范文一：肿瘤干细胞的鉴定与分离

垦匪艘疆堂盘盍垫!!生垒旦筮塑鲞笠垒魍!丛笾型,垒坠曼垫!!:丛≥!:塑垒鱼

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(收稿日期:2011-01-07修回日期:2011-04-26)

肿瘤干细胞的鉴定与分离

林之光陈波斌

【摘要】 肿瘤干细胞被认为是肿瘤复发的根源。目前通过特定的免疫表型来分离鉴定肿瘤干细 胞是最常用的方法。侧群(sP)细胞分离技术也已经相当成熟,利用Wnt通路在肿瘤细胞的表达活性差 异来分离肿瘤干细胞的方法正受到关注。构建干细胞龛来捕获肿瘤于细胞的方法有待进一步评价。 【关键词】肿瘤干细胞;免疫表型分型

Identification and isolation of cancer stem cells LIN Zhi-guang,

logy,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China

Corresponding author:CHEN Bo?bin,E-real[:bobin_chen@yahoo.COil'#

【Abstract】Cancer stem cells are considered to be the origin of tumor relapse.Isolating and identifying them by special immune—phenotypes is the most commonly used method.The technique of isolating SP cells is

very mature.More

attentions躺being paid to the isolation of c髓cer stem cells using differential expression activities of Wnt pathway on surface of tumor cells.Establishing stem cells niches to capture cancer tumor cells remains to be further evaluated.

【Key words】Neoplastic stem ceils;Immunophenotyping

肿瘤于细胞学说认为,肿瘤是由一小群具有自我

更新能力的肿瘤细胞不断增殖分化形成的,这群细胞

被称为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞通过自我更新维持

自身的数量,通过增殖分化形成整个肿瘤克隆。它们

可在体外形成克隆并无限传代;可在动物体内致瘤产

BOl:10.3760/cma.j.issn.1673-422X.2011.06.004

基金项目:上海市自然科学基金资助项目(10ZRl405200)

作者单位:200040上海,复旦大学附属华山医院血液科

通信作者:陈波斌,E-Mail:bobin chen@yahoo.COS ?综述?

生与原发肿瘤相似的肿瘤组织。现就目前肿瘤干细 胞的鉴定与分离方法作一综述。

1免疫表型

在许多实体肿瘤及血液系统肿瘤组织或细胞群 中均发现少量具有特定免疫表型的细胞具有干细胞 样特性。

1.1乳腺癌干细胞的筛选

在有关乳腺癌的研究中,最早发现CD44+ CD24√h乳腺癌细胞在非肥胖糖尿病重症联合免疫 缺陷(non-obese diabetic/severe combined immunodifi.

万方数据

cient,NOD/SCID)小鼠体内具有较强的致瘤能力, 认为CD44+CD24。10”为乳腺癌1=细胞的免疫表型。 但CD44+CD24。10”细胞群并非同质群体。Ginestier 等¨发现CIM4+CD24。10”细胞群中可进一步分选出 具有乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)活 性的细胞垭群ALDHI+CIM4+CD24√h,该细胞群具 有高度致瘤能力,20个细胞即可形成肿瘤,而 ALDHl一CIM4+CD24√10”细胞群无致瘤能力。另有 研究评价J,ALDHl、CD44、CDl33等表型对于筛选 肿瘤于细胞的作用,发现ALDHI+CD44+CDl33+细 胞群具有更强的克隆形成能力,更强的黏附、侵袭和 转移能力,在NOD/SCID小鼠中表现出更强的致瘤 能力。提示ALDHl+CD44+CDl33+细胞群富含乳腺 癌1二细胞,町作为筛选乳腺癌干细胞的表面标记口j。 乳腺癌干细胞所表达的CD44、CD24、ALDHl等 受多种因素调控。Twist是成人中胚层组织表达的转 录因子,其表达异常与多种肿瘤发生有关。Vesuna 等一1研究发现,通过基因转染的方法使乳腺癌细胞 株MCF.10A和MCF-7过表达Twist,MUSL腺癌细胞株 中CD44+CD24√h细胞显著增多,ALDHl表达也显 著增加;当敲除Twist基因后,乳腺癌细胞株中 CD44+CD24√k”细胞显著减少。Charafe.Jauffret等M J 研究发现,ALDHl+乳腺癌细胞高表达CXCRl/ IL-8RA,加入晕组人IL-8可使ALDHl+细胞显著增 加,具有更强的形成肿瘤球的能力,而阻断CXCRl可 以显著减少ALDHl+细胞的比例¨J。以上研究表明, 乳腺癌干细胞并非是恒定不变的,可受到多种因素调 控。

1.2中枢神经系统肿瘤干细胞的筛选

最早发现CDl33可能是包括胶质瘤、髓母细胞 瘤在内的多种中枢神经系统肿瘤的干细胞标记物,但 该结论尚存争议。有研究发现单一CDl33一细胞亦 可以形成不同克隆的肿瘤∞1。CDl33表达亦并非一 成不变。Annabi等

1.3消化系统肿瘤干细胞的筛选

CIM4、CD24、ALDH、CDl33等标记也可有效地 应用于消化系统肿瘤干细胞的筛选。CD44+细胞群 可能富含胃癌干细胞旧J,而CD44+CD24+细胞群可 能富含胰腺癌干细胞一J。CDl33则可用于肝癌干细 胞的筛选¨0】。Ma等…o研究发现,ALDH在肝癌细胞 的表达与CDl33表达相关,大部分ALDH+肝癌细胞 表达CDl33,但并非所有的CDl33+肝癌细胞均表达 ALDH。进一步研究发现,CDl33+ALDH+肝癌细胞 比CDl33+ALDH一和CDl33一ALDH一肝癌细胞具有 更强的致瘤能力。此外,有研究应用CD90来筛选肝 癌干细胞¨2J。CD90+肝癌细胞具有在裸鼠体内致瘤 能力,而CD90一细胞不能致瘤。将CD90+肝癌细胞 进一步分为CD44+和CIM4一细胞群,其中大部分是 CD44+细胞群。CIM4+CD90+细胞群具有很强致瘤 能力。使用抗CIM4单克隆抗体可以显著减少 CD90+CD44+细胞致瘤能力,并可导致CD90+细胞发 生凋亡。可见,尽管各种肿瘤的肿瘤干细胞不尽相 同,但很多肿瘤干细胞标记物具有重叠性,提示肿瘤 干细胞的生存可能存在共同的机制。

1.4血液系统肿瘤干细胞的筛选

肿瘤干细胞最早是在急性髓系白血病中发现,认 为白血病干细胞表达与正常造血干细胞相似的表型 CD34+CD38一。目前的研究发现CDl33、ALDH、 CD90等干细胞标记亦可用于筛选血液系统肿瘤干细 胞。Ran等¨引研究发现,ALDH+髓系白血病细胞大 部分表达CD34。在NOD/SCID小鼠模型中,ALDH+亚群较ALDH“一亚群具有更强的致瘤能力,可以在 骨髓和脾脏中形成肿瘤。但在小鼠淋巴结中, ALDH+亚群和ALDH“一亚群形成肿瘤的能力相似, 形成的肿瘤也相对较小。在急性淋巴细胞白血病干 细胞的研究中发现,CD90+CDll0+亚群可能富含急 性T淋巴细胞白血病干细胞¨4|,而CDl33+CDl9一可 能是急性B淋巴细胞白血病干细胞的标志物¨引。 虽然不同来源的肿瘤干细胞免疫表型各不相同, 但仍可发现某些表型是多种肿瘤干细胞所共有的。 如CDl33是干细胞相关标记,同细胞未分化状态有 关,最早在造血干细胞上表达,在乳腺癌、中枢神经系 统肿瘤、肝癌及白血病等肿瘤干细胞上均见表达。 CD44属于细胞黏附分子家族的一部分,其胞外区为 透明质酸受体,而胞内区可以同锚蛋白结合,与细胞 骨架、细胞运动有关¨6|。CD44可能是乳腺癌、胃癌、 胰腺癌、肝癌等多种肿瘤干细胞所共有的标记物。 CD90是一种细胞表面蛋白,可以在多种不同类型细 胞上表达,功能复杂多样,其中介导细胞黏附是其重 要功能之一。内皮细胞表达CD90,可以与表达整合 素CDllc/CDl8或CDllb/CDl8的白细胞相互作用, 介导细胞黏附及跨内皮转移017]。CD90可能是肝癌 干细胞、急性淋巴细胞白血病干细胞等肿瘤干细胞标 记物。ALDH是一组依赖NADP+的酶,可以将各种 醛类氧化成对应的羧酸。而各种醛类在自然界广泛 存在,因其化学活性而在低浓度时即具有毒性。由此

万方数据

可以推断,ALDH可能在保护干细胞不受醛类损害方 面发挥作用otSl。ALDH在白血病干细胞及实体肿瘤 如乳腺癌、肝癌上表达活性增高。共同的免疫标记可 能预示肿瘤干细胞所共有的生存机制。

2侧群细胞

GoodweH等最早发现,当用染料烟酸己可碱 (hoechst 33342)与骨髓细胞共同培养,一小部分细胞 并不积聚染料而表现淡染,该群细胞被称为侧群 (side population,sP)细胞。进一步研究发现,造血干 细胞群富含sP细胞。Hoechst 33342可以随机结合到 DNA富含腺嘌呤和胸腺嘧啶区域,染料的荧光强度 同DNA含量、染色体结构及细胞周期等有关。干细 胞之所以可以表现淡染是因为干细胞膜表面有三磷 酸腺苷结合盒转运体,可以将染料泵出细胞。该机制 亦是干细胞的自我保护机制。研究发现,在包括乳腺 癌:前列腺癌、结肠癌、膀胱癌等多种肿瘤细胞株中均 有SP细胞。sP细胞群可能富含肿瘤干细胞¨9|。 3Wnt/阻连环蛋白通路

Wnt蛋白属分泌性糖蛋白,作为配体同Frizzled 受体及低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6结合,促发下 游一系列事件,最后导致具有多样功能的B连环蛋 白在胞质内积聚,并转位至核内,同T细胞因子和淋 巴增强因子家族相互作用,调节相关基因表达,决定 细胞的增殖和转移等,属于经典Wnt/13连环蛋白通 路激活;另外还存在不依赖B一连环蛋白的非经典Wnt 激活途径,与细胞黏附、细胞运动等相关。多项研究 显示,Wnt通路活性与干细胞相关。Vermeulen等口0j 研究发现,Wnt通路活性较高的结肠癌细胞群具有较 强的克隆形成能力和致瘤能力,提示Wnt通路高表 达的结肠癌细胞富含结肠癌干细胞。Wnt/13一连环蛋 白通路激活后可以直接促进上皮细胞黏附激活分子 (epithelial cell adhesion/activating molecule,EpCAM) 转录。Yamashita等怛¨的研究表明,EpCAM+肝癌细 胞具有更强的克隆形成能力和侵袭能力,可以分化为 EpCAM+和EpCAM一细胞群,并具有更强的在NOD/ SCID小鼠体内致瘤的能力。Wang等旧1的研究亦显 示白血病干细胞的自我更新能力需要Wnt/13一连环蛋 白通路激活来维持。

4细胞黏附

既往的研究是通过获取慢性髓系白血病患者肱 骨上肿瘤组织建立细胞株MB-1,该细胞株由同源的 髓母细胞样细胞组成,具有较强的自我更新能力,可 以在小鼠体内致瘤,被认为富含白血病干细胞。但在 液体培养基或常规半固体培养基中,MB一1细胞株无 法形成克隆并迅速死亡。有研究发现旧J,当与小鼠 骨髓基质细胞共同培养时,MB-1细胞可以黏附在骨 髓基质细胞上,镜下形成”鹅卵石样”形态学表现,提 示细胞黏附使MB一1细胞维持了自我更新特性。相 对于其他慢性髓系白血病细胞,MB.1细胞高表达与 自我更新有关的基因BMll;细胞核内B.连环蛋白水 平明显增加,而p一连环蛋白是Wnt信号通路的核心 信号分子,提示细胞黏附促进MB-1细胞Wnt通路活 化。此外,还发现CD44在MB一1细胞高表达,与细胞 黏附发生有关。Funayama等Ⅲo在另一项研究中将 急性白血病细胞株TF一1细胞和小鼠骨髓来源细胞株 MS-5共同培养,发现在不添加白细胞介素3的条件 下,单纯TF-1细胞无法增殖并迅速死亡,但同MS-5发生黏附后可以缓慢增殖,形成“鹅卵石样”形态学 表现。与骨髓基质细胞发生黏附的TF.1细胞较单独 培养的TF一1细胞株高表达与自我更新有关的基因 BMll,其CD44表达为单纯TF.1细胞的1.9倍。通 过细胞黏附构建肿瘤干细胞龛,可能有助于富集肿瘤 干细胞。

5结语

目前最常用的仍然是通过免疫表型鉴定分离肿 瘤干细胞,但困难在于如何合理地选择备选干细胞标 志物。SP细胞分离技术已较为成熟,已广泛应用于 分离各种肿瘤干细胞。Wnt/13一连环蛋白通路激活在 多种肿瘤中均可见到,有望用于筛选肿瘤于细胞。研 究表明,目前已知的肿瘤干细胞标志物表达并非恒定 不变,特定转录因子及外环境包括细胞黏附可以调控 肿瘤干细胞标志物的表达。肿瘤干细胞的生物学性 状可能由内在遗传学因素和外环境共同决定。

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(收稿日期:2011-01-05修回日期:2011-04-08)

IQGAPl的功能及其在肿瘤发生发展中的作用

黄珞廖贵清

【摘要】 IQGAPl是一种能结合多种信号分子及结构分子的骨架蛋白。通过与目的蛋白相互作

用。参与信号通路的整合和细胞功能的调节。越来越多的研究发现,IQGAPl可通过促进细胞增殖和转

化,降低细胞黏附性以及刺激细胞活动性和侵袭性而在肿瘤的发生发展中扮演重要角色。

【关键词】IQGAPl蛋白;肿瘤

Functions of IQGAPl and its impact on tumors HUANG k,LIAO Cmi?qing.‰啦眦School ofStoma?

tology,Sun Yat一&n University,Guangzhou 510055,China

Corresponiag author:HAO Gui-qing,E-mail:drliaoguiqing@hotmail.com

【Abstract】IQGAPl is a scaffold protein which binds to various signaling and structural molecules.By

interacting试tII target proteins.IQGAPl participates in integration of signaling pathways and reguhtion of cellu—

DO!:10.3760/cma.j.isan.1673-422X.2011.06.005

作者单位:510055中山大学光华口腔医学院

通信作者:廖贵清,E—mail:drliaogniqing@hotmail.c啪

?综述? 万方数据

肿瘤干细胞的鉴定与分离

作者:林之光 , 陈波斌 , LIN Zhi-guang, CHEN Bo-bin

作者单位:复旦大学附属华山医院血液科,上海,200040

刊名:

国际肿瘤学杂志

英文刊名:JOURNAL OF INTERNATIONAL ONCOLOGY

年,卷(期):2011,38(6)

被引用次数:2次

参考文献(24条)

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引证文献(2条)

1. 杨国华 . 薛芳沁 . 黄若磊 ω-3脂肪酸抑制SW480结肠癌干细胞生长的研究 [期刊论文]-中国普通外科杂志 2012(10)

2. 薛芳沁 . 杨国华 . 黄若磊 CD44+-ESA+在结肠癌干细胞分选中的应用 [期刊论文]-中华胃肠外科杂志 2011(11)本文链接:http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_gwyx-zlxfc201106004.aspx

范文二：肿瘤干细胞及其分离鉴定

?138? 艘塑堑窒量!堕鏖垫!Q堡;旦筮丝鲞筮!塑g坚堡!坠!!!丝!坚!堡!鲤!:塑!些!翌垫!垒坠!:呈墨坠兰

肿瘤干细胞及其分离鉴定

王娜综述关泉林祝秉东 张颖审校

【摘要】肿瘤干细胞(TSC)是肿瘤组织中充当干细胞角色的细胞,具有无限增殖的潜能,在启动

肿瘤形成和生长中起着决定性的作用。从血液系统肿瘤和实体瘤研究获得的数据提示,在每一个癌组织

内只有--d,部分的细胞群具有这样启动肿瘤演进的能力,这些肿瘤起始干细胞承担着肿瘤干细胞或癌干

细胞的特定功能,而其余的大多数细胞则经过短暂的分化,最终死亡。近年来随着干细胞和TSC的深入

研究,越来越多的证据表明TSC是恶性肿瘤转移复发的原因,因此分离鉴定出TSC对阐明肿瘤发病机制

和研发抗肿瘤药物具有重要意义。目前分选技术尚未成熟,主要是利用TSC的生物学和表面标记。采用

高效的流式细胞仪和磁性细胞分选仪分选TSC或干细胞样细胞,判断其是否具备自我更新与增生分化

的能力。TSC的鉴定现在通常用的验证手段包括根据特异的细胞表面标志鉴定TSC,采用染料Hoechst

33342鉴定TSC,采用Brdu法鉴定TSC及利用TSC的生物学特性在体外培养进行初步的鉴定等。但是

进行TSC鉴定的最具说服力的方法主要是根据细胞体内成瘤能力鉴定TSC。

【关键词】肿瘤干细胞;细胞分级分离; 胃肿瘤

Cancer stem cells and their isolation and identification WA NG N扩.GUAN quan-lin,ZHU Bing-dong,

ZNA NG y略+Oneologicd Surgery,First Hospital ofLamhou University,Lanzhou 730000,China

Corresponding author:ZHU Bing-dong,Email:bdzhu@lzu.edu.cn

【Abstract】 Cancer stem cells眦a subclass of stem—cell?like tumor ceUs.They have all apparently

higher tumorigenicity than other cell populations within the same tumor.They play a very important mh in

genesis,development and maintenance of cancer.The data from research in leukemia

and solid tumors suggest

that in each cancer tissue,only a small fraction of the cells have the ability to initiate tumor,which ale called

cancer stem cells.In recent years,with

in—depth research on stem cells and cancer stem cells,accumulating

evidence suggests that cancer stem cells a弛the

cause

of malignant tumor metastasis and recurrence and are resistant current cancer drugs.Drugs targeting cancer stem ceUs are urgently needed.Flow cytometry and magnetic cell sorting using the identified tumor stem cell surface markers are mainly used to separate cancer stem ceUs or stem cell—like ceUs.In this article,the concept of cancer stem cells and the commonly used approaches to isolate

and identify cancer stem eels,especially for gastric cancer stem cells will be reviewed. 【Key words]Tumor stem cells;Cell fractionation;Stomach neoplasms

肿瘤(tumor,neoplasm)是指细胞在致癌因素作用下,基因

发生了改变,失去对其生长的正常调控,导致单克隆性异常增

生而形成的新生物。这种新生物常形成局部肿块,因而得名。传

统观念认为,肿瘤是由体细胞突变而成,每个肿瘤细胞都可以

无限制地生长。但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力

以及并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象。肿瘤细胞生

长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似。因此,有

学者提出肿瘤干细胞(tumor stem cell。TSC)的理论。这一理论

为我们重新认识肿瘤的起源和本质,为临床肿瘤治疗提供了新

的方向和视觉角度。

DOhl0.3760/cma.j.issn.1006-9801.2010.02.026

基金项目:教育部长江学者讲座教授项目和教育部新世纪优秀人

才支持计划(NCET一07-0403)

作者单位:730000兰州大学第一医院肿瘤外科(王娜、关泉

林);兰州大学病原生物学研究所(祝秉东、张颖);甘肃省新药临床前

研究重点实验室(祝秉东、张颖);美国约翰斯-霍普金斯大学布隆博

格公共卫生学院分子微生物学与免疫学系(张颖)

通信作者:祝秉东,Email:bdzhu@lzu.edu.clI ?综述?

1干细胞与rI’SC

干细胞(stemcell,SC)是一类具有自我复制能力的多潜能 细胞,在一定条件下,它可以分化成多种功能细胞。SC有两种 分类方法,一是根据sC所处的发育阶段分为胚胎干细胞 (embryonic stem cell,ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。第二种分类方法是根据干细胞的发育潜能分为三类:全 能干细胞(tofipotent stem cell)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)。ES细胞的发育等级 较高,是全能干细胞,而成体干细胞的发育等级较低,是多能或 单能干细胞【11。

TSC是指肿瘤细胞中极少数具有SC特性的细胞,有自我 更新和分化潜能,能形成分化程度不同的肿瘤细胞。其特点为 在肿瘤细胞中所占比例较少(约0.1%~4%);具有极强的自 我复制更新能力,能够产生与上一代完全相同的子代细胞;具 有多向分化能力,能够产生不同表型的肿瘤细胞;具有与非致 瘤细胞不同的表面标志fIj。但是TSC的概念已经不是—个新词 了,早在1963年,Bruce和VanDerGaag就发现在小鼠的淋巴

万方数据

照堕塑壅量堕盎垫!Q生2旦箜丝鲞箜2塑垦竺塑垦!!塑曲塑i业匦!:!尘翌!翌垫!垒:!尘:!!:塑!:兰 ?139?

瘤细胞中只有不到l%的细胞具有增殖能力。1968年在小鼠的 浆细胞肿瘤中又有同样的发现。1970年,有人用软琼脂法发现 在白血病和多发性骨髓瘤细胞中只有0.1%一l%的细胞有成 瘤性讶。

1SC因为在各种致瘤因素的作用下,在基因水平失去对其 生长的上E常调控。而表现出无限增生、转移和异质性等特点。随 着对肿瘤发病机制认识的深入,人们发现TSC与sC有很多极 为相似的特征:(1)都具有无限增殖和分化的特点;(2)存在 相似的调节自我更新的信号转导途径;(3)都具有不同表型和 异质性;(4)都具有端粒酶活性;(5)都能转移到各种不同的 组织且有相似的归巢和转移途径。当然,TSC还具有不同于Sc 的特点:(1)自我更新信号转导途径的负反馈机制已被破坏; (2)缺乏分化成熟能力;(3)倾向于累积复制的错误,而sc能 够防止复制错误的发展等闭。从TSC和sc的异同点不难看出, 1sC可能起源于相应正常SC的突变。

TSC有其特殊的分子标志特征,利用这些表面标志我们就 可以从肿瘤细胞中分离TSC。如Collins等【4l从前列腺癌细胞中 分离的TSC表面标志为CD2./d 2Bihl/CD南,Fang等嘲分离出 的恶性黑素瘤细胞干细胞表面标志为cD盎,Kim等161从肺腺癌 细胞中分离出的表面标志为Sea21+CD矗Pecam‘CD矗等。

2TsC分离与鉴定

2.1TSC的分离

TSC的研究处于初级阶段,分选技术尚未成熟。目前主要

采用两种手段,一种是流式分选(fluorescence-activated cell 嘛,FACS);另一种是磁式分选(magnetic activated cell sorting,MACS)。FACS方法是利用TSC表面一些膜蛋白(主要 是一些CD抗原,如CD。17、CD阶CD孙cD。/CD。等)表达上调 或下调的特点,用其一种或两种以上的不同激发波长的荧光 素标记的mAb标记单细胞悬液后用流式细胞仪分选TSCm。 MACS的原理则是利用未标记的CD抗原等蛋白的mAb作为 第一抗体与单细胞悬液孵育后,再用免疫磁珠(micro-beads) 标记的第二抗体结合,利用这种特异性一抗、二抗标记的细胞 悬液流过特制的永久磁铁的磁场时,可吸附在MACS柱内,再 将MACS柱移开磁场从柱内洗脱、收集的鉴定[sl。这些技术有赖 于细胞表面标志物的识别。

2.1.1利用细胞表面的蛋自标志物及特异抗体进行分选

研究表明:一些膜表面蛋白如CDll7、CDl33、CD补Nestin、 Nanog、Oct4等可在多种Sc中表达,用其中的一种或几种不同 的荧光素标记的单克隆抗体标记单细胞悬液后,可用FACS分 选。如乳腺癌19l等TSC的研究中运用了此种方法。

2.1.2利用sP细胞亚群的分析或许可作为TSC分选的手段旧 研究发现:sP细胞在肿瘤总细胞中极少并表达不同种类 的ArIP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白,如mdr-1和BCRP,导致其对化疗药物的天然抵抗;在肿瘤治疗中如果 靶向清除sP细胞,则能提高肿瘤疗效。目前在甲状腺癌…等的 研究中就是采用这种方法对TSC进行初步筛选的。

2.1.3利用干、祖细胞中醛脱氢酶(ALDH)含量较高进行分选 ALDH是存在于胞液中的一种氧化还原酶,主要对细胞内 的醛进行氧化,在乙醇和维生素A的氧化及环磷酰胺耐药中 均有重要作用。此外,利用肿瘤组织的微阵列分析也发现 ALDH+的乳腺癌临床预后差。目前临床上测定ALDH的活性 为乳腺癌的早期发现提供了有力支持。

2.1.4抗凋亡或许可作为分选TSC的手段啕

TSC是肿瘤中存在的极少数具有自我更新和繁殖能力等 Sc特性的细胞亚群,这一亚群细胞是肿瘤生长的“种子”。而 在肿瘤中占绝大多数的肿瘤细胞经过有限的增殖和更新后则 凋亡。

2.2TSC的鉴定

目前,难以从形态学角度对TSC进行鉴定,只能从功能 学方面进行分析。

2.2.1根据特异的细胞表面标志鉴定TSC

Sc的研究中,一般从细胞表面标志、分化潜能等方面对 sC进行鉴定。Sc研究的发展很大程度上依赖细胞表面分化抗 原的研究进展。因此,TSc分离鉴定的最重要方法就是确定细 胞表面特异性标志,一般原则为结合谱系标志、正常sc的特 异标志和正常组织特异性标志等综合评价旧。这种方法系统、 全面、可信度高,但困难在于很难科学地确立鉴定TSC的细胞 表面特异性标志。

2.2.2采用染料Hoechst 33342鉴定TSC

荧光染料HoechesG3342是一种脂溶性DNA结合染料, 可以穿过细胞膜而与DNA结合。其激发光为350am,在424. 444nm之间可以检测到发射光值,一直以来在细胞周期研究 方面得到广泛的应用。现发现有极少一部分细胞可以将进入细 胞核的荧光染料排出胞外,在荧光显微镜下观察或流式细胞检 测时表现为不着色。他们将这类细胞命名为sP(side population)细胞,将这种表型命名为sP表型【14】。这种方法简单 实用,但需要带有紫外光发射器的流式细胞仪,其价格昂贵且 操作费用很大。此外,这种方法虽然能有效地得到有祖细胞功 能的细胞群体,但由于制备和纯化方法不同而差异很大,得到 的所谓sP细胞并不等同于TSC。

2.2.3采用溴脱氧尿嘧啶核苷(BMU)法鉴定1司C

BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物,通过竞争掺人s 期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU经活体注射 或细胞培养加入后,利用抗BrdU单克隆抗体免疫细胞化学染 色,显示增殖细胞。如果细胞迅速分裂,Brdu则被稀释而检测 不到;如果细胞分裂缓慢,则可以被检测到。因此BrdU常被用 来鉴定体sC及其在SC龛中的位置,这种细胞被称为标记阻 滞细胞(1abel.retaining cell,LRC)1131。这种方法一般应用于活体 组织中检测TsC。

2.2.4悬浮培养分选假说

利用TSC的生物学特性在体外培养进行初步的鉴定,即 看体外培养的TSC是否呈悬浮球状生长、是否具自我更新和 增殖能力、是否具多向分化潜能。

2.2.5测定体外克隆形成能力鉴定TSC

将初步鉴定出的TSC注入NOD/SCID小鼠体内,从而观 察其致瘤性。此种方法被认为是现在进行TSC鉴定的最具说 服力的方法。

万方数据

?140? 贮擅婴壅皇堕鏖垫!Q堡!旦箜12鲞箜!塑堡墅!竺曼壁婴b磐!垡!i!:!!!型!翌垫!Q:!型:丝:塑!:兰

3胃癌TSC

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率在我国居各类 肿瘤的首位。每年约有17万人死于胃癌,几乎接近全部恶性肿 瘤死亡人数的1/4.且每年还有2万以上新发胃癌患者。但胃 癌的发病机制目前还不十分清楚。近年来,随着TSC研究的深 入,越来越多的证据表明,胃癌发生过程中,也存在TSC。比较 有代表性的工作是Houghton等f,鼍发现,在小鼠幽f J螺杆菌引起 胃的炎症组织中发现有骨髓造血干细胞的迁移,而这些SC随 后发展成胃肿瘤。但目前为止分离鉴定出胃癌TSC的证据仍 不是很充分。

胃组织存在自己特异的Sc。大鼠和人类胃的sc初步分化 为3种前体细胞:(1)前黏液细胞,其进一步分化为黏液细 胞。(2)前壁细胞。(3)前黏液颈细胞。成熟的壁细胞是由以 上3种前体细胞分化而来。一般认为,胃的sc定位于腺体峡 部区域,不同种类的前体细胞从这里产生,并向上或向下双方 向迁移,最终形成成熟的胃黏膜细胞,即壁细胞、主细胞、黏液 细胞和内分泌细胞【161。

Takaishi等㈣用细胞表面标记物CD。来标记胃癌细胞系, 在其中的三个细胞系MKN.45、MKN.74和NCI—N87中发现有 CD&表达的细胞,且都具有增殖能力和致瘤性,而且具有抗化 疗药的作用,但另外一些细胞标记物如CD孙CDm、CD阶 SSEA.1和SSEA-4等则没有致瘤性。这些证据也表明了胃癌 TSC的存在,而且cD。很可能作为胃癌sc的表叵i标志物。另 外,已有越来越多消化道肿瘤中分离出SP细胞的研究报道。 Haraguchi等11Sl采用流式细胞术和DNA染料H0echst 33342在 好几种人类消化系统肿瘤细胞系中分离到了sP细胞。所选择 的16种消化系统肿瘤细胞系中有15种存在SP细胞,分别占 细胞总数的0.3%一2.2%。他们用基因芯片、RT.PCR以及免 疫组织化学染色等方法分析了肝癌细胞系HuH7中sP细胞与 Non.SP细胞基因表达的差异情况,发现与胚胎发育和肝组织 分化相关的GATA6基因在SP细胞中的表达明显上调。在肝癌 细胞系HuH7和结肠癌细胞系SW480中,sP细胞表现出自我 更新以及分化能力,能够产生sP细胞和非sP细胞,说明消化 系统的一些肿瘤中含有拥有SC特征的SP细胞亚群。耿莉等【-91用Hoechst 33342染色结合荧光显微镜观察到人类胃癌 BGC2823细胞系中有sc样sP亚群的存在,且该表型细胞数 量少。体积较小,该实验还应用免疫荧光染色的方法通过原 位观察证实sP细胞表达sc标志物ABCG2。王宁等IZOJ用 Hoechst 33342染色结合荧光显微镜观察胃癌细胞株MKN.28, 并探讨ABCG2在胃癌细胞系MKN-28中的表达,对胃癌细胞 的分选进行了初步尝试,并成功分析了胃癌细胞系MKN.28的SP亚群。

4问题与展望

TSC概念的提出是人类认识肿瘤发病机制的一大进步。并 且随着更多的肿瘤相继分离出TSC,这种理论有助于阐明肿瘤 发生、发展、转移、耐药的机制。有助于肿瘤的诊断、治疗和预后 评估,有助于筛选靶向性杀伤TSC的药物从而得到根治肿瘤 的目的。但是对于TSC的概念和理论尚有争议,由于肿瘤细胞 的遗传不稳定性和异质性等,目前仍有许多问题有待研究。现 在虽已有研究表明胃癌组织中存在着胃癌TSC,但更多的是研 究胃癌细胞中分离出的sP细胞。关于胃癌TSC的实验证据仍 不充分,因此对胃癌TSC的分离及研究现仍需要做大量的工 作。今后工作的方向应为分离鉴定胃癌TSC及进行生物标志 物研究。筛选胃癌恶性度相关生物标志物。弄清胃癌TSC产生 机制及胃癌TSC与转移和预后的关系。

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(收稿日期:2009-06-11) (本文编辑:贾力涛校对:杨璐)

万方数据

范文三：肿瘤干细胞的分离及鉴定

www.CRTER.org

卞合涛，等．Wnt 信号与神经干细胞分化

关于作者： 第一作者构思并设计本综述，

同时搜集资料、 分析并起草， 通讯作者审校。

1992 年从动物中枢神经系统分离培养成功 以来，近十几年已有了突飞猛进的发展，成 为治疗中枢神经系统疾病最有发展潜力的种 子细胞。神经干细胞在一定的诱导条件下， 可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质 细胞等。

文拟探讨 Wnt 信号通路及其在神经干细胞 分化中的作用，为以后神经干细胞定向分化 为神经元的研究提供理论基础。

利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关

雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利 益的赞助。

临床应用的意义：Wnt 信号通路在神经

干细胞分化中起到重要作用，总结近几年关 于神经干细胞分化与 Wnt 信号通路之间关 系的相关研究，为临床上应用神经干细胞移 植治疗神经系统疾病提供理论依据。

伦理批准：没有与相关理论道德冲突的

内容。

本综述增加的新信息：目前，对于神经

干细胞定向分化为神经元的研究还很少，本

此问题的已知信息：神经干细胞性自

ISSN 1673-8225

CN 21-1539/R

2010 年版权归《中国组织工程研究与临床康复》杂志社所有

团。选定的干细胞表面标志物CD133及CD34

肿瘤干细胞的分离及鉴定：本刊中文部

1 2 3 4 5 6 7 8 9 血清剥夺法分离U87细胞系中的胶质瘤 无血清培养基体外分离培养人胶质瘤干 肺癌细胞系中肿瘤干细胞的分离鉴定与 筛选鉴定Thy-1标记阳性肝癌细胞系中的 无血清培养肾癌干细胞及其鉴定 无 血 清 悬浮培 养 肾 癌干 细 胞表 面 标 志 肠癌细胞系SW-620中肿瘤干细胞相关 EpCAMhigh/CD44+ 结直肠癌干细胞的形 简化无血清培养基分离U2-OS人骨肉瘤 的人胶质瘤干细胞可在体外连续传代，培养方法 简便快捷。对进一步研究其生物学特性尤为关 键。见2009年10期1896~1900页。

分子进行流式细胞仪鉴定，最终得到了少量 CD133+、CD34 细胞。作者认为运用无血清培

-

养技术从肾癌细胞中是可以获得肾癌干细胞 的。见2009年32期6284-6288页。 6 无血清悬浮培养肾癌干细胞表面标志CD133 鹏(江苏大学附属医院泌尿外科，江苏省镇 推荐理由：实验分别测定了无血清培养肾 癌细胞(具有干细胞特性)、 肾癌细胞及正常肾组 织细胞端粒酶的活性，结果显示端粒酶活性在 肾癌干细胞球的表达同在肾癌细胞中一样明显 高于正常肾组织。虽然肿瘤细胞及肿瘤干细胞 中端粒酶活性都增加， 但其各自有不同的意义。 肿瘤中绝大多数细胞只具备有限增殖能力，靶 向这些细胞虽然能够使肿瘤消退或缓解，但是 治疗如果不能杀死导致肿瘤形成并维持肿瘤生 长的肿瘤干细胞，那么肿瘤干细胞仍然可以导 致肿瘤的复发。这一结论提示，端粒酶活性抑 制剂不仅能抑制或杀死肾癌细胞，而且对决定 肾癌发生发展的干细胞也有作用。见2009年27 期5286-5290页。 7 肠癌细胞系SW-620中肿瘤干细胞相关SP亚 高钢龙(南方医科大学附属奉贤医院普外 科(上海市奉贤区中心医院普外科)，上海市 201400) 8 EpCAMhigh/CD44+ 结直肠癌干细胞的形态

干细胞 细胞与鉴定

3 吴

肺癌细胞系中肿瘤干细胞的分离鉴定与功 婕(解放军军事医学科学院放射与辐射医 推荐理由：肿瘤干细胞是影响肿瘤发生发

及端粒酶活性的表达 潘 江市 212001)

功能分析 卵圆细胞样干细胞：可能是肝肿瘤干细胞吗？

能分析 学研究所，北京市 100850) 展的关键细胞群，也是决定肿瘤治疗彻底与否 的关键。从肿瘤细胞系中发现、分离肿瘤干细 胞是解决肿瘤干细胞体外分离和培养的可靠手 段。本实验对两株遗传背景相似、转移特性不 同的细胞进行了肿瘤干细胞的分离鉴定和功能 分析， 初步显示具有高转移潜能的PLA-801D细 胞中含有少量的肿瘤干细胞，且该细胞在体外 的可塑性较好， 这些都可能是PLA-801D细胞转 移潜能明显高于PLA-801C细胞的重要原因。 见 2010年32期5988~5991页。 4 筛选鉴定Thy-1标记阳性肝癌细胞系中的卵

CD133及端粒酶活性的表达 SP亚群分析 态特征及分布 细胞系肿瘤干细胞 1 胞 刘于海(安徽医科大学附属省立医院神经外科， 安徽省立体定向神经外科研究所，安徽省合肥 市 230001) 推荐理由：胶质瘤干细胞的研究尚处于探 索阶段，其细胞的起源、特异性标记物、生物 学行为、增殖分化的信号途径等机制还不是很 清楚。实验采用血清剥夺的方法成功地从U87 细胞系中筛选出肿瘤干细胞，并使其增殖形成 肿瘤球。为阐明脑胶质瘤的发病机制，发现新 的临床治疗策略均具有积极的意义。见2010年 1期6~10页。 2 袁 无血清培养基体外分离培养人胶质瘤干细 血清剥夺法分离U87细胞系中的胶质瘤干细

圆细胞样干细胞：可能是肝肿瘤干细胞吗？ 程变巧(解放军南京军区福州总医院肝胆外科， 福建省福州市 350002) 推荐理由： 卵圆细胞是肝脏的正常干细胞， 研究认为其是肝癌的始动细胞，与肝癌发生密 切相关。Thy-1是卵圆细胞的标记蛋白，在肝癌 中有一定的表达。实验结果证实Thy-1+细胞是 肝癌干细胞，在肝癌患者进一步行血清学和组 织学检测中，有助于对肝癌病情的复发及远处 转 移 和 预 后 进 行 预 测 。 见 2010 年 10 期 1795~1798页。 特征及分布 张秋菊(解放军兰州军区兰州总医院病理科，甘 肃省兰州市 9 730050) 群分析

胞与鉴定 鲁(青岛大学医学院附属医院，山东省青岛 推荐理由： 体外传代多次的细胞系其生长环 境与体内有较大差异，从中提取的肿瘤干细胞可 能已经发生某些生物学行为的变化。实验中采用 无血清培养法，从胶质瘤手术标本中成功培养出 市 266003)

5 潘

无血清培养肾癌干细胞及其鉴定 鹏(江苏大学附属医院泌尿外科，江苏省镇 212001) 推荐理由：实验应用无血清培养的方法对

简化无血清培养基分离U2-OS人骨肉瘤细

胞系肿瘤干细胞 郭洪章(四川省攀枝花市第二人民医院骨科，四 川省攀枝花市 617068) 详见： http://www.crter.org/Html/2010_10_ 16/ 2_64026_2010_10_16_133341.html

江市

肾癌细胞株OS-RC-2培养，经过一段时间后出 现细胞聚集成的细胞球，并呈悬浮生长，这种 细胞球可能是单个干细胞增殖分化形成的细胞

7550

P.O. Box 1200, Shenyang

110004

cn.zglckf.com

范文四：肿瘤干细胞理论及肿瘤干细胞分离和鉴定研究进展_宋东颖

肿瘤干细胞理论及肿瘤干细胞分离和鉴定研究进展

宋东颖 1, 2, 王 毅 2, 孙 岚 1, 张英鸽 1

(1．军事医学科学院毒物药物研究所纳米药理毒理重点实验室 , 北京 100850;

2．吉林大学药学院 , 吉林 长春 130021)

摘要 :肿瘤 是 当今社会 对 人 类健康 和 生 命危害 最 大 的 疾 病 之 一 , 即 使 在 人 类医 学 科技迅速 发 展 的 今 天 , 对 于 肿瘤 的 治疗 仍 是 一大 难题 , 其 根本 原 因 是 对 肿瘤 的 发 生 、 发 展 、 转 移 和 复 发 的 机制 尚 不 清 楚 。 近些 年 来 , 研究 人 员 通过 对 肿瘤 细胞表 面标 志物 、 增 殖 能 力 和 致 瘤 能 力 等 的 深 入 研究 , 提 出 了肿瘤 干 细胞 理 论 , 即 肿瘤 中 存 在 着 少 数 具 有 无 限 自 我 更 新 能 力 和 异 种 免疫 缺陷 动 物 致 瘤 能 力 的 干 细胞 样 肿瘤 细胞 , 它们 在 肿瘤 的 发 生 、 生 长 和 转 移 等 生 物学 过 程 中 起 着决 定 性的作用 , 该 理 论 的 提 出 给 肿瘤 治疗 提 供 了新 的 思 路 和 策略 。 本文 将 对 肿瘤 干 细胞 理 论 的 形成 和 发 展 过 程 , 肿瘤 干 细胞 的 特 性 以 及 肿瘤 干 细胞 的 分 离 和 鉴 定 最 新 研究 进 展 进 行 综述 。

关键词 :肿瘤 ; 肿瘤 干 细胞 ; 生 物学 特 性 ; 分 离鉴 定

中图分类号 :R73-3, R965．2文献标志码 :A 文章编号 :1000-3002(2012) 05-0674-06

DOI :10．3867/j．issn．1000-3002．2012．05．014

肿瘤干细胞是指肿瘤中具有无限自我更新能力并能产 生出异质性肿瘤细胞的细胞 。 研究发现 , 这类细胞与肿瘤 的生长 、 转移和复发具有密切联系 [1－2]。 这类细胞的很多性 质与干细胞类似 , 因此将其称为肿瘤干细胞 。

目前 , 临床肿瘤治疗中的主要难题就是转移和复发 。 传 统肿瘤学理论认为 , 所有的肿瘤细胞都具有无限增殖的能 力 , 因此 , 临床上主要是通过手术 、 放疗和化疗对整个实体 肿瘤病灶进行杀伤 , 然而这些治疗方法不能有效地杀死癌症 病灶 , 特别是对转移病灶治疗效果更是有限 。 并且很多患者 在结束治疗后会出现肿瘤复发现象 , 复发后的肿瘤对于化疗 或放疗具有极强的耐受性 , 传统肿瘤学理论无法合理解释肿 瘤的产生 、 转移和复发现象 。 随着实体肿瘤研究的深入展 开 , 研究人员发现肿瘤组织中存在干细胞样的肿瘤细胞 , 即 肿瘤干细胞 , 肿瘤干细胞理论随之诞生 。

1肿瘤干细胞的发现

早在 20世纪 50年代 , Hewitt 等 [3]在进行肿瘤细胞的自 体 /异体移植实验时发现 , 将白血病小鼠的肿瘤细胞移植到 同种小鼠体内后 , 仅有 0．1% 1%的少部分细胞形成克隆集 落 。 对此研究人员提出两种不同的理论来解释这一发现 :一 种理论认为出现这种现象的原因是由于肿瘤细胞具有同质 性 , 即每一个肿瘤细胞都具有新生肿瘤的潜力 , 但是能进入 细胞分化周期的肿瘤细胞很少 , 是一个小概率随机事件 , 这 就是肿瘤的随机化理论 ; 另一种理论就是分层理论 , 即肿瘤 细胞具有功能异质性 , 只有有限数目的肿瘤细胞具有产生肿 瘤的能力 , 并且这些肿瘤细胞再生肿瘤是高频事件 , 而这一 理论逐渐被更多的研究人员所接受 。 这类具有非常高的增

作者简介 :宋东颖 (1985－) , 男 , 硕士研究生 , 主要从事生物 医学工程研究 , E-mail :figo115@163．com , Tel :(010) 66931623; 张 英鸽 (1958-) , 男 , 研 究 员 , 博 士 生 导 师 , 主 要 从 事 纳 米 药 物 药 理 研究 。

通讯作者 :张英鸽 , E-mail :zhangyg58@126．com , Tel :(010) 66930654 殖能力 、 分化能力和致瘤能力的细胞也成为了研究的重点 。 1977年 , Hamburger 等 [4－5]在骨髓瘤等细胞的体外软琼 脂克隆形成实验中发现 , 只有不到 0．2%的骨髓瘤细胞才能 形成克隆 , 不到 4%的细胞才能在非肥胖糖尿病 /重症联合免 疫 缺 陷 (nonobesediabetic /severecombined immunodeficient , NOD /SCID) 小鼠脾内形成肿瘤 , 并提出了通过杀伤此类细胞 而达到治愈肿瘤的设想 。 此后 , 多个研究组在肺小细胞癌 、 神经胶质瘤 、 黑色素瘤等肿瘤的研究中也发现了类似的现 象 。 有人将这些小量的具有成瘤能力的细胞称之为 “ 肿瘤干 细胞 ” , 也提出通过杀伤肿瘤干细胞有可能达到治愈肿瘤的 目的 , “ 肿瘤干细胞假说 ” 逐渐受到了研究人员们的关注 。 1997年 , Bonnet 等 [6]研究人类急性粒细胞白血病时 , 首次成 功分离出了表型为 CD34+和 CD38－的白血病肿瘤干细胞 , 并发现此类细胞与普通肿瘤细胞相比具有很高的体内成瘤 能力 , 从而证实了肿瘤干细胞的存在 。 随后在其他多种肿瘤 组织和肿瘤细胞系中也证实了肿瘤干细胞的存在 [7－8]。

2肿瘤干细胞与肿瘤的发生

肿瘤干细胞理论认为 , 发生肿瘤的根源就是机体组织中 形成了肿瘤干细胞 , 而肿瘤干细胞的来源有三个途径 :① 正 常组织中原有的干细胞由于突变因素的积累 , 发生突变而产 生 ; ② 组织中含有的祖细胞发生基因重排 , 从新获得与干细 胞类似的表型和特性 , 形成肿瘤干细胞 ; ③ 骨髓来源的干细 胞发生突变产生 [9]。 而这些突变一般发生于某些信号通路 中的关键蛋白 , 这些信号通路在干细胞增殖和更新过程中发 挥重要作用 , 例如 Wnt 通路 、 Notch 通路等 。

2．1Wnt 通路

Wnt 信号通路是一类广泛作用于动物生长发育过程的 信号通路 , 对细胞增殖 、 分化 、 迁移过程以及干细胞池的维持 和不对称分裂等方面起着重要的作用 , 并且可以决定细胞的 极性 、 命运 , 在成年期则主要参与机体内平衡的稳定 。 该通路中有两个关键蛋白 :Wnt 蛋白和 β联蛋白 。 Wnt 蛋白是细胞内一类分泌型糖蛋白 , 是此通路的起始蛋白 , 它

能与胞膜上的卷曲蛋白受体家族和低密度脂蛋白受体相关 蛋白 (LDL-receptor-related protein , LRP ) 中的 LRP-5和 LRP-6结合 。 β联蛋白是该通路发挥效应的关键蛋白 。 正常状态 下 , 由酪蛋白激酶 1α、 糖原合成酶激酶 -3β、 抑癌因子 APC 和 轴蛋白 (axin ) 组成的 β联蛋白降解复合体可与 β联蛋白结 合 , 使胞内 β联蛋白含量维持在一个较低水平 。

在正常细胞中 WNT 抑制因子 -1(Wnt inhibitory factor-1, WIF-1) , Cerberus 和 分 泌 型 卷 曲 蛋 白 相 关 蛋 白 家 族 (如 FrzB ) 竞争性地抑制 Wnt 蛋白与卷曲蛋白受体结合 , 而 Dick-okpf 家族 (如 DKK-1和 DKK-2) 通过间接减少可利用的辅助 受体 LRP 的数量来抑制 Wnt 蛋白与 LRP-5, LRP-6等受体结 合 。 如果此抑制过程中的某些蛋白发生突变 , Wnt 蛋白可与 相应受体发生结合 , 从而活化 Wnt 信号使细胞内散乱蛋白激 活 。 活化的散乱蛋白能使 β联蛋白降解复合体发生解离 , β联蛋白从而可以在细胞质内发生积聚 , 最后进入细胞核启动 靶基因过度转录表达 , 其靶基因包括原癌基因 c-myc 、 周期蛋 白 D1、 基质溶解酶 、 成纤维细胞生长因子 、 上皮细胞生长因 子和存活蛋白等 , 而这些表达产物均有助于肿瘤的发生和迁 移 。 研究发现 , 大部分胃肠道癌症均是由 Wnt 通路突变引 起的 , 其中 β联蛋白降解复合体中的 APC 是最常见的突变 位点 , 该通路的突变最终引起 β联蛋白调节的靶基因过度表 达而引起肿瘤的发生 [10]。 进一步研究表明 , 在白血病和乳 腺癌等多种肿瘤干细胞发生早期均伴有 Wnt 通路的突变或 调节异常 , 而且 Wnt 信号通路在肿瘤干细胞的稳定和自我更 新过程中发挥着重要作用 [11－13]。

2．2Notch 通路

Notch 通路在脊椎动物和无脊椎动物的发育过程中 , 对 细胞生长 、 发育和凋亡 、 命运的决定 、 神经系统的发育 、 器官 的形成等生理过程具有重大意义 , 并且证实在肿瘤细胞中也 起着重要作用 。

Notch 受体是细胞中广泛存在的一类高度保守的受体蛋 白 。 该受体在细胞中首先以单体蛋白的形式合成 , 经高尔基 体的修饰后转移到细胞表面 , 最后经过原蛋白转化酶切割与 Lin-12/Notch重复蛋白 (Lin-12/Notchrepeats , LNR ) 在跨膜 区形成异二聚体 , 形成成熟的 Notch 受体 。 当成熟的 Notch 受体与相邻细胞的 Notch 配体发生作用后 , 受体通过先后两 次裂解 , 释放出活化的 Notch 受体胞内区 (Notch intracellular domain , NICD ) 进入细胞质中 。 通过细胞内吞作用和膜泡运 输 , NICD 经过核孔进入细胞核 , 首先与 DNA 转录抑制因子 CSL 结合形成短期的核转录异二聚体复合物 , 接着与转录辅 助激活蛋白 MAML 结合形成三聚体 , MAML 能募集组蛋白乙 酰转移酶等乙酰化组蛋白的因子 , 最终三聚体成为转录激活 因子诱导其下游靶基因的表达 。

研究发现 , Notch 信号通路由于所处环境的不同 , 在不同 癌细胞中起着不同的作用 , 即该通路发挥作用具有环境依赖 性 。 该通路根据被激活 Notch 受体种类 、 被激活受体量的不 同 、 细胞种类的不同 、 细胞所处微环境的不同 、 通路与其他通 路所处关系的不同 , 既有可能促进癌细胞增殖和迁移的作 用 , 也可能抑制癌细胞的作用 [14]。

3肿瘤干细胞的特性

肿瘤干细胞顾名思义既具有肿瘤细胞的特性 , 同时也具 有正常干细胞的某些特性 , 具体有如下基本特性 。

(1) 肿瘤干细胞不是处于分化途径的终端 , 而是保持未 分化的状态 , 具有无限增殖能力和分化潜能 。 肿瘤的发生是 一个长期的突变积累过程 , 在皮肤及肠黏膜上皮等肿瘤的高 发部位 , 衰老细胞不断地死去并脱离机体 , 只有干细胞是唯 一可以长期存在的细胞 , 有可能积累多次突变而生成肿瘤干 细胞 , 进而最终形成肿瘤 [15]。

(2) 肿瘤干细胞在肿瘤细胞当中所占的比例非常小 , 它 主要通过两种方式分裂 :一种是对称分裂 , 即形成两个相同 的肿瘤干细胞或两个相同的分化肿瘤细胞 ; 另一种是非对称 分裂 , 即肿瘤干细胞分裂后形成的两个细胞中有一个细胞不 可逆地走向分化的终端成为功能专一的分化肿瘤细胞 , 而另 一个保持亲代的特征 , 仍作为肿瘤干细胞保留下来 [16]。 由 于这种类似于干细胞的分裂方式 , 低密度的肿瘤干细胞能在 维持自身数量的同时产生出分化的肿瘤细胞 。

(3) 肿瘤干细胞具有高端粒酶活性以及扩增的端粒重复 序列 , 高活性的端粒酶可抑制细胞增殖过程中端粒长度的缩 短 , 延长肿瘤干细胞的增殖寿命 , 这为肿瘤干细胞的不断增 殖和分化提供了基础条件 [15]。

(4) 肿瘤干细胞内抗凋亡家族蛋白过表达 。 研究发现 , 大部分肿瘤干细胞中抗凋亡基因 Bcl-2的表达量显著增加 , 从而启动肿瘤干细胞内抗凋亡程序 , 阻断 Bid 和 Bad 等促凋 亡蛋白引起的线粒体凋亡途径 , 并进一步阻断胱天蛋白酶凋 亡途径 , 防止肿瘤干细胞发生凋亡 [17]。

(5) 肿瘤干细胞的 DNA 修复能力显著增强 。 研究发现 , 肿瘤干细胞内与 DNA 损伤修复相关的核酸内切酶 、 DNA 聚 合酶和 DNA 连接酶等酶蛋白的合成增加 、 活性增强 , 增强了 肿瘤干细胞的抗 DNA 损伤能力 , 使得肿瘤干细胞可逃避以 DNA 损伤为主的肿瘤治疗手段 [18]。

(6) 肿瘤干细胞除在连续分裂的一段时间外 , 其余较长 时间均是处在 G 0期 , 即相对静止状态 。 而现在临床上普遍 使用的化疗药物主要是针对增殖旺盛的肿瘤细胞进行杀伤 , 处在 G 0期的大多数肿瘤干细胞能逃避传统肿瘤治疗方法的 杀伤 , 一 旦 时 机 成 熟 或 停 止 用 药 , 它 们 便 成 为 复 发 的 根 源 [19]。

(7) 肿瘤干细胞通常位于由发育良好的三维细胞外基质 包裹的低氧环境中 , 这些细胞外基质起到很好的屏障作用 , 尽可能避免了肿瘤干细胞接触到抗肿瘤药物 。 同时由于射 线引起的 DNA 损伤需要氧气 , 所以肿瘤干细胞所处的低氧 环境使得放疗对肿瘤干细胞的杀伤作用也非常局限 [20－21]。 (8) 肿瘤干细胞能够表达与某些干细胞相同的特殊功能 蛋白或特异性表面标志 , 如 CD133, CD90和 CD44等 。 这些 特异性蛋白或标志物在肿瘤干细胞的增殖 、 肿瘤干细胞分化 成肿瘤组织周围所必须的血管等组织 、 肿瘤干细胞的迁移等 过程中发挥至关重要的作用 。 利用这些特异性的表面标志 物达到肿瘤干细胞分离或鉴定的目的 。

(9) 肿瘤干细胞在形成和发展过程中 , 生物学特征和功 能均会有适当的改变 。 如正常干细胞由于周围微环境的改 变或其他突变因素的刺激形成癌前期干细胞 , 癌前期干细胞 能表达 OCT3/4, SOX2和 KLF4等 , 能促进干细胞自我更新能 力和多向分化能力 [22]。 突变进一步积累癌前期干细胞逐渐 转变为原癌肿瘤干细胞 , 不断分化形成肿瘤细胞和肿瘤周围 血管从而最终形成肿瘤 。 另有研究表明 , 并非所有原癌肿瘤

干细胞都能转移 , Hermann 等 [23]在研究胰腺癌的时候发现 , CD133+/CXCR4+和 CD133+/CXCR4－都具有异种动物连续 成瘤能力 , 即均为胰腺癌肿瘤干细胞 , 具有无限自我更新能 力和分化潜能 。 但是只有 CD133+/CXCR4+的肿瘤干细胞 才能引起胰腺癌的转移 , 而 CD133+/CXCR4－的肿瘤干细胞 则不会导致胰腺癌的转移 。 说明在肿瘤发生 、 生长和迁移等 不同过程中肿瘤干细胞的特性和功能也不断发生着改变 , 从 而有利于肿瘤生长 、 转移和躲避治疗 。

4肿瘤干细胞的分离纯化

肿瘤干细胞的研究可能会在根治肿瘤和解决肿瘤的复 发等问题上发挥重要作用 。 然而在肿瘤组织或细胞中肿瘤 干细胞所占比例非常小 , 一般只占到总细胞数的 0．01% 2%, 使得肿瘤干细胞的分离比较困难 。 目前常用如下几种 肿瘤干细胞分离方法 。

4．1利用肿瘤干细胞表面的特异性标志物进行分离

通过将肿瘤干细胞表面特异性标志物与相应的单克隆 抗体或荧光素标记物结合 , 再应用一些分离技术手段将肿瘤 干细胞分离 、 筛选出来的方法 。 可分为磁性活化细胞分离法 和荧光活化细胞技术分离法两种 。

4．1．1磁性活化细胞分离法 (免疫磁珠分选法 , magnetic activated cell sorting , MACS )

MACS 是基于肿瘤干细胞表面特异性抗原能与连接有 磁珠的特异性单克隆抗体相结合 , 之后在外部磁场的作用 下 , 连接有单克隆抗体磁珠的肿瘤干细胞停留在磁场中 , 而 无特异性表面抗原的肿瘤细胞则不能与免疫磁珠结合 , 因而 不能在磁场中停留 , 从而得以分离出肿瘤干细胞 。

MACS 是目前比较常用的分离肿瘤干细胞的技术手段 , 特别是在胶质瘤干细胞的分离上应用较多 。 2008年 , 董强刚 等 [24]利用该方法从人肺腺癌细胞株 A549和 SPC-A1中成功 分离出表型为 CD24+/IGF-1R +的肺腺癌干细胞 。 MACS 对 设备要求相对较抵 , 所获得的目的细胞纯度高 (纯度一般可 达到 90%以上 ) , 且对细胞损伤小 , 不影响细胞活性和功能 。 4．1．2荧光活化细胞分选法 (流式细胞分选法 , fluores-cence-activated cell sorting , FACS )

FACS 是通过将待分选的肿瘤细胞和肿瘤干细胞用同一 种或多种荧光素标记的特异性抗体标记 , 根据肿瘤干细胞与 肿瘤细胞结合荧光素标记抗体能力的差异 , 通过流式细胞仪 将肿瘤干细胞分选出来的方法 。

第一位从人类急性粒细胞白血病的研究中分离出白血 病干细胞的 Bonnet 等 [6]就是通过 FACS 获得白血病干细胞 的 。 FACS 技术是目前应用最为广泛的肿瘤干细胞分离方 法 , 具有特异性和敏感性均非常强的特点 , 但由于成本 、 设备 和技术要求较高 , 且容易对细胞造成损伤 , 因此限制了该方 法在国内的广泛应用 。

4．2根据生物学特性分离肿瘤干细胞

根据肿瘤干细胞具有的某些生物学特性将肿瘤干细胞 分离筛选出的方法 。 如可以通过细胞核对核染料的拒染性 质 、 肿瘤干细胞体外培养所需的特殊条件等特性 , 分离出肿 瘤干细胞 。

4．2．1旁群细胞 (side population , SP ) 分选法

肿瘤干细胞具有对核染料 Hoechst 33342拒染的特性 , 研究人员针对这一特性而建立了 SP 分选法 , 经研究证实 , 这些分离出的旁群细胞具有肿瘤干细胞样性质 [25]。

Hoechst 33342是一种核酸染料 , 在紫外光激发下可发出 蓝色荧光 (波长 450nm 左右 ) 和红色荧光 (波长 650nm 左 右 ) , 肿瘤干细胞可将染料外排 , 而不发出荧光 , 从而可将这 类旁群细胞分离出来 。

Kondo 等 [26]证明大多数肿瘤细胞系中存在旁群细胞 , 并 在 C6神经 胶质瘤 、 MCF-7乳 腺癌 、 B104成 神 经 细 胞 瘤 和 HeLa 肿瘤细胞系中成功分离出旁群细胞亚群 , 且这些旁群细 胞具有与肿瘤干细胞相同的表面标志物 , 多向分化和少量成 瘤的特性 , 从而证实旁群细胞是适用于肿瘤干细胞分离的一 种方法 。 经进一步研究发现干细胞标志物 ABCG2高表达的 细胞可高效外排 Hoechst 33342, 从而用流式细胞仪分选出对 Hoechst 33342拒染的 SP 细胞 , 旁群细胞分选法对于仍未有 表面标志物研究的肿瘤干细胞的分离具有非常重要的意义 。 4．2．2无血清培养基 (serum-free medium , SFM ) 分选法 研究人员发现 , 在合成培养基的基础上 , 引入特定的生 长因子和细胞添加剂 , 使绝大多数肿瘤细胞由于缺乏生长所 必须的血清成分而停止生长 , 经长时间培养后最终死亡 , 而 肿瘤干细胞则可以在含特定生长因子和添加剂的无血清培 养基中呈球状悬浮生长 , 经几代的培养增殖形成富含肿瘤干 细胞的肿瘤细胞球 , 这种肿瘤干细胞的分离方法就是 SFM 分选法 。

2003年 , Hemmati 等 [27]和 Singh 等 [28]通过无血清培养 的方法从脑胶质瘤和成髓细胞瘤等脑肿瘤细胞中成功分离 培养出了脑肿瘤细胞球 , 后被证实为脑肿瘤干细胞 。

经过证实可以在含有 B27(1? 50) 、 EGF (20ng ·ml －1) 、 bFGF (10ng ·ml －1) 的 DMEM /F12(1? 1) 无血清培养基中培养 对数生长期的 HCT-116细胞系 , 可以培养分离出结肠癌干细 胞球 。 这种方法具有操作简便 , 对设备要求较低等优点 , 但 获得的肿瘤干细胞纯度较低 , 应根据实验需要进行进一步纯 化 。

4．3联合运用多种方法分离肿瘤干细胞

在目前的研究中 , 肿瘤干细胞的分离并不是采用单一的 方法 , 而是选用两种或者两种以上的分离方法 , 以获得数量 更多 、 纯度更高的肿瘤干细胞 。 如只运用 FACS 技术时 , 虽然 能分离出肿瘤干细胞 , 但是其数量不是很多 , 不易扩大培养 , 而单采用 SFM 分离法时 , 虽然经过几代的培养能够获得较 多肿瘤细胞球 , 但其周期长 , 且其中会含有非肿瘤干细胞 , 因 此 , 其纯度就无法得到研究的要求 。 因此 , 可以通过无血清 培养法 , 将肿瘤干细胞培养至一定数量之后 , 再利用 FACS 技术或 MACS 技术对所获得的肿瘤干细胞进行进一步的分 离和筛选 , 这样所获得的肿瘤干细胞在数量和纯度上均能满 足进一步的实验要求 。

5肿瘤干细胞的鉴定

肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞之间虽有区别 , 但也具有很 大的相似性 , 因此 , 分离出来的肿瘤干细胞必须经过鉴定才 能确认 。

5．1利用肿瘤干细胞特异性表面标志物进行鉴定

目前 , 肿瘤干细胞最为广泛且可靠的鉴定方法就是利用 肿瘤干细胞特异性表面标志物 。 将分离出的肿瘤干细胞通

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·中国药理学与毒理学杂志 2012年 10月第 26卷第 5期 Chin J Pharmacol Toxicol , Vol 26, No 5, Oct 2012

过免疫组织化学法 、 流式细胞检测技术等方法测定阳性或阴 性细胞表面标志物表达情况 , 进而鉴定是否是肿瘤干细胞 。 因此 , 科学地探寻肿瘤干细胞表面标志物对于肿瘤干细胞 的分离和鉴定十分重要 , 确定肿瘤干细胞表面标志物的一般 原则为结合谱系标志 、 正常干细胞的特异标志和正常组织特 异性标志等的综合评价 。 表 1为几种已鉴定出的肿瘤干细 胞特异性表面标志物 。

表 1肿瘤干细胞特异性表面标志物

名称 肿瘤干细胞特异性表面标志物

急性粒细胞白血病 CD34+/CD38－[6, 29]

乳腺癌 Lineage －/CD24－/Low/CD44+[30－31],

ALDH1+[32]

胰腺癌 CD133+[23], CD24+/CD44+/ESA+[33]肺腺癌 CD133+[34]

神经胶质瘤 CD133(AC133) +[28, 35]

胃肠道癌 CD133+[36], CD44+/EpCAMHigh [37]

肝癌 CD90+[38], CD133+[39]

黑色素瘤 ABCB5+[40]

肾癌 CD105+[41]

卵巢癌 CD44+/CD117+[42], CD133+[43－44],

CD44+/MYD88+[45]

子宫内膜癌 CD133+[46]

5．2异种移植成瘤性实验鉴定肿瘤干细胞

将分离出的肿瘤干细胞 , 制备成细胞悬液后种植到异种 动物体内 , 如将人的肿瘤干细胞接种于 NOD /SCID小鼠体 内 , 观察其能否形成肿瘤病灶 , 且异种动物体内形成的肿瘤 病灶在组织学结构上与原发肿瘤病灶类似 , 则可鉴定为肿瘤 干细胞 。 一般来说 , 肿瘤干细胞形成肿瘤病灶所需的细胞密 度比普通肿瘤细胞要小 , 如普通的肿瘤细胞接种密度必须达 到 1? 109 1? 1010L －1才能形成肿瘤 , 而肿瘤干细胞根据其 纯度接种密度达到 1? 106 1? 109L －1即可形成肿瘤 。 从形 成的肿瘤病灶中提取肿瘤干细胞 , 再次种植到免疫缺陷动物 体内后 , 仍可以形成肿瘤病灶 , 这种连续的异种动物致瘤能 力说明这类细胞具有稳定的自我更新能力和致瘤能力 , 从而 可进一步鉴定为肿瘤干细胞的 。 这些现象也证明了肿瘤干 细胞在肿瘤的形成和增殖过程中发挥的重要作用 。 肿瘤干 细胞在异种动物体内的连续成瘤实验是鉴定肿瘤干细胞最 为可靠的鉴定方法 。

5．3肿瘤干细胞的其他鉴定方法

对于肿瘤干细胞的鉴定 , 还可通过肿瘤干细胞具有的类 干细胞特性进行鉴定 。 如根据肿瘤干细胞核对核染料拒染 (如 Hoechst 33342染料 ) 的性质进行鉴定 [25]、 根据肿瘤干细 胞长期处于静止状态的特性 , 应用溴脱氧尿嘧啶核苷法进行 鉴定 [47]和软琼脂克隆形成实验鉴定 [4－5]等方法 。

6肿瘤干细胞研究前景

虽然经过深入研究对肿瘤干细胞有了更深的认识 , 但在 研究中也仍面临着不少难题 :① 虽然已成功分离出了几种 类型的肿瘤干细胞 , 但其分离和鉴定方法尚不完善 , 分离效 率比较低 ; ② 多数肿瘤干细胞的特异性表面标志物还不是 很清楚 , 肿瘤干细胞的分离鉴定还是仅限于少数几种肿瘤细 胞 ; ③ 肿瘤干细胞的离体研究忽略了肿瘤干细胞与肿瘤组 织周围环境间的相互影响 ; ④ 分离出的肿瘤干细胞在体外 培养条件下 , 容易分化成肿瘤细胞 , 如何保持肿瘤干细胞的 干细胞样特性也是研究人员面临的问题 ; ⑤ 在肿瘤干细胞 培养中长期使用蛋白水解酶可能影响细胞表面分子的表达 , 影响进一步的研究 。

肿瘤干细胞理论仍然存在不少的争议和研究难点 , 但该 理论的提出不仅丰富了传统的肿瘤理论 , 还给研究肿瘤发生 机制和治疗策略的人们提供了新的思路和研究途径 , 提示治 疗肿瘤时不能只杀伤肿瘤细胞 , 而是应该同时采取相应的治 疗手段杀伤肿瘤干细胞 , 从而达到根治肿瘤的目的 。 并且有 望阐明肿瘤的发病和生长增殖机制 , 尤其在研究肿瘤的转移 和恶性复发等问题有望发挥重大作用 。

肿瘤干细胞分离和鉴定方法的不断发展是这一理论走 向应用过程中迈出的第一步 。 在这一基础上 , 对肿瘤干细胞 的进一步研究 (包括肿瘤干细胞的生物学特征 、 寻找肿瘤干 细胞特异性表面标志物 、 肿瘤干细胞形成或自我更新等生理 过程中的关键蛋白等 ) 不仅有助于实现肿瘤的早期诊断 , 还 可通过将肿瘤干细胞特异性表面标志物 、 增殖过程中所必须 的酶类 、 细胞自我更新过程中的主要信号通路蛋白 、 细胞周 期调控蛋白 、 miRNAs 等作为靶标设计出能抑制和杀伤肿瘤 干细胞的治疗手段 , 从而最终达到根治肿瘤的目的 。

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Progress in tumor-stem cell theory and tumor stem

cells isolation and identification

SONG Dong-ying 1, 2, WANG Yi 2, SUN Lan 1, ZHANG Ying-ge 1

(1．Key Labortory of Nanopharmacology and Nanotoxicology , Institute of Pharmacology and Toxicology , Academy of Military Medical Sciences , Beijing 100850, China ; 2．School of Pharmacy , Jilin University ,

Changchun 130021, China )

Abstract :Tumors have long threatened human health and life , but the treatment of tumors remains a serious challenge despite the advances in medical science and technology ．The most important cause of the incurability of tumors is the lack of knowledge of the mechanisms for the development , progress , metastasis and relapse．Based on extensive investigations into suface markers , proliferation capabilities and tumor generations , scientists have pro-posed a new theory , known as “ tumor-stem-cell theory ” ．Research proved that in tumor cells there is a rare popu-lation of stem-like cells which have the ultimate self-renewal , multi-differentiation and tumorrigenic capacity．Sci-entists found that the tumor-stem cells play a critical role in tumorigenesis , tumor-growth , metastasis and relapse．The “ tumor-stem cell theory ” has provided scientists with a new strategy to research treatment methods of tumors．This review introduces the origin and development of “ tumor-stem cell theory ” and features of cancer-stem cells , and addresses the latest research on isolation and identification of cancer-stem cells．

Key words :tumor ; cancer stem cells ; biological characteristics ; isolation and identification

Corresponding author :ZHANG Ying-ge , E-mail :zhangyg58@126．com , Tel :(010) 66930654

(收稿日期 :2011-09-02接受日期 :2011-10-31) (本文编辑 :乔 虹 )

范文五：干细胞、肿瘤干细胞与肿瘤

摘要：干细胞是一种具有自我更新、无限增殖和多向分化能力的细胞。而多数肿瘤是由不同增殖潜能的不均一性细胞构成。随着对干细胞的研究不断深入，使人们对肿瘤的发生机制重新进行了审视，并在造血系统、脑、肺、乳腺等部位肿瘤中发现极少量的具有与干细胞非常类似生物学特性的细胞，称之为肿瘤干细胞，它们很可能是肿瘤细胞的起源。肿瘤干细胞的提出，使得靶向性杀伤肿瘤干细胞从而使根治肿瘤和防止肿瘤复发和转移成为可能。所以研究肿瘤干细胞的起源及其与肿瘤的发生关系，成为当前研究和治疗肿瘤领域的新热点。本文就肿瘤干细胞的存在证据、干细胞与肿瘤干细胞的异同点及它们与肿瘤发生之间的关系作简要的综述。

　　关键词：干细胞；肿瘤干细胞；肿瘤；自我更新；调控

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