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热,直到所规定的温度,并 维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。
开始灭菌时,应排放夹套或蛇管中的冷水,开启排气管阀,夹套内通入蒸汽。当发酵 罐的温度升至 70℃时,开始由空气过滤器、取样管和放料管通人蒸汽,当发酵罐内温度达
到 120℃,压力达到 l ×105Pa(表压 ) 时,灭菌进入保温阶段。在保温阶段,凡液面以下各管 道都应通蒸汽, 液面以上其余各管道则应排蒸汽, 不留死角, 维持压力、温度恒定直到保温 结束。 再依次关闭各排气、进气阀门,并通过空气过滤器迅速向罐内通入无菌空气,维持发 酵罐降温过程中的正压,且在夹套或蛇管中通入冷却水,使培养基的温度降到所需温度。 4.2 连续灭菌
(1)空罐灭菌
空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是尿素(或液氨)罐、消泡罐,当培养 基(或物料)尚未进罐前对罐进行预先灭菌,为空罐灭菌。
为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢, 空罐灭菌要求温度较高, 灭菌时间较长, 只 有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。
(2)培养基连续灭菌
1) 概念:将配制好的培养基在通入发酵罐之前,进行加热、保温和降温的灭菌过程, 叫做连消。
2)优点:连续灭菌可采用高温短时灭菌,营养成分破坏少,有利于提高发酵产率;发 酵罐利用率高;蒸汽负荷均衡;采用板式换热器时,可节约大量能量;适宜采用自动控制, 劳动强度小。 组成培养基的耐热性物料和不耐热性物料可在不同温度下分开灭菌, 以减少物 料至受热破坏的程度, 也可将糖和氮源分开灭菌, 以免醛基与氨基受热发生反应生成有害物 质。
3)流程
A 、喷淋冷却连续灭菌流程
喷淋冷却连续灭菌流程是常用的连续灭菌流程 (见图 5— 1) 。培养基由配料罐放出,通 过蒸汽预加热后,用连消泵送入气液混合器或连消塔底端,料液被加热到灭菌温度 (130℃ ) 后,由顶部流出,进入维持罐,维持 8~25min ,再由维持罐上部侧面管道流出,维持罐内 最后的培养液由底部排尽,经喷淋冷却器冷却到发酵温度,送入发酵罐。
图 5-1 喷淋冷却连续灭菌流程
B、 喷射加热连续灭菌流程
图 5-2 喷射加热连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程也是常用的连续灭菌流程 (见图 5— 2) 。蒸汽直接喷人培养基, 因此培养基急速升温到预定的灭菌温度,在此温度下的保温时问由维持段管子的长度来保 证,灭菌后培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器, 急速冷却。 该流程由于受热时间短, 故温 度可升到 140℃而不会引起培养基的严重破坏。该流程能保证培养基先进先出,避免过热或 灭菌不彻底的现象。
C 、 薄板式换热器连续灭菌流程
图 5-3 薄板式换热器连续灭菌流程
薄板式换热器连续灭菌流程是较为节能的流程 (图 5— 3) 。该流程采用了薄板换热器作 为培养基的加热器和冷却器, 蒸汽在薄板换热器的加热段使培养基的温度升高, 经维持段保 温一段时间, 然后在薄板换热器的冷却段进行冷却, 从而使培养基的预热、 灭菌及冷却过程 可在同一设备内完成。 虽然加热和冷却培养基所需时间比使用喷射式连续灭菌稍长, 但灭菌 周期则比间歇灭菌小得多。 由于生培养基的预热过程就是灭菌培养基的冷却过程, 所以节约
了蒸汽及冷却水的用量,故该流程的能量利用比较合理。
4.3发酵培养基及设备管道灭菌技术
①种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌 从有关管道通入蒸汽, 使罐内蒸汽压力达 O.147MPa ,维持 45min , 灭菌过程中,从所有液位以上的阀门、边阀排出 空气, 并使蒸汽通过这些阀门以防止出现死角。 灭菌完毕后关闭蒸汽, 待罐内压力低于空气 过滤器压力时,通入无菌空气保压 O.098MPa 。
②空气总过滤器和分过滤器灭菌 排出过滤器中的空气, 从过滤器上部通人蒸汽, 并从 上、下排气口排蒸汽,维持压力 O.147MPa 灭菌 2h 。灭菌完毕,通入压缩空气吹干。
③种子培养基实罐灭菌 从夹层通入蒸汽间接加热至 80℃,再从取样管、进风管、接 种管等液面以下的阀门通人蒸汽,进行直接加热。同时关闭夹层蒸汽进口阀门、升温至 121℃,维持 30min 。期间,所有液面以上的阀门保持一定时间的排蒸汽状态。
④发酵培养基实罐灭菌 从夹层或盘管式热交换器进入蒸汽,间接加热至 90℃,关闭 夹层及盘管蒸汽, 从取样管、 进风管、 放料管等液面以下的阀门通入蒸汽, 直接加热至 12l℃, 维持 30min 。在此期间,所有液面以上的阀门保持一定时间的排蒸汽状态。
⑤发酵培养基连续灭菌一般培养基的连续灭菌采用灭菌温度为 130℃,维持 5min 。 ⑥补料实罐灭菌 根据料液不同而异, 淀粉料液为 121℃, 维持 5~lOmin 。 尿素溶液灭 菌为 105℃,维持 5min 。
⑦消泡剂灭菌 直接加热至 121℃,维持 30min 。
⑧杀菌锅内灭菌 固体培养基灭菌蒸汽压力 0.098MPa , 维持 20~30min ; 液体培养基灭 菌蒸汽压力 0.098MPa ,维持 15~20min 。
三、空气的除菌
1、好气性发酵对无菌空气的要求
(1)连续提供一定流量的压缩空气。 VVM----单位时间 (min)单位体积 (m3) 培养基中通 入标准状况下空气的体积 (m3), 一般为 0.1— 2.0.
(2)空气的压强(表压)为 0.2— 0.4 MPa。
(3)进入过滤器之前,空气的相对湿度 Φ≤ 70%;
(4)进入发酵罐的空气温度可比培养温度高 10— 30 ℃;
(5)压缩空气的洁净度,在工程设计上,一般要求 1000次使用周期中,只允许有 1个菌通过,即经过滤后空气的无菌程度为 N=10-3
2、空气除菌的方法
(1) 辐射杀菌:最常用的是用紫外光线进行无菌室灭菌。2537?波长的紫外线具有极 强烈的杀菌效力, 它的主要作用是使微生物的 DNA 分子产生的胸腺嘧啶的二聚体, 导致细胞 死亡。
无菌室常用的紫外灯功率为 30W , 安装在操作台上方一米左右高处, 每次照射 15-30min 既可。
紫外线有很强的杀菌力, 但穿透力很弱, 一张薄纸即可完全挡住紫外线, 因此待灭菌物 品必须置于紫外光直接照射下,而且在一定范围内作用强度与距离平方成反比。
此外, 紫外线对人体组织有一定刺激作用,眼睛、 皮肤受照射后会产生某些症状, 所以 工作人员在无菌室操作时应关闭紫外灯
(2)热杀菌 基于加热后微生物体内的蛋白(酶)热变性而得以实现。
热空气进入培养系统之前,一般均需用压缩机压缩,提高压力。
空气压缩后温度能达到 200度以上,保持一定时间后,便可实行干热杀菌。
利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌的原理对制备大量无菌空气有特别意义。
实际应用中需考虑培养装置与空气压缩机的相对位置, 连接压缩机与培养装置的管道的 灭菌以及管道长度等。
(3) 静电除菌 静电除尘器可除去空气中的水雾、油雾、尘埃,同时也除去微生物。 原理:利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌目的。
对于一些直径小的微粒,所带电荷小,不能被吸附而沉降。
(4) 过滤除菌 介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层,将空气中的微 生物等颗粒阻截在介质层中,而达到除菌的目的。
从可靠性,经济适用与便于控制等方面考虑,目前仍以介质过滤法较好,也是大多数 发酵厂广泛采用的方法。
3、介质过滤除菌机制
介质过滤除菌的机制主要有以下几种,至于哪种作用机制为主,随条件而变化。 (1)惯性碰撞滞留作用:空气气流流速大时,气流中的微粒具有较大的惯性力。当微 粒随气流以一定速度向纤维垂直运动因受纤维阻挡而急剧改变运动方向时, 由于微粒具有的 惯性作用使它们仍然沿原来方向前进碰撞到纤维表面, 产生摩擦粘附而使微粒被截留在纤维 表面,这种作用称惯性碰撞截留。
截留区域的大小决定于微粒运动的惯性力,所以, 气流速度愈大, 惯性力大,截留效果
也愈好。此外,惯性碰撞截面作用也与纤维直径有关,纤维愈细,捕集效果愈好。惯性碰撞 截面在介质除尘中起主要作用。
(2) 阻拦滞留作用:微粒随空气气流向前运动,当气流为层流时, 随气流运动的粒子在 接近纤维表面的部分由于与过滤介质接触而被纤维吸附捕集,这种作用称之为阻拦截留。 空气流速愈小, 纤维直径愈细, 阻拦截留作用愈大。但是在介质过滤的除尘除菌中,阻 拦截留并不起主要作用。
(3)布朗扩散作用:直径小于 1μ的微粒在运动中往往产生—种不规则的布朗运动, 使微粒间相互凝集成较大的粒子, 从而发生重力沉降或被介质敲留。 但是这种作用只有在气 流速度较低时才较显著。
(4)重力沉降作用:重力沉降是一个稳定的分离作用,当微粒所受的重力大于气流对 它的拖带力时,微粒就容易沉降。
就单一的重力沉降情况下, 大颗粒比小颗粒作用显著, 对于小颗粒只有在气流速度很慢 时才起作用。
一般它是与拦截作用相配合的,即在纤维的边界滞留区内,微粒的沉降作用提高了拦 截滞留的捕集效率。
(5) 静电吸附作用:干空气对非导体的物质相对运动磨擦时, 会产生诱导电荷,纤维和 树脂处理过的纤维,尤其是一些合成纤维更为显著。
悬浮在空气中的微生物微粒大多带有不同的电荷,如枯草杆菌孢子 20%带正电荷, 20%带负电荷, 15%中性, 这些带电的微粒会受带异性电荷的物体所吸引而沉降。
此外,表面吸附也归属于这个范畴,如活性炭的大部分过滤效能应是表面吸附的作用。
4、常用的滤菌介质
(1)棉花
(2)活性炭
(3)玻璃纤维
(4)超细玻璃纤维纸
(5)石棉滤板
(6)烧结材料过滤介质
(7)绝对过滤介质:微孔膜
5、空气净化流程
(1)一级冷却析水、加热的空气净化流程图
图 5— 4 一次冷却一次析水的空气预处理流程
l 一高空采风; 2一粗过滤器; 3一空压机; 4一冷却器; 5, 6一析水器;
7一贮气罐; 8一加热器; 9一总过滤器; 10一分过滤器
将压缩空气冷却至露点以下,析出部分水分,然后升温使相对湿度为 60%左右,进入 空气过滤器。根据气候情况有一次冷却一次析水流程 (见图 5— 4) 、二次冷却二次析水流程 (见图 5— 5) 。这两种流程适用于空气湿含量较大的地区。
(2)二级冷却析水、加热的空气净化流程图
图 5— 5 二次冷却析水、加热的空气预处理流程
1一高空采风; 2一粗过滤器; 3一空压机; 4, 6一冷却器; 5, 7一析水器;
8一贮气罐; 9一加热器; 10一空气总过滤器; 11一空气分过滤器
(2)高效前置过滤除菌流程
1、高效前置过滤器 2、压缩机 3、贮罐 4、冷却器 5、丝网分离器 6、加热器
7、过
滤器
(3)利用热空气加热冷空气的空气净化流程图
图 5— 7 利用热空气加热冷空气的流程
l 一高空采风; 2一粗过滤器; 3一空压机; 4一热交换器; 5一冷却器; 6, 7一析水器; 8一总过滤 器; 9一分过滤器
利用压缩后的热空气和冷却后的冷空气进行热交换, 使冷空气温度升高, 降低相对湿度, 如图 5— 7所示。此流程对热能利用较合理,热交换器还兼做贮气罐,但由于气一气换热的 传热系数很小,加热面积要足够大。
(4)冷热空气直接混合式空气净化流程图
图 5— 8 冷热空气直接混合的流程
1一高空采风; 2一粗过滤器; 3一空压机; 4一冷却器; 5, 6一析水器; 7一贮气罐; 8一总过滤器; 9一 分过滤器
将压缩后的空气一部分冷却析水, 另一部分热空气直接与冷却析水后的空气混合, 然后 进入空气过滤器,如图 5— 8所示。此流程适用于空气的湿含量中等的地区。其对热能利用 合理,但操作要求较高,要经常根据条件调节两部分空气的混合比。
(5)将空气冷却至露点以上的流程
图 5— 9 将空气冷却至露点以上的流程
1一高空采风; 2一粗过滤器; 3一空压机; 4一冷却器 5一贮气罐; 6一空气总过滤器; 7一空气分过滤器
将压缩空气冷却至露点以上,使进入过滤器的空气相对湿度为 60%~70%,如图 5— 9所示。这种流程适用于北方和内陆气候干燥地区。
6、提高过滤除菌效率的措施
(1)针对不同地区,设计合理的空气预处理设备,选择合适的空气净化流程,以达到除 油、水和杂质的目的。
(2)设计和安装合理的空气过滤器,选用除菌效率高的过滤介质。
(3) 保证进口空气清洁度,如加强生产场地卫生管理,正确选择进风口,加强空气压缩 前的预处理。
(4) 降低进入空气过滤器的空气相对湿度, 如使用无油润滑的空气压缩机, 加强空气冷 却和去油,提高进入过滤器的空气温度。
(5)稳定压缩空气的压力,采用合适容量的贮气罐。
四、无菌检测及发酵废气废物的安全处理
自学
思考题
1、培养基湿热灭菌的原理是什么?
2、设计一个培养基连续灭菌流程,并说明原理。
3、简述发酵用无菌空气的质量指标。
4、试设计一个空气除菌流程图,并说明各设备的主要作用。
5、介质过滤除菌的机理是什么?
6、如何提高过滤除菌的效率?
范文四：培养基
氧化亚铁硫杆菌与氧化硫硫杆菌在四价铀浸出中作用研究 培养基
pH=2.0,121℃灭菌15 min。
浸矿培养基则根据试验条件在上述两种培养基中加不同的矿石样。
[3] 张在海. 铜硫化矿生物浸出高效菌种选育及浸出机理[D].长沙:中南大学,2002.
[4] 龚文琪, 张晓峰, 刘艳菊. 表面活性剂对嗜酸氧化硫硫杆菌浸磷的影响[J].中南大学学报(自然科学版),2007,38(1): 60-64.
氧化硫硫杆菌的培养特性及低品位磷矿浸出 1.2 培养基
试验中所用培养基的组成如下[7]:Starkey培养基pH=2.4:
次, 每次30min; 然后用无菌操作将硫粉加入无机盐培养基中。 1.4 细菌的分离与纯化
吸取10 mL含菌种水样加入盛有100 mL已灭菌的Starkey 或ONM 液体培养基的250 mL锥形瓶中, 在30℃、120 rpm 的空气浴恒温摇床中振荡培养, 此过程一般需要7 d 。反复几次, 然后采用固体培养基稀释涂布平板法分离、纯化菌种以获得纯培养。在Starkey 固体培养基上7—10 d出现圆形凸起状小菌落(直径1 mm左右), 将单独小菌落挑起, 接种到装有5 mL液体培养基的小锥形瓶
(或试管) 中, 以棉球封口, 培养条件同上, 直到小锥形瓶的液体均匀浑浊。重复在液体培养基中扩大培养和在平板上反复分离, 最后分离出优良菌株。 氧化硫硫杆菌的培养特性及低品位磷矿浸出
嗜酸氧化硫硫杆菌的选育及其在磷矿浸出中的应用
范文五：培养基
一、
高氏1号琼脂培养基
试剂：可溶性淀粉(20g)，KNO3(1g)，K2HPO4(0.5g)，MgSO4· 7H2O(0.5g)，NaCl(0.5g)，FeSO4· 7H2O(0.01g)，琼脂 20g，pH=7.4-7.6
步骤：
1、称量和溶化 按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需 其他各类培养基水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分，并依次溶化，对微量成分FeSO4 .7 H2 O可先配成高浓度的贮备 液，按比例换算后再加入。待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的试剂中，在加热融化，最后补充所损失的水分。
2、调pH 用试纸测培养基的原始PH,如果偏酸，用滴管向培养基中加入
1mol/LNaOH,边滴边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCI进行调节。
3、分装和加塞 将配制的培养基分装入试管内，在试管口或锥形瓶口上塞上棉塞。
4、包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一根麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
5、 灭菌 将上述培养基以121℃,20min,0.103MPa高压蒸汽灭菌。
6、搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上。斜面的斜度要适当，使斜面的长度约为管长 1/3。
7、无菌检查 将灭菌培养基放入37℃的培养箱中培养24~28h，以检查灭菌是否彻底。
脯氨酸琼脂培养基
成分：脯氨酸10g、琼脂18~20g、蒸馏水1000ml
二、
PDA培养基
配方：马铃薯 200克、 葡萄糖 20克、 琼脂 15~20克 、自来水 1000毫升 自然PH
步骤：(1)称量和熬煮
按培养基配方逐一称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20-30min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分到1000ml。
(2)加热溶解
把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g(提前搞碎)，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。
(3)分装
按实训要求，将配制的培养基分装入试管或500ml三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜;半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
(4)加棉塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或试管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。
(5)包扎
加塞后，将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳或橡皮筋扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
马丁培养基
配方：葡萄糖 1g、蛋白胨 0.5g、KH2PO4·3H2O 0.1g、MgSO4·7H2O 0.05g0.1% 孟加拉红溶液 0.33ml、琼脂 1.5～2g、蒸馏水 100ml、自然pH2%
去氧胆酸钠溶液 2ml（预先灭菌，临用前加入）
链霉素溶液（10 000 u/ml） 0.33ml（临用前加入）
步骤：
1）称量 称取培养基各成分的所需量。
2）溶化 在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一溶化培养基各成分。按每100ml培养基加入0.33ml的0.1％孟加拉红溶液。
3）定容 待各成分完全溶化后，补足水量至所需体积。
4）加琼脂 加入所需琼脂量，加热融化，补足失水。
5）分装、加塞、包扎。
6）高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。
7）临用前，加热融化培养基，候冷至60℃左右，按每100ml培养基无菌操作加入2ml的2％去氧胆酸钠溶液及0.33ml的链霉素溶液（10 000 u/ml），迅速混匀。
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