难以把握的娘炮
范文一：色谱分离技术实验思考题及实验指导
附件3-5
色谱分离技术的演变和发展
（张卫weizhang@sjtu.edu.cn）
一、本探究实验需要讨论的问题：
A 组：
(1) 什么是色谱分离技术？它经历怎样的发展、演变过程？
(2) 简要说明色谱分析方法的基本原理，固定相和流动相的作用分别是什么？
(3) 柱色谱的色谱柱如何进行填充？填充过程中需要注意哪些问题？
(4) 简述柱色谱常用的洗脱剂及其洗脱能力的次序，如何选择合适的洗脱剂？采用柱色谱分离甲基橙和次甲基蓝混合染料时，为什么先用95%乙醇溶液作为洗脱剂，再用去离子水做洗脱剂进行洗脱，如果两者换一下次序是否可以？为什么？
(5) 设计实验：利用纸层析法进行植物色素的提取与分离
任意采集叶片、果皮等有色植物适量，经过烘干、研磨、溶剂浸提、离心分离、点样、展开等操作，提取与分离植物色素。
设计要求：通过文献查阅，判断所选的植物色素样本所含的色素种类有哪些？可以选取哪些合适的提取和分离色素的有机溶剂？如何分离各种不同的色素？设计相应的实验方法和步骤，给出所用的试剂及仪器。
拟提供的试剂与仪器：石油醚、丙酮、乙醇、碳酸钙、烘箱、纸层析滤纸、表面皿、培养皿、研钵、离心机等；
B 组：
(6) 常用的色谱分析方法有哪些？分别有怎样的特点和适用范围？
(7) 薄层色谱中，最常用的固定相（吸附剂）有哪些？其颗粒的大小对于分离效果有何影响？影响固定相活性的主要因素有哪些？
(8) 薄层色谱的分离效果的评价指标是什么？如何进行计算？若化合物本身无色，薄层色谱的色谱图中组分迁移产生的展开斑点位置如何确定？试举例说明两种常用的确定方法。
(9) 采用薄层色谱分离顺式偶氮苯和反式偶氮苯的混合物时，若分别采用20:1环己烷-乙酸乙酯和10:1环己烷-乙酸乙酯作为展开剂，展开效果有何不同？为什么？
(10) 设计实验：利用纸层析法进行植物色素的提取与分离
任意采集叶片、果皮等有色植物适量，经过烘干、研磨、溶剂浸提、离心分离、点样、展开等操作，提取与分离植物色素。
设计要求：通过文献查阅，判断所选的植物色素样本所含的色素种类有哪些？可以选取哪些合适的提取和分离色素的有机溶剂？如何分离各种不同的色素？设计相应的实验方法和步骤，给出所用的试剂及仪器。
(2) 称量7g 中性Al 2O 3放入小烧杯中，并用10ml 95％乙醇调匀。
(3) 打开色谱柱活塞，控制乙醇流速为1滴/s，将Al 2O 3从柱顶一次加入柱内，并用装有橡皮塞的玻棒轻轻敲击管外壁，使其填装均匀。
(4) 待Al 2O 3全部下沉，通过转动轻敲使Al 2O 3柱顶成均匀平面，然后在表面轻轻地覆盖一张圆形滤纸。
(5) 当乙醇液面降至滤纸表面时，关闭活塞，用滴管沿管壁加入1ml 次甲基蓝与甲基橙（1:1）的乙醇混合液。
(6) 打开活塞，仍控制流速为1滴/s，当混合液降至滤纸面时再关闭活塞，用滴管沿管
壁滴入1～2ml 95％乙醇，洗去粘附在柱壁上的液滴，打开活塞，让洗涤液降至滤纸面时，
再加入3ml 95％乙醇。
(7) 在色谱柱顶上装上滴液漏斗，用95％乙醇淋洗，洗脱速度1滴/s，观察色层带的形成和分离。
(8) 当蓝色次甲基蓝色带到达柱底时，更换接受器，收集全部此色带，然后改用水为洗脱剂，同时更换接受器。
(9) 当黄色甲基橙色带到达柱底时，再更换接受器，收集全部色层带。
(10) 色谱分离结束后，开活塞将柱内氧化铝倒入废物桶内，切勿倒入水槽。
(11) 回收次甲基蓝乙醇溶液和甲基橙水溶液。
3. 纸层析分离植物色素（自行设计）
（五）实验数据记录（自行设计实验记录表）
（六）实验结论
范文二：液相色谱思考题
1. 用标准曲线法定量的优缺点是什么？
标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。
标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。
2. 根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？
不行
因为离子交换色谱（ion exchange chromatography ，IEC ）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。
平衡常数K 值越大，表示组分的离子与离子交换树脂的相互作用越强。由于不同的物质在溶剂中离解后，对离子交换中心具有不同的亲合力，因此具有不同的平衡常数。亲合力大的，在柱中的停留时间长，具有高的保留值。
依据咖啡因的结构式1,3,7-三甲基黄嘌呤或3,7-二氢-1,3,7三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮，其解离常数很小，不符合离子交换色谱的要求。
3. 若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能得出准确结果吗？与本实验的标准曲线相比何
者优越？为什么？
一般来说峰面积相对更准一些，高度是不准的，毕竟还涉及到峰宽的问题。 用峰高来定量，如果峰形不好，比如说有拖尾，用峰高就不太准确。如果用峰高对峰面积也是可以的，但对峰的对称性要求比较高，药典要求应该是对称因子得是0.95 ~ 1.05之间，色谱条件要求比较高，如果能达到要求也是可以的。所以一般用峰面积定量更好些。
4. 在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果，为什么？
干过滤主要是保持溶液浓度不变而采取的一种过滤方法，前液中可能有一些滤纸或滤膜上的杂质存在，为了保持溶液浓度不变，所以要将前液去掉。干过滤为分离掉溶液中的固体, 并且不改变溶液浓度而采取的一种方法。为保持溶液浓度不变。前段滤液要弃去，并且滤纸漏斗盛接的烧杯都要干的。这样做不会影响实验结果。
5. 高效液相色谱柱一般可在室温下进行分离，而气相色谱柱必须恒温，为什么？高效液相
色谱在有时也实行恒温，这又是为什么？
气相温度对于样品的气化程度影响很大, 一般说温度越高, 气化越快, 通过色谱柱时间也越短, 气相单一物质分析一般用恒温, 多种物质分析时, 通过改变柱温能够很好的对样品进行分离, 节省了分析时间, 这时往往用梯度升温
液相并不是都是室温, 一般来说, 温度对于反相色谱分析影响不大, 所以用反相柱分析时, 一般用室温, 不配备柱温箱, 但是很多正相色谱分析时对于温度要求比较严格, 比如说配位体交换色谱法时, 温度的影响还是很大的, 用金属离子柱分析时, 如Ca 柱, 一般要求温度80度以上, 没有柱温箱是不能分析的
范文三：色谱实验思考题
七、思考题
FID 检测器与其他检测器相比的优缺点。
气相色谱常用检测器有热导检测器(TCD)、氢火焰离子化检测器(FID)、电子捕获检测器(ECD)、氮磷检测器(NPD)。
FID 检测器主要适用于含有碳氢键的有机物分析。对无机气体、水、四氯化碳等含氢少或不含氢的物质灵敏度低或不响应。FID 的优点是灵敏度高、线性范围宽，几乎对所有化合物均有响应，由于它属于质量型检测器，故对操作条件变化相对不敏感，稳定性好，特别适合于做微量到常量的常规分析。又因它响应时间短，所以与毛细管分析技术配用能完成痕量与快速分析。
TCD 检测器工作原理：当被测组分与载气混合后，混合物的热导系数与纯载气的热导系数大不相同，当通过热导池池体的气体组成及浓度发生变化时，会引起池体上热敏元件的温度变化，用惠斯顿电桥测量，就可由所得信号的大小求出该组分的含量。TCD 是通用型检测器，但灵敏度相对较低。特别适合于检测永久性气体、C 1~C3烃、氮、硫和各种形态碳氧化物及水等挥发性化合物的分析，特别是厌氧产气中CO 、CO 2、CH 4和H 2S 等的分析。
ECD 是一种高灵敏度、高选择性检测器，对电负性大的物质特别敏感，主要分析测定卤化物、含磷(硫) 化合物以及过氧化物、硝基化合物、金属有机物、金属螯合物、甾族化合物、多环芳烃、共轭羰基化合物等电负性物质。对大多数烃类没有响应。
NPD 又称热离子化检测器，是分析含氮、磷化合物的高灵敏度、高选择性和宽线性范围的检测器。
七、思考题
有天然气样品，成分可能有CH4、CO 、CO2、C2H2、C2H4、C2H6、C3H6、C3H8等，希望用气相色谱检测含量，请问选用什么检测器，选用那些色谱柱？可以用多根色谱柱，分几次进样，完成测试任务。
选用TCD 、FID 检测器并联的方式，对于永久无机气体可选用TCD 作为检测器，对于C2及以上的烃类物质选用FID 作为检测器。选用Propack-Q 预处理柱，后用13X 和Propack-R 为分析柱，或者PQ 为预柱5A 和GDX-104 为分析柱，主阀三阀三柱系统。无机气体组分较有机气体组分先流出Propack-Q 预柱，避免 CO2进入分子筛，可以将CO2 切入GDX-104 或Propack-R 柱中，并且同时使用 TCD 和FID ，灵活选用柱长度以便于中心切割，进而使
一次分析同时检测出所有组分。当分子筛采用TDX-01 柱时，经过Propack-Q 后可以将CO2 切入TDX-01 柱中。具体阀柱系统图如下：
七、思考题
1. 简述离子交换色谱分析的特点及应用范围。
答：离子交换色谱的分离机制是离子交换，其特点是耐酸碱，可在任何pH 值下
使用，易再生处理，使用寿命长，缺点是机械强度差、易溶胀、易受有机物污染。离子交换色谱主要用于不同基质中常见亲水性阴离子（F -、Cl -、SO 42-、NO 3-、Br -等）和常见亲水性阳离子（Li +、Na +、K +、Ca 2+等）的分离测定。一些碳水化合物也可以用离子交换法进行分离分析。
2. 简述离子色谱上样前处理要求和方法。
答：离子色谱样品预处理的目的主要是将样品中的目标离子从样品介质中最大浓度地转移到水溶液或水与极性有机溶剂的混合溶液中，以达到减少或取出干扰物、大大降低基体浓度、调节pH
、浓缩和富集待测离子成分的多重目的，使
之符合进样的要求，获得准确的分析结果。
A. 液体样品前处理
1）固相萃取法：
固相萃取(SPE)利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。固相微萃取(SPME)是在固相萃取上发展起来的一种新型、高效的样品预处理技术。
2）膜处理法
膜分离技术是利用膜对混合物中各组分的选择渗透性能的差异来实现分离、提纯和浓缩的新型分离技术。该方法只能去除颗粒态不溶性物质，一般通过0.45μm或0.22μm微孔滤膜过滤后直接进样。
3）其他液体样品的预处理技术
由于液膜处理法具有局限性，超过滤、渗析、电渗析也在离子色谱中开始得到应用。超过滤实际上是减压过滤，一般用于大分子和不溶物的分离；渗析是一个浓度平衡过程，离子通过离子交换膜从浓度高的一方向浓度低的一方扩散，这样某些离子可通过膜选择性地从样品中除去或加入到该样品中；电渗析是一个特殊的渗析过程，通过一个外部电场来提高渗析效率，与其他的膜处理相比，有一定的选择性，因此不仅可以去除颗粒物、有机污染物，还可以去除重金属离子的污染。
B. 固体样品前处理
1）分解处理法
将固体样品分解，将固体样品的非金属元素转化为相应的酸，然后再用离子色谱方法进行测定。湿式消解法是最简便的样品处理方法，而紫外光具有强氧化性，可以用于消解去除复杂样品中的有机物。
2）浸提法
对于固体样品，有时不一定需要测定非金属的总含量，二是需要测定特定阴阳离子的水溶性部分含量，或者在一定条件下的形态特征，这就需要选择合适的进出方法，在不破坏样品中的离子形态的前提下，将水溶解态离子尽可能高比例的浸提出来。
C. 特殊样品的预处理
对于组成复杂的样品，若待测离子对树脂亲合力相差颇大，一般可采用几次进样，并用不同浓度或强度的淋洗液或梯度淋洗等方法来改善分离效果。对固定相亲合力差异较大的离子，提高分离度的最简单方法是稀释样品或进行样品的预处理。对高浓度基体中痕量离子的测定，例如海水中阴离子的测定，最好的方法是做适当的预处理除去过量的Cl -。对于含有大分子有机物和重金属的样品，应该在进样前将有机物和重金属全部去除。
思考题
1、 为什么溶剂和样品要过滤？
溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。
色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。
仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。
2、 流动相使用前为什么要脱气？
流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD ，可能会造成荧光猝灭。
3、 如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？
溶剂的质量或溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4-7）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。
A ：严格执行溶剂过滤。
B ：勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液。
C ：如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001---0.001M 的叠氮化钠。
D ：在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气, 以隔绝空气。
E ：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或
磷酸盐缓冲液。
溶剂瓶里的砂心滤头清洗方法：用浓硝酸（分析纯）泡1小时左右，再用液相用水泡1-2小时，冲洗干净即可，不建议用超声洗。
4、 系统压力过高的原因有哪些？
压力过高，可能的原因有：
A 色谱柱进口过滤芯被污染
B 冲洗阀过滤芯被污染
C 色谱柱被污染
D 连接管路的毛细管堵塞
E 进样器转子上的凹槽被堵塞
F 进样针或针座被堵塞
范文四：分离工程思考题
第一章
1、生物技术与生物分离的关系是什么,为什么说生物分离过程是生物技术的重要组成部分,
生物技术的主要目标是生物物质的高效生产，而分离纯化是生物产品工程的重要环节。因此，生物分离是生物技术的重要组成部分。
2、生物物质有哪些,现代生物技术产品的主体是什么,
生物物质总类繁多，包括小分子化合物，生物大分子，超大分子，细胞和具有复杂结构与组成成分的生物体组织。
现代生物技术产品的主体---蛋白质类药物.
1) 细胞因子:干扰素、生长因子、红细胞生成素
2) 激素:胰岛素、生长激素
3) 抗体药物:单克隆抗体、抗体片段
4) 酶类药物:尿激酶
5) 基因工程疫苗
6) 基因治疗
3、生物分离过程设计应考虑哪些因素,为什么色谱是分离过程的核心技术, 考虑因素:
1) 目标产物的存在位置:胞内或胞外
2) 目标产物的存在形式:活性表达产物或包含体
3) 目标产物分子的大小、疏水性、电荷性质、溶解度和稳定性 4) 目标产物的商业价值和对纯度的要求
4、生物分离过程有哪些特点,
1) 生化产物的稳定性差，产物可能失活
2) 分离难度大，一般需用特殊的高效分离技术
3) 生物产物的原料构成成分复杂，需要采用多种分离技术和多个分离步骤完成
一个目标产物的分离
4) 对最终产物的质量要求很高
5) 需对原料液进行高度浓缩
5、生物分离过程中需要考虑分离对像的哪些性质,
1) 根据物理性质的差异实现分离
i. 力学性质:密度、尺寸和形状。用于重力沉降、离心、膜分离等
ii. 热力学性质:溶解度、挥发度等。用于如蒸馏、蒸发、结晶、吸附
和离子交换等
iii. 传质性质:粘度、扩散系数、热扩散现象等。即利用传质速度的差
别进行分离
iv. 电磁性质:荷电性质、电荷分布、等电点等。用于电泳、电渗析、
离子交换、磁性分离等
2) 根据化学性质的差异实现分离
i. 化学性质包括热力学(化学平衡)、反应动力学(反应速率)和光化学特
性等。
ii. 化学吸附和化学吸收即利用化学性质实现分离。
3) 根据生物学性质的差异实现分离
a) 生物分子间的识别作用，如亲和色谱
b) 利用酶的立体选择性，如对手性分子进行选择性修饰后以增大分子间差
异，从而用常规方法进行分离
6、什么是平衡分离,什么是差速分离,
差速分离(速度分离)
分离机理:根据溶质在外力作用下产生的移动速度的差异实现分离。传质推动力主要有压力差、电位梯度和磁场梯度等;分离方法:超滤、反渗透、电渗析和电泳等;
扩散分离(平衡分离)
分离机理:根据溶质在两相中分配平衡状态的差异实现分离。传质推动力为偏离平衡态的浓度差;分离方法:萃取、结晶、吸附和离子交换等。
7、如何对分离效率进行评价,
1) 从分离方法和设备的角度
i. 分离容量:单位体积的分离设备处理料液或目标产物的体积或质量;
ii. 分离速度:单批次分离所需时间;
iii. 分辨率:目标产品的纯化效果或杂质的去除能力
2) 从分离过程和产品的角度
i. 浓缩程度
ii. 分离纯化程度
iii. 回收率
8、为什么分离因子α要足够大,
ccmTPTCT,,, ccmXPXCX
ccTPTW,, ccXPXW AP ,,AC
9、如何确定产品的回收率,
第二章
1、细胞重力沉降速度的计算
2、离心沉降速度的计算
3、常用离心分离设备有哪些,
实验室主要使用离心管式转子离心机;生化上需用冷冻离心机;工业上较常用的
有管式和碟片式两大类。
4、离心机的处理能力如何计算,如何放大, 管式 碟式;
332 2(),,nr-r2212,,Q=, = (2.26)2,,Lr,g2 ,,,Qvv (2.23)3tang,ggg 式中，和分别为分离板的外径和rr22122Lr ,,2,,内径;为分离板数;为分离板与n,g
旋转板轴的夹角
离心机的放大:采用等校正系数法
QQQ 122,,,==, = (2.27)21 ,,Q,,g1g21
出恒压过滤速度基本方程，如何确定过滤系数K, 5、导
,2Ap1-c,()dQs = (2.32),,,dtQ+Qc()L0Ls
恒压条件下:
2 ()() (2.33)Q+Q=Kt+t00
其中:
2ApcΔ(1-β)s K= (2.34)μραcsLL
上式中，为料液中固形成分形成滤饼c() s
的含量，为湿滤饼和干滤饼的质量比，,
Q为形成相当于过滤介质阻力的滤饼时0 透过的虚拟滤液体积，为透过虚拟滤液 t0
量所需的虚拟时间。Q0
对微分可得:2.33
2Qdt2Q0 2.35=+ dQKK
2.35由式可计算和KQ0
6、细胞破碎的原理是什么,什么是机械破碎,什么是化学破碎,
机械破碎:原理是细胞在机械作用力下受到压缩和剪切而破碎。细胞越小，所需
压缩或剪切力越大，越难破碎。
化学破碎又称化学渗透:其原理是利用化学或生化试剂(酶)改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质的溶出速率;或者完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。
7、为什么细胞直径越小，越难破碎,
4du4,, = (2.39)F= (2.37) dydd,
由2.37和2.39可见，单纯从细胞直径的角度，细胞越小，所需的压缩力或剪切力越大，即破碎的难度越大
8、在产物释放速度模型中，什么是破碎速度控制过程,什么是释放速度控制过程,
由式可得:2.41~2.43
2 dcdc+k+k=kkc-c()() (2.44)DRDRM2 dtdt
上式即为两步释放过程的速率方程。如果细胞破碎和产物
释放的其中一步很快，则成为表观一级释放过程，速率方
程分别为:
dc破碎速率控制过程:kc-c (2.44a)=() DM dt
dc释放速率控制过程:kc-c (2.44b)=()RM dt
9、各种机械破碎方法的原理是什么,各有何优缺点,
机械破碎处理量大、效率高、速度快，是工业规模细胞破碎的主要手段 1高压匀浆
破碎原理:主要利用细胞悬液在高压作用下液相剪切力以及细胞与固定表面的撞击力而使之破碎。 特点:适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不宜用于团状或丝状菌的破碎;由于操作中温度会升需对料液作冷却处理，保护目的产物活性。
2珠磨破碎
破碎原理:利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相互磨擦碰撞而破碎。
特点:适用范围较广;但有效能量利用率很低， 设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力;影响破碎率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。 3撞击破碎
破碎原理:细胞冷冻后成为易于破碎的刚性球体，高速撞击固定的撞击板使其破碎。特点:细胞破碎均匀;可通过调节载气压力控制细胞破碎程度;适用于细胞器(如线粒体、叶绿体)的回收。
4超声波破碎
破碎原理:超声波作用下液体发生空化作用，产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 特点:它是很强烈的破碎方法;适用范围广;但有效能量利用率极低，对冷却的要求相当苛刻，故不易放大，多在实验室使用。
10、化学和生物化学渗透破碎有哪些方法,与机械破碎相比有什么优缺点, 1酸碱处理
破碎原理:蛋白质为两性电解质，改变PH值可以改变其荷电性质，使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的相互作用力降低而易于溶解。 2化学试剂处理
破碎原理:表面活性剂、螯合剂、有机溶剂或变性剂等处理细胞，增大细胞壁或细胞膜的通透性，或者降低胞内物质间相互作用，使目的产物易于释放。 3酶溶
破碎原理:利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，增大胞内产物的通透性。
机械破碎法
优点:处理量大、破碎效率高、速度快，适用于工业规模的细胞破碎。 缺点:由于操作条件比较剧烈，往往容易造成细胞的过度破碎，不利于后续处理。 化学破碎法
优点:选择性高，胞内产物的总释放率低，料液粘度小，有利于后处理过程。 缺点:适用范围小，通用性差，破碎速度慢，处理时间长，破碎效率低，不适于大规模细胞破碎操作。
11、物理渗透法破碎有哪些方法,其原理是什么,
渗透压冲击法
破碎原理:细胞在高渗透压介质中平衡后，再突然将其转至低渗透压环境中，水会大量进入细胞，使细胞壁和膜胀破。
特点:最温和的细胞破碎法;适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。
冻结,融化法
破碎原理:利用细胞在快速冷冻时，细胞内水很快结晶，形成大量晶核，体积增大，将细胞胀破， 经冻结,融化反复多次操作，即可达到所需的破碎率。
特点:此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细胞，特别适用于位于胞间质的酶的释放;操作方便，但耗时、耗能，大规模应用困难。
第四章
1. 什么是沉淀,它与结晶的区别在哪里,
1定义:沉淀(Precipit-tion)是物理环境的变化引起溶质溶解度降低，生成固体凝聚物的现象。
2与结晶的区别
a) 沉淀的纯度远低于结晶，是一种初级分离技术。但多步沉淀操作也可制
备高纯度的目标产物。
b) 目前广泛应用于蛋白质等生物产物的分离。
c) 蛋白质沉淀是不定形颗粒，不是结晶。
2. 水溶液中的蛋白质的表面特性有哪些,
a) 蛋白质是两性高分子电解质，主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组
成，蛋白质的疏水特性是一重要性质;
b) 蛋白质的相对分子量在5，103~1，106之间，分子直径约1~30nm;
c) 在水溶液中呈胶体性质，在蛋白质周围形成水化层，水化层可达蛋白质
分子质量的2倍以上;胶体性质是蛋白质的又一重要性质
d) 分子间由于形成双电层而存在静电排斥作用。
3. 蛋白质的双电层是指什么,对沉淀分级有何指导意义,
(绝对值)的大小， a) 带电离子间的静电相互作用取决于ξ电位
b) 由于粒子表面电位一定，所以分散层厚度越小，ξ电位越小， c) 若分散层厚度为零，则ξ电位为零，粒子处于等电状态，不产生静电相互作
用，
d) 当双电层的ξ电位足够大时，静电排斥作用等于抵御分子间的相互吸引作用
(分子间力)，使蛋白质溶液处于稳定状态。
因此:
1) 可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度(ξ电位)降低蛋白质溶液
的稳定性，实现蛋白质的沉淀;
2) 水化层厚度和ξ电位与溶液性质(如电解质的种类、浓度、pH值等)密切
相关;
3) 蛋白质沉淀可采用恒温条件下添加各种不同试剂的方法:加入无机盐的
盐析法，调节pH的等电点沉淀法，加入有机溶剂的有机溶剂沉淀法。
4. 盐析沉淀的原理是什么,影响因素有哪些,
高盐浓度下，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱;同时，由于盐离子的水化作用使蛋白质表面疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出疏水区域，从而增大了蛋白质表面疏水区之间的疏水相互作用，容易发生凝聚，进而沉淀。
影响因素:无机盐种类(影响):离子半径小而带电荷较多的阴离子盐析效果较好。温度和pH值(主要影响,)，蛋白质起始浓度的影响。
5. 为什么常用硫酸铵作为盐析用盐,如何进行盐析沉淀操作,
6. 等电点沉淀的原理及操作条件,为什么亲水性太强的蛋白质不适合于等电
点沉淀,
1定义:利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法。
2原理: 在等电点附近，蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水作用力使分子间相互吸引，形成沉淀。
3操作条件:低离子强度;pH,pI，由于一般蛋白质的等电点在偏酸性的范围内，故等电点操作中多通过加入无机酸，如盐酸、磷酸和硫酸等调节pH。 4一般适用于疏水性较大的蛋白质(如酪蛋白)，而对于亲水性很强的蛋白质(如明胶)则不太适用，故其不如盐析沉淀法应用广泛。
7. 有机溶剂沉淀的原理是什么,应注意什么问题,
1定义:向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，造成蛋白质分子表面水化程度降低，蛋白质分子间的静电引力增大，从而发生沉淀的方法。 2原理:加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生多种效应，这些效应结合起来，使蛋白质沉淀。其中主要效应是水的活度的降低，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，因而静电引力增大。也有可能是因为有机溶剂的加入使蛋白质的键如氢键等受到破坏，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀，当蛋白质的空间结构发生变形超过一定程度时，便会导致完全变性。
3操作条件:低离子强度;等电点附近。
4优缺点:优点:有机溶剂密度较低，易于沉淀分离;不需后续脱盐处理;缺点:易引起蛋白质变性，须在低温下进行。
5注意事项:
a) 降低温度，能增加收率和减少蛋白质的变性所选择的溶剂必须能和水互溶，
而和蛋白质不起作用，最常用的溶剂是丙酮和乙醇，工业上最常用的是乙醇; b) 蛋白质的分子量越大，产生沉淀所需加入的有机溶剂量越少; c) 一种蛋白质的溶解度通常会由于另一种蛋白质的存在而降低; d) 对很多酶，丙酮加量在20%-50%之间，就能产生沉淀;
e) 接近等电点时，以引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少;
f) 当溶剂量达到50%时，则通常只有分子量小于15000的蛋白质仍留在溶液中; g) 少量中性盐的存在(0.1-0.2mol/L以上)能产生盐溶作用，增加蛋白质在有机溶
剂水溶液的溶解度，使所需的有机溶剂量增大。
8. 沉淀生成的动力学方程
9. 泡沫分离的原理是什么,影响泡沫分离的因素有哪些,
a) 表面张力与表面吸附
i. 在水溶液中加入表面活性剂形成胶团。在气液界面处，极性头溶于
水相，而非极性尾部暴露在气相中(气泡内);
ii. 不同溶质在气泡表面的吸附量(浓聚)不同，从而实现分级。
iii. 根据热力学理论，在气液两相界面处的表面活性物质浓度与主体溶
液不同，这种现象称为表面过剩。
b) Gibbs等温吸附方程:溶质的表面过剩量可用Gibbs吸附等温式表达 影响因素:1料液性质:pH、离子强度，添加剂等。2表面活性剂:对于非表面活性物质的泡沫分离，可以提高目标蛋白质的分离度和收率;3操作条件:主要是气体流速。4泡沫柱高度。
第四章
1. 膜分离方法有哪些，其分离原理是什么,
膜分离法 传质推动力 分离原理 应用举例
压差 微滤(MF) 筛分 除菌，回收菌体，分离病毒 (0.05~0.5MPa) 压差超滤(UF) 筛分 蛋白质等大分子的回收与浓缩 (0.1~1.0MPa)
压差 反渗透(RO) 筛分 脱盐，淡水制造 (1.0~10MPa) 透析(DS) 浓度差 筛分 脱盐，除变性剂
电渗析(ED) 电位差 荷电、筛分 脱盐,氨基酸与有机酸的分离
渗透气化(PV) 压差、温差 溶质与膜的亲和作用 共沸物的分离(如乙醇浓缩)
2. 图示说明反渗透的原理
在溶质浓度高的一侧施加超过渗透压的压
力，使溶剂透过膜的操作。
3. 超滤和微滤的分离原理与反渗透有何区别,
一般来讲，反渗透法主要用于截留无机盐类这样的小分子，而超滤则是从小分子溶质或溶剂分子中，将比较大的溶质分子筛分出来。二者并无本质上的差别。
4. 透析的原理是什么,在生化分离中有何用途,
利用透析膜(具有一定孔径大小，高分子溶质不能透过的亲水膜)将料液与透析液(纯水或缓冲液)分隔，在浓差作用下，料液中小分子溶质进入透析液，而透析液中的水进入料液。
应用:临床上常用于血液透析;生物分离中主要用于生物大分子溶液的脱盐。
特点:以浓差为推动力，膜透过通量很小，不适于大规模生物分离过程，多
在实验室中应用。
5. 电渗析的工作原理是什么,
使用离子交换膜，利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离的膜分离法
6. 渗透汽化的工作原理是什么,
通过渗透气化膜，在膜两侧溶质分压差的作用下，根据溶质间透过速度的不同，并在透过侧发生气化，使液体混合物得到分离的膜分离法
特点:溶质发生相变，消除了渗透压的作用，可在较低压力下进行，适于高浓度混合物的分离;特别适用于共沸物和挥发度相差较小的双组分溶液的分离。
7. 对膜材料有哪些要求,
a) 有效膜厚度小，UF和MF膜孔隙率高，过滤阻力小;
b) 膜材料为惰性，不易污染和堵塞;
c) 适用的pH和温度范围广，稳定性高，使用寿命长;
d) 容易通过清洗恢复透过性能;
e) 能满足实现分离目的的各种要求。
8. 膜的结构特征包含哪些内容,
1孔道结构
因膜材料和制造方法而异，对膜的透过通量和耐污染能力等操作性能有重要影响。
孔道特性
包括孔径、孔径分布和孔隙率。
9. 什么是膜的水通量,
i. 定义:在一定条件下(一般压力为0.1MPa，温度为20?) ，单位时
间透过单位膜面积的纯水体积。
ii. 膜材料、生产工艺和膜孔径影响水通量大小。
iii. 实际操作中由于溶质吸附、膜孔堵塞及浓度极化等原因会使透过通
量大幅度降低。
10. 膜组件有哪些形式,
由膜、固定膜的支撑体、间隔物及收纳这些部件的容器构成的一个单元。
管式,
, 平板式,, 螺旋卷式, ,中空纤维(毛细管)式,
11. 试导出浓差极化模型
12. 有哪些因素影响膜的截留率,
i. 溶质分子量
ii. 分子特性
1. 不同分子截留率大小顺序:球形,带支链,线性;
2. 对于荷电膜，与膜相反电荷的分子截留率较低;
3. 若膜对溶质有吸附作用，截留率增大。
iii. 其他高分子溶质的影响
1. 其他高分子溶质的存在使溶质截留率增大。
iv. 操作条件
1. 温度升高(使粘度降低)，膜面流速提高，截留率降低;
2. pH=pI时，蛋白质在膜表面形成的凝胶极化层浓度最大，即透过
阻力最大。因此，此时的溶质截留率高于其他pH下的截留率
13. 影响膜分离速度的因素有哪些,
操作方式
流速
压力
料液浓度
14. 膜分离操作中浓缩与洗滤有何区别,
15. 膜分离在生化分离中的应用领域
第五章
1、什么是萃取、反萃取、萃取洗涤,
萃取:利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作。 反萃取:调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的操作。作用:为了进一步纯化目标产物或便于后续分离操作。
洗涤:有时加在萃取与反萃取之间，除去与目标产物同时萃取到有机相的杂质，提高反萃液中目标产物纯度。
2、物理萃取和化学萃取有何区别,
1) 物理萃取
定义:溶质根据相似相溶原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质间不发生化学反应。
应用:广泛应用于抗生素及天然植物中有效成分的提取。如利用乙酸丁酯萃取青霉素。
2) 化学萃取
定义:利用脂溶性萃取剂与溶质的化学反应生成脂溶性复合分子，使溶质向有机相分配。
应用:用于氨基酸、抗生素和有机酸等生物产物的分离回收。如利用季铵盐萃取氨基酸。
3、萃取平衡的分配定律是什么,分配系数是如何定义的,
分配定律:一定温度、压力下，溶质在互不相溶的两相中达到分配平衡后，在两相的浓度比为一常数,即分配系数m。
4、导出弱电解质的分配系数表达式
5、导出化学萃取平衡的分配系数表达式
6、哪些条件对溶剂萃取操作产生影响,为什么,
1萃取剂
2水相pH
对弱电解质萃取，水相pH影响分配系数,如青霉素.
3温度
生化产物在温度较高时都不稳定，故萃取应维持在室温或较低温度下进行。个别情况下，为提高萃取速度可适当提高萃取温度。温度对萃取分配系数也有影响。 4无机盐
加入无机盐如硫酸铵、氯化钠等可使产物在水中的溶解度降低，而易于转入到溶剂中去;另一方面也能减少有机溶剂在水中的溶解度。如在提取维生素B12时，加入硫酸铵;在提取青霉素时加入氯化钠等。
5助萃剂(化学萃取剂，带溶剂)
当目标产物的水溶性太强，通常在有机溶剂中的溶解度很小时，难于用萃取的方法进行分离。此时可在有机溶剂中加入助萃剂，其作用是使其与目标产物形成复合物，从而增大目标产物在有机溶剂中的溶解度
6乳化现象(萃取过程中极易发生)影响:两相分层困难，并产生两种夹带 萃余液中夹带有机溶剂，造成目标产物损失;
萃取相中夹带萃余液，给后处理带来困难。
7、导出多级错流萃取、多级逆流萃取、及分馏萃取的萃取分率计算式
8、建立微分萃取的平推流及轴扩散模型
9、双水相萃取的原理及特点是什么,
某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相系统; 两相中水分占有很大比例，达85-95%;
生物活性物质在这种环境中不会引起失活，但可以不同的比例分配于两相中。
10影响分配系数(萃取效果)的因素
1成相聚合物和浓度
分子量:降低聚合物的分子量，则蛋白质易于分配于富含该聚合物的相中。 总浓度:越大则两相性质的差别越大，系线越长，蛋白质越容易分配于其中的某一相。
2盐的种类和浓度
影响,,:
影响,HFS:由于盐析作用，盐浓度增加则蛋白质表面疏水性增大。 影响双水相系统:改变上、下相中成相物质的组成和相体积比。 3pH值
影响蛋白质的表面电荷数Z:影响蛋白质的解离度。
影响,,:影响磷酸盐的解离。
4温度
主要影响双水相系统的相图。
大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，主要基于以下考虑: PEG对蛋白质有稳定作用;
溶液粘度较低，容易相分离;
节省冷却费用。
11、什么是液膜萃取,有支撑液膜和无支撑液膜萃取的区别在哪里,各有何优缺点,
定义:液膜是由水溶液或有机溶剂(油)构成的液体薄膜，将与之不能互溶的液体分隔开来，使其中一侧液体中的溶质选择性透过液膜进入另一侧，实现溶质间的分离。
特点:液膜结构独特，分离性能高效，可实现萃取和反萃取一步完成。 应用:有机酸、氨基酸和抗生素等小分子生物产物的分离纯化。
12、影响液膜萃取操作的因素有哪些,为什么,
膜相组成
1膜溶剂 粘度影响乳状液膜稳定性、液膜厚度和传质系数;当分离需要流动载体时，应对其有较高的溶解度。
2表面活性剂
操作条件
1pH 值 对氨基酸和有机酸等弱电解质的萃取，pH 影响其电离，从而影响萃取率。
2搅拌速度 影响乳化液的分散和液膜的稳定性，过低则操作时间长;过高则液膜易被破坏。
3反萃相 对于?型和?型促进迁移的萃取过程，反萃相组成和浓度影响萃取速度和选择性。
4操作温度 一般在常温下进行，因过高虽然可提高萃取速度，但同时膜相挥发速度加快，甚至造成表面活性剂水解，对维持液膜稳定性不利。 5操作时间 因乳状液膜为高度分散体系，相间接触比表面积极大，且液膜很薄，传质阻力小，故在短时间内可萃取完全。时间过长反而会引起液膜的破坏。
13、什么是反胶团,反胶团萃取与液液萃取有什么区别,
向有机溶剂中加入表面活性剂(如AOT)，浓度超过一定值时，形成反胶团. 与一般有机溶剂萃取的区别:
利用表面活性剂在有机相中形成反胶团(reversed micelles)，从而在有机相内形成分散的亲水微环境。
生物分子可溶解在反胶团的亲水微环境中，消除了蛋白质类生物活性物质难溶解在有机相中，或在有机相中发生变性的现象。
14、反胶团的溶解作用有哪几种,为什么反胶团萃取中酶可能失活,
a) 反胶团溶解蛋白质的形式，有人提出四种模型:
i. 水壳模型;
ii. 蛋白质分子表面疏水区域直接与有机相接触;
iii. 蛋白质吸附于反胶团内壁;
iv. 蛋白质疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾相互作用，被几个
小反胶团“溶解
15、什么是超临界流体萃取,为什么CO2常作为超临界流体, 定义:利用超临界流体(SCF)，即温度、压力略超过或靠近临界温度和临界压力的流体为萃取剂，从固体或液体原料中提取目的产物。
最常用的超临界流体:CO2，因其临界温度接近常温，无毒、化学稳定性高、价廉。CO2的p-V(,)-T图:临界点附近温度或压力的微小变化，引起密度发生很大变化。
第六章
1. 影响吸附的主要因素,
2. 亲和吸附的原理和特点是什么,
3. 常用的离子交换树脂类型有哪些,
常用的离子交换树脂
1强酸性阳离子交换树脂:活性基团是-SO3H(磺酸基)和-CH2SO3H(次甲基磺酸基);
2弱酸性阳离子交换树脂:活性基团有-COOH,
-OCH2COOH, C6H5OH等弱酸性基团;
3强碱性阴离子交换树脂:活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-?-羟基乙基胺基;
弱碱性阴离子交换树脂:活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱
4. 影响离子交换速度的因素有哪些,
5. 用于蛋白质提取分离的离子交换剂有哪些哪些特殊要求，主要有哪几
类,
i. 要求:良好的亲水性、具有较大的均匀网格结构、粒度越小分辨
率越高
ii. 种类:多糖类 离子交换纤维素
交联葡聚糖
交联琼脂糖
聚乙烯醇类
Mono系列 Amersham Pharmacia
第7章
1. 色谱工作原理
2. 色谱的分类
a) 按流动相和固定相分:按流动相有气相色谱、液相色谱、超临界流体
色谱;按固定相有固体、液体和以固体为载体的液体薄层。生物分离
主要采用液相色谱。
b) 按固定相的形状分:液相色谱又分为纸色谱、薄层色谱和柱色谱。纸
色谱和薄层色谱多用于分析目的，而柱色谱用于大量制备(也可用于
分析，如HPLC)
c) 按使用压力分:低压(0.5MPa)、中压(0.5-4.0MPa)、高压(4.0-40MPa)。
高压液相色谱主要用于分析。
d) 按流体流动方向分:轴向和径向色谱。一般的色谱操作中流动相从固
定床的一端输入，沿轴流向另一端，属于轴向色谱;而沿径向流动属
于径向色谱。
e) 按分离操作方式分:洗脱展开、迎头分析、置换展开
f) 按分配机理分:凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色谱、疏水性相
与作用色谱、亲和色谱
3. 什么是平衡模型,理论板模型,
1平衡模型假定整个色谱柱中不存在传质阻力，溶质在固定相和流动相中的分配平衡均瞬间完成，即在色谱柱内的任何时刻和位置，固定相和流动相中的溶质浓度(分别为cs和cm)均符合分配(吸附)等温式
2理论板模型认为溶质的分配平衡不能瞬间完成，而需要一定的柱高，即在此柱高内溶质在两相间达到一次平衡。
4. 由van deemeter方程分析流动相流速与HETP的关系
5. 什么是分离度,分离度与理论板数及容量因子有何关系,
分离度是两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值之比。
6. 分析凝胶过滤色谱的原理
凝胶过滤色谱又称尺寸排阻色谱，它是利用凝胶粒子为固定相，根据料液中溶质
相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法
7. 影响凝胶过滤色谱分离特性的因素有哪些,为什么,
a) 线速度
i. 除NaCl外，HETP与线速度u基本上呈线性关系 b) 料液体积
i. 在一定的料液体积范围内HETP为常数，之后HETP随料液体积
增大而急剧增大;
ii. 料液浓度
1. 根据GFC的分离原理，溶质的洗脱时间和HETP应与料液浓
度无关;
2. 但在实际操作中，当料液浓度较高时，洗脱曲线常呈现不对
称形状，如出现吐舌或拖尾，甚至出现分裂的两个峰，使
HETP急剧增大;
3. 料液与流动相的黏度比需小于2，以避免不规则洗脱曲线的
出现，影响分离效果。
c) 相对分子质量与分配系数的关系
i. GFC中溶质的分配系数在分级范围内随相对分子质量的对数值
增大而线性减小;
ii. 凝胶的分级范围越小，分离度越大;
iii. 根据混合物中相对分子质量选择分级范围较小的凝胶过滤介质，
对提高分离度或料液处理量是非常重要的。
d) 凝胶颗粒
i. 凝胶粒径越小，HETP越小;
ii. 减小粒径，不仅柱效增大，分离度提高，而且可以提高分离速度，
即提高流速;
iii. 通常在固定相或设备允许的压力范围内采用最大限度的流速，使
柱效保持在较高的水平，提高分离度。
8. 什么是离子交换色谱,与离子交换吸附有何关系,
IEC以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离
子交换亲合力的不同而得到分离的方法
9. 离子交换色谱的恒定洗脱、线性洗脱及逐次洗脱各有何不同, 1. 恒定洗脱 洗脱液(盐溶液或缓冲液)的流速和浓度均不发生变化。这种洗
脱方法适用于样品纯度比较高，洗脱方便的情况
2. 线性梯度洗脱 连续改变洗脱液(离子强度)的组成可使目标物洗脱集中，
避免拖尾出现;并能提高分辩率，与其它成分洗脱分开;需要梯度洗脱
设备。
3. 逐次洗脱(介于恒定洗脱和线性洗脱之间)当样品含杂质较多时，可先用一
种洗脱缓冲液洗脱杂质;然后用更强烈的(离子强度更高)洗脱液洗脱。 a) 线性梯度洗脱法的优缺点
i. 优点:流动相离子强度(盐浓度)连续增大，不出现干扰峰，操作范围
广;
ii. 缺点:需要特殊的调配浓度梯度的设备。
b) 逐次洗脱法(介于恒定洗脱和线性梯度之间)
i. 优点:利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不需要特殊梯
度设备，操作简便;
ii. 缺点:因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰，而且易出现
洗脱峰重叠，洗脱操作参数的设计较困难。
10. 疏水性色谱的工作原理
a) 亲水性蛋白质表面均含有一定量的疏水性基团，疏水性氨基酸含量较
多的蛋白质疏水性基团多，疏水性也大;
b) 利用表面偶联弱疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与
疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大
分子分离纯化的洗脱色谱法;
c) 在离子强度较高的溶液中，蛋白质表面疏水部位的水化层被破坏，裸
露出疏水部位，疏水性相互作用增大。
d) 因此，HIC蛋白质的吸附需要在高浓度盐溶液中进行，洗脱则主要采
用降低流动相离子强度的线性梯度洗脱法或逐次洗脱法。
11. 什么是色谱聚焦,图示说明色谱聚焦的分离过程
a) 色谱聚焦是基于离子交换的原理，根据两性电解质分子间等电点的差
别进行分离纯化的洗脱色谱法.
i. 准备:设有A、B两种蛋白质，等电点分别为pIA和pIB,并且pIA >
pIB，首先用pH高于pIA的缓冲液冲洗色谱柱，使柱内pH为pH0;
ii. 吸附:将一定量的料液加入上述色谱柱中，由于pH0 >pIA > pIB，
因此两种蛋白质均带负电荷，被阴离子交换剂吸附;
iii. 洗脱:用已将pH调到小于pIB的多缓冲剂为流动相进行洗脱，
使柱内形成pH梯度;
12. 什么是反相色谱,为什么对生物大分子大多采用反相色谱, 反相色谱利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行分离纯化的洗脱色谱法;
13. 羟基磷灰石色谱的工作原理是什么,
a) 羟基磷灰石是一种磷酸钙晶体，基本分子结构为:Ca10(PO4)6(OH)2，
在生物医学材料上有广泛应用;
b) 在HAP晶面存在两种不同的吸附晶面，各存在吸附点C和P，前者
起阴离子交换作用，后者起阳离子交换作用;
c) 在中性pH环境下，酸性蛋白质(pI<>
质(pI>7)主要吸附于P点，可用磷酸盐缓冲溶液为流动相进行洗脱展
开;
d) 同样可采用线性梯度洗脱法。
14. 什么是纸色谱和薄层色谱,有何应用
纸色谱:以滤纸为介质，将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端;选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹。
薄层色谱:将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法
用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析
15. 什么是置换色谱,
第8章 亲和色谱
1、什么是亲和作用,什么是亲和色谱,
生物亲和作用 生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性(即生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。生物分子间的这种持异性相互作用称为生物亲和作用
亲和色谱利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。
2、为什么说亲和作用是自然界普遍存在的现象,生物分子间的亲和作用有何特点,
3、影响亲和作用的因素有哪些,
1) 离子强度
a) 提高离子强度使静电引力降低
b) 提高离子强度使氢键作用降低或消除
c) 提高离子强度使疏水相互作用增强
pH将影响蛋白质的解离。因此，如果静电引力对亲和作用的贡献较大，2pH值
则pH变化将严重影响亲和作用
3抑制氢键生成的物质
i. 脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成
ii. 但脲和盐酸胍高浓度下(>4mol/L)下容易引起蛋白质的变性 4温度
iii. 升高温度使静电作用、氢键及金属配位键减弱
iv. 但升高温度使疏水性相互作用增强
5离液离子
v. 半径较大的离液离子SCN-、I-等使疏水作用降低
6螯合剂
vi. 加入乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂除去金属离子，会使亲和结合作
用消失
4、简述亲和色谱操作过程
5、亲和色谱有哪些种类的配基,
1) 酶的抑制剂: 蛋白酶均存在抑制其活性的物质，这类物质称为酶的抑制剂。
在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制酶的活性，必
要时保护生物组织不受蛋白酶的损害。
2) 抗体: 利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色谱。抗体与抗原之间具
有高度特异性结合能力。但价格很贵，只适用于产量较小的某些基因工程药
物。
3) A蛋白: A蛋白分子量约42000，与动物免疫球蛋白具有很强的亲和作用，
可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。
4) 凝集素 :是与糖特异性结合的蛋白质(酶和抗体除外)的总称，大部分凝集素
为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不
同。
5) 辅酶和磷酸腺苷:各种脱氢酶和激酶需要在辅酶的存在下表现其生物催化活
性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。磷酸腺苷的腺苷部分与
辅酶的结构类似。
6) 色素配基: 三嗪色素与DNA的结合，与蛋白质的结合
7) 过渡金属离子: 过渡金属离子可与N、S和O等供电子原子产生配位健，
因此可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基等发生亲和结合作
用;也可能形成螯合物
8) 组氨酸: 具有弱疏水性，可与蛋白质发生亲和作用
9) 肝素
6、在配基和载体之间引入间隔臂的作用是什么,
1. 间隔臂的存在能够排除由多孔基质的骨架引起的空间障碍，增加活性功
能团(配基)的可动性，从而提高功能基团的利用率;
2. 间隔臂的存在可以确保基质的惰性性质，而基质惰性性质正是色谱固定
相能够具有生物特异性吸附、提高分辨率的重要条件;
3. 间隔臂本身与蛋白质表面某一对应疏水区域相互作用，增加了对蛋白质
的吸附能力。
7、亲和膜色谱的原理是什么,
利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质。 亲和膜色谱的优点
无内扩散传质阻力，仅存在表面液膜传质阻力，由于传质阻力小，吸附速度快，达到吸附平衡所需时间短，配基利用率高;
设备压降小，流速快，设备体积小，配基用量低;
微孔膜介质种类多，价格便宜。
第九章 电泳
1、什么是电泳,什么是电色谱,
2、负电离子的双电层理论
3、荷电溶质的泳动速度如何计算,
4、什么是凝胶电泳,
5、等电点聚焦的原理是什么,
1) 分离原理(与色谱聚焦有相似之处)
a) 一般的区带电泳利用溶质迁移率的差别进行分离，而等电点聚焦利用蛋
白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的pH值下呈电中性，
不发生泳动的特点进行分离;
b) 在电泳设备中首先调配连续的pH梯度，然后使蛋白质在电场作用下泳
动到等于各自等电点的pH值区域，从而形成具有不同等电点的pH值
区域，从而形成具有不同等电点的蛋白质区带;
c) 根据建立pH梯度的原理不同，梯度又分为载体两性电解质梯度(Carrier
ampholytes pH gradient)和固相梯度。
6、什么是二维电泳,
同时利用分子尺寸和等电点这两种性质的差别进行蛋白质等生物大分子的分离，即将普通的凝胶电泳和等电聚焦相结合，使溶质在二维平面上得到分离。 第一相 等电聚焦 第二相 SDS,PAGE
7、逆向作用色谱电泳的原理是什么,
1) 凝胶柱分为上下两层;
2) 利用填充两层具有不同排阻极限的凝胶过滤介质的色谱柱为电泳场; 3) 溶质的电泳速度方向与流动相的流向相反;上层色谱速度RF,T大于下层色
谱速度RF,B，电泳速度为RE
4) 在上层凝胶柱中，目标溶质的净速度RN,T= RF,T- RE ,下层中的净速度
RN,B= RF,B- RE ,方向相反;
5) 当RN,T=- RN,B时，目标溶质在两层凝胶柱的交界处所受作用力达到动态平
衡，从而积聚在界面处，产生界面聚焦现象，实现目标溶质的浓缩; 6) 由于其它溶质的电泳迁移率以及在上下凝胶柱的色谱速度与目标溶质不同，
不能在同一界面聚焦，从而实现目标溶质的浓缩和纯化
8、毛细管电泳的原理及特点
1) 分离原理
a) 在电场中，毛细管内的电解质溶质因其荷电性质而发生电泳;
b) 同时，在溶液中，石英毛细管内表面的硅羟基解离而带负电荷，诱导管
内产生电渗流(EOF);
c) 溶质的移动速度是电渗流和电泳的综合结果。
9、连续电泳的工作原理
范文五：分离富集思考题
第10章分析化学中常用的分离和富集方法
【思考题解答】
1. 在分析化学中，为什么要进行分离富集？分离时对常量和微量组分的回收率要求如何？ 答：在定量分析，对于一些无法通过控制分析条件或采用掩蔽法来消除干扰，以及现有分析方法灵敏度达不到要求的低浓度组分测定，必须采用分离富集方法。换句话说，分离方法在定量分析中可以达到消除干扰和富集效果，保证分析结果的准确性，扩大分析应用范围。 在一般情况下，对常量组分的回收率要求大于99.9%，而对于微量组分的回收率要求大于99%。样品组分含量越低，对回收率要求也降低。
2．常用哪些方法进行氢氧化物沉淀分离？举例说明。
答：在氢氧化物沉淀分离中，沉淀的形成与溶液中的[OH-]有直接关系。因此，采用控制溶液中酸度可使某些金属离子彼此分离。在实际工作中，通常采用不同的氢氧化物沉淀剂控制氢氧化物沉淀分离方法。常用的沉淀剂有：
a. 氢氧化钠：NaOH 是强碱，用于分离两性元素（如Al3+，Zn2+，Cr3+）与非两性元素，两性元素的含氧酸阴离子形态在溶液中，而其他非两性元素则生成氢氧化物胶状沉淀。
b. 氨水法：采用NH4Cl-NH3缓冲溶液（pH8-9），可使高价金属离子与大部分一、二金属离子分离。
c. 有机碱法：可形成不同pH 的缓冲体系控制分离，如pH5-6六亚甲基胺-HCl 缓冲液，常用于Mn2，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Cd2+与Al3+，Fe3+，Ti （IV ）等的分离。
d. ZnO 悬浊液法等：这一类悬浊液可控制溶液的pH 值，如ZnO 悬浊液的pH 值约为6，可用于某些氢氧化物沉淀分离。
3. 某矿样溶液含有等离子，加入NH4Cl 和氨水后，哪些离子以什么形式存在于沉淀中？哪些离子以什么形式存在于溶液中？分离是否完全？
答：NH4Cl 与NH3构成缓冲液，pH 在8-9间，因此溶液中有Ca2+，Mg2+，Cu （NH3）42-、Zn （NH3）42+等离子和少量Mn2+，而沉淀中有Fe （OH ）3，Al （OH ）3和Cr （OH ）3和少量Mn （OH ）2沉淀。试液中Fe3+，A13+，Cr3+可以与Ca2+，Mg2+，Cu2+和Zn2+等离子完全分开，而Mn2+分离不完全。
4．如将上述矿样用Na2O2熔融，以水取，其分离情况又如何？
答：Na2O2即是强碱又是氧化剂，Cr3+、Mn2+分别被氧化成CrO42-和MnO4-。因此溶液有AlO22-，ZnO22-，MnO4-和CrO42-和少量Ca2+，在沉淀中有：Fe(OH)3，Mg(OH)2和Cu(OH)2和少量Ca(OH)2或CaCO3沉淀。Ca2+将分离不完全。
5．某试样含Fe, Al, Ca, Mg, Ti元素，经碱熔融后，用水取，盐酸酸化，加氨水中和至出现红棕色沉淀(pH=3)，再加入六亚甲基四胺，加热过滤，获得沉淀和滤液。试问
a. 为什么溶液中刚出现红棕色沉淀时，表示pH 为3左右？
b. 过滤后得到的沉淀是什么？滤液又是什么？
c. 试样中若含和，它们是在沉淀中还是在滤液中？
答： a 溶液中出现红棕色沉淀应是Fe(OH)3，沉淀时的pH 应在3左右。（当人眼看到红棕色沉淀时，已有部分Fe(OH)3析出，pH 值稍大于Fe3+开始沉淀的理论值）。b 过滤后得的沉淀应是TiO(OH)2、Fe(OH)3 和Al(OH)3；滤液是Ca2+，Mg2+离子溶液。c 试样中若含Zn2+和Mn2+，它们应以Zn2+和MnO4-离子形式存在于滤液中。
6．采取无机沉淀剂，怎样从铜和金的试液中分离出微量？
答：采用NH4Cl- NH3缓冲液，pH8-9，采用Al(OH)3共沉淀剂可以从铜合金试液中氢氧化物共沉淀法分离出微量Fe3+。
7．采取氢氧化物沉淀分离，常有共沉淀现象，怎样可以减少沉淀对其他组分的吸附？ 答：加入大量无干扰的电解质，可以减少沉淀对其他组分的吸附。
8．共沉淀富集痕量组分时，对共沉淀剂有什么要求？有机共沉淀剂较无机共沉淀剂有何优点？
答：对共沉淀剂的要求主要有：一是对富集的微量组分的回收率要高（即富集效率大）；二是不干扰富集组分的测定或者干扰容易消除（即不影响后续测定）。
有机共沉淀剂较无机共沉淀剂的主要优点：一是选择性高；二是有机共沉淀剂除去（如灼烧）；三是富集效果较好。
9．何谓分配系数、分配比？萃取率与哪些因素有关？采用什么措施可提高萃取率？
答：分配系数：是溶质在两相中型体相同组分的浓度比（严格说应为活度比）。而分配比：是溶质在两相中的总浓度之比。在给定的温度下，KD 是一个常数。但D 除了与KD 有关外，还与溶液酸度、溶质浓度等因素有关，它是一个条件常数。在分析化学中，人们更多关注分离组分的总量而较少考虑其形态分布，因此通常使用分配比。
萃取率：，可见萃取率与分配比（即溶质性质和萃取体系）和相比有关，但组分含量无关。 提高萃取率有两个重要途径：一是采用（少量有机溶剂）多次萃取；二是采用协同萃取。
10．为什么在进行和萃取时，溶液酸度的控制显得很重要？
答：对于萃取反应，其平衡常数为
由上式可见，金属离子的分配比取决于Kex 、螫合剂浓度及溶液的酸度。因此，在选择萃取条件时，应注意选择合适的螫合剂、溶液酸度应控制在较低的酸度下、萃取溶剂的选择及干扰离子的消除等。在萃取过程中，溶液的酸度越小，则被萃取的物质分配比越大，越有利于萃取，但酸度过低则可能引起金属离子的水解，或其他干扰反应发生，应根据不同的金属离子控制适宜的酸度。
11．用硫酸钡重量法则定硫酸根时，大量Fe3+会产生共沉淀。试问当分析硫铁矿(FeS)中的硫时，如果用硫酸钡重量法进行测定，用什么方法可以消除Fe3+的干扰?
答：将试液流过强酸型阳离子交换树脂过柱除去Fe3+，流出液再加入沉淀剂测定硫酸根。
12．离子交换树脂分几类，各有什么特点？什么是离子交换树脂的交联度、交换容量？ 答：通常离子交换树脂按性能通常分为三类：
a) 阳离子交换树脂，用于分离阳离子，又分为强酸型阳离子交换树脂和弱酸型阳离子交换树脂。前者可在酸性中型和碱性溶液中使用，而后者不宜在酸性溶液中使用。
b) 阴离子交换树脂，用于分离阴离子，又分为强碱性阴离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂两种。前者可在酸性中型和碱性溶液中使用，而后者不宜在碱性溶液中使用。 c) 螯合树脂。选择性地交换某些金属离子。
交联度指交联剂在树脂中质量百分率，其大小与树脂性能有关。交联度一般在4-14%之间。交联度小，树脂网眼大，溶胀性大，刚性差。
交换容量是指每克干树脂所能交换的物质量（mmol ），它决定于树脂内所含活性基团的数目，一般为3-6mmol-g-1。
13．几种色谱分离方法（纸上色谱、薄层色谱及反相分配色谱）的固定相和分离机理有何不同？
答：1) 纸上色谱分离法以滤纸为固定相，是根据不同物质在两相间的分配比不同而进行分离的。通常用比移值(Rf)来衡量各组分的分离情况
2) 薄层色谱分离法是将涂有吸附剂的薄层板作固定相，有机溶剂作流动相(展开剂) ，根据不同物质在两相间的分配比不同而进行分离的。与纸色谱一样，也是用比移值(Rf)来衡量各组分的分离情况。
3) 反向分配色谱分离法
反向分配色谱分离法是用有机相作固定相，水相为流动相的萃取色谱分离法。它将吸着有机萃取剂的惰性载体填充在柱子里，加入洗脱剂后，各组分在两相中的分配不同而达到分离。反向分配色谱分离法将液-液萃取的高选择性与色谱过程的高效性结合在一起，大大提高了分离效果。
14．以和纸上色谱分离为例说明展开剂对各组分的选择。
答：纸色谱的展开剂应对分离组分有一定的溶解度和不同的分配能力。展开剂的组成和极性对比移值和分离选择性均有较大的影响。
参见课本P290矿石中的Nb 和Ta 分离测定：试样用HF-HCl-HNO3分解后，使Nb(Ⅴ) 和Ta(Ⅴ) 以NbF72-和Ta F72-的形式存在。采用20×26cm2的滤纸，丁酮-HF （6：1）展开剂。展开2h 后，Nb(Ⅴ) 在前，Ta(Ⅴ) 在后。分离机理是丁酮质子化后，与NbF72-或Ta F72-形成离子对在流动相和固定相间进行多次分配。HF 的作用是提供H+和抑制NbF72-和Ta F72-的离解。
15．如何进行薄层色谱和纸色谱的定量测定？
答：薄层色谱的定量测定有直接测定或将样斑刮下后提取溶液测定两种方式。直接测定又分为：
a) 比较斑点面积定量法：与标准溶液斑点对照样品斑点大小和颜色深浅，只能达到半定量分析。
b) 稀释定量法：用标准溶液、稀释一定倍数的标准溶液和样品溶液等体积点样在同一块板上，展开显色后进行斑点面积测量。样品含量计算公式为：
式中A 、As 和Asd 分别为样品、标准溶液和稀释标准溶液的斑点面积，d 为稀释倍数的倒数。 c) 薄层扫描法：使用薄层色谱扫描仪对薄层上被分离物质斑点进行光吸收或荧光测定的直接定量法。
16．用气浮分离法富集痕量金属离子有什么优点？为什么要加入表面活性剂？
答：用气浮分离法富集痕量金属离子具有分离速度快、富集倍数大和操作简便等优点，特别适用于大量的极稀溶液(10-7--10-15mol/ L) 金属离子的分离富集。对于共沉淀分离中不易过滤或离心分离的胶状、絮状沉淀，对于离子对溶剂萃取分离中经常遇到的分层费时、两液界面不清晰等分离难题, 改用适当的浮选分离可以较好地解决。
在浮选过程中，表面活性剂可改变被浮选物的表面性质和稳定气泡，它直接影响着浮选分离的成败。但表面活性剂的用量不宜超过临界胶束浓度（CMC ）。表面活性剂非极性部分链长度增加，会使它在气泡上的吸附增加，从而提高分离效果。一般说来，碳链越长浮选效果越好；但太长时泡沫的稳定性增大，浮选平衡时间增长，反而对浮选不利。碳链太短则表面活性下降，泡沫不稳定，使浮选率下降。碳链的碳原子数以14 ~ 18为宜。
17．若用浮选分离富集水中的痕量CrO42-，可采用哪些途径？
答：一是采用离子浮选法：在试液中加入溴化十六烷基三甲胺(CTMAB)为表面活性剂浮选。二是沉淀浮选：在试液中加入Al(OH)3沉淀剂和油酸钠表面活性剂，控制pH~7浮选。
18．固相微萃取分离法、超临界萃取分离法、液膜分离法及微波萃取分离法的分离机理有何不同？
答：固相微萃取分离法、超临界萃取分离法、液膜分离法及微波萃取分离法是一些新型的分离技术。
固相微萃取(SPME)是一种无需有机溶剂、简便快速，集" 采样、萃取、浓缩、进样" 于一体，能够与气相色谱或高效液相色谱仪连用样品前处理技术。适用于气体、水样、生物样品（如血、尿、体液等）的萃取提取。其分离原理是溶质在高分子固定液膜和水溶液间达到分配平衡后分离。
超临界流体具有类似于气体的较强穿透能力和类似于液体的较大密度和溶解度。超临界萃取分离法（SFE ）是基于分离组分溶解度及其与超临界流体分子间作用力的差别，当超临
界溶剂流过样品时，使分离组分与样品基体分离。由于超临界流体不仅有好的溶剂化能力，比液体有更大的扩散系数，而且它的表面张力几乎接近零，即它较容易渗透到一些固体的孔隙里，以使分离效率和速度大为提高。值得一提的是，90 % 的SFE 采用CO2流体，因此避免了有害溶剂对环境的严重污染。SFE 已逐步作为替代有害溶剂萃取法的标准方法。
在液膜分离过程中, 组分主要是依靠在互不相溶的两相间的选择性渗透、化学反应、萃取和吸附等机理而进行分离。这时欲分离组分从膜外相透过液膜进入内相而富集起来。这一过程实际上是" 在膜的两侧界面同时进行萃取和反萃取操作, 液膜选择性地输送欲分离物质" 。 微波萃取分离法是利用微波能强化溶剂萃取的效率，使固体或半固体试样中的某些有机物成分与基体有效地分离。微波实际上是一种内部加热方式，微波萃取需要在特定的密闭容器中进行。
19．试述毛细管电泳分离法的分离机理？它的应用如何？
答：毛细管电泳，又称高效毛细管电泳（HPCE ），统指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中个组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。
由于毛细管电泳具有高效、快速、样品量极少等特点，它广泛用于分子生物学、医学、药学、材料学以及与化学有关的化工、环境保护、食品饮料等各个领域，从无机小分子到生物大分子，从带电离子到中性化合物都可以进行分离分析。
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