探究铜绿的性质备课

范文一：探究铜绿的性质备课

探究铜绿的性质备课实验目的:探究铜绿的性质

实验用品:(略)

实验过程及现象记录:

(1)观察铜绿的颜色和状态等物理性质:铜绿是绿色固体

(2)将铜绿粉末用药匙或纸槽分别加到两支试管中;

(3)用胶头滴管向一支试管中逐滴滴加稀盐酸，观察到铜绿溶解，溶液呈蓝绿色，同时有大量气泡产生;

(4)将另一支试管在酒精灯的外焰上加热(注意:加热时要先均匀加热后重点 )，一段时间后，观察到绿色粉末逐渐变成黑色，试管口有水滴水滴出( 结论:

铜绿具有的化学性质是

(?)能与盐酸反应;

(?)加热会分解

实验探究:

查阅资料得知:铜绿在加热时还会产生二氧化碳气体(又:二氧化碳气体能使澄清石灰水变浑浊)，请帮他设计一个实验证明在加热过程中二氧化碳气体的存在(考点:实验探究物质的性质或变化规律(专题:综合实验题(分析:铜绿是初中化学中一种常见绿色粉末状物质，受热可分解出氧化铜、二氧化碳和水，与稀盐酸发生复分解反应，生成氯化铜(蓝色溶液)、水和二氧化碳(取用粉末状药品使用药匙或纸槽，对药品加热时使用酒精灯外焰，先预热再重点加热(使用泡沫石灰水检验二氧化碳(解答:解:(1)铜绿为铜生锈所形成的一种绿色物质，故称铜绿(

故答:绿色固体

(2)取用粉末状药品需要使用药匙，若药匙不能伸入试管中，需要使用纸槽( 故答:药匙或纸槽

(3)滴加少量液体药品时要用胶头滴管;铜绿与稀盐酸反应生成氯化铜溶液呈蓝色并放出气体二氧化碳(

故答:胶头滴管，溶解，蓝绿，大量气泡

(4)对固体药品加热时要先预热，然后用外焰对药品集中部位重点加热; 铜绿受热分解出黑色氧化铜和水，同时放出气体二氧化碳(

故答:外，均匀，重点，黑，水滴

化学性质是指物质在化学变化中表现出来的性质，铜绿遇盐酸可放出气体，受热可分解( 故答:(?)能与盐酸反应;(?)加热会分解;

检验二氧化碳的方法是将气体通入澄清石灰水，石灰水变浑浊(

故答:将加热时产生的气体通入澄清石灰水中，观察其是否变浑浊(点评:本题为基本操作考查，主要考查学生的化学基础知识(要耐心细致(

范文二：铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究

铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究

摘要:【目的】通过构建毕赤酵母工程菌株～以期获得重组海藻酸裂解酶～并对其性质加以研究。【方法】采用PCR的方法～以铜绿假单胞菌,Pseudomonas aeruginosa,基因组DNA 为模板～克隆出约1.0kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列～并将其插入巴斯德毕赤酵母,Pichia pastoris,表达载体pPIC9K中～获得重组质粒pPIC9K-algL。重组质粒线性化后用聚乙二醇,PEG,法导入毕赤酵母菌株GS115中表达。【结果】用甲醇

-1诱导培养基进行摇瓶发酵～表达得到40 kD的目的蛋白～酶活力达540 U?ml左右。经测定～该重组酶的最适反应

-12+2+pH为8.5～最适反应温度为40?～并且在20，45?～pH 3.0，12.0具有较好的稳定性。50 mmol?L的Co和Ca

2+2+2+对酶活力均有显著的促进作用～Zn、Cu和Fe在不同浓度下对酶活力均有不同程度的抑制作用。在重组酶的辅助作用下～抗生素的抑菌效果明显提高。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源海藻酸裂解酶～为其今后在工农业中的应用奠定了基础。

关键词:海藻酸裂解酶,毕赤酵母,海藻寡糖,诱导表达

收稿日期:2006-12-18;接受日期:2007-12-19 基金项目:国家“973”计划课题(2004CB117500)、国家“863”计划课题(2005AA246010)和国际科技合作重点项目计划课题(2005DFA31070)联合资助作者简介:岳明(1982-)，男，河北石家庄人，博士研究生，研究方向饲料生物技术。Tel:010-62133407;E-mail:rockyueming@yahoo.com. cn。通讯作者丁宏标(1966-)，男，江苏盐城人，研究员，博士，研究方向饲料生物技术。Tel:010-62139742;E-mail:dinghongbiao@mail.caas.net.cn

2 中国农业科学 41卷

Expression of Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL)

in Pichia pastoris and Characterization of the Enzyme

Abstract: 【Objective】The purpose was to clone and express alginate lyase gene (algL) of Pseudomonas aeruginosa in Pichia

pastoris expression system. 【Method】Alginate lyase gene of P. aeruginosa was amplified and inserted into pPIC9K expression vector by adding EcoR I site to generate recombinant pPIC9K-algL construct. The positive construct was transformed to Pichia

pastoris GS115 cells by PEG method. The AlgL protein was over-produced in P. pastoris induced by methanol. 【Result】 The -1product of recombinant alginate lyase showed a molecular weight of 40 kD on SDS-PAGE with activity of 540 U?ml at an optimal

temperature 40? and pH 8.5, respectively. The recombinant AlgL was stable below 45? between pH 3.0 and 12.0. The 2+2+2+2+2+ recombinant AlgL was sensitive to some metal cations negatively including Zn, Cu and Fe, but Co and Capromoted it

dramatically. The sterilization of ampicilin and kanamycin on P. aeruginosa increased with the help of AlgL. 【Conclusion】P.

pastoris expression system is an efficient way of production of AlgL. The recombinant AlgL has potency as feed additive and

antibiotic assistant.

Key words: Alginate lyase; Pichia pastoris; Alga oligosaccharides; Induction expression

4期岳明等:铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究 1193

1.1.1 菌株和质粒铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)，引言购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心

【研究意义】海藻酸盐(alginate)是广泛存在于(CGMCC 1.1785);大肠杆菌(E. coli)DH5α菌株大型海藻细胞壁中和某些细菌胞外的黏性多糖。它的由本室保存;毕赤酵母(P. Pastoris)GS115和pPIC9K存在对以海藻为饲料的动物体内形成了一种抗营养因分泌型表达载体购自Invitrogen公司;质粒pGEM-T 子，影响了海藻细胞内营养物质的释放，降低了饲料Vector购自Promega公司。

利用率。另外，海藻酸盐有助于致病铜绿假单胞菌1.1.2 酶和试剂限制性内切酶、T4 DNA、X-Gal

[1,2](Pseudomonas aeruginosa)在病灶部位定殖，影连接酶为TaKaRa公司产品; DNA聚合酶购自响抗生素的扩散和杀菌效果，使铜绿假单胞菌具有较Tiangen公司; G418购自Invitrogen公司;海藻酸钠、

[3,4]高的抗药性。铜绿假单胞菌在产生海藻酸盐的生理葡萄糖醛酸为Sigma公司产品;氨苄青霉素和卡那霉后期能产生一种海藻酸盐裂解酶(alginate lyase，素为Amresco产品;其它化学试剂为国产和进口分析 AlgL)，可催化海藻酸盐β-D-甘露糖醛酸单体间1，纯试剂。

[5,6]4-糖苷键断裂，生成寡聚糖醛酸，降低细菌的黏附1.1.3 培养基 LB 培养基见文献[23]，YPD、RDB、能力，从而结束其生命周期。海藻饲料中的海藻酸盐MM、MD、BMGY、BMMY培养基见Invitrogen公司经海藻酸裂解酶降解后，胞内的营养物可被充分质释毕赤酵母操作手册。

放出来，利于动物消化吸收，所产生的海藻寡糖还具1.2 试验方法

有改善动物胃肠道微生态环境等活性。因此，海藻酸algL基因成熟蛋白编码序列的1.2.1 铜绿假单胞菌

裂解酶的生产研究对饲料资源与医药开发具有一定的克隆参照文献[23]方法从铜绿假单胞菌中提取基因

[7~9][18]理论与现实意义。【前人研究进展】一些微生物组DNA。根据GenBank No. U27829序列，以algL

[10~13]和海洋动植物都可以产生海藻酸裂解酶，早期海基因信号肽编码序列后第一个核苷酸到全基因终止密

[5,14]藻酸裂解酶主要由天然菌株培养提取。随着基因码子序列(1 023 bp)设计PCR扩增引物，上游引物工程技术的发展，一些物种海藻酸裂解酶基因被克隆序列为5' CGAATTCGCCGACCT GGTACCCCCGCC

[15~17][18][19]和表达。Boyd等和Neal等先后于1993年CGGCTACTA 3'，下游引物序列为5' CGAATTCGCC 首次克隆了铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶的编码基因CGCTTCCCGCCACGCCCTCAAC TTC 3'，其中上、algL并在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达，下游引物中都引入EcoR ?限制性酶切位点(如下划证明了它与其它海藻酸代谢相关基因(algD-8-44-K- 线所示)。以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，进E-G-X-L-I-J-F-A)位于染色体上同一基因簇中，在海藻行PCR反应，体系为50 μl:含有约50 ng铜绿假单胞

[20]-1酸代谢过程中起重要作用。【本研究切入点】原始菌基因组DNA 1.5 μl，总浓度10 mmol?L dNTP 4 μl，

-1菌株产酶量非常有限，提取纯化成本高昂，而在大肠10 mmol?L的上下游引物各1 μl，10×PCR反应缓冲

-1杆菌中表达海藻酸裂解酶基因，易受原核表达系统自液5 μl，5 U?μl pfu DNA聚合酶0.5 μl，ddHO 37 μl。2身局限性的限制，影响产量与活性。巴斯德毕赤酵母反应条件为:94?预变性5 min后，94?变性50 s，(Pichia pastoris)作为一种分泌型真核表达系统，表58?退火50 s，72?延伸1 min，进行30个循环，最

[21,22]达水平高，纯化过程简单，生产成本低，可作为后延伸5 min，反应结束后加入Taq DNA聚合酶与一种高效生产海藻酸裂解酶的手段。【拟解决的关键dATP 72?反应20 min，以使平末端带有成为A突出问题】本研究利用基因工程技术克隆了铜绿假单胞菌的黏性末端。

PCR扩增产物经胶回收纯化后，连接到pGEM-T algL基因，将其导入巴斯德毕赤酵母并进行诱导表达，

旨在获得一种高效生产海藻酸裂解酶的新途径，进而Vector上，转化大肠杆菌DH5,，通过蓝白斑筛选获对表达产物性质以及作为抗生素辅助剂的作用效果进得阳性克隆，并进行测序鉴定。行探究。 1.2.2 毕赤酵母重组表达载体的构建鉴定正确的

pGEM-algL经EcoR?酶切处理，将切下的algL基因1 材料与方法成熟蛋白编码序列插入同样酶切处理的毕赤酵母表达1.1 实验材料载体pPIC9K中，使其位于α-因子信号肽序列的下游，

1194 中国农业科学 41卷利用PCR鉴定出正向插入的克隆，并对该质粒进行进藻酸钠水解生成1 μg葡糖醛酸的酶量定义为一个海一步限制性酶切及测序鉴定。藻酸裂解酶活力单位(U)。

1.2.3 毕赤酵母的聚乙二醇,PEG,法转化接毕赤1.2.6 重组海藻酸裂解酶最适反应条件及稳定性测酵母菌株GS115单菌落于10 ml YPD中30?，250,定表达产物经Millipore离心过滤脱盐后，在40?不300 r/min培养至OD为0.6,1.0，离心收集菌体，同pH条件下测定重组海藻酸裂解酶的活力;将重组600

用10 ml Solution ?(见Invitrogen公司毕赤酵母操作海藻酸裂解酶液在不同pH值的缓冲液中40?保温30 手册)重悬细胞，离心收集菌体，用1 ml Solution ?min，检测剩余的酶活力(以最适反应pH下酶活力为重悬细胞，此时酵母细胞处于感受态，取80 μl上述100%)。

菌液，加入3 μg经限制性内切酶Bgl?线性化的重组将表达产物在pH 8.0不同温度下测定重组海藻酸质粒pPIC9K-algL，加入1 ml Solution ?，充分混匀，裂解酶的酶活力;将重组海藻酸裂解酶液在pH 8.0不30?水浴1 h，其中每15 min旋涡震荡，42?水浴10 同温度下分别保温30 min，检测剩余的酶活力(以最min，4 000 r/min离心收集菌体，加入1 ml Solution ?，适反应温度下酶活力为100%)。

-1离心去上清，最后加入100,150 μl Solution ?，重悬的CoCl?6HO、MnSO?HO、配制0.1 mol?L2242细胞，菌液涂布于固体RDB平板上，30?培养2,4 dCaCl、KCl、NaCl、CuSO、FeSO?7HO、ZnCl、24422直至转化子出现。 MgSO溶液，将酶液与上述溶液混合(使终浓度分别4-11.2.4 重组毕赤酵母的筛选和鉴定用灭菌牙签挑为1、10和50 mmol?L)后在40?保温30 min，测取RDB平板上的转化子分别点种到MM、MD和含定酶活力，以未与盐溶液混合，在40?保温30 min

-1600 μg?ml G418的YPD平板上，30?培养。在MD的酶液活力为100%。

上生长正常而在MM上生长缓慢或不生长的转化子为1.2.7 重组海藻酸裂解酶酶解产物TLC分析与对铜甲醇利用慢型;在含G418的YPD平板上生长正常的绿假单胞菌耐药性的影响将1 ml 1%的海藻酸钠底为多拷贝转化子。物与500 μl酶液混和，在40?下保温6 h，使之充分

毕赤酵母基因组DNA的提取参照Invitrogen公司反应。将反应混和物煮沸灭活后，在展开剂(正丁毕赤酵母操作手册。以毕赤酵母基因组DNA为模板，醇:甲酸:水,4:6:1)中进行薄层层析，凉干后，利用目的基因特异性引物(序列见1.2.1)进行PCR均匀喷上显色剂(甲醇:硫酸,4:1)，100?显色5 反应，以确定外源基因的整合情况。 min。

1.2.5 重组海藻酸裂解酶的诱导表达与活力检测将重组酶、抗生素分别或混和(使抗生素终浓度将转化子接种于含3 ml BMGY培养基中的12 ml离心相同)点于铜绿假单胞菌生长平板(含OD0.6菌液600管中，30? 220 r/min摇床培养48 h。离心收集菌体，100 μl)上，对比氨苄青霉素和卡那霉素的抑菌效果

[26]用3 ml BMMY诱导培养基重悬菌体，30?220 r/min变化。

继续培养，每24 h补加甲醇至终浓度1.0%。每24 h2 结果与分析取样，将培养液于6 000 r/min离心5 min，收集上清

酶液，用于初步定性测定酶活力，以确定产酶菌株。2.1 铜绿假单胞菌algL基因成熟蛋白编码序列的克将产酶菌株重新接种于50 ml培养基中用于性质研究隆及毕赤酵母表达载体的构建

[24]和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，扩增出1.0

[25]采用3，5-二硝基水杨酸法测定酶活力。每24 hkb左右的 algL基因成熟蛋白编码序列，插入到毕赤取甲醇诱导的产酶菌株酶液100 μl与100 μl 1%褐藻酵母表达载体pPIC9K中后，测序结果表明插入片段酸钠溶液(pH 7. 0的1/15N的磷酸缓冲液配制)于试在pPIC9K中有正确的阅读框，表达载体pPIC9K-algL管中混匀，同时以100 μl 蒸馏水替代酶液做空白对照构建成功。

试验。置于40?水浴反应10 min，冷却，加入3，5-2.2 重组毕赤酵母的筛选和鉴定二硝基水杨酸显色剂600 μl，再沸水浴10 min显色，通过在MM和MD培养基上的培养，得到的转化

4期岳明等:铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究 1195 基因成熟蛋白编码序列已插入到毕赤酵母的基因组中

(图1)，保证了基因的稳定遗传。

2.3 重组海藻酸裂解酶的诱导表达与活力检测

将初筛有酶活的菌株在诱导培养基中进行表达，

每24 h测酶活力，筛选出一株酶活力最高的毕赤酵母

重组工程菌，酶的活力在诱导培养120,144 h达到高

-1峰(图2)，峰值为540 U?ml左右。SDS-PAGE分析

结果表明(图3)，表达产物分子量约为40 kD。

2.4 重组海藻酸裂解酶最适反应条件及稳定性测定

在不同pH反应条件下测定重组海藻酸裂解酶的

1-6. 甲醇诱导24, 48, 72, 96, 120和 144小时重组AlgL产物; 7. 蛋白质活力，测得该酶最适pH为8.5左右，并在pH 4.0,12.0分子量标准; 8. 诱导前上清液 1-6. Recombinant AlgL induced within 24, 48, 72, 96, 120, 144 h by 的条件下仍具有60%以上的酶活力。将重组海藻酸裂 methanol; 7. Standard protein molecular weight; 8. Supernatant before induction

图3 不同诱导时间重组海藻酸裂解酶表达量

Fig. 3 SDS-PAGE of expressed AlgL within different induction

times

解酶在不同pH的磷酸缓冲液中40?保温30 min，检

测剩余的酶活力，发现该酶在pH 3.0,12.0的条件下

保温30 min后仍剩余60%以上的酶活力(图4)。

1. 重组酵母基因组PCR扩增产物;2. DL2000分子量标准;3. 原始酵母菌株GS115基因组PCR扩增产物 1. PCR product of recombinant P. pastoris; 2. DL2000 marker; 3. PCR product of P. pastoris GS115

图1 重组毕赤酵母工程菌株的PCR鉴定

Fig. 1 Identifation of recombinant P. pastoris by PCR

图4 pH对重组酶活力的影响及pH稳定性

Fig. 4 Optimum pH and pH stability of the recombinant AlgL

在不同温度条件下测定海藻酸裂解酶的活力，发

现该酶最适反应温度为40?。将重组海藻酸裂解酶的

酶液分别在不同温度下保温30 min，检测剩余的酶活图2 重组毕赤酵母诱导产酶曲线力，结果表明重组海藻酸裂解酶在20,45?的条件下Fig. 2 Curve of recombinant AlgL activity produced by P.

pastoris 保温30 min后仍具有75%以上的酶活力，而在50? 及以上条件下保温30 min酶活下降明显(图5)。

1196 中国农业科学 41卷

1. 葡萄糖醛酸;2，3. 重组酶降解海藻酸钠产物 1. Glucuronic acid; 2, 3. Poduction catalyzed by recombinant AlgL 图5 温度对重组酶活力的影响和热稳定性图7 重组海藻酸裂解酶酶解产物TLC分析 Fig. 5 Optimum temperature and thermolstability of

Fig. 7 TLC of production catalyzed by recombinant AlgL recombinant AlgL

-1在铜绿假单胞菌生长平板上，根据抑菌圈直径大由图6可见，离子浓度为1、10和50 mmol?L-1-1-1小，终浓度分别为20 mg?ml和2 mg?ml的氨苄青霉的盐溶液对酶活力的影响有明显差异:50 mmol?L的

2+2+2+2+++素和卡那霉素与重组酶的混合物的抗菌效果分别提高Mn、Mg、Co、Ca、K和Na对酶活力均有不

-129%和18%，纯酶液不产生抑菌圈(图8)。同程度的促进作用，而在1和10 mmol?L浓度下作用

-12+2+不明显，其中50 mmol?L 的Co和Ca可将酶活力

2+2+2+提高50%以上;Zn、Cu和Fe对酶活力均有抑制

-12+作用，而且浓度越高越明显，其中50 mmol?L的Cu

2+与Fe分别使酶活力丧失了近80%和60%。

a 1. 氨苄西林;2. 重组海藻酸裂解酶与氨苄西林混合物;3. 重组海藻酸裂解酶 b 2. 卡那霉素;2. 重组海藻酸裂解酶与卡那霉素混合物;3. 重组海藻酸裂解酶 a 1. Ampicilin; 2. Blending of ampicilin and recombinant AlgL; 3. Rcombinant AlgL b 1. Kanamycin; 2. Blending of kanamycin and recombinant AlgL; 3. Rcombinant AlgL

图8 重组海藻酸裂解酶对抗生素抗菌效果的影响 Fig. 8 Effect of ampicilin and kanamycin with recombinant AlgL on Pseudomonas aeruginosa 图6 金属离子对重组海藻酸裂解酶活性的影响 Fig. 6 Effect of metallic ions on recombinant AlgL activity

3 讨论

2.5 重组海藻酸裂解酶酶解产物分析及对铜绿假单本试验克隆的是铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶algL胞菌耐药性的影响基因成熟蛋白编码序列，利用DAMAN软件与海藻酸钠经重组海藻酸裂解酶降解，可产生多种GenBank中algL基因序列进行比对，分别与No. 寡糖，其中包括单糖及其它一系列寡糖(图7)，由U27829和L14597序列具有99.71%和99.12,的一致于单糖和其它寡糖的同时产生说明该酶具有外切和内[18,19]性。SDS-PAGE分析结果显示，表达产物分子量切活性。

4期岳明等:铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究 1197

[18]约为40kD，与文献报道的天然酶基本一致。重组

-1References 海藻酸裂解酶活力达540 U?ml左右，远高于近期袁

[24][1] Arnold S B, Susan P, Marcelo C R, Cynthia C N, Fereshteh E, Neal L 兆慧等报道的活力水平。

S. Effects of alginase on the natural history and antibiotic therapy of 本研究利用分泌型毕赤酵母表达系统，可获得较

experimental endocarditis caused by mucoid Pseudomonas 纯的目的蛋白，基本可以排除酵母自身产生蛋白的影

aeruginosa. Infection and Immunity, 1992, 60(10): 3979-3985. 响。另外，通过对重组海藻酸裂解酶酶学性质的初步

[2] Mark T A, Neal L S. Alginate lyase (AlgL) activity is required for 研究，发现该酶的最适反应温度为40?，最适pH为

[5]alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Journal of 8.5左右，均高于Alfred报道，可能与毕赤酵母表

Bacteriology, 2005, 187(11): 3869-3872. 达产物的糖基化有关，并且保证了该重组酶在较宽的

[3] Boyd A , Chakrabarty A M. Role of alginate lyase in cell detachment pH范围下具较高活性和稳定性。本研究中抗生素在重

of Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental 组海藻酸裂解酶辅助作用下，抑菌效果明显提高，这[26]Microbiology, 1994, 60(7): 2355-2359. 与Richard等使用天然酶所得到的结果相近，说明

[4] Jain S, Ohman D E. Role of an alginate lyase for alginate transport in 重组海藻酸裂解酶能够破坏铜绿假单胞菌细胞的保护

mucoid Pseudomonas aeruginosa. Infection and Immunity, 2005, 层，使抗生素较易进入细菌细胞发挥杀灭作用，降低

73(10): 6429-6436. 了细菌的抗药性与药物施用剂量。

[5] Alfred L, Leigh R E. Isolation and characterization of an alginase 不同生物来源的海藻酸裂解酶具不同的底物专一

from mucoid strains of Pseudomonas aeruginosa. Journal of 性，本试验以多聚甘露糖醛酸(M)海藻酸钠作为酶

Bacteriology, 1984, 159(3): 958-964. 解底物，但在对不同具体天然底物作用时，可能会产

[6] Monday S R, Schiller N L. Alginate synthesis in Pseudomonas 生不同结构与功能活性的的海藻寡糖:有些海藻寡糖

aeruginosa: the role of AlgL (alginate lyase) and AlgX. Journal of 可以用作养殖动物和鱼虾的能量饲料和黏结剂，还是

Bacteriology, 1996, 178(3): 625-632. 一些植物的免疫刺激因子，可刺激小麦等作物免受真

[7] Helga E, Frode E, Gudmund S, Bernd H A R, Svein V. Biochemical 菌危害，在欧洲已经被用于防治小麦的白粉病、青枯

properties and substrate specificities of a recombinantly produced 病等。鉴于自然界中海藻酸裂解酶与其降解产物的多

[27]Azotobacter vinelandii alginate lyase. Journal of Bacteriology, 1998, 样性，尚需进一步对不同生物来源具有不同酶学特

180(15): 3779-3784. 性的海藻酸裂解酶及酶解产物以深入研究。

[8] Tomoo S, Miwa O, Yoshio E. Novel alginate lyases from marine 海藻是世界上最为丰富的海洋植物资源之一，由

bacterium Alteromonas sp. strain H-4. Carbohydrate Research, 1997, 于人口增多、水资源紧缺、耕地减少，粮食和饲料等

304: 69-76. 优质生物资源需求缺口增大，世界大国日益关注可再

[9] Zhang Z Q, Yu G L, Guan H S, Zhao X, Du Y G, Jiang X L. 生的海洋生物质，日本美国等均投入巨资进行海洋藻

Preparation and structure elucidation of alginate oligosaccharides 类的开发利用研究，“海洋经济”、“生物质经济”

degraded by alginate lyase from Vibro sp. 510. Carbohydrate 已经成为世界性新课题。中国具有占世界30%的海藻

Research, 2004, 339: 1475-1481. 产量，因此，利用基因工程技术，采用酵母生物反应

[10] Shimizu E, Ojima T, Nishita K. cDNA cloning of an alginate lyase 器高效表达海藻酸裂解酶，将海藻转化为优质饲料原

from abalone，Haliotis discus hannai. Carbohydrate Research, 2003, 料，对开发海洋生物质，缓解陆地生物资源紧张，具

338: 2841-2852. 有重大的社会、科学和经济意义。

[11] Favorov V, Vozhova E, Denisenko V, Elyakova L. A study of reaction

4 结论 catalysed by alginate lyase VI from the sea molluse, Littorina sp..

Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 569: 259-266. 利用巴斯德毕赤酵母，高效分泌表达了具有较高

[12] Brown B J, Preston J F III. L-Guluronan-specific alginate lyase from a 活性的海藻酸裂解酶;另外，通过对重组海藻酸裂解

marine bacterium associated with Sargassum. Carbohydrate Research, 酶耐酸碱和耐热性质的研究, 为其在食品, 饲料等工

1991, 211: 91-102. 农业领域的应用提供了依据; 加之其具有提高抗生素

[13] Gacesa P. Enzymic degradation of alginates. The International 杀灭致病菌的作用，也扩展了该重组酶在医药等其它

Journal of Biochemistry, 1992, 24(4): 545-552. 领域的应用。

1198 中国农业科学 41卷 [14] Hansen J B, Doubet R S, Ram J. Alginase enzyme production by 林S H. 蛋白质纯化与鉴定实验指南. 北京: 科学出版社, 1999:

279. Bacillus circulans. Applied and Environmental Microbiology, 1984,

47(4): 704-709. Marshak D R, Kadonaga J T, Burgess R R, Knuth M W, Brennan W A,

[15] Yoon H J, Wataru H, Osamu M, Masako O, Bunzo M, Kousaku M. Lin S H. Strategies for Protein Purification and Characterization: A

Overexpression in Escherichia coli, purification, and characterization Laboratory Course Manual. Beijing: Science Press, 2002: 279. (in

Chinese) of Sphingomonas sp. A1 alginate lyases. Protein Expression and

Purification, 2000, 19: 84-90. [25] 袁兆慧, 韩丽君, 林伟, 韩宝芹. 褐藻酸降解酶的制备及其性质[16] Pecina A, Pascual A, Paneque A. Cloning and expression of the algL 研究. 海洋科学, 2005, 29(2): 78-80.

Yuan Z H, Han L J, Lin W, Han B Q. Preparation of alginase and its gene, encoding the Azotobacter chroococcum alginate lyase:

purification and characterization of the enzyme. Journal of properties. Marine Sciences, 2005, 29(2): 78-80. (in Chinese)

[26] Hatch R A, Schiller N L. Alginate lyase promotes diffusion of Bacteriology, 1999, 181(5): 1409-1414.

[17] Chavagnat F, Duez C, Guinand M, Potin P, Barbeyron T, Henrissat B, aminoglycosides through the extracellular polysaccharide of mucoid

Wallach J, huysen J M. Cloning, sequencing and overexpression in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,

1998, 42(4): 974-977. Escherichia coli of the alginatelyase-encoding aly gene of

[27] Wong T Y, Preston L A, Schiller N L. Alginate lyase: Review of major Pseudomonas alginovora: identification of three classes of alginate

sources and enzyme characteristics, structure-function analysis, lyases. Journal of Biochemistry, 1996, 319: 575-583.

[18] Schiller N L, Monday S R, Boyd C M, Keen N T, Ohman D E. biological roles, and applications. Annual Review Microbiology, 2000,

54: 289-340. Characterization of the Pseudomonas aeruginosa alginate lyase gene

(algL): Cloning, sequencing, and expression in Escherichia coli.

Journal of Bacteriology, 1993, 175(15): 4780-4789. (责任编辑林鉴非) [19] Boyd A, Ghosh M, May T B, Shinaberger D, Koegh R, Chakrabarty A

M. Sequence of the algL gene of Pseudomonas aeruginosa and

purification of its alginate lyase product. Gene, 1993, 131: 1-8.

[20] Antonette R P, Wong T Y, Sletta H, Svein V, Schiller N L. AlgX Is a

periplasmic protein required for alginate biosynthesis in Pseudomonas

aeruginosa. Journal of Bacteriology, 2004, 186(21): 7369-7377.

[21] Gurkan C, Ellar D J. Recombinant production of bacterial toxins and

their derivatives in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.

Microbial Cell Factories, 2005, 4: 33.

[22] Macauley P S, Fazenda M L, McNeil B, Harvey L M. Heterologous

protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast,

2005, 22: 249-270.

[23] 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 D W. 分子克隆实验指南(第3版). 北京:

科学出版社, 2002: 1949.

Sambrook J, Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual

(3rd ed). Beijing: Science Press, 2002: 1949. (in Chinese) [24] 马歇克 D R, 门永 J T, 布格斯 R R, 克努特 M W, 布伦南 W A,

范文三：铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究

铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表

达及其性质研究

中国农业科学2008,4l(4):1192—1198

ScientiaAgriculturaSinica

铜绿假单胞菌a/基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究

岳明,丁宏标,乔宇

(中国农业科学院饲料研究所生态饲料研究室,北京100081)

摘要:【目的】通过构建毕赤酵母工程菌株,以期获得重组海藻酸裂解酶,并对其

性质加以研究.【方法】采

用PCR的方法,以铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)基因组DNA为模板,

克隆出约1.Okb的海藻酸裂解

酶基因的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达载

体pPIC9K中,获得重

组质粒pPIC9K—algL重组质粒线性化后用聚L-’-醇(PEG)法导入毕赤酵母菌株

GS115中表达【结果】用甲醇

诱导培养基进行摇瓶发酵,表达得到40kD的目的蛋白,酶活力达540u.ml左右.

经测定,该重组酶的最适反应

pH为8.5,最适反应温度为40~C,并且在20,45?,pn3.0,12.0具有较好的稳定

性.50mmo1.L的co和ca

对酶活力均有显着的促进作用,Zn,Cu和Fe在不同浓度下对酶活力均有不同程

度的抑制作用.在重组酶的辅

助作用下,抗生素的抑菌效果明显提高.【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外

源海藻酸裂解酶,为其今后在工农

业中的应用奠定了基础.

关键词:海藻酸裂解酶;毕赤酵母;海藻寡糖;诱导表达

ExpressionofPseudomonasaeruginosaAlginateLyaseGene(algL)

inPichiapastorisandCharacterizationoftheEnzyme

YUEMing,DINGHong—biao,QIAOYu

(FeedResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081)

Abstract:[Objective]Thepurposewastocloneandexpressalginatelyasegene(algL)ofPse

udomonasaeruginosainPichia

pastorisexpressionsystem.[Method]AlginatelyasegeneofPaeruginosawasamplifiedan

dinsertedintopPIC9Kexpression

vectorbyaddingEcoRIsitetogeneraterecombinantpPIC9K—algLconstruct.ThepositiveconstructwastransformedtoPichia

pastorisGS115cellsbyPEGmethod.TheAlgLproteinwasover-producedinPpastorisind

ucedbymethano1.

[Result]The

productofrecombinantalginatelyaseshowedamolecularweightof40kDonSDS—PAGE

withactivityof540U.ml一atanoptimal

temperature40~CandpH8.5,respectively.TherecombinantAlgLwasstablebelow45~C

betweenpH3.0and12.0.The

recombinantAIgLwassensitivetoSO[hemetalcationsnegativelyincludingZn.CuandFe.

butCoandCapromotedit

dramatically.ThesterilizationofampicilinandkanamycinonPaeruginosaincreasedwitht

hehelpofAlgL.[Conclusion]P

pastorisexpressionsystemisanefficientwayofproductionofAlgL.

TherecombinantAlgLhaspotencyasfeedadditiveand

antibioticassistant.

Keywords:Alginatelyase;Pichiapastoris;Algaoligosaccharides;Inductionexpression

0引言

【研究意义】海藻酸盐(alginate)是广泛存在于

大型海藻细胞壁中和某些细菌胞外的黏性多糖.它的

存在对以海藻为饲料的动物体内形成了一种抗营养因

子,影响了海藻细胞内营养物质的释放,降低了饲料

利用率.另外,海藻酸盐有助于致病铜绿假单胞菌

(Pseudomonasaeruginosa)在病灶部位定殖[1,21,影

响抗生素的扩散和杀菌效果,使铜绿假单胞菌具有较

高的抗药性钔.铜绿假单胞菌在产生海藻酸盐的生理

收稿日期:2006—12—18;接受日期:2007.12—19

基金项目:国家”973”计划课题(2004CB117500),国家”863”计划课题

(2005AA246010)和国际科技合作重点项目计划课题(2005DFA31070)

联合资助

作者简介:岳明(1982一),男,河北石家庄人,博士研究生,研究方向饲料生物技

术.Tel:010—62133407;E-mail:rockyueming@yahoo.com.cno

通讯作者j宏标(1966一),男,江苏城人,研究员,博士,研究方向饲料生物技

术.Te1:010-62139742;E-mail:dinghongbiao@mail.caas.net.cn

4期岳明等:铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究l193

后期能产生一种海藻酸盐裂解酶(alginatelyase,

AlgL),可催化海藻酸盐B.D.甘露糖醛酸单体问1,

4.糖苷键断裂,生成寡聚糖醛酸I5.6],降低细菌的黏附

能力,从而结束其生命周期.海藻饲料中的海藻酸盐

经海藻酸裂解酶降解后,胞内的营养物可被充分质释

放出来,利于动物消化吸收,所产生的海藻寡糖还具

有改善动物胃肠道微生态环境等活性.因此,海藻酸

裂解酶的生产研究对饲料资源与医药开发具有一定的

理论与现实意义.【前人研究进展】一些微生物[7-9]

和海洋动植物【1o~】都可以产生海藻酸裂解酶,早期海

藻酸裂解酶主要由天然菌株培养提取[5,141.随着基因

工程技术的发展,一些物种海藻酸裂解酶基因被克隆

和表达].Boyd等和Neal等?先后于1993年

首次克隆了铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶的编码基因

algL并在大肠杆菌(Escherichiacoli)中进行了表达,

证明了它与其它海藻酸代谢相关基因(algD一8—44一K-

BG,.)位于染色体上同一基因簇中,在海藻

酸代谢过程中起重要作用f2州.【本研究切入点】原始

菌株产酶量非常有限,提取纯化成本高昂,而在大肠

杆菌中表达海藻酸裂解酶基因,易受原核表达系统自

身局限性的限制,影响产量与活性.巴斯德毕赤酵母

(Pichiapastoris)作为一种分泌型真核表达系统,表

达水平高,纯化过程简单,生产成本低?,可作为

一

种高效生产海藻酸裂解酶的手段.【拟解决的关键

问题】本研究利用基因工程技术克隆了铜绿假单胞菌

algL基因,将其导入巴斯德毕赤酵母并进行诱导表达,

旨在获得一种高效生产海藻酸裂解酶的新途径,进而

对表达产物性质以及作为抗生素辅助剂的作用效果进

行探究.

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌株和质粒铜绿假单胞菌(JP,aeruginosa),

购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心

(cGMcc1.1785);大肠杆菌(Ecoli)DH5a菌株

由本室保存;毕赤酵母(JP.Pastoris)GSll5和pPIC9K

分泌型表达载体购白Invitrogen公司;质粒pGEM.T

Vector购白Promega公司.

1.1.2酶和试剂限制性内切酶,T4DNA,X—Gal

连接酶为TaKaRa公司产品;DNA聚合酶购自

Tiangen公司;G418购自Invitrogen公司;海藻酸钠,

葡萄糖醛酸为Sigma公司产品;氨苄青霉素和卡那霉

素为Amresco产品;其它化学试剂为国产和进口分析

纯试剂.

1.1.3培养基LB培养基见文献[23],YPD,RDB,

MM,MD,BMGY,BMMY培养基见Invitrogen公司

毕赤酵母操作手册.

1.2试验方法

1.2.1铜绿假单胞菌a基因成熟蛋白编码序列的

克隆参照文献[23]方法从铜绿假单胞菌中提取基因

组DNA.根据GenBankNo.U27829序列【1,以algL

基因信号肽编码序列后第一个核苷酸到全基因终止密

码子序列(1023bp)设计PCR扩增引物,上游引物

序列为5’CGAATTCGCCGACCTGGTACCCCCGCC

CGGCTACTA3’,下游引物序列为5’C??卫GCC

CGCTTCCCGCCACGCCCTCAACTTC3’,其中上,

下游引物中都引入EcoRI限制性酶切位点(如下划

线所示).以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,进

行PCR反应,体系为50:含有约50ng铜绿假单胞

菌基因组DNA1.5山,总浓度10mmo1.L,dNTP4pl,

10mmo1.L.的上下游引物各1pl,lOXPCR反应缓冲

液5,5U?pfuDNA聚合酶0.5pl,ddH2037.

反应条件为:94?预变性5min后,94?变性50S,

58?退火50S,72?延伸1min,进行30个循环,最

后延伸5min,反应结束后加入TaqDNA聚合酶与

dATP72?反应20min,以使平末端带有成为A突出

的黏性末端.

PCR扩增产物经胶回收纯化后,连接到pGEM—T

Vector上,转化大肠杆菌DH50c,通过蓝白斑筛选获

得阳性克隆,并进行测序鉴定.

1.2.2毕赤酵母重组表达载体的构建鉴定正确的

pGEM—algL经EcoRI酶切处理,将切下的algL基因

成熟蛋白编码序列插入同样酶切处理的毕赤酵母表达

载体pPIC9K中,使其位于0【.凶予信号肽序列的下游,

利用PCR鉴定出正向插入的克隆,并对该质粒进行进

一

步限制性酶切及测序鉴定.

1.2.3毕赤酵母的聚乙二醇(PEG)法转化接毕赤

酵母菌株GS115单菌落于l0mlYPD中30?,250,

300r/min培养至OD6on为0.6,1.0,离心收集菌体,

用l0mlSolutionI(见Invitrogen公司毕赤酵母操作

手册)重悬细胞,离心收集菌体,用1mlSolutionI

重悬细胞,此时酵母细胞处于感受态,取80u1上述

菌液,加入3经限制性内切酶BglII线性化的重组

质粒pPIC9K.algL,加入1mlSolutionII,充分混匀,

30?水浴1h,其中每15min旋涡震荡,42?水浴l0

min,4000r/min离心收集菌体,加入1mlSolutionIII,

1194中国农业科学41卷

离心去上清,最后加入1O0,150plSolutionIII,重悬

细胞,菌液涂布于固体RDB甲板上,30?培养2,4d

直至转化予出现.

1.2.4重组毕赤酵母的筛选和鉴定用灭菌牙签挑

取RDB平板上的转化子分别点种到MM,MD和含

600Pg.ml0G418的YPD平板上,30~C培养.在MD

上生长正常而在MM上生长缓慢或不生长的转化予为

甲醇利用慢型;在含G418的YPD平板上生长正常的

为多拷贝转化子.

毕赤酵母基因组DNA的提取参照Invitrogen公司

毕赤酵母操作手册.以毕赤酵母基因组DNA为模板,

利用目的基因特异性引物(序列见1-2.1)进行PCR

反应,以确定外源基凶的整合情况.

1.2.5重组海藻酸裂解酶的诱导表达与活力检测

将转化予接种于含3mlBMGY培养基中的l2ml离心

管中,30?220r/min摇床培养48h.离心收集菌体,

用3mlBMMY诱导培养基重悬菌体,30?220r/min

继续培养,每24h补加甲醇至终浓度1.0%.每24h

取样,将培养液于6000r/rain离心5min,收集上清

酶液,用于初步定性测定酶活力,以确定产酶菌株.

将产酶菌株重新接种于50ml培养基中用于性质研究

和SDS.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析曙训.

采用3,5-二硝基水杨酸法测定酶活力l2.每24h

取甲醇诱导的产酶茼株酶液100pl与100pll%褐藻

酸钠溶液(pH7.0的1/15N的磷酸缓冲液配制)于试

管中混匀,同时以100pl蒸馏水替代酶液做空白对照

试验.置于40?水浴反应10rain,冷却,加入3,5.

二硝基水杨酸显色剂600u1,再沸水浴10min显色,

冷却,用蒸馏水定容至5ml,混匀,存550nm下测

定吸光度(用空白调零),OD值越高酶活力越高.

酶活力定义:在一定温度和pH值下,每分钟催化海

藻酸钠水解生成1Pg葡糖醛酸的酶量定义为一个海

藻酸裂解酶活力单位(U).

1.2.6重组海藻酸裂解酶最适反应条件及稳定性测

定表达产物经Millipore离心过滤脱盐后,在40?不

同pH条件下测定重组海藻酸裂解酶的活力;将蕈组

海藻酸裂解酶液在不同pH值的缓冲液中40?保温30

min,检测剩余的酶活力(以最适反应pH下酶活力为

100%).

将表达产物在pH8.0不同温度下测定重组海藻酸

裂解酶的酶活力;将重组海藻酸裂解酶液在pH8.0不

同温度下分别保温30min,检测剩余的酶活力(以最

适反应温度下酶活力为100%).

配制0.1mol?L的CoC12?6H2O,MnSO4.H20,

CaC12,KC1,NaC1,CuS04,FeSO?7H20,ZnC12,

MgSo4溶液,将酶液与上述溶液混合(使终浓度分别

为1,10和50mmo1.L0)后在40?保温3Omin,测

定酶活力,以未与盐溶液混合,在40~C保温30min

的酶液活力为100%.

1.2.7重组海藻酸裂解酶酶解产物TLC分析与对铜

绿假单胞菌耐药性的影响将lml1%的海藻酸钠底

物与500uJ酶液混和,在40~C下保温6h,使之充分

反应.将反应混和物煮沸灭活后,在展开剂(正丁

醇:甲酸:水=4:6:1)中进行薄层层析,凉干后,

均匀喷上显色剂(甲醇:硫酸:4:1),100.C显色5

min.

将重组酶,抗生素分别或混和(使抗生素终浓度

相同)点于铜绿假单胞菌生长平板(含ODoo0.6菌液

100p1)上,对比氨苄青霉素和卡那霉素的抑菌效果

变化.

2结果与分析

2.1铜绿假单胞菌a/基因成熟蛋白编码序列的克

隆及毕赤酵母表达载体的构建

以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,扩增出1.0

kb左右的atgL基因成熟蛋白编码序列,插入到毕赤

酵母表达载体pPIC9K中后,测序结果表明插入片段

在pPIC9K中有正确的阅读框,表达载体pPIC9K.妣

构建成功.

2.2重组毕赤酵母的筛选和鉴定

通过在MM和MD培养基上的培养,得到的转化

子大部分为甲醇利用慢型,并在含有600Pg.mlG418

的YPD平板上获得了多个高拷贝转化予.提取重组工

程菌菌株基因组DNA,进行PCR鉴定,结果表明atgL

基因成熟蛋白编码序列已插入到毕赤酵母的摹凶组中

(图1),保证了基因的稳定遗传.

2.3重组海藻酸裂解酶的诱导表达与活力检测

, 将初筛有酶活的菌株在诱导培养基中进行表达

每24h测酶活力,筛选出一株酶活力最高的毕赤酵母

重组工程菌,酶的活力在诱导培养1204144h达到高

峰(图2),峰值为540U.ml.左右.SDS—PAGE分析

结果表明(图3),表达产物分子量约为40kD.

2.4重组海藻酸裂解酶最适反应条件及稳定性测定

在不同pH反应条件下测定重组海藻酸裂解酶的

活力,测得该酶最适pH为8.5左右,并在pH4.0~12.0

的条件下仍具有60%以上的酶活力.将重组海藻酸裂

4期岳明等:铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究1195

1.O

1.重组酵母基因组PCR扩增产物;2.DL2000分子量标准;3原始酵

母菌株GS115基因组PCR扩增产物

1.PCRproductofrecombinantP.pastoris;2.DL2000marker;3.PCR

productofP.pastorisGS115

图1重组毕赤酵母工程菌株的POR鉴定

Fig.1IdentifationofrecombinantPpastorisbyPCR

,一

;

《

忙

溢

24487296120144168

诱导时间Inductiontime(h)

图2重组毕赤酵母诱导产酶曲线

Fig.2CurveofrecombinantgLactivityproducedbyP

pastoris

234567

97.4

66.2

43.0

解酶在不同pH的磷酸缓冲液中40~C保温30min,检

测剩余的酶活力,发现该酶在pH3.0~12.0的条件下

保温30min后仍剩余60%以上的酶活力(图4).

l2O

1OO

图4pH对重组酶活力的影响及pH稳定性

Fig.4OptimumpHandpHstabilityoftherecombinantAlgL

在不同温度条件下测定海藻酸裂解酶的活力,发

?.将重组海藻酸裂解酶的现该酶最适反应温度为40

酶液分别在不同温度下保温30min,检测剩余的酶活

力,结果表明重组海藻酸裂解酶在20~45?的条件下

保温30min后仍具有75%以上的酶活力,而在50?

及以上条件下保温30min酶活下降明显(图5).

+最适温度一热稳定性

温度Temperature(?)

.?.图5温度对重组酶活力的影响和热稳定性

I-6.甲醇诱导24,48,72,96,120和l44小时重组AlgL产物;7.蛋白质

分子量标准:8.诱导前上清液

1-6.RecombinantAlgLinducedwithin24,48,72,96,120,144hby

methanol;7.Standardproteinmolecularweight;8.Supernatantbefore

induction

图3不同诱导时间重组海藻酸裂解酶表达量

Fig.3SDS—PAGEofexpressedA1withindifferentinduction

times

Fig.5Optimumtemperatureandthermolstabilityof

recombinantAlgL

由图6可见,离子浓度为1,10和50mmo1.L.

的盐溶液对酶活力的影e分别使酶活力丧失了近8o%~060%.

200

—1Tnmo1L’.固10rnmo『L日5()mmolL

图6金属离子对重组海藻酸裂解酶活性的影响

Fig.6EffectofmetallicionsonrecombinantAlgLactivity

2.5重组海藻酸裂解酶酶解产物分析及对铜绿假单

胞菌耐药性的影响

海藻酸钠经重组海藻酸裂解酶降解,可产生多种

寡糖,其中包括单糖及其它一系列寡糖(图7),由

于单糖和其它寡糖的同时产生说明该酶具有外切和内

切活性.

1葡萄糖醛酸;2,3.重组酶降解海藻酸钠产物

1Glucuronicacid;2,3PoductioncatalyzedbyrecombinantAlgL

图7重组海藻酸裂解酶酶解产物TLC分析

Fig.7TLCofproductioncatalyzedbyrecombinantAlgL

在铜绿假单胞菌生长平板上,根据抑菌圈直径大

小,终浓度分别为20mg?ml和2mg.ml.的氨苄青霉

素和卡那霉素与重组酶的混合物的抗菌效果分别提高

29%~D18%,纯酶液不产生抑菌圈(图8).

@?a1.氨苄西林;2.重组海藻酸裂解酶与氨苄西林混合物:3.重组海藻

酸裂解酶

b2.卡那霉素;2重组海藻酸裂解酶与卡那霉素混合物:3.重组海藻

酸裂解酶

a1.Ampicilin;2.BlendingofampicilinandrecombinantAIgL;3.

RcombinantAIgL

b1.Kanamycin;2.BlendingofkanarnycinandrecombinantAIgL;3.

RcombinantAIgL

图8重组海藻酸裂解酶对抗生素抗菌效果的影响

Fig.8Effectofampicilinandkanamycinwithrecombinant

AlgLonPseudomonasaeruginosa

3讨论

本试验克隆的是铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶algL

基因成熟蛋白编码序列,利用DAMAN软件与

GenBank中algL基因序列进行比对,分另0与No.

U27829和L14597序列具有99.71%和99.12的一致

性f1l.sDs—PAGE分析结果显示,表达产物分子量

约为40kD,与文献报道的天然酶基本一致I1.重组

海藻酸裂解酶活力达540U.ml.左右,远高于近期袁

兆慧等报道的活力水平[241.

本研究利用分泌型毕赤酵母表达系统,可获得较

纯的目的蛋白,基本可以排除酵母自身产生蛋白的影

响.另外,通过对重组海藻酸裂解酶酶学性质的初步

研究,发现该酶的最适反应温度为40?,最适pH为

8.5左右,均高于Alfred报道],可能与毕赤酵母表

达产物的糖基化有关,并且保证了该重组酶在较宽的

pH范围下具较高活性和稳定性.本研究中抗生素在重

组海藻酸裂解酶辅助作用下,抑苜效果明显提高,这

与Richard等使用天然酶所得到结果相近[261,说明

重组海藻酸裂解酶能够破坏铜绿假单胞菌细胞的保护

层,使抗生素较易进入细菌细胞发挥杀灭作用,降低

了细菌的抗药性与药物施用剂量.

不同生物来源的海藻酸裂解酶具不同的底物专一

性,本试验以多聚甘露糖醛酸(M)海藻酸钠作为酶

解底物,但在对不同具体天然底物作用时,可能会产

4期岳明等:铜绿假单胞菌a基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究l197

生不同结构与功能活性的的海藻寡糖:有些海藻寡糖

可以用作养殖动物和鱼虾的能量饲料和黏结剂,还是

一

些植物的免疫刺激因子,可刺激小麦等作物免受真

菌危害,在欧洲已经被用于防治小麦的白粉病,青枯

病等.鉴于自然界中海藻酸裂解酶与其降解产物的多

样性[2,尚需进一步对不同生物来源具有不同酶学特

性的海藻酸裂解酶及酶解产物以深入研究.

海藻是世界上最为丰富的海洋植物资源之一,由

于人口增多,水资源紧缺,耕地减少,粮食和饲料等

优质生物资源需求缺口增大,世界大国目益关注可再

生的海洋生物质,日本美国等均投入巨资进行海洋藻

类的开发利用研究,”海洋经济”,”生物质经济”

已经成为世界性新课题.中国具有占世界30%的海藻

产量,因此,利用基因工程技术,采用酵母生物反应

器高效表达海藻酸裂解酶,将海藻转化为优质饲料原

料,对开发海洋生物质,缓解陆地生物资源紧张,具

有重大的社会,科学和经济意义.

4结论

利用巴斯德毕赤酵母,高效分泌表达了具有较高

活性的海藻酸裂解酶;另外,通过对重组海藻酸裂解

酶耐酸碱和耐热性质的研究,为其在食品,饲料等工

农业领域的应用提供了依据;加之其具有提高抗生素

杀灭致病菌的作用,也扩展了该重组酶在医药等其它

领域的应用.

References

[1]ArnoldSB,SusanP,MarceloCR,CynthiaCN,FereshtehE,NealL

S.Effectsofalginaseonthenaturalhistoryandantibiotictherapyof

experimentalendocarditiscausedbymucoidPseudomonas

aeruginosa.InfectionandImmunity,1992,60(10):3979—3985.

[2】MarkTA,NealLS.Alginatelyase(AlgL)activityisrequiredfor

alginatebiosynthesisinPseudomonasaeruginosa.Journalof

Bacteriology,2005,187(11):3869—3872.

[3]BoydA,ChakrabartyAM,Roleofalginatelyaseincelldetachment

ofPseudomonasaeruginosa.AppliedandEnvironmental

Microbiology,1994,60(7):2355—2359.

[4]JainS,OhmanDE.Roleofanalginatelyaseforalginatetransportin

mucoidPseudomonasaeruginosa.InfectionandImmunity,2005,

73(10):6429—6436.

[5】AlfredL,LeighRE.Isolationandcharacterizationofanalginase

frommucoidstrainsofPseudomonasaeruginosa,Journalof

Bacteriology,1984,159(3):958—964.

[6]MondaySR,SchillerNL.AlginatesynthesisinPseudomonas

aeruginosa:theroleofAIgL(alginatelyase)andAIgX.Journalof

Bacteriology,1996,178(3):625-632.

[7】HelgaE,FrodeE,GudmundS,BemdHAR,SveinVBiochemical

propertiesandsubstratespecificitiesofarecombinantlyproduced

Azotobactervinelandiialginatelyase.JournalofBacteriology,1998,

180(151:3779-3784.

[8]TomooS,MiwaO,YoshioE.Novelalginatelyasesfrommarine

bacteriumAlteromonassp.strainH一4.CarbohydrateResearch,1997,

304:69.76

[9]ZhangZQ,YuGL,GuanHS,ZhaoX,DuYGJiangXL.

Preparationandstructureelucidationofalginateoligosaccharides

degradedbyalginatelyasefromI/ibmsp.510.Carbohydrate

Research,2004,339:1475—1481.

[10]ShimizuE,OjimaLNishitaK.cDNAcloningofanalginatelyase

fromabalone,Haliotisdiscushannai.CarbohydrateResearch,2003,

338:2841-2852.

[11]FavorovVVozhovaE,DenisenkoVElyakovaL.Astudyofreaction

catalysedbyalginatelyaseVIfromtheseamollusc,Littorinasp..

BiochimicaetBiophysicaActa,1979,569:259-266.

[12]BrownBJ,PrestonJFIII.L—Guluronan—specificalginatelyasefroma

marinebacteriumassociatedwimSargassum.CarbohydrateResearch.

1991,211:91—102.

[13]GacesaPEnzymicdegradationofalginates.TheInternational

JournalofBiochemistry,1992,24(4):545—552.

[14]Hans~JB,DoubetRS,RamJ.Alginaseenzymeproductionby

Bacilluscirculans.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1984,

47(4):704—709.

[15]YoonHJ,WataruH,OsamuM,MasakoO,BunzoM,KousakuM.

OverexpressioninEscherichiacoli,purification,andcharacterization

ofSphingomonassp.A1alginatelyases.ProteinExpressionand

Purification,2000,19:84-90.

[16]PecinaA,PascualA,PanequeA.Cloningandexpressionofthe口

gene,encodingtheAzotobacterchroococcumalginatelyase:

purificationandcharacterizationoftheenzyme.Journalof

Bacteriology,1999,181(5):1409—1414.

[17]ChavagnatEDuezC,GuinandM,PotinP,BarbeyronHenrissatB,

WallachJ,huysenJM.Cloning,sequencingandoverexpressionin

Escherichiacoliofthealginatelyase—encoding劬geneof

Pseudomonasalginovora:identificationofthreeclassesofalginate

lyases.JournalofBiochemistry,1996,319:575—583.

[18]SchillerNL,MondaySR,BoydCM,KeenNOhmanDE.

CharacterizationofthePseudomonasaeruginosaalginatelyasegene

1l98中国农业科学41卷

(algL):Cloning,sequencing,andexpressioninEscherichiacoli.

JournalofBacteriology,1993,175(15):4780-4789.

[19]BoydA,GhoshM,MayTB,ShinabergerD,KoeghR,ChakrabartyA

MSequenceofthealgtgeneofPseudomonasaeruginosaand

purificationofitsalginatelyaseproduct.Gene,1993,13l:1-8.

【20】AntonetteRWongTSlettaH,SveinV,SchillerNL.ALBXIsa

periplasmicproteinrequiredforalginatebiosynthesisinPseudomonas

7377. aernginosaJournalofBacteriology,2004,186(21):7369—

[21]GurkanC,EllarDJ.Recombinantproductionofbacterialtoxinsand

theirderivativesinthemethylotrophicyeastPichiapastoris.

MicrobialCellFactories,2005,4:33.

[22]MacauleyPS,FazendaML,McNeilB,HarveyLM.Heterologous

proteinproductionusingthePichiapastorisexpressionsystem.Yeast,

2005,22:249—270.

[23]萨姆布鲁克J,拉塞尔D分子克隆实验指南(第3版).北京:

科学出版社,2002:1949.

SambrookJ.RussellDW.MolecularCloning:ALaboratoryManual

(3rded).Beijing:SciencePress,2002:1949.(inChinese)

[24]马歇克DR,门永JL布格斯RR,克努特M,v’布伦南WA,

林sH_蛋白质纯化与鉴定实验指南.北京:科学出版社,1999:

279.

MarshakD&KadonagaJLBurgessRRKnuthMW,BrermanWA,

LinSH.StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:A

LaboratoryCourseManua1.Bering:SciencePress,2002:279(in

Chinese)

[25]袁兆慧,韩丽君,林伟,韩宝芹.褐藻酸降解酶的制各及其性质

研究.海洋科学,2005,29【2):78—80.

YuanZH,HanLJ,Linw,HanBq.Preparationofalginaseandits

properties.MarineSciences,2005,29【2):78—80(inChinese)

[26]HatchRA,SchillerNL.Alginatelyasepromotesdiffusionof

aminoglycosidesthroughtheextracellularpolysaccharideofmucoid

Pseudomonasaeruginosa.AntimicrobialAgentsandChemotherapy,

l998,42(4):974—977.

[27]WongTPrestonLA,SchillerNL.Alginatelyase:Reviewofmajor

sourcesandenzymecharacteristics,structure—functionanalysis,

biologicalroles,andapplications.AnnualReviewMicrobiology,2000,

54:289—340

(责任编辑林鉴非)

范文四：铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究

中国农业科学 2008,41(4):1192-1198

Scientia Agricultura Sinica

铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究

岳明～丁宏标～乔宇

(中国农业科学院饲料研究所生态饲料研究室，北京 100081)

摘要:【目的】通过构建毕赤酵母工程菌株～以期获得重组海藻酸裂解酶～并对其性质加以研究。【方法】采

用PCR的方法～以铜绿假单胞菌,Pseudomonas aeruginosa,基因组DNA 为模板～克隆出约1.0kb的海藻酸裂解

酶基因algL的成熟蛋白编码序列～并将其插入巴斯德毕赤酵母,Pichia pastoris,表达载体pPIC9K中～获得重

组质粒pPIC9K-algL。重组质粒线性化后用聚乙二醇,PEG,法导入毕赤酵母菌株GS115中表达。【结果】用甲醇

-1诱导培养基进行摇瓶发酵～表达得到40 kD的目的蛋白～酶活力达540 U?ml左右。经测定～该重组酶的最适反应

-12+2+pH为8.5～最适反应温度为40?～并且在20，45?～pH 3.0，12.0具有较好的稳定性。50 mmol?L的Co和Ca

2+2+2+对酶活力均有显著的促进作用～Zn、Cu和Fe在不同浓度下对酶活力均有不同程度的抑制作用。在重组酶的辅

助作用下～抗生素的抑菌效果明显提高。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源海藻酸裂解酶～为其今后在工农

业中的应用奠定了基础。

关键词:海藻酸裂解酶,毕赤酵母,海藻寡糖,诱导表达

Expression of Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL)

in Pichia pastoris and Characterization of the Enzyme

YUE Ming, DING Hong-biao, QIAO Yu

(Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

Abstract: 【Objective】The purpose was to clone and express alginate lyase gene (algL) of Pseudomonas aeruginosa in Pichia pastoris expression system. 【Method】Alginate lyase gene of P. aeruginosa was amplified and inserted into pPIC9K expression

vector by adding EcoR I site to generate recombinant pPIC9K-algL construct. The positive construct was transformed to Pichia pastoris GS115 cells by PEG method. The AlgL protein was over-produced in P. pastoris induced by methanol. 【Result】 The

-1product of recombinant alginate lyase showed a molecular weight of 40 kD on SDS-PAGE with activity of 540 U?ml at an optimal temperature 40? and pH 8.5, respectively. The recombinant AlgL was stable below 45? between pH 3.0 and 12.0. The 2+2+2+2+2+ recombinant AlgL was sensitive to some metal cations negatively including Zn, Cu and Fe, but Co and Capromoted it dramatically. The sterilization of ampicilin and kanamycin on P. aeruginosa increased with the help of AlgL. 【Conclusion】P. pastoris expression system is an efficient way of production of AlgL. The recombinant AlgL has potency as feed additive and

antibiotic assistant.

Key words: Alginate lyase; Pichia pastoris; Alga oligosaccharides; Induction expression

子，影响了海藻细胞内营养物质的释放，降低了饲料0 引言利用率。另外，海藻酸盐有助于致病铜绿假单胞菌

[1,2]【研究意义】海藻酸盐(alginate)是广泛存在于(Pseudomonas aeruginosa)在病灶部位定殖，影大型海藻细胞壁中和某些细菌胞外的黏性多糖。它的响抗生素的扩散和杀菌效果，使铜绿假单胞菌具有较

[3,4]存在对以海藻为饲料的动物体内形成了一种抗营养因高的抗药性。铜绿假单胞菌在产生海藻酸盐的生理

4期岳明等:铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究 1193 后期能产生一种海藻酸盐裂解酶(alginate lyase，纯试剂。

AlgL)，可催化海藻酸盐β-D-甘露糖醛酸单体间1，1.1.3 培养基 LB 培养基见文献[23]，YPD、RDB、

[5,6]4-糖苷键断裂，生成寡聚糖醛酸，降低细菌的黏附MM、MD、BMGY、BMMY培养基见Invitrogen公司能力，从而结束其生命周期。海藻饲料中的海藻酸盐毕赤酵母操作手册。

经海藻酸裂解酶降解后，胞内的营养物可被充分质释1.2 试验方法

放出来，利于动物消化吸收，所产生的海藻寡糖还具algL基因成熟蛋白编码序列的1.2.1 铜绿假单胞菌

有改善动物胃肠道微生态环境等活性。因此，海藻酸克隆参照文献[23]方法从铜绿假单胞菌中提取基因

[18]裂解酶的生产研究对饲料资源与医药开发具有一定的组DNA。根据GenBank No. U27829序列，以algL

[7~9]理论与现实意义。【前人研究进展】一些微生物基因信号肽编码序列后第一个核苷酸到全基因终止密

[10~13]和海洋动植物都可以产生海藻酸裂解酶，早期海码子序列(1 023 bp)设计PCR扩增引物，上游引物

[5,14]藻酸裂解酶主要由天然菌株培养提取。随着基因序列为5' CGAATTCGCCGACCT GGTACCCCCGCC 工程技术的发展，一些物种海藻酸裂解酶基因被克隆CGGCTACTA 3'，下游引物序列为5' CGAATTCGCC

[15~17][18][19]和表达。Boyd等和Neal等先后于1993年CGCTTCCCGCCACGCCCTCAAC TTC 3'，其中上、首次克隆了铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶的编码基因下游引物中都引入EcoR ?限制性酶切位点(如下划algL并在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达，线所示)。以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，进证明了它与其它海藻酸代谢相关基因(algD-8-44-K- 行PCR反应，体系为50 μl:含有约50 ng铜绿假单胞

-1E-G-X-L-I-J-F-A)位于染色体上同一基因簇中，在海藻菌基因组DNA 1.5 μl，总浓度10 mmol?L dNTP 4 μl，

[20]-1酸代谢过程中起重要作用。【本研究切入点】原始10 mmol?L的上下游引物各1 μl，10×PCR反应缓冲

-1菌株产酶量非常有限，提取纯化成本高昂，而在大肠液5 μl，5 U?μl pfu DNA聚合酶0.5 μl，ddHO 37 μl。2杆菌中表达海藻酸裂解酶基因，易受原核表达系统自反应条件为:94?预变性5 min后，94?变性50 s，身局限性的限制，影响产量与活性。巴斯德毕赤酵母58?退火50 s，72?延伸1 min，进行30个循环，最(Pichia pastoris)作为一种分泌型真核表达系统，表后延伸5 min，反应结束后加入Taq DNA聚合酶与

[21,22]达水平高，纯化过程简单，生产成本低，可作为dATP 72?反应20 min，以使平末端带有成为A突出一种高效生产海藻酸裂解酶的手段。【拟解决的关键的黏性末端。

问题】本研究利用基因工程技术克隆了铜绿假单胞菌PCR扩增产物经胶回收纯化后，连接到pGEM-T algL基因，将其导入巴斯德毕赤酵母并进行诱导表达，Vector上，转化大肠杆菌DH5,，通过蓝白斑筛选获旨在获得一种高效生产海藻酸裂解酶的新途径，进而得阳性克隆，并进行测序鉴定。对表达产物性质以及作为抗生素辅助剂的作用效果进1.2.2 毕赤酵母重组表达载体的构建鉴定正确的行探究。 pGEM-algL经EcoR?酶切处理，将切下的algL基因

成熟蛋白编码序列插入同样酶切处理的毕赤酵母表达1 材料与方法载体pPIC9K中，使其位于α-因子信号肽序列的下游，1.1 实验材料利用PCR鉴定出正向插入的克隆，并对该质粒进行进1.1.1 菌株和质粒铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)，一步限制性酶切及测序鉴定。购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心1.2.3 毕赤酵母的聚乙二醇,PEG,法转化接毕赤(CGMCC 1.1785);大肠杆菌(E. coli)DH5α菌株酵母菌株GS115单菌落于10 ml YPD中30?，250,由本室保存;毕赤酵母(P. Pastoris)GS115和pPIC9K300 r/min培养至OD为0.6,1.0，离心收集菌体，600

分泌型表达载体购自Invitrogen公司;质粒pGEM-T 用10 ml Solution ?(见Invitrogen公司毕赤酵母操作Vector购自Promega公司。手册)重悬细胞，离心收集菌体，用1 ml Solution ?1.1.2 酶和试剂限制性内切酶、T4 DNA、X-Gal重悬细胞，此时酵母细胞处于感受态，取80 μl上述连接酶为TaKaRa公司产品; DNA聚合酶购自菌液，加入3 μg经限制性内切酶Bgl?线性化的重组Tiangen公司; G418购自Invitrogen公司;海藻酸钠、质粒pPIC9K-algL，加入1 ml Solution ?，充分混匀，葡萄糖醛酸为Sigma公司产品;氨苄青霉素和卡那霉30?水浴1 h，其中每15 min旋涡震荡，42?水浴10 素为Amresco产品;其它化学试剂为国产和进口分析 min，4 000 r/min离心收集菌体，加入1 ml Solution ?，

1194 中国农业科学 41卷

-1600 μg?ml G418的YPD平板上，30?培养。在MD的酶液活力为100%。

[26]用3 ml BMMY诱导培养基重悬菌体，30?220 r/min变化。

继续培养，每24 h补加甲醇至终浓度1.0%。每24 h2 结果与分析取样，将培养液于6 000 r/min离心5 min，收集上清

[24]和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，扩增出1.0

-1冷却，用蒸馏水定容至5 ml，混匀，在550 nm下测子大部分为甲醇利用慢型，并在含有600 μg?ml G418定吸光度(用空白调零)，OD值越高酶活力越高。的YPD平板上获得了多个高拷贝转化子。提取重组工酶活力定义:在一定温度和pH值下，每分钟催化海程菌菌株基因组DNA，进行PCR鉴定，结果表明algL藻酸钠水解生成1 μg葡糖醛酸的酶量定义为一个海基因成熟蛋白编码序列已插入到毕赤酵母的基因组中藻酸裂解酶活力单位(U)。 (图1)，保证了基因的稳定遗传。 1.2.6 重组海藻酸裂解酶最适反应条件及稳定性测2.3 重组海藻酸裂解酶的诱导表达与活力检测定表达产物经Millipore离心过滤脱盐后，在40?不将初筛有酶活的菌株在诱导培养基中进行表达，同pH条件下测定重组海藻酸裂解酶的活力;将重组每24 h测酶活力，筛选出一株酶活力最高的毕赤酵母海藻酸裂解酶液在不同pH值的缓冲液中40?保温30 重组工程菌，酶的活力在诱导培养120,144 h达到高

-1min，检测剩余的酶活力(以最适反应pH下酶活力为峰(图2)，峰值为540 U?ml左右。SDS-PAGE分析100%)。结果表明(图3)，表达产物分子量约为40 kD。

将表达产物在pH 8.0不同温度下测定重组海藻酸2.4 重组海藻酸裂解酶最适反应条件及稳定性测定裂解酶的酶活力;将重组海藻酸裂解酶液在pH 8.0不在不同pH反应条件下测定重组海藻酸裂解酶的同温度下分别保温30 min，检测剩余的酶活力(以最活力，测得该酶最适pH为8.5左右，并在pH 4.0,12.0适反应温度下酶活力为100%)。的条件下仍具有60%以上的酶活力。将重组海藻酸裂

4期岳明等:铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究 1195

解酶在不同pH的磷酸缓冲液中40?保温30 min，检

测剩余的酶活力，发现该酶在pH 3.0,12.0的条件下

保温30 min后仍剩余60%以上的酶活力(图4)。

图1 重组毕赤酵母工程菌株的PCR鉴定

Fig. 1 Identifation of recombinant P. pastoris by PCR

图4 pH对重组酶活力的影响及pH稳定性

Fig. 4 Optimum pH and pH stability of the recombinant AlgL

在不同温度条件下测定海藻酸裂解酶的活力，发

现该酶最适反应温度为40?。将重组海藻酸裂解酶的

酶液分别在不同温度下保温30 min，检测剩余的酶活

力，结果表明重组海藻酸裂解酶在20,45?的条件下

保温30 min后仍具有75%以上的酶活力，而在50? 及以上条件下保温30 min酶活下降明显(图5)。图2 重组毕赤酵母诱导产酶曲线

Fig. 2 Curve of recombinant AlgL activity produced by P.

pastoris

图5 温度对重组酶活力的影响和热稳定性

Fig. 5 Optimum temperature and thermolstability of

1-6. 甲醇诱导24, 48, 72, 96, 120和 144小时重组AlgL产物; 7. 蛋白质recombinant AlgL 分子量标准; 8. 诱导前上清液 1-6. Recombinant AlgL induced within 24, 48, 72, 96, 120, 144 h by methanol; 7. Standard protein molecular weight; 8. Supernatant before -1由图6可见，离子浓度为1、10和50 mmol?Linduction -1 的盐溶液对酶活力的影响有明显差异:50 mmol?L的图3 不同诱导时间重组海藻酸裂解酶表达量 2+2+2+2+++Mn、Mg、Co、Ca、K和Na对酶活力均有不Fig. 3 SDS-PAGE of expressed AlgL within different induction -1times 同程度的促进作用，而在1和10 mmol?L浓度下作用

1196 中国农业科学 41卷

-12+2+不明显，其中50 mmol?L 的Co和Ca可将酶活力

2+2+2+提高50%以上;Zn、Cu和Fe对酶活力均有抑制

-12+作用，而且浓度越高越明显，其中50 mmol?L的Cu

2+与Fe分别使酶活力丧失了近80%和60%。

图8 重组海藻酸裂解酶对抗生素抗菌效果的影响

Fig. 8 Effect of ampicilin and kanamycin with recombinant

AlgL on Pseudomonas aeruginosa 图6 金属离子对重组海藻酸裂解酶活性的影响

Fig. 6 Effect of metallic ions on recombinant AlgL activity

3 讨论

2.5 重组海藻酸裂解酶酶解产物分析及对铜绿假单

本试验克隆的是铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶algL胞菌耐药性的影响

基因成熟蛋白编码序列，利用DAMAN软件与海藻酸钠经重组海藻酸裂解酶降解，可产生多种

GenBank中algL基因序列进行比对，分别与No. 寡糖，其中包括单糖及其它一系列寡糖(图7)，由

U27829和L14597序列具有99.71%和99.12,的一致于单糖和其它寡糖的同时产生说明该酶具有外切和内[18,19]性。SDS-PAGE分析结果显示，表达产物分子量切活性。 [18]约为40kD，与文献报道的天然酶基本一致。重组 -1海藻酸裂解酶活力达540 U?ml左右，远高于近期袁

[24]兆慧等报道的活力水平。

本研究利用分泌型毕赤酵母表达系统，可获得较

纯的目的蛋白，基本可以排除酵母自身产生蛋白的影

响。另外，通过对重组海藻酸裂解酶酶学性质的初步

研究，发现该酶的最适反应温度为40?，最适pH为

[5]8.5左右，均高于Alfred报道，可能与毕赤酵母表达产物的糖基化有关，并且保证了该重组酶在较宽的 1. 葡萄糖醛酸;2，3. 重组酶降解海藻酸钠产物 pH范围下具较高活性和稳定性。本研究中抗生素在重1. Glucuronic acid; 2, 3. Poduction catalyzed by recombinant AlgL 组海藻酸裂解酶辅助作用下，抑菌效果明显提高，这

[26]图7 重组海藻酸裂解酶酶解产物TLC分析与Richard等使用天然酶所得到的结果相近，说明

Fig. 7 TLC of production catalyzed by recombinant AlgL 重组海藻酸裂解酶能够破坏铜绿假单胞菌细胞的保护

层，使抗生素较易进入细菌细胞发挥杀灭作用，降低

了细菌的抗药性与药物施用剂量。在铜绿假单胞菌生长平板上，根据抑菌圈直径大

-1-1不同生物来源的海藻酸裂解酶具不同的底物专一小，终浓度分别为20 mg?ml和2 mg?ml的氨苄青霉

性，本试验以多聚甘露糖醛酸(M)海藻酸钠作为酶素和卡那霉素与重组酶的混合物的抗菌效果分别提高

解底物，但在对不同具体天然底物作用时，可能会产29%和18%，纯酶液不产生抑菌圈(图8)。

4期岳明等:铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究 1197

[6] Monday S R, Schiller N L. Alginate synthesis in Pseudomonas 生不同结构与功能活性的的海藻寡糖:有些海藻寡糖

aeruginosa: the role of AlgL (alginate lyase) and AlgX. Journal of 可以用作养殖动物和鱼虾的能量饲料和黏结剂，还是

Bacteriology, 1996, 178(3): 625-632. 一些植物的免疫刺激因子，可刺激小麦等作物免受真

[7] Helga E, Frode E, Gudmund S, Bernd H A R, Svein V. Biochemical 菌危害，在欧洲已经被用于防治小麦的白粉病、青枯

properties and substrate specificities of a recombinantly produced 病等。鉴于自然界中海藻酸裂解酶与其降解产物的多

[27]Azotobacter vinelandii alginate lyase. Journal of Bacteriology, 1998, 样性，尚需进一步对不同生物来源具有不同酶学特

180(15): 3779-3784. 性的海藻酸裂解酶及酶解产物以深入研究。

[8] Tomoo S, Miwa O, Yoshio E. Novel alginate lyases from marine 海藻是世界上最为丰富的海洋植物资源之一，由

bacterium Alteromonas sp. strain H-4. Carbohydrate Research, 1997, 于人口增多、水资源紧缺、耕地减少，粮食和饲料等

304: 69-76. 优质生物资源需求缺口增大，世界大国日益关注可再

[9] Zhang Z Q, Yu G L, Guan H S, Zhao X, Du Y G, Jiang X L. 生的海洋生物质，日本美国等均投入巨资进行海洋藻

Preparation and structure elucidation of alginate oligosaccharides 类的开发利用研究，“海洋经济”、“生物质经济”

degraded by alginate lyase from Vibro sp. 510. Carbohydrate 已经成为世界性新课题。中国具有占世界30%的海藻

Research, 2004, 339: 1475-1481. 产量，因此，利用基因工程技术，采用酵母生物反应

[10] Shimizu E, Ojima T, Nishita K. cDNA cloning of an alginate lyase 器高效表达海藻酸裂解酶，将海藻转化为优质饲料原

from abalone，Haliotis discus hannai. Carbohydrate Research, 2003, 料，对开发海洋生物质，缓解陆地生物资源紧张，具

338: 2841-2852. 有重大的社会、科学和经济意义。

[11] Favorov V, Vozhova E, Denisenko V, Elyakova L. A study of reaction

4 结论 catalysed by alginate lyase VI from the sea molluse, Littorina sp..

Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 569: 259-266. 利用巴斯德毕赤酵母，高效分泌表达了具有较高

[12] Brown B J, Preston J F III. L-Guluronan-specific alginate lyase from a 活性的海藻酸裂解酶;另外，通过对重组海藻酸裂解

marine bacterium associated with Sargassum. Carbohydrate Research, 酶耐酸碱和耐热性质的研究, 为其在食品, 饲料等工

1991, 211: 91-102. 农业领域的应用提供了依据; 加之其具有提高抗生素

[13] Gacesa P. Enzymic degradation of alginates. The International 杀灭致病菌的作用，也扩展了该重组酶在医药等其它

Journal of Biochemistry, 1992, 24(4): 545-552. 领域的应用。

[14] Hansen J B, Doubet R S, Ram J. Alginase enzyme production by

Bacillus circulans. Applied and Environmental Microbiology, 1984, References

[1] Arnold S B, Susan P, Marcelo C R, Cynthia C N, Fereshteh E, Neal L 47(4): 704-709.

S. Effects of alginase on the natural history and antibiotic therapy of [15] Yoon H J, Wataru H, Osamu M, Masako O, Bunzo M, Kousaku M.

experimental endocarditis caused by mucoid Pseudomonas Overexpression in Escherichia coli, purification, and characterization aeruginosa. Infection and Immunity, 1992, 60(10): 3979-3985. of Sphingomonas sp. A1 alginate lyases. Protein Expression and

[2] Mark T A, Neal L S. Alginate lyase (AlgL) activity is required for Purification, 2000, 19: 84-90. alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Journal of [16] Pecina A, Pascual A, Paneque A. Cloning and expression of the algL Bacteriology, 2005, 187(11): 3869-3872. gene, encoding the Azotobacter chroococcum alginate lyase:

[3] Boyd A , Chakrabarty A M. Role of alginate lyase in cell detachment purification and characterization of the enzyme. Journal of of Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Bacteriology, 1999, 181(5): 1409-1414.

[17] Chavagnat F, Duez C, Guinand M, Potin P, Barbeyron T, Henrissat B, Microbiology, 1994, 60(7): 2355-2359.

[4] Jain S, Ohman D E. Role of an alginate lyase for alginate transport in Wallach J, huysen J M. Cloning, sequencing and overexpression in

mucoid Pseudomonas aeruginosa. Infection and Immunity, 2005, Escherichia coli of the alginatelyase-encoding aly gene of 73(10): 6429-6436. Pseudomonas alginovora: identification of three classes of alginate

[5] Alfred L, Leigh R E. Isolation and characterization of an alginase lyases. Journal of Biochemistry, 1996, 319: 575-583.

[18] Schiller N L, Monday S R, Boyd C M, Keen N T, Ohman D E. from mucoid strains of Pseudomonas aeruginosa. Journal of

Bacteriology, 1984, 159(3): 958-964. Characterization of the Pseudomonas aeruginosa alginate lyase gene

1198 中国农业科学 41卷

(algL): Cloning, sequencing, and expression in Escherichia coli. 林S H. 蛋白质纯化与鉴定实验指南. 北京: 科学出版社, 1999:

279. Journal of Bacteriology, 1993, 175(15): 4780-4789.

[19] Boyd A, Ghosh M, May T B, Shinaberger D, Koegh R, Chakrabarty A Marshak D R, Kadonaga J T, Burgess R R, Knuth M W, Brennan W A,

M. Sequence of the algL gene of Pseudomonas aeruginosa and Lin S H. Strategies for Protein Purification and Characterization: A

purification of its alginate lyase product. Gene, 1993, 131: 1-8. Laboratory Course Manual. Beijing: Science Press, 2002: 279. (in [20] Antonette R P, Wong T Y, Sletta H, Svein V, Schiller N L. AlgX Is a Chinese)

periplasmic protein required for alginate biosynthesis in Pseudomonas [25] 袁兆慧, 韩丽君, 林伟, 韩宝芹. 褐藻酸降解酶的制备及其性质

aeruginosa. Journal of Bacteriology, 2004, 186(21): 7369-7377. 研究. 海洋科学, 2005, 29(2): 78-80.

[21] Gurkan C, Ellar D J. Recombinant production of bacterial toxins and Yuan Z H, Han L J, Lin W, Han B Q. Preparation of alginase and its

their derivatives in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. properties. Marine Sciences, 2005, 29(2): 78-80. (in Chinese)

[26] Hatch R A, Schiller N L. Alginate lyase promotes diffusion of Microbial Cell Factories, 2005, 4: 33.

[22] Macauley P S, Fazenda M L, McNeil B, Harvey L M. Heterologous aminoglycosides through the extracellular polysaccharide of mucoid

protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast, Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,

2005, 22: 249-270. 1998, 42(4): 974-977.

[27] Wong T Y, Preston L A, Schiller N L. Alginate lyase: Review of major [23] 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 D W. 分子克隆实验指南(第3版). 北京:

sources and enzyme characteristics, structure-function analysis, 科学出版社, 2002: 1949.

Sambrook J, Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual biological roles, and applications. Annual Review Microbiology, 2000,

(3rd ed). Beijing: Science Press, 2002: 1949. (in Chinese) 54: 289-340.

[24] 马歇克 D R, 门永 J T, 布格斯 R R, 克努特 M W, 布伦南 W A,

(责任编辑林鉴非)

4期岳明等:铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究 1199

范文五：寒区水体中溶藻铜绿假单胞菌的分离和性质研究

网络出版时间：2014-06-17 16:16

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13671/j.hjkxxb.2014.0792.html

环境科学学报 Acta Scientiae Circumstantiae

DOI: 10.13671/j.hjkxxb.2014.0792

寒区水体中溶藻铜绿假单胞菌的分离和性质研究

陈庆丽, 景澄茗，付韵馨，王晓洋，李明堂

吉林农业大学资源与环境学院，长春 130118

,*摘要：我国北方，尤其是东北地区的一些水体由于富营养化导致的水华现象呈增加趋势，成为急需解决的水环境问题。溶藻菌可从生态调控的角度来控制水华的爆发，因此在富营养化水体治理方面逐渐得到重视。本文从寒区水华爆发水体中分离获得了一株溶藻细菌JM1，系统发育分析表明，菌株JM1与铜绿假单胞菌的同源性最高；VITEK 系统鉴定表明菌株JM1。菌株JM1在不同的碳源和氮源培养基中可产生不同颜色和pH 的溶藻效果明显好于其它培养基。菌株JM1随发酵液添加量的增加而增加；当菌体细胞的密度达到1011时，105时，18 h 时，藻细胞彻底丧失了恢复能力。菌株JM1关键词：

Isolation and of Pseudomonas aeruginosa from ANG Xiaoyang, LI Mingtang

Abstract: China, especially in Northeast China, has become a pressing water environmental issue. More attention has been paid to algicidal bacteria in the aspect of eutrophic water body treatment because they can control algal bloom from ecological regulation point of view. This paper screened a strain of bacterium JM1 which showed strong algicidal effect. According to phylogenetic analysis and VITEK identification system, strain JM1 was identified as Pseudomonas aeruginosa . Strain JM1 produced metabolites with different colors and pH values in different culture media containing different carbon and nitrogen sources. The fermentation fluid produced by strain JM1 基金项目：国家自然科学基金(51109089); 吉林省科技发展计划项目(20100141和20130206031NY)

Supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 51109089） and the Program of Science and Technology Development Plan of Jilin Province (No. 20100141 and 20130206031NY)

作者简介：陈庆丽(1987—) ，女，在读硕士研究生, E-mail :Chenqingli31@163.com；*通讯作者(责任作者)

Biography ：CHEN Qingli (1987—) ，Female, postgraduate student, E-mail: Chenqingli31@163.com；*Corresponding author

grown on glucose and peptone showed better algicidal effect, compared with those on other culture media. The algicidal effect increased with the decreasing of initial algal cell density and increased with the increasing of additive amount of fermentation fluid. The bacterial cells with the density of 1011 could inhibit algal cells growth alone. The bacterial cells could promote the algicidal effect of fermentation fluid when its density was more than 105. After 6 h of exposure to fermentation fluid, the recovery capacity of algal cells was significantly affected and algal cells were completely deprived of recovery capacity after 18 h of exposure. The fermentation fluid of strain JM1 showed strong algicidal effect under neutral and weakly-alkaline conditions. The fermentation fluid still showed strong algicidal effect even after treatment of acidification, alkalinification and high temperature treatment. This study could provide dominant bacterium and technical support in application in the algal bloom control based on microbial processes.

Keywords: algcidal bacteira; Pseudomonas aeruginosa;

1 引言（Introduction ）

华爆发现象，并呈现逐渐增强之势，, 甚至威胁着饮用水安全，成为急需解决的水环境问题（金志民等, 2009）南方地区的一些大型水体（冯胜等），而对低温期较长的北方水体的富营养化现象的重视程度明显不足），因此有必要探寻针对北方水体的水华控制技术。/杀死和溶解藻细胞的微生物。、芽孢杆菌属和弧菌属等（Dakhama et al., 1993; 裴海燕等, 2005; 汪辉等, , 李东等, 2013; 李三华和张亚奇, 2013; Yang et al ., 2013; 王琼等, 2014）在不同环境下的溶藻特征，从而为提高其实际应用效果提供依据。本文从寒区处于水华爆发期的富营养化水体中分离和鉴定了一株铜绿假单胞菌，并分析其对我国北方水体中常见的水华蓝藻优势种铜绿微囊藻的抑制和溶解特征，以期为北方富营养化水体蓝藻爆发的生物控制提供优势的土著菌种资源和技术支持。

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1供试藻种及其培养

实验用铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa ）FACHB 928购自中国科学院淡水藻种库，该藻属于蓝藻门微囊藻属的原核生物，为藻种库同日本国立环境研究所交换所得。

实验过程中使用BG11培养基进行藻种复活和溶藻实验。铜绿微囊藻的培养条件：温度25±0.5℃，光暗比14:10，光照强度2000 lux，每日振荡4次。溶藻实验的基本条件：除不同藻密度实验外，溶藻实验的

藻液初始叶绿素a 的浓度大约为2.4 μg?mL -1；除不同添加比例实验外，其余实验发酵液的添加比例为1:100，溶藻周期为5 d，每种处理重复三次，同时做无菌水代替发酵液的对照。 2.2细菌培养和发酵液的制备

细菌的培养条件：除溶藻菌和最佳溶藻培养基的筛选实验温度为25℃外，其它获得发酵液的细菌培养温度为32℃，振荡速度为150 rpm。

发酵液制备：利用牛肉膏蛋白胨培养基将保存的菌种活化后，利用无菌水制备成OD 600为0.3左右的菌悬液，按照1%的比例接种至相应的培养基中，培养36 h，在8000 rpm下离心5 min，上清液再过0.22 μm的滤膜为发酵液，用于溶藻实验。 2.3溶藻菌的筛选和分离

2013年8月分别在吉林省和内蒙古共9100 mL于500 mL 三角瓶中，加入等量的稀释50倍后的BG11培养基，培养15黄化现象最明显的培养液，梯度稀释后涂在牛肉膏蛋白胨固体培养基表面上，在25JM1进行纯化。 2.4菌株JM1的鉴定

2.4.1菌株JM1的常规和VITEK 系统鉴定

, 2001）。利用法国生物梅里埃公司VITEK 2 COMPACT2.4.2菌株JM1的分子生物学鉴定

总DNA 1牛肉膏蛋白胨培养基中在25℃和150 rpm下培养24 h后取2 mL，弃培养基，加入200 μL ddH2O ，沸水煮10 min，然后13000 rpm离心16S rDNA扩增。

16S rDNAJM1的16S rDNA基因PCR 反应体系包括：1 μL DNA模板，10 μmol ／L ／L dNTPs 5 μL ，10×缓冲液5 μL ，RNA 聚合酶 1 mL，补充36 μL 双蒸水至50 μL Pf ：5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′；反向引物Pr ：5′。PCR 反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 3 min，35个循环; 72 ℃ 10 min， 4℃保存。取PCR 产物 5 μL 进行1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定后送，北京信诺金达生物科技有限公司测序。

系统发育分析：将测得的序列提交GenBank ，并进行BLAST 同源性序列比对。选取同源性较高的序列用RNAMEN 软件编辑成头尾一致并等长的序列后, 再选取属内同源性较高的模式菌株的16S rRNA 序列进行遗传距离计算, 用ClustalW 2.0 软件进行序列比对，应用系统发育树分析软件MEGA 4.0中Neighbor-Joining 方法，采用Kimura 双参数计算模型构建系统树，并评估系统发育。另外，已分离鉴定的可产生溶藻活性物质的菌株也包含在了系统发育树的构建中。 2.5菌株JM1的溶藻特征研究

2.5.1具有最佳溶藻效果的细菌培养基筛选

分别利用蔗糖（10 g?L -1）、葡萄糖（10g ?L -1）、甘油（10 g?L -1）为碳源，蛋白胨（5 g?L -1）、硝酸钠（3.14 g?L -1）和硫酸铵（2.8 g?L -1）为氮源，加上其它无机盐制备成培养基。以蛋白胨为氮源时，无机盐为NaCl （5g ?L -1）；以无机氮为氮源时，其它无机盐为KH 2PO 4 (0.125 g?L -1) 、MgSO 4·7H 2O( 0.2 g?L -1) 、NaCl (0.2 g?L -1) 、CaCl 2·2H 2O (0.025 g?L -1) ，微量元素溶液2 mL（李明堂等, 2012），共9种培养基。菌株JM1分别接入这9种培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中培养，利用发酵液进行溶藻实验。通过比较叶绿素a 的浓度，确定最佳的培养基组成，实验过程中观察记录发酵液的颜色和pH 值变化。以下实验所用的发酵液都是用最佳培养基培养菌株JM1后获得。 2.5.2菌株溶藻方式研究

向处于对数期的藻液中加入菌体细胞和发酵液，分别做加入单一菌体细胞、单一发酵液和同时加入菌体细胞和发酵液三种处理，菌体细胞最终浓度分别为103、105、107、1011，通过比较叶绿素a 的浓度，分析菌株的溶藻方式。

2.5.3初始藻密度和发酵液添加比例对溶藻效果的影响

利用BG11培养基将叶绿素a 的浓度为 3.42 μg?mL -1 2.46 μg?mL -1和1.72 μg?mL -1的两种藻液，然后以1:50、1:100、1:150 2.5.4菌株JM1分别在溶藻实验开始后的第6、BG11培养基中重新培养，分别培养5 d后测定叶绿素a 2.5.5藻液pH 利用1M pH 值调节成5.1、6.05、7.07、8.04、9.05、10.15 2.5.6分别利用1M pH 值调节为2和12，然后再用氢氧化钠和盐酸溶液将pH 121℃下高压蒸汽处理20 min ，分别利用这三种经过酸 2.7叶绿素a 的测定

利用《水和废水监测分析方法》( 国家环境保护总局，2002 ) 中的标准方法测定叶绿素a 。具体方法：将藻液震荡均匀后在8000 rpm下离心10 min，去掉上清液，尽量获得干燥藻细胞，用5 mL 90%丙酮将底部绿色沉淀溶至50mL 锥形瓶中，用透气封口膜加盖两层报纸封口，置于4℃冰箱中保存，24 h 后取出离心获得上清液，以丙酮为参比溶液，用分光光度计测定上清液在630 nm、645 nm、665 nm波长处的吸光度(A)，根据公式C=11.6×A 665－1.31×A 645－0.14×A 630计算藻液中叶绿素a 的浓度（μg?mL -1）。

3 结果(Results)

3.1 菌株JM1的分离和鉴定

通过驯化筛选，从水体中分离获得了一株在微藻黄化过程中具有数量优势的细菌，命名为JM1

。该

牛肉膏蛋白胨

℃

菌落，随着培养时间的延长，平板颜色逐渐变化为深青色，并能分泌一种特殊气味（见图1a ）。光学显微镜观察发现，菌体细胞呈短杆状、无芽孢、无荚膜、革兰阴性（见图1b ）。VITEK 2 COMPACT GN 鉴定卡的鉴定结果表明菌株JM1与铜绿假单胞菌的相似度为98%（见表1）。将菌株JM1的16S rRNA 基因序列提交GenBank ，获得的登录号为 KJ 7559957，Blast 结果表明其与铜绿假单胞菌有98%的同源性。选取铜绿假单胞菌和已分离的具有溶藻作用的菌株的16S rRNA 部分基因序列构建的系统发育树(见图2) 表明菌株JM1与已报道的铜绿假单胞菌的亲源关系最近，与BLAST 结果一致。综合以上鉴定结果，菌株JM1

10 17 23 33 40 46 58

H2S BGLU ProA SAC ILATK GIyA O129R - - + - + - +

11 18 26 34 41 47 59

BNAG dMAL LIP dTAG AGLU ODC GGAA - - + - - - -

12 19 27 35 42 48 61

13 20 29 36 43 53 62

dGLU dMNE TyrA CIT NAGA IHISa ELLM + + + + - - -

14 21 31 37 44 56 64

GGT BXYL URE MNT AGAL CMT ILATa + 15 - 22 + 32 + 39 - 45 + 57 +

OFF BAIap dSOR 5KG PHOS BGUR - + - - - -

AGLTp - dMAN PLE dTRE SUCT LDC IMLTa

+ - - + - +

YC15-JN999890.1 Pseudomonas putida strain CH-22-GU060497

Acinetobacter sp. 18III-AY576723.1

Achromobacter sp. ALB1-EF617310.1

3.2

葡萄糖+蛋白胨蔗糖+蛋白胨甘油+蛋白胨葡萄糖+硝酸钠蔗糖+硝酸钠甘油+硝酸钠葡萄糖+硫酸铵蔗糖+硫酸铵甘油+硫酸铵牛肉膏蛋白胨

橘红浅蓝深蓝淡黄无色黄绿黄无色无色蓝绿色

4.43 8.37 8.39 4.35 8.3 8.57 3.9 7.19 4.59 8.81

强弱弱中弱中中弱弱中

注：“强”表示叶绿素a 的浓度小于 1.0 μg?mL-1；弱表示叶绿素a 浓度大于 2.1 μg?mL-1；中为叶绿素a 浓度介于1.0和 2.1 μg?mL-1之间。

3.3菌株溶藻方式研究

分别利用菌株JM1的菌悬液和发酵液做单一和混合添加的溶藻实验，结果如图3所示。从图中可以看出，只添加菌体细胞时，细胞密度达到1011才对藻细胞的生长产生影响；菌体细胞的密度达到105时，随着细菌密度的增加，菌体细胞和代谢产物的协同溶藻作用逐渐增强。结果表明，菌株JM1可以通过直接和间接两种方式溶藻，但以间接溶藻方式为主，菌体细胞数量只有增加到一定量时，才产生直接溶藻作用，并且只有菌体细胞密度达到一定程度时，二者才有较强的协同溶藻作用。实验过程中观察到菌体细胞的添加比例越大，呈黄色的藻细胞残体的数量越少，藻液的颜色越发白。根据以上结果可推测：菌株JM1与铜绿微囊藻之间可能存在营养和生存空间上的竞争，当只有菌体细胞存在时，较低浓度的菌体细胞不会胁迫

, 2013），

3.4初始藻密度和发酵液添加比例对溶藻效果的影响

分别利用不同的藻液初始密度和添加比例进行溶藻实验，结果如图4所示，从图中可以看出，当藻细胞的叶绿素a 含量为1.72 μg?mL -1时，添加比例为1:200时仍然可以产生明显的影响，当叶绿素a 含量为2.46 μg?mL -1和 3.42 μg?mL -1时，随着添加比例的减少，溶藻效果逐渐降低，当为 3.42 μg?mL -1时，添加比例为1:150和1:200时，无明显影响。并且培养过程观察到低密度和高添加量可加快藻液的黄化速度。

图3 菌株JM1的菌体细胞和发酵液的单一和联合溶藻效果

Fig.3 Single and combined algicidal effect of bacterial cells and fermentation fluid of strain JM1

结果表明，菌株JM1发酵液的溶藻效果随藻细胞初始密度的降低而增强，随添加量的增加而增加。因此在实际应用过程中可根据水体中叶绿素a 的浓度确定适宜的添加比例，并且在藻细胞密度低时投加发酵液可在使用量减少的情况下达到相同的溶藻效果，从而减少发酵液使用可能对水生生态系统造成的不利影响。

3.5以JM1

图5 发酵液对藻细胞毒性的可逆性

3.6藻液pH 值对发酵液溶藻效果的影响

分别利用不同初始pH 值的藻液进行溶藻实验，结果如图6所示，从图中可以看出，不添加溶藻活性物质时，酸性培养液会对藻细胞的生长产生明显的影响，中性和偏碱性藻细胞的生长能力最好；添加发酵液后，酸性条件下发酵液的溶藻效果不明显，但在中性和偏碱性条件下溶藻效果非常明显。结果表明，在中性和偏碱性条件下铜绿微囊藻的数量增加快，但发酵液的溶藻效果也同样增强，在酸性条件下酸性条件下藻细胞的生长能力差，发酵液的溶藻效果也同样较差，具体影响机制还有待于深入研究。研究表明，富营养化水体的pH 值大多呈中性和偏碱性，因此菌株JM1发酵液在实际的水华治理治理过程中可发挥积极的作用，并且在应用过程中需要监测水体的pH 值，以保证最佳的溶藻效果。

3.7菌株JM1

将菌株JM1溶藻实验。pH 如图7所示，消失或者起溶藻作用的主要物质酸碱变化过程中结构发生变化，溶藻活性有所下降。同时还可以看出发酵液经过高温处理后，溶藻效果略有下降，但溶藻效果仍然非常明显。以上结果表明菌株JM1发酵液中起主要溶藻作用的物质酸、碱和热稳定性较高，有利于溶藻活性物质的提取和使用。

4 结论（

1JM1。菌株JM12）菌株胞的密度达到的溶藻作用。

3恢复能力。

4）菌株

E-mail ：limtdoc2008@163.com。

参考文献（References ）:

Dakhama A, No üe J de, Lavoie M C. 1993. Isolation and identification of antialgal substances produced by Pseudomonas aeruginosa [J]. Journal of Applied Phycology, 1993, 5: 297—306

冯胜, 秦伯强, 高光. 2008. 太湖磷转化细菌与水体磷形态关系[J]. 湖泊科学, 20 (4): 428—436

龚良玉, 王修林, 李雁宾, 等. 2004. 铜绿假单胞菌产吩嗪类色素的分离纯化及其对赤潮生物生长的影

响[J]. 复旦学报(自然科学版) , 43 (4): 494—499, 506

郭静, Liswaniso Gadafii, 郭安南, 等. 2012. 溶藻弧菌相关分离株的分子及VITEK 鉴定[J]. 水产学报, 3 (36): 383-390

环境科学学报 Acta Scientiae Circumstantiae

Holt J G, Krieg N R, Sneath P H A, et al. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th Ed. William

and Wilkins, Baltimore

黄继国, 彭祥捷, 俞双, 等. 2008. 水体结冰期营养盐和叶绿素a 的分布特征[J]. 吉林大学学报（理学版）, 46(6): 1231—1236

金志民, 杨春文, 金建丽, 等. 2009. 镜泊湖水质及富营养化现状调查[J]. 水资源保护, 25(6): 56—57, 75 李三华, 张奇亚. 2013. 1株溶藻菌的部分生物学特性及溶鱼腥藻作用[J], 环境科学, 34（2）: 583—588. 李东, 安新丽, 傅丽君, 等. 2013. 溶藻细菌BS03分离、鉴定及其对塔玛亚历山大藻生长的影响[J]. 环境科

学学报, 33(1): 44—52

李明堂, 郝林琳, 刘梦洋, 等. 2012. 反硝化耐冷菌Acinetobacter johnonii DBP-3的低温除磷特性研究[J]. 环

境科学学报, 32(7): 1557—1562.

裴海燕, 胡文容, 曲银波, 等. 2005. 一株溶藻细菌的分离鉴定及其溶藻特征[J]. 环境科学学报, 25(2):

796—802

邱雪婷, 钱雨婷, 周韧, 等. 2011. 溶藻菌N25, 31(10): 1375—1379

国家环境保护总局. 2002. 水和废水监测分析方法（第四版）

Tian C, Liu X L,Tan J, et al1823—1831

汪辉, 刘兆普, 魏微, 等. 2008. 、[J]. 中国环境科学,

28(5): 461—465

王琼, 吴伟, 季丽. 2014. [J]. 农业环境科学学报, 33(2):

383-391

徐慧萍, 杨桂军, 周健, 等. 2014. 氮(Microcystis flos-aquae) 群体生长的影响

[J]. 湖泊科学, 26(2): 213—

Yang F, Wei H Y, Li X Q, [J]. Biomedical and Environmental 11