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范文一：菌种保藏
菌种保藏
一 实验目的
1.1 了解菌种保藏的基本原理 。
1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。
二 实验原理
菌种保藏的方法有很多，其原理为人工地创造适合于菌种休眠的环境条件（干燥、低温、缺乏氧气和养料等），使微生物的代谢活动处于最低的状态但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。应不同的菌种不同需求的要求，一般选用不同的保藏方法。通常情况下，斜面保藏、石蜡油封存和甘油管保藏法较为常用。 三 实验材料 、器具
3.1 材料
待保藏的适龄菌株Z41、脱脂牛奶、无菌水等。
3.2 器具
无菌操作台、甘油管、离心管、移液枪、无菌枪头、安瓿管 、真空泵、干燥器、接种针、接种环、火柴、酒精灯、离心机、冻干机等。
四、实验步骤
A 冷冻干燥保藏法
① 准备安瓿管、脱脂乳
安瓿管先用2%HCl浸泡，再水洗多次，烘干，管口塞上棉花，灭菌备用。使用脱脂奶粉配兑脱脂牛奶，灭菌待用。
② 取菌液1ml 于离心管中，离心10min 。
③ 倒去上清液，加入无菌脱脂牛奶1ml ，重新吹打使之悬浮。
④ 分装
用移液枪将悬浮液分装入安瓿管底部，每支安瓿管的装量约为0.25毫升(装入量大约为安瓿管球部体积的1／3) 。
⑤ 预冻
将分装好的安瓿管在冰箱内进行预冻。
⑥ 开冻干机，预冷30min 。
⑦ 真空干燥
预冻以后，将安瓿管放入真空器中，开动真空泵进行干燥。
⑧ 封管
打开酒精喷灯，火焰熔封安瓿管。
甘油管冷冻保藏法
① 将40%的甘油1ml 装入甘油管内高压蒸汽灭菌待用。
② 取1ml 菌悬液用移液枪装入甘油管充分混匀，使甘油浓度约为20%，标上实验日期、菌种名。
③ 置4℃预冷30min ，后放至-20℃冰箱保存。
斜面冰箱保藏法
① 接种
将接种环在菌悬液内蘸取，于无菌操作台上在斜面上划线接种。
② 培养
置37℃恒温箱中培养48小时。
③ 保藏
斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。
五 实验讨论
甘油管中装有浓度为40%的甘油，浓度准确吗？
将准确配好的40%的甘油装入甘油管中灭菌，若甘油管拧的太紧，在灭菌过程中甘油管会炸开造成损失。如果是先将40%的甘油和甘油管分别先灭菌，再在无菌操作台上将甘油分装到甘油管内，一方面甘油在灭菌的过程中会蒸发，二来染菌的几率也比较大。由于只用作保藏菌种对浓度要求不严格，所以这个问题不会影响实验。但求解决方法。
范文二：菌种保藏
菌种的保藏
菌种是一个国家所拥有的重要生物资源，菌种保藏（preservation ）是一项重要的微生物学基础工作。菌种保藏机构的任务是在广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株甚至动、植物细胞株和质粒等）的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。为此，在国际上一些工业较发达的国家中都设有相应的菌种保藏机构。例如：中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM ），美国典型菌种保藏中心（ATCC ），美国的“北部地区研究实验室”（NRRL ），荷兰的霉菌中心保藏所（CBS ），英国的国家典型菌种保藏所（NCTC ），苏联的全苏微生物保藏所（UCM ）以及日本的大阪发酵研究所（IFO ）等都是有关国家有代表性的菌种保藏机构。
菌种保藏的具体方法很多，原理却大同小异。首先要挑选典型菌种（type culture）的优良纯种，最好采用它们的休眠体（如分生孢子、芽孢等）；其次，还要创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。 水分对生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥尤其是深度干燥，在保藏中占有首要地位就不言而喻了。五氧化二磷、无水氯化钙和硅胶是良好的干燥剂，当然，高度真空还可同时达到驱氧和深度干燥的双重目的。
除水分外，低温乃是保藏中的另一重要条件。微生物生长的温度低限约在-30℃，可是，在水溶液中能进行酶促反应的温度低限则在-140℃左右。这或许就是为什么在有水分的条件下，即使把微生物保藏在较低的温度下，还是难以较长期地保藏它们的一个主要原因。在低温保藏中，细胞体积较大者一般要比较小者对低温更为敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因同低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤有关。如果放到低温（不是一般冰箱）下进行冷冻时，适当采用速冻的方法，可因产生的冰晶小而可减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温也可减少对细胞的损伤。当然，不同微生物的最适冷冻速度和升温速度也是不同的。例如，酵母的冷冻速度以每分钟10℃为宜，而红细胞则相应地为2000℃。冷冻时的介质对细胞损伤与否也有显著的影响。例如，0.5mol ／L 左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质如糊精、血清白蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（PVP ）虽不能透入细胞，但可能是通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。在实践中，发现用较低的温度进行保藏时效果更为理想，如液氮温度（-195℃）比干冰温度（-70℃）好，-70℃又比-20℃好，而-20℃则比4℃好。
一种良好的保藏方法，首先应能保持原菌的优良性状不变，同时还须考虑方法的通用性和操作的简便性。具体的菌种保藏方法很多，其原理和应用范围各有侧重，优缺点也有所差别。
在国际著名的美国ATCC （American Type Culture Collection）中，目前已改为仅采用两种最有效的方法，即保藏期一般达5～15年的冷冻干燥保藏法和保藏期一般达20年以上的液氮保藏法，以达到最大限度地减少传代次数和避免菌种衰退的目的。
保藏原理是这样的：当菌种保藏单位收到合适菌种时，先将原种制成若干液氮保藏管作为保藏菌种，然后再制一批冷冻干燥保藏菌种作为分发用。经5年后，假定第一代（原种）的冷冻干燥保藏菌种已分发完毕，就再打开一瓶液氮保藏原种，这样下去，至少在20年内，
凡获得该菌种的用户，至多只是原种的第二代，可以保证所保藏和分发菌种的原有性状。
定期移植法
亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下：
1 培养基制备
1.1 器皿准备
培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料
先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH 值
配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠) 调pH 值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂
配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装
在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL) ，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记
将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌
根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min 。
1.8 斜面摆放
灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查
将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2接种
2.1.1 点接
把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线
从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。
2.1.3 稀波状蜿蜒划线法
从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。
2.1.4 密波状蜿蜒划线法
从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。
2.1.5 挖块接种法
挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。
2.2 穿刺接种
用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌和酵母菌等。
挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。
3 培养
将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。
4 保藏
培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1～3个月移植一次。
保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。
斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。
液体石蜡法
亦称矿物油保藏法, 定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。
操作步骤如下：
1 液体石蜡的准备
选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，采用以下两种方式进行灭菌：
121℃湿热灭菌30min ，置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。
160℃干热灭菌2个小时，冷却后，经无菌检查后备用。
2 斜面培养物的制备
参照定期移植法。
3 灌注石蜡
将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入培养好的新鲜斜面培养物上，液面高出斜面顶部1cm 左右，使菌体与空气隔绝。
4 保藏
4.1 注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（4～6℃）干燥处保藏，保藏时间2～10年。
4.2 保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。
5 恢复培养
恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，
再重新转接一次。
沙土管法
操作步骤如下：
1 沙土管制备
将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用10%盐酸浸泡，如河沙中有机物较多可用20%盐酸浸泡。24小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干或晒干。
另取地面下40～60cm 非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100目过筛, 水洗至中性，烘干。
将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1cm 左右，塞好棉塞，121℃湿热灭菌30min 。 随机抽取灭菌后的砂土管若干支，无菌条件下取少许砂土至营养肉汁培养基中，30℃培养24小时，检查无微生物生长后方可使用。 2 斜面培养物的制备
参照定期移植法。
3 制备菌悬液
向培养好的斜面培养物中注入3～5mL 无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管0.2～
0.5mL 。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。
4 干燥
真空抽去沙土管中水分。
5 保藏
将沙土管用火焰熔封后存放于低温(4～6℃) 干燥处保藏，每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。
保藏时间2～10年。
6 恢复培养
无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。
真空冷冻干燥法
该方法是将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
操作步骤如下：
好氧菌冷冻干燥管的制备
1 安瓿管准备
安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，
自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH 中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
2 保护剂的选择和准备
保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH 值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。
3 冻干样品的准备
在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。 4 预冻
一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。
5 冷冻干燥
采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。
将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。
6 真空封口及真空检验
将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。
熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。 7 保藏
安瓿管应低温避光保藏。
8 质量检查
冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。
厌氧菌冷冻干燥管的制备
主要程序与需氧菌操作相同，注意保护剂的选择和准备，保护剂使用前应在100℃的沸水中煮沸15分钟左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。
复苏方法
—— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，
—— 将安瓿管顶部烧热，
—— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，
—— 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。
-80℃ 冰箱冻结法
将菌种保藏在-80℃冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。
操作步骤如下：
1 安瓿管的准备
安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH 中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
2 保护剂的选择和准备
保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH 值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。
3 微生物保藏物的准备
在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。 4 冻结保藏
将安瓿管或塑料冻存管置于-80℃冰箱中保藏。
5 复苏方法
从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。
液氮超低温冻结法
液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196℃的液态氮，或在
-150℃的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。
操作步骤如下：
1 安瓿管或冻存管的准备
用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净， 121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
2 保护剂的准备
保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，一般采用10-20%甘油。
3 微生物保藏物的准备
微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。
分装时注意应在无菌条件下操作。
菌种的准备可采用下列几种方法：
刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内； 接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；
将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些
大小均匀的小块（直径约5-10毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；
在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。
4 预冻
预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1℃为好、使样品冻结到-35℃。
目前常用的有三种控温方法：
—— 程序控温降温法，应用电子计算机程序控制降温装置，可以稳定连续降温，能很好地控制降温速率。
—— 分段降温法：将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却，或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温，将安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小时，然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降1-1.5℃。
—— 对耐低温的微生物、可以直接放入气相或液相氮中。 5 保藏
将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150℃，液相中温度为-196℃。
6 复苏方法
从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。
范文三：菌种保藏
微生物菌种保藏
在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。
微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。
1.1. 蒸馏水悬浮法
这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可用此法保存。
1.2. 斜面传代保藏
斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。
1.3. 矿物油中浸没保藏
此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3年也应做一次存活试验。
1.4. 干燥-载体保藏
此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡3~4 h，以除去其中所含的有机物，用水漂洗至中性，烘干，然后装入高度约1cm的河沙于小试管中，121℃间歇灭菌3次。用无菌吸管将孢子悬液滴入砂粒小管中，经真空干燥8 h，于常温或低温下保藏均可，保存期为1~10年。土壤法以土壤代替砂粒，不需酸洗，经风干、粉碎，然后同法过筛、灭菌即可。一般细菌芽孢常用砂管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。
1.5. 冷冻保藏
冷冻保藏是指将菌种于-20℃以下的温度保藏， 冷冻保藏为微生物菌种保藏非常有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了保藏的结果更加令人满意，通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂；同时还要认真掌握好冷冻速度和解冻速度。冷冻保藏的缺点是培养物运输较困难。
普通冷冻保藏技术(-20℃)：将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，于冰箱的冷藏室中贮藏，或于温度范围在-5~20℃的普通冰箱中保存。或者将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分别接到试管或指管内，严格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力 1~2年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。
超低温冷冻保藏技术：要求长期保藏的微生物菌种，一般都应在-60℃以下的超低温冷藏柜中进行保藏。超低温冷冻保藏的一般方法是：先离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞，再用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞，然后加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1~2℃/ min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。
液氮冷冻保藏技术：近年来，大量有特殊意义和特征的高等动、植物细胞能够在液氮中长期保藏，并发现在液氮中保藏的菌种的存活率远比其他保藏方法高且回复突变的发生率极低。液氮保藏巳成为工业微生物菌种保藏的最好方法。具体方法是：把细胞悬浮于一定的分散剂中或是把在琼脂培养基上培养好的菌种直接进行液体冷冻，然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。进行液氮冷冻保藏时应严格控制致冷速度。液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤是先制备冷冻保藏菌种的细胞悬液，分装0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口。然后以1.2℃／min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)。待细胞冻结后，将致冷速度降为1℃／min，直到温度达到-50℃，将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相 (-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可用如下方法代替：将安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。
1.6. 真空冻干保藏
真空冷冻干燥的基本方法是先将菌种培养到最大稳定期后，一般培养放线菌和丝状真菌约需7~10天，培养细菌约需24~28小时，培养酵母约需3天。然后混悬于含有保护剂的溶液中，保护剂常选用脱脂乳、蔗糖、动物血清、谷氨酸钠等，菌液浓度为109~1019个/ml，取0.1~0.2ml菌悬液置于安瓿管中冷冻，再于减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华至1%~5%，使培养物干燥。最后将管口熔封，保存在常温下或冰箱中。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一，大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。但操作过程复杂，并要求一定的设备条件。
1.7. 寄主保藏
适用于一些难于用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。
1.8. 基因工程菌的保藏
随着基因工程的不断发展，越来越多的基因工程菌需要得到合理的保藏，由于它们的载体质粒等所携带的外源DNA片段的遗传性状不太稳定、且其外源质粒复制子很容易丢失。另外，对于宿主细胞质粒基因通常为生长非必需，一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。而由质粒编码的抗生素抗性在富集含此类质粒的细胞群体时极为有用。当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。由此看来基因工程菌最好应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。例如，质粒pBR322。它除了能将外源DNA 输入E．coli细胞外，还赋予E．coli细胞Ampr和Tetr。如果在培养基中加入Amp和Tet，则培养时可选择出含pBR322质粒的细胞。
范文四：菌种保藏
第八章 菌种的保藏
第一节 菌种的衰退和复壮
在微生物的基础研究和应用研究中, 选育一株理想的菌株是一件艰苦的工作, 而欲使菌 种始终保持优良性状的遗传稳定性,便于长期使用,还需要做很多日常的工作。实际上,由 于各种各样的原因, 要使菌种永远不变是不可能的, 菌种衰退是一种潜在的威胁。 只有掌握 了菌种衰退的某些规律, 才能采取相应的措施, 尽量减少菌种的衰退或使已衰退的菌种得以 复壮。
一、菌种的衰退
(一)菌种衰退的现象
菌种衰退(degeneration )是指由于自发突变的结果,而使某物种原有的一系列生物学 性状发生量变或质变的现象。菌种衰退的具体表现有以下几个方面:
1. 菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件下都有一定的形态特征,如 果典型的形态特征逐渐减少,就表现为衰退。例如,泾阳链霉菌“ 5406”的菌落原来为凸形 变成了扇形、 帽形或小山形; 孢子丝由原来螺旋形变成波曲形或直形, 孢子从椭圆形变成圆 柱形等。
2. 生长速度缓慢,产孢子越来越少。例如, “ 5406”的菌苔变薄,生长缓慢 (半个月以 上才长出菌落 ) ,不产生丰富的桔红色的孢子层,有时甚至只长些黄绿色的基内菌丝。 3. 代谢产物生产能力的下降,即出现负突变。例如,黑曲霉糖化力、放线菌抗生素发 酵单位的下降以及各种发酵代谢产物量的减少等,在生产上是十分不利的。
4. 致病菌对宿主侵染能力下降。如白僵菌对宿主致病能力的降低等。
5. 对外界不良条件(包括低温、高温或噬菌体侵染等)抵抗能力的下降等。如抗噬菌 体菌株变为敏感菌株等。
值得指出的是, 有时培养条件的改变或杂菌污染等原因会造成菌种衰退的假象, 因此在 实践工作中一定要正确判断菌种是否退化,这样才能找出正确的解决办法。
(二)菌种衰退的原因
菌种衰退不是突然发生的, 而是从量变到质变的逐步演变过程。 开始时, 在群体细胞中 仅有个别细胞发生自发突变(一般均为负变) ,不会使群体菌株性能发生改变。经过连续传 代, 群体中的负变个体达到一定数量, 发展成为优势群体, 从而使整个群体表现为严重的衰 退。经分析发现,导致这一现象的原因有以下几方面。
1. 基因突变
(1)有关基因发生负突变导致菌种衰退
菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。 如果控制产量的基因发生负突变, 则表现为 产量下降; 如果控制孢子生成的基因发生负突变, 则产生孢子的能力下降。 菌种在移种传代 过程中会发生自发突变。 虽然自发突变的几率很低 (一般为 10-6~10-9) , 尤其是对于某一特定 基因来说,突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力,随着传代次数增加, 衰退细胞的数目就会不断增加,在数量上逐渐占优势,最终成为一株衰退了的菌株。 (2)表型延迟造成菌种衰退
表型延迟现象也会造成菌种衰退。 如, 在诱变育种过程中, 经常会发现某菌株初筛时产 量较高,进行复筛时产量却下降了。
(3)质粒脱落导致菌种衰退
质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多,不少抗生素的合成是受质粒控制 的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响(如高温) ,致使控制产量的质粒脱落或者核 内 DNA 和质粒复制不一致,即 DNA 复制速度超过质粒,经多次传代后,某些细胞中就不 具有对产量起决定作用的质粒,这类细胞数量不断提高达到优势,则菌种表现为衰退。 2. 连续传代
连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面,传代次数越多,发生自发突变(尤 其是负突变)的几率越高;另一方面,传代次数越多,群体中个别的衰退型细胞数量增加并 占据优势越快,致使群体表型出现衰退。
3. 不适宜的培养和保藏条件
不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。 不良的培养条件如营养成 分、温度、湿度、 pH 值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等,不仅会诱 发衰退型细胞的出现, 还会促进衰退细胞迅速繁殖, 在数量上大大超过正常细胞, 造成菌种 衰退。
(三)菌种衰退的防止
根据菌种衰退原因的分析 , 可以制定出一些防治衰退的措施,主要从以下几方面考虑: 1. 控制传代次数
意即尽量避免不必要的移种和传代, 将必要的传代降低到最低限度, 以减少自发突变的 机率。一套良好的菌种保藏方法可大大减少不必要的移种和传代次数。
2. 创造良好的培养条件
创造一个适合原种的良好培养条件, 可以防止菌种衰退。 如培养营养缺陷型菌株时应保 证适当的营养成分, 尤其是生长因子; 培养一些抗性菌时应添加一定浓度的药物于培养基中 , 使回复的敏感型菌株的生长受到抑制, 而生产菌能正常生长; 控制好碳源、 氮源等培养基成 分和 pH 、温度等培养条件,使之有利于正常菌株生长,限制退化菌株的数量,防止衰退。 例如,利用菟丝子的种子汁培养“鲁保一号”真菌可防止其退化;在赤霉素生产菌藤仓赤霉 的培养基中,加入糖蜜、天冬酰胺,谷氨酰胺、 5-核苷酸或甘露醇等丰富营养物时,也有 防止菌种衰退的效果;此外,将培养栖土曲霉 (Aspergillus terricola)3.942的温度从 28~30℃ 提高到 33~34℃,可防止其产孢子能力的衰退。
3. 利用不易衰退的细胞移种传代
在放线菌和霉菌中, 由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核, 甚至是异核体, 因此用菌丝 接种就会出现不纯和衰退,而孢子一般是单核的,用它接种时,就不会发生这种现象。在实 践中, 若用灭过菌的棉团轻巧地对放线菌进行斜面移种, 由于避免了菌丝的接入, 因而达到 了防止衰退的效果;另外,有些霉菌(如构巢曲霉)若用其分生孢子传代就易衰退,而改用 子囊孢子移种则能避免衰退。
4. 采用有效的菌种保藏方法
有效的菌种保藏方法是防止菌种衰退极其必要的措施。 在实践中, 应当有针对性的选择 菌种保藏的方法。 例如, 啤酒酿造中常用的酿酒酵母, 保持其优良发酵性能最有效的保藏方 法是-70℃低温保藏,其次是 4℃低温保藏,若采用对于绝大多数微生物保藏效果很好的冷 冻干燥保藏法和液氮保藏法,其效果并不理想。
一般斜面冰箱保藏法只适用于短期保藏, 而需要长期保藏的菌种, 应当采用砂土保藏法、 冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法。对于比较重要的菌种,尽可能采用多种保藏方法。 工业生产用菌种的主要性状都属于数量性状, 而这类性状恰是最易衰退的。 即使在较好 的保藏条件下, 还是存在这种情况。 例如链霉素产生菌——灰色链霉菌的菌种保藏即使是用 冷冻干燥保藏法等现今较好的方法, 还是会出现这类情况。 由此说明有必要研究和采用更有 效的保藏方法以防止菌种的衰退。
5. 讲究菌种选育技术
在菌种选育时, 应尽量使用单核细胞或孢子, 并采用较高剂量使单链突变而使另一单链 丧失作为模板的能力 , 避免表型延迟现象。同时,在诱变处理后应进行充分的后培养及分离 纯化,以保证菌种的纯度。
6. 定期进行分离纯化
定期进行分离纯化, 对相应指标进行检查, 也是有效防止菌种衰退的方法。 此方法将在 菌种复壮部分介绍。
二、菌种的复壮
(一)复壮
从菌种衰退的本质可以看出,通常在已衰退的菌种中存在有一定数量尚未衰退的个体。 狭义的复壮是指在菌种已经发生衰退的情况下, 通过纯种分离和测定典型性状、 生产性 能等指标, 从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体, 以达到恢复原菌株固有性状的相 应措施。
广义的复壮是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前, 就经常有意识地采取纯种分 离和生产性状测定工作,以期从中选择到自发的正突变个体。
由此可见, 狭义的复壮是一种消极的措施, 而广义的复壮是一种积极的措施, 也是目前 工业生产中积极提倡的措施。
(二)菌种复壮的主要方法
1. 纯种分离法
通过纯种分离 , 可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来 , 经扩大培养 , 就可恢复原菌株的典型性状。常用的分离纯化的方法可归纳成两类:一类较粗 放,只能达到“菌落纯”的水平,即从种的水平来说是纯的。例如采用稀释平板法、涂布平 板法、 平板划线法等方法获得单菌落。 另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法。 它可以 达到“细胞纯”即“菌株纯”的水平。后一类方法应用较广,种类很多,既有简单的利用培 养皿或凹玻片等作分离室的方法, 也有利用复杂的显微操纵器的纯种分离方法。 对于不长孢 子的丝状菌, 则可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植, 也可用无菌毛细管截
取菌丝尖端单细胞进行纯种分离。
2. 宿主体内复壮法
对于寄生性微生物的衰退菌株, 可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的 毒性。例如,苏云金芽孢杆菌经过长期人工培养会发生毒力减退、杀虫率降低等现象,可用 退化的菌株去感染菜青虫的幼虫, 然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。 如此反复多次, 就可提高菌株的杀虫率。根瘤菌属经人工移接 , 结瘤固氮能力减退 , 将其回接到相应豆科宿主 植物上 , 令其侵染结瘤 , 再从根瘤中分离出根瘤菌 , 其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。
3. 淘汰法
将衰退菌种进行一定的处理(如药物,低温、高温等) ,往往可以起到淘汰已衰退个体 而达到复壮的目的。如有人曾将“ 5406”的分生孢子在低温 (-10~30℃ ) 下处理 5~7d ,使 其死亡率达到 80%,结果发现在抗低温的存活个体中留下了未退化的健壮个体。
4. 遗传育种法
即把退化的菌种, 重新进行遗传育种, 从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产 菌种。
第二节 菌种的保藏
菌种是重要生物资源,研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。
一、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡,因而常常造成菌种的衰退, 并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳 定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。 菌种保藏对于基础研究和实际生产具有特别重要的意义。 在基础研究中, 菌种保藏可以 保证研究结果获得良好的重复性。 对于实际应用的生产菌种, 可靠的保藏措施可以保证优良 菌种长期高产稳产。
二、菌种保藏的原理
无论采用何种保藏方法, 首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏, 最好保藏它们 的休眠体,如分生孢子、芽孢等。其次,应根据微生物生理、生化特点,人为地创造环境条 件, 使微生物长期处于代谢不活泼、 生长繁殖受抑制的休眠状态。 这些人工造成的环境主要 是干燥、低温和缺氧,另外,避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏 效果。
水分对生化反应和一切生命活动至关重要, 因此, 干燥尤其是深度干燥, 在菌种保藏中 占有首要地位。五氧化二磷、无水氯化钙和硅胶是良好的干燥剂,当然,高度真空则可以同 时达到驱氧和深度干燥的双重目的。
低温是菌种保藏中的另一重要条件。微生物生长的温度下限约在 -30℃,可是在水溶液 中能进行酶促反应的温度下限则在 -140℃左右。 这可能就是即使把微生物保藏在较低的温度 下,但只要有水分存在,还是难以较长期地保藏它们的一个主要原因。因此,低温必须与干 燥结合, 才具有良好的保藏效果。 在低温保藏中, 细胞体积较大者一般要比较小者对低温敏 感, 而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。 其原因是低温会使细胞内的水分形成冰晶, 从而引 起细胞结构尤其是细胞膜的损伤。 如果放到低温 -70℃下进行冷冻时, 适当采用速冻的方法, 可使产生的冰晶小而减少对细胞的损伤。 当从低温下移出并开始升温时, 冰晶又会长大, 故
此时快速升温也可减少对细胞的损伤。 不同微生物的最适冷冻速度和升温速度是不同的。 例 如,酵母菌的冷冻速度以 10℃ /min为宜,而红细胞则相应地为 20℃ /min。另外,在适宜的 介质中冷冻, 可以减少对细胞的损伤。 例如, 0.5mol /L 左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞, 并通过强烈的脱水作用而保护细胞; 大分子物质如糊精、 血清白蛋白、 脱脂牛奶或聚乙烯吡 咯烷酮 (PVP)虽不能透入细胞,但可能是通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。 在实践中,发现用极低的温度进行保藏时效果更为理想,如液氮温度 (-196℃ ) 比干冰温度 (-70℃ ) 好, -70℃又比 -20℃好,而 -20℃比 4℃好。
三、菌种保藏的方法
各种微生物由于遗传特性不同, 因此适合采用的保藏方法也不一样。 一种良好的有效保 藏方法, 首先应能保持原菌种的优良性状长期不变, 同时还须考虑方法的通用性、 操作的简 便性和设备的普及性。下面介绍几种常用的菌种保藏方法:
(一)斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于 4℃左右的冰箱中保藏, 每隔一定时间(保藏期)再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断。此 法广泛适用于细菌、 放线菌、 酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干 燥保藏的菌种。 放线菌、 霉菌和有芽孢的细菌一般可保存 6个月左右, 无芽孢的细菌可保存 1个月左右,酵母菌可保存 3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于 4℃冰 箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种 的保藏期延长。
此法由于采用低温保藏, 大大减缓了微生物的代谢繁殖速度, 降低突变频率; 同时也减 少了培养基的水分蒸发,使其不至于干裂。该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高, 故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。 其缺点是菌株仍有一定程度的代 谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染。
(二)石蜡油封藏法
此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面 (或半固体穿刺培养物)上,石蜡油层高出斜面顶端 lcm ,使培养物与空气隔绝,加胶塞并 用固体石蜡封口后,垂直放在室温或 4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒,化学 纯规格,其灭菌条件是:150~170℃烘箱内灭菌 lh ;或 121℃高压蒸汽灭菌 60~80min ,再 置于 80℃的烘箱内烘干除去水分。
由于液体石蜡阻隔了空气, 使菌体处于缺氧状态下, 而且又防止了水分挥发, 使培养物 不会干裂,因而能使保藏期达 1~2年,或更长。这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵 母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达 10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。 有试验指出,此法用于保藏红曲霉很合适,保藏 1~2年后存活率为 100%;也有报道 显示,某些蕈菌菌丝用石蜡油保藏法,在 3~6℃保藏时菌丝易于死亡,而在室温下反而较 理想,这是值得注意的。
(三)砂土管保藏法
这是一种常用的长期保藏菌种的方法, 适用于产孢子的放线菌、 霉菌及形成芽孢的细菌, 对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用。
其制作方法是,先将砂与土分别洗净、烘干、过筛 (一般砂用 60目筛,土用 120目筛 ) , 按砂与土的比例为 (1~2) :1混匀,分装于小试管中,砂土的高度约 1cm ,以 121℃蒸汽灭 菌 1~1.5h ,间歇灭菌 3次。 50℃烘干后经检查无误后备用。也有只用砂或土作载体进行保 藏的。 需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养, 再以无菌水制成 108~1010个 /ml菌悬液或
孢子悬液滴入砂土管中, 放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀, 而后置于干燥器中抽 真空约 2~4h ,用火焰熔封管口 (或用石蜡封口 ) ,置于干燥器中,在室温或 4℃冰箱内保藏, 后者效果更好。
砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件,故保藏期较长、效果较好,且微 生物移接方便,经济简便。它比石蜡油封藏法的保藏期长,约 1~10年。中国科学院微生物 研究所用砂土管保藏法保藏放线菌。
(四)麸皮保藏法
麸皮保藏法亦称曲法保藏。 即以麸皮作载体, 吸附接入的孢子, 然后在低温干燥条件下 保存。 其制作方法是按照不同菌种对水分要求的不同将麸皮与水以一定的比例 1:(0.8~1.5) 拌匀,装量为试管体积 2/5,湿热灭菌后经冷却,接入新鲜培养的菌种,适温培养至孢子长 成。 将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中, 于室温下干燥数日后移入低温下保藏; 干 燥后也可将试管用火焰熔封,再保藏,则效果更好。
此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌,保藏期在 1年以上。因操作简单,经济实惠, 工厂较多采用。中国科学院微生物研究所采用麸皮保藏法保藏曲霉,如米曲霉、黑曲霉、泡 盛曲霉等,其保藏期可达数年至数十年。
(五)甘油悬液保藏法
此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中, 置于低温下保藏, 本法较简便, 但需置备低温冰箱。 保藏温度若采用 -20℃,保藏期约为 0.5~1年,而采用 -70℃,保藏期可达 10年。
将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经 121℃蒸汽灭菌 20min 的甘油混合, 并使甘油的 终浓度在 10%~15%,再分装于小离心管中,置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法 保藏。
(六)冷冻真空干燥保藏法
冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法, 简称冻干法。 它通常是用保护剂制备拟保藏 菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中, 再在低温下快速将含菌样冻结, 并减压抽真空, 使 水升华将样品脱水干燥, 形成完全干燥的固体菌块。 并在真空条件下立即融封, 造成无氧真 空环境,最后置于低温下,使微生物处于休眠状态,而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂 牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件,因此保藏期长,一般达 5~15年,存活率高,变异率低,是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状 真菌不宜用此法外,其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采 用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐,技术要求较高,且需要冻干机等设备。
保藏菌种需用时, 可在无菌环境下开启安瓿管, 将无菌的培养基注入安瓿管中, 固体菌 块溶解后,摇匀复水,然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
(七)液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂, 在液氮超低温(-196℃)下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温,并在降 到低温之前, 使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来, 以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细 胞损伤。 美国 ATCC 菌种保藏中心采用该法时, 把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度, 以每分钟下降 1℃ /min 的速度从 0℃直降到 -35℃,然后保藏在 -150℃~-196℃液氮冷箱中。 如果降温速度过快, 由于细胞内自由水来不及渗出胞外, 形成冰晶就会损伤细胞。 据研究认 为降温的速度控制在 (1~10) ℃ /min,细胞死亡率低;随着速度加快,死亡率则相应提高。 液氮低温保藏的保护剂,一般是选择甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊 环、吐温 80等,但最常用的是甘油(10%~20%) 。不同微生物要选择不同的保护剂,再通 过试验加以确定保护剂的浓度,原则上是控制在不足以造成微生物致死的浓度。
此法操作简便、高效、保藏期一般可达到 15年以上,是目前被公认的最有效的菌种长
期保藏技术之一。 除了少数对低温损伤敏感的微生物外, 该法适用于各种微生物菌种的保藏, 甚至连藻类、 原生动物、 支原体等都能用此法获得有效的保藏。 此法的另一大优点是可使用 各种培养形式的微生物进行保藏, 无论是孢子或菌体、 液体培养物或固体培养物均可采用该 保藏法。其缺点是需购置超低温液氮设备,且液氮消耗较多,操作费用较高。
要使用菌种时,从液氮罐中取出安瓿瓶,并迅速放到 35~40℃温水中,使之冰冻熔化, 以无菌操作打开安瓿瓶, 移接到保藏前使用的同一种培养基斜面上进行培养。 从液氮罐中取 出安瓿瓶时速度要快,一般不超过 1min ,以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量。并且取样 时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤。
(八)宿主保藏法
此法适用于专性活细胞寄生微生物(如病毒、立克次氏体等)。它们只能寄生在活的动 植物或其他微生物体内, 故可针对宿主细胞的特性进行保存。 如植物病毒可用植物幼叶的汁 液与病毒混合, 冷冻或干燥保存。 噬菌体可以经过细菌培养扩大后, 与培养基混合直接保存。 动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液,然后分装于试管中密封,低温保存。
在上述的菌种保藏方法中,以斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简便, 砂土管保藏法、 麸皮保藏法和甘油悬液保藏法次之; 以冷冻真空干燥保藏法和液氮超低温保 藏法最为复杂,但其保藏效果最好。应用时,可根据实际需要选用。
在国际著名的 “美国典型培养物收藏中心” (简写 ATCC) , 仅采用两种最有效的保藏法, 即保藏期一般达 5~15年的冷冻真空干燥保藏法与保藏期一般达 15年以上的液氮超低温保 藏法, 以达到最大限度地减少传代次数, 避免菌种变异和衰退的目的。 我国菌种保藏多采用 3种方法,即斜面低温保藏法、液氮超低温保藏法和冷冻真空干燥保藏法。
四、目前国内外主要菌种保藏机构
菌种是一个国家的重要资源, 世界各国都对菌种极为重视, 设置了各种专业性的菌种保 藏机构。
(一)国内主要菌种保藏机构 (表 8-1)
(二)国外部分菌种保藏机构 (表 8-2)
表 8-1 国内主要菌种保藏机构
表 8-2 国外部分菌种保藏机构
范文五：菌种的保藏
第八章 菌种的保藏
第一节 菌种的衰退和复壮
在微生物的基础研究和应用研究中，选育一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，便于长期使用，还需要做很多日常的工作。实际上，由于各种各样的原因，要使菌种永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。
一、菌种的衰退
（一）菌种衰退的现象
菌种衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。菌种衰退的具体表现有以下几个方面：
1. 菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少，就表现为衰退。例如，泾阳链霉菌“5406”的菌落原来为凸形变成了扇形、帽形或小山形；孢子丝由原来螺旋形变成波曲形或直形，孢子从椭圆形变成圆柱形等。
2. 生长速度缓慢，产孢子越来越少。例如，“5406”的菌苔变薄，生长缓慢(半个月以上才长出菌落)，不产生丰富的桔红色的孢子层，有时甚至只长些黄绿色的基内菌丝。
3. 代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。例如，黑曲霉糖化力、放线菌抗生素发酵单位的下降以及各种发酵代谢产物量的减少等，在生产上是十分不利的。
4. 致病菌对宿主侵染能力下降。如白僵菌对宿主致病能力的降低等。
5. 对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵抗能力的下降等。如抗噬菌体菌株变为敏感菌株等。
值得指出的是，有时培养条件的改变或杂菌污染等原因会造成菌种衰退的假象，因此在实践工作中一定要正确判断菌种是否退化，这样才能找出正确的解决办法。
（二）菌种衰退的原因
菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。经分析发现，导致这一现象的原因有以下几方面。
1. 基因突变
（1）有关基因发生负突变导致菌种衰退
菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降；如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。菌种在移种传代过程中会发生自发突变。虽然自发突变的几率很低(一般为10-6～10-9)，尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退了的菌株。
（2）表型延迟造成菌种衰退
表型延迟现象也会造成菌种衰退。如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。
（3）质粒脱落导致菌种衰退
质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响（如高温），致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒，经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。
2. 连续传代
连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
3. 不适宜的培养和保藏条件
不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。
（三）菌种衰退的防止
根据菌种衰退原因的分析,可以制定出一些防治衰退的措施，主要从以下几方面考虑：
1. 控制传代次数
意即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的机率。一套良好的菌种保藏方法可大大减少不必要的移种和传代次数。
2. 创造良好的培养条件
创造一个适合原种的良好培养条件，可以防止菌种衰退。如培养营养缺陷型菌株时应保证适当的营养成分，尤其是生长因子；培养一些抗性菌时应添加一定浓度的药物于培养基中,使回复的敏感型菌株的生长受到抑制，而生产菌能正常生长；控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。例如，利用菟丝子的种子汁培养“鲁保一号”真菌可防止其退化；在赤霉素生产菌藤仓赤霉的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺，谷氨酰胺、5－核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，也有防止菌种衰退的效果；此外，将培养栖土曲霉(Aspergillus terricola)3.942的温度从28～30℃提高到33～34℃，可防止其产孢子能力的衰退。
3. 利用不易衰退的细胞移种传代
在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就不会发生这种现象。在实践中，若用灭过菌的棉团轻巧地对放线菌进行斜面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止衰退的效果；另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退，而改用子囊孢子移种则能避免衰退。
4. 采用有效的菌种保藏方法
有效的菌种保藏方法是防止菌种衰退极其必要的措施。在实践中，应当有针对性的选择菌种保藏的方法。例如，啤酒酿造中常用的酿酒酵母，保持其优良发酵性能最有效的保藏方法是－70℃低温保藏，其次是4℃低温保藏，若采用对于绝大多数微生物保藏效果很好的冷冻干燥保藏法和液氮保藏法，其效果并不理想。
一般斜面冰箱保藏法只适用于短期保藏，而需要长期保藏的菌种，应当采用砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法。对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏方法。
工业生产用菌种的主要性状都属于数量性状，而这类性状恰是最易衰退的。即使在较好的保藏条件下，还是存在这种情况。例如链霉素产生菌——灰色链霉菌的菌种保藏即使是用冷冻干燥保藏法等现今较好的方法，还是会出现这类情况。由此说明有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌种的衰退。
5. 讲究菌种选育技术
在菌种选育时，应尽量使用单核细胞或孢子，并采用较高剂量使单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力,避免表型延迟现象。同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌种的纯度。
6. 定期进行分离纯化
定期进行分离纯化，对相应指标进行检查，也是有效防止菌种衰退的方法。此方法将在菌种复壮部分介绍。
二、菌种的复壮
（一）复壮
从菌种衰退的本质可以看出，通常在已衰退的菌种中存在有一定数量尚未衰退的个体。 狭义的复壮是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
由此可见，狭义的复壮是一种消极的措施，而广义的复壮是一种积极的措施，也是目前工业生产中积极提倡的措施。
（二）菌种复壮的主要方法
1. 纯种分离法
通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。常用的分离纯化的方法可归纳成两类：一类较粗放，只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平来说是纯的。例如采用稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落。另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法。它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水平。后一类方法应用较广，种类很多，既有简单的利用培养皿或凹玻片等作分离室的方法，也有利用复杂的显微操纵器的纯种分离方法。对于不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管截
取菌丝尖端单细胞进行纯种分离。
2. 宿主体内复壮法
对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。例如，苏云金芽孢杆菌经过长期人工培养会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，可用退化的菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。如此反复多次，就可提高菌株的杀虫率。根瘤菌属经人工移接,结瘤固氮能力减退,将其回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。
3. 淘汰法
将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。如有人曾将“5406”的分生孢子在低温(－10～30℃)下处理5～7d，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存活个体中留下了未退化的健壮个体。
4. 遗传育种法
即把退化的菌种，重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。
第二节 菌种的保藏
菌种是重要生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。
一、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。
菌种保藏对于基础研究和实际生产具有特别重要的意义。在基础研究中，菌种保藏可以保证研究结果获得良好的重复性。对于实际应用的生产菌种，可靠的保藏措施可以保证优良菌种长期高产稳产。
二、菌种保藏的原理
无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。
水分对生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥尤其是深度干燥，在菌种保藏中占有首要地位。五氧化二磷、无水氯化钙和硅胶是良好的干燥剂，当然，高度真空则可以同时达到驱氧和深度干燥的双重目的。
低温是菌种保藏中的另一重要条件。微生物生长的温度下限约在-30℃，可是在水溶液中能进行酶促反应的温度下限则在-140℃左右。这可能就是即使把微生物保藏在较低的温度下，但只要有水分存在，还是难以较长期地保藏它们的一个主要原因。因此，低温必须与干燥结合，才具有良好的保藏效果。在低温保藏中，细胞体积较大者一般要比较小者对低温敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因是低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤。如果放到低温-70℃下进行冷冻时，适当采用速冻的方法，可使产生的冰晶小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故
此时快速升温也可减少对细胞的损伤。不同微生物的最适冷冻速度和升温速度是不同的。例如，酵母菌的冷冻速度以10℃/min为宜，而红细胞则相应地为20℃/min。另外，在适宜的介质中冷冻，可以减少对细胞的损伤。例如，0.5mol／L左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质如糊精、血清白蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)虽不能透入细胞，但可能是通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。在实践中，发现用极低的温度进行保藏时效果更为理想，如液氮温度(-196℃)比干冰温度(-70℃)好，-70℃又比-20℃好，而-20℃比4℃好。
三、菌种保藏的方法
各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。下面介绍几种常用的菌种保藏方法：
（一）斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。
此法由于采用低温保藏，大大减缓了微生物的代谢繁殖速度，降低突变频率；同时也减少了培养基的水分蒸发，使其不至于干裂。该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。
（二）石蜡油封藏法
此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。
由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达1～2年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好，可保存几年，甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。
有试验指出，此法用于保藏红曲霉很合适，保藏1～2年后存活率为100％；也有报道显示，某些蕈菌菌丝用石蜡油保藏法，在3～6℃保藏时菌丝易于死亡，而在室温下反而较理想，这是值得注意的。
（三）砂土管保藏法
这是一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用。
其制作方法是，先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛，土用120目筛)，按砂与土的比例为(1～2)：1混匀，分装于小试管中，砂土的高度约1cm，以121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。也有只用砂或土作载体进行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养，再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或
孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏，后者效果更好。
砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它比石蜡油封藏法的保藏期长，约1～10年。中国科学院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放线菌。
（四）麸皮保藏法
麸皮保藏法亦称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。其制作方法是按照不同菌种对水分要求的不同将麸皮与水以一定的比例1：(0.8～1.5)拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。
此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。因操作简单，经济实惠，工厂较多采用。中国科学院微生物研究所采用麸皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可达数年至数十年。
（五）甘油悬液保藏法
此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用-20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可达10年。
将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。
（六）冷冻真空干燥保藏法
冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
（七）液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min 的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降温速度过快，由于细胞内自由水来不及渗出胞外，形成冰晶就会损伤细胞。据研究认为降温的速度控制在(1～10)℃/min，细胞死亡率低；随着速度加快，死亡率则相应提高。
液氮低温保藏的保护剂，一般是选择甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊环、吐温80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要选择不同的保护剂，再通过试验加以确定保护剂的浓度，原则上是控制在不足以造成微生物致死的浓度。
此法操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上，是目前被公认的最有效的菌种长
期保藏技术之一。除了少数对低温损伤敏感的微生物外，该法适用于各种微生物菌种的保藏，甚至连藻类、原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏。此法的另一大优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏，无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。
要使用菌种时，从液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃温水中，使之冰冻熔化，以无菌操作打开安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一种培养基斜面上进行培养。从液氮罐中取出安瓿瓶时速度要快，一般不超过1min，以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量。并且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤。
（八）宿主保藏法
此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。它们只能寄生在活的动植物或其他微生物体内，故可针对宿主细胞的特性进行保存。如植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。
在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简便，砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效果最好。应用时，可根据实际需要选用。
在国际著名的“美国典型培养物收藏中心”(简写ATCC)，仅采用两种最有效的保藏法，即保藏期一般达5～15年的冷冻真空干燥保藏法与保藏期一般达15年以上的液氮超低温保藏法，以达到最大限度地减少传代次数，避免菌种变异和衰退的目的。我国菌种保藏多采用3种方法，即斜面低温保藏法、液氮超低温保藏法和冷冻真空干燥保藏法。
四、目前国内外主要菌种保藏机构
菌种是一个国家的重要资源，世界各国都对菌种极为重视，设置了各种专业性的菌种保藏机构。
（一）国内主要菌种保藏机构（表8－1）
（二）国外部分菌种保藏机构（表8－2）
表8－1 国内主要菌种保藏机构
表8－2 国外部分菌种保藏机构
