低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光

范文一：低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧化系统的影响_左敏

低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧化系统的影响_左敏

西北农业学报

2006,15(3):20~26ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica

低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧化系统的影响

左敏,张成军,陈国祥,施大伟,张超英,吕川根,苏柱琼111*1121*

(1.南京师范大学生命科学学院,南京 210097;2.江苏省农业科学研究院粮食与作物研究所,南京 210014)

摘要:以高产杂交稻两优培九和常规杂交稻汕优63为材料,研究10e夜间低温处理对水稻幼苗叶绿体自发荧光强度及抗氧化系统的影响。与同时期的常温对照相比,两优培九的SOD、GR、CAT、POD酶活性的上升幅度要强于汕优63,而汕优63的GSH、ASA含量的上升幅度要强于两优培九。两优培九的O2-和MDA

的积累少,叶绿体自发荧光强度降低程度小于汕优63。表明两优培九幼苗的抗冷性优于汕优63。胁迫后期,

两优培九中一些保护酶类活性低于对照,O2-产生速率和MDA含量高于对照,表明此时活性氧清除系统的平衡已被破坏。

关键词:低温;水稻;抗氧化系统;叶绿体自发荧光

中图分类号:S511 文献标识码:A 文章编

号:1004-1389(2006)03-0020-07

EffectsofChillingTemperatureonChloroplastAuto-Fluorescence

andAntioxidantSysteminRiceSeedlings ———————————————————————————————————————————————

ZUOMin1,ZHANGCheng-jun1,CHENGuo-xiang1*,SHIDa-wei1,

ZHANGChao-ying,LUChuan-genandSUZhu-qiong121

(1.CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity,Nanjing 210097,China;2.Instituteof

Food&Crops,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing 210014,China)

Abstract:Toclarifytheresistanceofhigh-yieldhybridrice(OryzasativaL)atseedlingstagetochil-lingtemperature,antioxidantsystemandchloroplastauto-fluorescencewereinvestigatedintwocult-ivars-LiangyoupeijiuandShanyou63,setting25eascontroland10easlowtemperaturetreatment.Theresultsindicatedthatunderlowtemperature,theincreasingextentoftheactivityofsuperoxidedismutaseandglutathionereductasewashigherinLiangyoupeijiuthanthatinShanyou63.TheactivityofcatalaseinLiangyoupeijiuincreased,whilethatinShanyou63decreased.IsoenzymeofperoxidasehadevidentnewexpressioninLiangyoupeijiu,whichwasnotobviousinShanyou63.AlltheaboveshowedthattheprotectiveenzymesystemofLiangyoupeijiuwassuperiortothatofShanyou63.As-corbicacidandglutathionecooperatedwitheachothertocleanperoxid.TheincreasingextentofthecontentofAscorbicacidandglutathionewerehigherinShanyou63thaninLiangyoupeijiu,whichmeanttheprotectivenonenzymesystemofLiangyoupeijiuwasweakerthanthatofShanyou63.TheproducingvelocityofO2waslowerinLiangyoupeijiuinchillingsituationthanthenor———————————————————————————————————————————————

mal.ButthecasewasoppositeinShanyou63.Thedecreasingextentofchloroplastauto-fluorescencewaslowerinLiangyoupeijiuthanthatofShanyou63.Thefindingsindicatedthatthecold-resistanceabilityofsuper-high-yieldhybridriceLiangyoupeijiuwasbetterthanthetraditionalricecultivarShanyou63.Butatthelaterperiodofchillingstress,O2

*--producingvelocityandMDAcontentinLiangyoupeijiuwashigher收

稿日期:2005-12-26 修回日期:2006-01-15

基金项目:国家自然科学基金(30270792);教育部科学技术研究重

点项目(204049);江苏省博士后科研资助计划。

作者简介:左敏(1982)),女,硕士,主要从事植物光合生理及生态的

研究。E-mail:areyoufine12.345@163.com.

3期左敏等:低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧

化系统的影响#21#

thanthenormal.ThisshowedthatthebalanceofthecleansystemofO2-hadbeendestroyed.Keywords:Chillingtemperature;OryzasativaL;Antioxidantsystem;Chloroplastauto-fluorescence 低温冷害是作物在生育期最低临界

温度以下冰点以上温度范围内发生的生长停滞或生育障碍现象[1,2]。

许多喜温作物对低温敏感,当处在0~10e下一定时间后,各个生理过程

都或多或少受到干扰,其中由于抗氧化系统功能的破坏所导致的活性

氧产生和清除的平衡体系的打破已多有报道[4,5],自由基和活性氧的

积累可能引发叶绿素的破坏,进一步导致叶绿体自发荧光的下降。而

———————————————————————————————————————————————

荧光强弱是PSII活性的表现[6],PSII活性与作物的光合功能息息相关,因此研究这两项指标对于探讨作物在低温下的抗性具有现实意义。本文以超高产杂交稻两优培九和常规杂交稻汕优63作为试验材料,研究了低温处理过程中,抗氧化系统的一些酶类和非酶类物质的活性、含量、同工酶谱的变化及叶绿体自发荧光强度的变化,旨在进一步探讨低温逆境导致水稻减产的机理,从而为水稻的耐寒育种提供一定的理论依据。

[3]

性来表示;过氧化氢酶(CAT)测定参照张志良的方法[8];谷胱甘肽还原酶(GR)测定参照YangCW的方法[9];还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定参照Ellman的方法[10];抗坏血酸(ASA)测定参照Tanaka等的方法[11];超氧阴离子(O2-)产生速率测定参照罗广华和王爱国的方法[12]进行。膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量的测定参照赵世杰等的硫代巴比妥酸(TBA)比色法

[13]

。过

氧化物酶(POD)同工酶电泳采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳,分离胶浓度为7.5%,浓缩胶浓度为2.5%,电泳缓冲液采用高离子强度Tris-甘氨酸系统,电泳采用稳流方式,电流强度为45mA,在0~4e低温下连续电泳5~6h。染色采用改良的醋酸联苯胺法,室温下染色,5~6min内酶带显现,拍摄并记录。

叶绿体自发荧光强度的检测:每2d取水稻叶片做横切面徒手切片,———————————————————————————————————————————————

在光镜下挑选出厚薄均匀一致的,以未经低温处理的作为对照,用0.1mol/L(pH7.8)的磷酸缓冲液浸没切片,用盖玻片将其固定,迅速放在20@物镜下,打开Kr/Ar激光器,激发波长为488nm,在Bio-Rad公司MRC1024型激光共聚焦扫描显微镜下观察记录,结果用Lasersharp软件进行数字化图像分析及处理。

不同品种、处理时间之间的差异在MicrocalOrigin(Version7.0)上用单向方差分析(ANO-VA)的方法在P[0.05的水平上进行显著性检验。

1 材料与方法

1.1 材料培养

供试材料为常规杂交稻汕优63以及高产杂交稻两优培九,种子由江苏省农科院提供。选取健壮饱满的种子用1%H2O2消毒1h,充分漂洗后,28e浸种36h,然后在30e的黑暗条件下催芽48h。挑选发芽良好的种子播种于盛有蛭石的瓷盘当中,放置于光照培养箱中培养。培养温度为25e/20e(昼/夜),培养液为木村B培养液。待幼苗长到两叶一心期时,将部分幼苗取出移栽至可控温的培养箱中进行低温处理,培养温度为25e/10e(昼/夜),光照同上。每2d取样一次,以未经低温处理的作为对照,每个样品重复3次,文中各数据为3次重复的平均值?标准差。

1.2 试验方法

将取下的幼苗叶片称重0.1g,剪碎,加入0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8),冰浴下研磨匀浆,以12000r/min冷冻离心20min,上清液以磷酸缓冲液定容至10mL即为粗酶液,置于4e冰箱保存备用。

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定参照Stew-[7] ———————————————————————————————————————————————

2 结果与分析

2.1 酶促保护系统SOD、CAT、GR活性的变化

由图1可见,2个品种SOD活性的总体趋势随时间延长而降低,低温处理后2d、4d、6d、8d时,两优培九的SOD活性均较对照有所上升,

8d时上升163%,10d时较对照有所下降;汕优63中,仅在2d、4d时较对照有所上升,在6d、8d、10d时均低于对照。这表明在对抗低温胁迫时,两优培九的SOD活性增加幅度要高于汕优63。

由图2可看出,低温处理初期,两优培九的,,

#22#西北农业学报 15卷

在4d时达到峰值,然后下降,但整个过程中仍高于对照,而汕优63则刚好相反,仅在低温处理初期稍高于对照,而后在整个过程中均低于对照,在6d下降明显,这说明汕优63的CAT活性受低温影响较为明显,而两优培九的CAT活性在经过低温锻炼后,

表现出低温适应。

图3表明,在整个低温处理过程中,两优培九的GR(谷胱甘肽还原酶)活性高于对照,而在汕优63中,仅2d、4d、6d时高于对照,在8d和10d则低于对照,说明两优培九的谷胱甘肽还原酶适应低温的能力更强。2.2 非酶促保护系统GSH、ASA含量的变化

由图4可看出,低温处理2d、4d时,两优培九的GSH含量变化不大,仅有缓慢上升,处理6d时上升稍微明显,8d、10d时较对照相比均有下降;而在汕优63中,低温2d、4d、6d、8d时,GSH含量较对照均有上升,6d上升80%,仅在10d时低于对照。

———————————————————————————————————————————————

图5表明,两优培九中,仅在低温处理2d、4d时,ASA含量高于对照,此后,处理6d、8d、10

L-两优培九L-Liangyoupeijiu;DL-低温处理的

两优培九DL-Liangyoupeijiuinchillingtemperature;S-汕优63S-Shanyou63;DS-低温处理的汕优63(下图同) DS-Shanyou63inchilling

temperature(sameasbelow)

d时,均低于对照,而在汕优63中,在低温处理的整个过程中,ASA含量均高于对照,初期上升明显。

图1 SOD活性的变化Fig.1 ChangesinSOD

activity

图4 GSH含量的变化

Fig.4 ChangesinGSHcontent

图2 CAT活性的变化Fig.2 ChangesinCAT

activity

图5 ASA含量的变化

Fig.5 ChangesinASAcontent

2.3 超氧阴离子和膜脂过氧化产物MDA含量的变化

图3 GR活性的变化

3inactivity

超氧阴离子伤害植物的机理之一在于启动膜,

3期左敏等:低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧化系统的影响#23#

———————————————————————————————————————————————

的增加[14]。如图6所示,在低温胁迫前8d,尽管两优培九中O2的含量在逐渐上升,但始终保持在一个较低的水平,始终低于对照。当胁迫继续进行时,O2-的含量迅速增大,10d时为对照的1.33倍。在汕优63中,仅在处理中期(6d左右)时低于对照,

其他时间均高于对照。

酶带颜色变深,说明低温能诱导两优陪九中POD同工酶的表达。而在汕优63中,与常温对照相比,低温处理2d后,I区中即有两条二级带变为一级带,活性减弱,II区、III区颜色亦变浅,处理中期,与对照相比,谱带数目无明显变化,颜色继续变浅,说明酶活性持续减弱,处理后期,谱带有明显的消失现象,以III区最为明显,说明低温对其POD酶活性影响较大。

图6 O2-含量的变化Fig.6 ChangesinO2-

content

L2-2days'Liangyoupeijiu;DL2-2days'Liangyoupeijiuinchillingte

mperature

图8 两优陪九POD电泳图

Fig.8 ChangesofPODEnzymesinLiangyoupeijiu

inchillingtemperature

图7 MDA含量的变化Fig.7 ChangesinMDAcontent

由图7中可看出,与O2的产生速率相对应,两优培九的MDA含量———————————————————————————————————————————————

在低温胁迫的前期(0~6d)略微有所上升,但并没有太大的变化,一直维持在比较低的水平,仅在末期高于对照;而低温则能导致汕优63的MDA在体内的迅速积累,在低温处理的过程中,汕优63的MDA含量除在8d左右时低于对照外,其它时间均高于对照。2.4 过氧化物酶(POD)同功酶谱的变化

根据酶学特性原理,将POD酶带按透明度及带宽分为一级带(酶带色深而宽),二级带(酶带色浅而较宽),三级带(酶带色极浅而窄),以此来表示酶活性的变化[15]。如图8,9所示,正常情况下(即对照中),两优陪九和汕优63主要表达三组同工酶,分为I区、II区和III区。两优培九中,与常温对照相比,低温处理情况下,无论是I区、II区

S2-2days'Shanyou63;DS2-2days'Shanyou63

inchillingtemperature(sameasbelow)

图9 汕优63POD电泳图

Fig.9 ChangesofPODEnzymesinShanyou63

inchillingtemperature

2.5 叶绿体自发荧光的变化

水稻叶片横切面经波长488nm光激发后,在激光共聚焦扫描显微镜下观察到其叶细胞产生蓝、绿两种颜色的图像。其中绿色图像为水稻叶片细胞壁外观形态扫描图像(非自发荧光图像由

FilterBlueReflection所采集)蓝色图像为检测到的细胞组份自发荧光图像,发射波长680nm,蓝色为仪器所设置的伪彩色。将蓝色图像进行数———————————————————————————————————————————————

字化图像分析处理,低温使两优陪九和汕优63中的

#24#西北农业学报 15卷荧光分子均遭到破坏,自发荧光强度范围变窄,峰

值变小,平均自发荧光强度(象素荧光强度)降低。

但仍存在品种间差异,与常温对照相比,两优陪九

的自发荧光量在处理过程中虽有下降,但幅度较

小,趋势较为平缓;而在汕优63中,处理2d时,

自发荧光量即有急剧下降,此后虽有短暂回升,但10d后,下降仍然明显。本试验表明,与汕优63相比,两优陪九叶绿体自发荧光受低温影响较小,耐受低温的能力较强,虽然在低温胁迫下,2个品种的荧光强度均有所减弱,但两优培九减弱程度较小,表明其光合系统受低温伤害较小,说明两优培九幼苗的抗冷力要强于汕优63

。

图10 低温对水稻叶片自发荧光强度的影响Fig.10 Effectsofchillingtemperatureonauto-fluorescentintensityofriceleafcells

3期左敏等:低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧化系统的影响#25#

3 讨论

环境胁迫下秧苗体内活性氧所造成的氧化伤害是一种普遍现象[16],植物的光合器官是对光、温反应敏感的部位,植物细胞因其本身的有氧状况和类囊体膜上存在许多光敏感部位和不饱和脂肪酸而更易受到活性氧的伤害[18]。正常情况下,植物体内由于抗氧化的酶促和非———————————————————————————————————————————————

酶促两大保护体系的存在,活性氧的产生与清除处于平衡状态,从而使植物免遭这种伤害[19];当植物处于逆境时,体内发生一系列的生理生化变化,一些酶的活性和一些物质的含量受到不同程度的影响,这种平衡可能会被打破,活性氧的积累和所造成的膜脂过氧化是需氧生物遭受逆境伤害的重要特征

[20]

[17]

ASA和GSH在叶绿体中组成ASA-GSH循环系统,清除氧自由基,排除过氧化物,保护光合器官

[27]

。低温胁迫下,与同时期的常温对照相比,

汕优63的GSH和ASA含量的上升幅度和维持时间要强于两优培九,说明汕优63的非酶促保护能力强于两优培九。SOD酶是植物体内抗氧化系统中首要的清除酶,随着处理时间的延长,两个品种SOD酶活性呈下降趋势,与其相对应,O2-产生速率呈上升趋势。在低温胁迫前8d,两优培九中O2的产生速率虽逐渐上升,但仍低于对照,MDA含量亦低于对照。这说明此时植物体内的活性氧清除系统正在发挥积极作用。胁迫后期,O2-的产生速率迅速增大,MDA含量亦增大,推测可能是活性氧清除系统的平衡已被破坏。而在低温胁迫下的大部分时间内,汕优63的O2-产生速率和MDA含量均高于对照。说明两优培九受低温伤害的膜脂过氧化程度较轻,膜结构破坏较小。在低温处理过程中,两优培九叶绿体自发荧光强度下降幅度小于汕优63,且自发荧光强度基本———————————————————————————————————————————————

上强于汕优63,表明两优陪九PSII活性受低温的影响较小。因此,两优培九在对抗低温光抑制方面要优于汕优63,可能是其通过启动防御伤害的保护性反应来保护自身的光合器官以免受到伤害

[28,29]

。由本试验可以看出,低温处理10d后,无

论是两优培九还是汕优63,部分抗氧化酶的活性和抗氧化物质的含量与常温对照相比均有不同程度的降低。在两优培九中表现为SOD活性和GSH、ASA含量的降低,在汕优63中则表现为SOD,CAT,GR活性和GSH含量的降低,POD同工酶的表达在汕优63出现明显的酶带消失和酶活性减弱。O2的产生速率和MDA的含量二者均高于对照。这表明低温对水稻是有害的,低温引起水稻抗氧化系统的保护能力的改变,O2-大量产生,攻击细胞膜脂和其他生物大分子,产生膜脂过氧化产物MDA,使膜结构和功能受到破坏。

已有研究表明,逆境胁迫时,自由基和活性氧的积累引发叶绿素a的降解,破坏叶绿体的结构和功能,降低叶片捕捉和利用光能的能力,影响光能在叶绿体中的分配,使植物光合器官利用光能的能力降低,从而积累过量的光能造成对植物的伤害

[21~24]

。

植物对逆境抵抗能力的强弱与细胞生理生化的一系列适应性变———————————————————————————————————————————————

化有关,因此不能以单一指标的变化来判断低温对水稻幼苗的影响。两优培九的幼苗在低温处理下活性氧的清除能力得到了加强,活性氧在体内的积累降低,这可能是由于两优培九在经历过处理初期的锻炼以后,逐渐适应了低温的环境,各种抗氧化酶的活性也得到了提高。而低温显然对汕优63伤害较大,虽然各项指标互有升降,但是由于其酶促和非酶促保护系统之间的平衡被打破,因此其活性氧含量增加,膜脂过氧化程度加剧,从而使组织遭到破坏。由本试验可以看出,两优培九的幼苗要比汕优63对低温更加适应,抗氧化酶似乎起主要作用,这也可能是其产量高的原因,但同时,两优培九启动保护体系对抗抗低温逆境的伤害也是有限度的,持续的低温也可能会对细胞造成不可逆的伤害。

参考文献:

[1] 邓应德,刘阳梅,陈志兵.丰源A及其杂交组合生长后期耐

[J].,2005,2):58~

。本试验中,低温处理导致叶绿体自发

[6]

荧光的下降,而荧光强弱是PSII活性的表现,意味着低温降低了PSII活性,这与前人的研究结果一致

[25,26]

。

本研究同时表明,在低温胁迫下,两优培九和汕优63的抗性存在品种间差异。在低温处理前期和中期,与同时期的常温对照相比,两优———————————————————————————————————————————————

培九的SOD、CAT和GR活性的增加幅度和维持时间要强于汕优63。

低温诱导了两优培九POD同工酶结构和功能的改组,而汕优63的同工

酶谱带则出现明显的消失。这说明在对抗低温胁迫时,两优

#26#

60.

西北农业学报 15卷

42.

[17] 薛国希,高辉远,**民.低温下壳聚糖处理对黄瓜幼苗生

理生化特性的影响[J].植物生理与分子生物学学

报,2004,30(4):441~448.

[18] HalliwellB,GutterdgeJMC.Freeradicalsinbiologyand

medicine2ndClarendon[J].Oxford,1989.1~59.

[19] 刘家忠,龚明.植物抗氧化系统研究进展[J].云南师范

大学学报,1999,(6):1~11.

[20] 苏维埃,王文英,李棉柱.植物类脂及脂肪酸的分析技术

[J].植物生理学通讯,1980(3):54~60.

[21]

AsadaK.Thewater-watercycleinchloroplasts:scaven-gingofactiveoxygensa

nddissipationofexcessphoton[J].AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol,1999,

50:601~639.

[22] LidonFC,LoureiroAS,VieiraDE.Photoinhibitionin

———————————————————————————————————————————————

chillingstressedwheatandmaiz[J].Photosynthetica,2001,39(2):161~166.

[23]

LongSP,EastTM,BakerNR.Chillingdamagetopho-tosynthesisinyoungZeamays.I.EffectsoflightandtemperaturevariationonphotosyntheticCO2assimilation[J].ExpBot,1983,34:177~188.

[24] PowlesSB.Photoinhibitionofphotosynthesisinducedby

visiblelight[J].AnnRevPlantPhysicl,1984,35:15~44.

[25] 周艳虹,黄黎峰,喻景权.持续低温弱光对黄瓜叶片气体交

换,叶绿素荧光猝灭和吸收光能分配的影响[J].植物生理与分子生

物学学报,2004,30(2):153~160.

[26] 刘鹏,赵世杰,孟庆伟.冷锻炼对甜椒叶片光合作用及其

低温光抑制的影响[J].植物生理与分子生物学学

报,2002,28(1):51~58.

[27] 方学智,朱祝军,孙光闻.不同浓度Cd对小白菜生长及抗

氧化系统的影响[J].农业环境科学学报,2004,23(5):877~880.

[28] HunerNPA,QquistG,HurryVM.Photoinhibitionand

lowtemperatureacclimationincoldtolerantplants[J].PhotosynRes,1993,37:19~39.

[29] SomersaloS,KrauseGH.Reversiblephotoinhibitionof

unhardenedandcold-acclimatedspinachleavesatchillingtemperature[J].Pl———————————————————————————————————————————————

anta,1990,180:181~187.

[2] 刘景花.低温冷害对绿色食品水稻的影响及防御措施[J].

黑龙江气象,2003,1:23~25.

[3] 何洁,刘鸿先,王以柔,等.低温与植物的光合作用[J].植

物生理学通讯,1986(2):1~62.

[4] 李美茹,刘鸿先,王以柔.低温下水稻幼苗叶片细胞膜膜脂

过氧化和膜磷脂脱酯化反应[J].广西植物,1998,18(2):173~176.

[5] 梁颖,王三根.Ca2+对低温下水稻幼苗的保护作用[J].作

物学报,2001,27(1):59~64.

[6]

KrauseGH,WeisE.Chlorophyllfluorescenceandphoto-synthesis[J].PlantMolBoil,1991,42:313~349.

[7] StewretRC,BewbyJD.Lipidperoxidationassociatedwith

acceleratedagingofsoybeanaxes[J].PlantPhysiol,1980,65:245~248.

[8] 张志良.植物生理学实验指导(第2版)[M].北京:高等教

育出版社,1990.154~157.

[9]

YangCW,PengCL,ChenYZ.Dailychangesofcompo-nentsofxanthopyllcycleandantioxidantsystemsinleavesofriceatdifferentdevelopingstage[J].ActaPhysiolPlant,2001,23(4):361~369.

[10] EllmanGL.Tissuesulfhydrylgroups.[J].ArchBiochem

Biophys,1959,82:70~77.

———————————————————————————————————————————————

[11]

Tanakak,SudaY,KondoN.Ozonetoleranceandthea-scorbate-dependenthyd

rogenperoxidedecomposingsysteminchloroplasts[J].PlantCellPhysiol,198

5,26:1425~1431.

[12] 王爱国,罗广华.植物的超氧物自由基与羟胺反应的定量

关系[J].植物生理学通讯,1990,6:55~57.

[13] 赵世杰,李德全.现代植物生理学实验指南[M].北京:科

学出版社,1999.

[14] 蔡志全,曹坤芳,冯玉龙.夜间低温胁迫对两种生长下藤黄

幼苗叶片荧光特性和活性氧代谢的影响[J].应用生态学

报,2003,14(3):326~331.

[15] 姚允聪,王有年,赵晓芳.低温条件下君迁子幼苗SOD同

工酶谱带与活性研究[J].北京农学院学报,1994,10:49~55.

[16] 肖用森,王正直,郭绍川.低温胁迫对杂交稻及其亲本幼

苗内活性氧清除剂的影响[J].杂交水稻,1990,5:39~

———————————————————————————————————————————————

范文二：低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧化系统的影响

低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧化

系统的影响

罩北藤业学抠2006,15(3):2O,26

AetaAgr('ulturaeBoreali一0c.cidentalisSini~" 低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧化系统的影响

左敏,张成军,陈国祥,施大伟,张超英,吕川根,苏柱琼

(1.南京师范大学生命科学学院,南京21oo97;2.江苏省农科学研究院粮食与作物研究所,南京210014)

摘要:以高产杂交稻两优培九和常规杂交稻汕优63为材料,研究10C夜间低温处理对水稻幼苗叶绿体自

发荧光强度及抗氧化系统的影响.与同时期的常温对照相比,两优培九的SOD,GR,CAT,POD酶活性的上

升幅度要强于汕优63,而汕优63的GSH,ASA含量的上升幅度要强于两优培九.两优培九的O.一和MDA

的积累少,叶绿体自发荧光强度降低程度小于汕优63.表明两优培九幼苗的抗冷性优于汕优63.胁迫后期,

两优培九中一些保护酶类活性低于对照.()一产生速率和MDA含量高于对照.表明此时活性氧清除系统的

平衡已被破坏.

关键词:低温;水稻;抗氧化系统;叶绿体自发荧光

中图分类号:S511文献标识码:A文章编号:10041389(2006)03—002007 EffectsofChillingTemperatureonChloroplastAuto.Fluorescence

andAntioxidantSysteminRiceSeedlings ZU0Min,ZHANGCheng-jun,CHENGuo—xiangH,SHIDa—wei, ZHANGChao—ying.LUChuan—gen.andSUZhu—qiong

(1.CollegeofI.ifeSciences,NanjingNormalUniversity.Nanjing210097,China;2.Institute

Food&Crops.JiangsuAcademyofAgrieuhuralSciences.Nanjing210014.China) Abstract:Toclarifytheresistanceofhighyieldhybridrice(OryzasativaI)atseedlingstagetochill—

ingtemperature,antioxidantsystemandchloroplastauto,

fluorescencewereinvestigatedintwoculti—

vars—IiangyoupeijiuandShanyou63,setting25?

ascontroland10"Caslowtemperaturetreatment.

Theresultsindicatedthatunderlowtemperature,theincreasingextentoftheactivityofsuperoxide

dismutaseandglutathionereduetasewashigherinLiangyoupeijiuthanthatinShanyou63.Theactivity

ofcatalaseinLiangyoupeijiuincreased,whilethatinShanyou63decreased.Isoenzymeofperoxidase

hadevidentnewexpressioninIiangyoupeijiu,whichwasnotobviousinShanyou63.Alltheabove

showedthattheprotectiveenzymesystemofIiangyoupeijiuwassuperiortothatofShanyou63.As—

corbicacidandglutathionecooperatedwitheachothertocleanperoxid.Theincreasingextentofthe

contentofAscorbicacidandglutathionewerehigherinShanyou63thaninLiangyoupeijiu,which

meanttheprotectivenonenzymesystemofLiangyoupeijiuwasweakerthanthatofShanyou63.The

producingvelocityofOz—waslowerinLiangyoupeijiuinchillingsituationthanthenorma【.Butthe

casewasoppositeinShanyou63.Thedecreasingextentofchloroplastauto—

fluorescencewaslowerin

LiangyoupeijiuthanthatofShanyou63.Thefindingsindicatedthatthecold—

resistanceabilityofsuper一

high—yieldhybridriceLiangyoupeijiuwasbetterthanthetraditionalricecultivarShanyou63.Butat

the

laterperiodofchillingstress,()2一producingvelocityandMDAcontentinLiangyoupeijiuwashigher

收稿日期:200512—26修回日期:2006—01—15

基金璇自:国家自然科学基金(30270792);教育部科学技术研究重点项目(204049);江苏省博士后科研资助计划.

作者简介:左敏(1982一),女.硕士.主要从事植物光合生理及生态的研究.Email:areyoufine12.345@163.cOm. *通讯作者..Email:gxehen@njnu.edu.cn.

3期左敏等:低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧化系统的影响

thanthenorma1.ThisshowedthatthebalanceofthecleansystemofO2一hadbeendestroyed. Keywords:Chillingtemperature;Oryzasativa1;Antioxidantsystem~Chloroplastautofluo

rescence

低温冷害是作物在生育期最低临界温度以下

冰点以上温度范围内发生的生长停滞或生育障碍

现象].许多喜温作物对低温敏感,当处在0,

1O?下一定时间后,各个生理过程都或多或少受

到干扰],其中由于抗氧化系统功能的破坏所导

致的活性氧产生和清除的平衡体系的打破已多有

报道,],自由基和活性氧的积累可能引发叶绿

素的破坏.进一步导致叶绿体自发荧光的下降.

而荧光强弱是PSII活性的表现j,PSII活性与作

物的光合功能息息相关,因此研究这两项指标对

于探讨作物在低温下的抗性具有现实意义.本文

以超高产杂交稻两优培九和常规杂交稻汕优63

作为试验材料,研究了低温处理过程中,抗氧化系

统的一些酶类和非酶类物质的活性,含量,同工酶谱的变化及叶绿体自发荧光强度的变化,旨在进一

步探讨低温逆境导致水稻减产的机理,从而为水稻的耐寒育种提供一定的理论依据. 1材料与方法

1.1材料培养

供试材料为常规杂交稻汕优63以及高产杂交稻两优培九,种子由江苏省农科院提供.选取健壮饱满的种子用17/5H()消毒1h,充分漂洗后.28?浸种36h,然后在3O?的黑暗条件下催芽48h.挑选发芽良好的种子播种于盛有蛭石的瓷盘当中,放置于光照培养箱审培养.培养温度为25.C/20C(昼/夜).培养液为木村B培养液.待幼苗长到两叶一心期时,将部分幼苗取出移栽至可控温的培养箱中进行低温处理,培养温度为25?/1O.C(昼/夜),光照同上.每2d取样一

次,以未经低温处理的作为对照,每个样品重复 3次,文中各数据为3次重复的平均值?标准差.

1.2试验方法

将取下的幼苗叶片称重0.1g,剪碎,加入 0.1mol/I的磷酸缓冲液(pH7.8),冰浴下研磨匀浆,以12000r/min冷冻离心20min,上清液以磷酸缓冲液定容至10mI即为粗酶液,置于4C 冰箱保存备用.

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定参照Stew— ert等的方法,采用单位重量可溶性蛋白的酶活

性来表示;过氧化氢酶(CAT)测定参照张志良的方法;谷胱甘肽还原酶(GR)测定参照Yang CW的方法Ig;还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定参照Ellman的方法..;抗坏血酸(ASA)测定参照Tanaka等的方法?1;超氧阴离子(O)产生速率测定参照罗广华和王爱国的方法[1进行. 膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量的测定参照赵世杰等的硫代巴比妥酸(TBA)比色法_l1.过氧化物酶(P0D)同工酶电泳采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳,分离胶浓度为7.59,6,浓缩胶浓度为2.59/6,电泳缓冲液采用高离子强度Tris一甘氨酸系统,电泳采用稳流方式,电流强度为45 mA,在O,4?低温下连续电泳5,6h.染色采用改良的醋酸联苯胺法,室温下染色,5,6rain 内酶带显现,拍摄并记录.

叶绿体自发荧光强度的检测:每2d取水稻叶片做横切面徒手切片,在光镜下挑选出厚薄均匀一致的,以未经低温处理的作为对照,用0.1 mol/L(pH7.8)的磷酸缓冲液浸没切片,用盖玻片将其固定,迅速放在20×物镜下,打开Kr/Ar 激光器,激发波长为488nm,在Bio—Rad公司 MRC1024型激光共聚焦扫描显微镜下观察记录, 结果用Lasersharp软件进行数字化图像分析及处理.

不同品种,处理时间之问的差异在Microcal Origin(Version7.0)上用单向方差分析(AN()一 VA)的方法在P?0.05的水平上进行显着性检验.

2结果与分析

2.1酶促保护系统SOD,CAT,GR活性的变化由图1可见,2个品种SOD活性的总体趋势随时间延长而降低,低温处理后2d,4d,6d,8d

时,两优培九的SOD活性均较对照有所上升, 8d时上升1639/6,10d时较对照有所下降;汕优 63中,仅在2d,4d时较对照有所上升,在6d,8 d,10d时均低于对照.这表明在对抗低温胁迫时,两优培九的SOD活性增加幅度要高于汕优 63.

由图2可看出,低温处理初期,两优培九的 CAT活性稍低于对照,而后迅速上升,高于对照,

?22?西北农业l5卷

在4d时达到峰值,然后下降,但整个过程中仍高于对照,而汕优63则刚好相反,仅在低温处理初期稍高于对照,而后在整个过程中均低于对照,在 6d下降明显,这说明汕优63的CAT活性受低温影响较为明显,而两优培九的CAT活性在经过低温锻炼后,表现出低温适应.

2468l0

处人数/d

Daysafterchilling

I一两优培九L-Iiangyoupeijiu;D1一低温处理的两优培九DIIiangyoupeljiuinchilling

temperature;S一汕优63~Shanyou63;Ds_低温

处理的汕优63(下图同)DS-Shanyou63inchilling

temperature(ssrfleasbelow) 圈1SOD活性的变化

Fig.1ChangesinSODactivity 2468lO

处理人数/d

Daysafterchilling

图2CAT活性的变化

Fig.2ChangesinCATactivity 2468

处理灭数/d

Daysafterchilling

图3GR活性的变化

Fig.3ChangesinGRactivity 图3表明,在整个低温处理过程中,两优培

九的GR(谷胱甘肽还原酶)活性高于对照,而在汕优63中,仅2d,4d,6d时高于对照,在8d和

10d则低于对照,说明两优培九的谷胱甘肽还原酶适应低温的能力更强.

2.2非酶促保护系统GSH,ASA含量的变化

由图4可看出,低温处理2d,4d时,两优培'

九的GSH含量变化不大,仅有缓慢上升,处理6 d时上升稍微明显,8d,10d时较对照相比均有' 下降;而在汕优63中,低温2d,4d,6d,8d时,

GSH含量较对照均有上升,6d上升8O,仅在

10d时低于对照.

图5表明,两优培九中,仅在低温处理2d,4 d时,ASA含量高于对照,此后,处理6d,8d,10 d时,均低于对照,而在汕优63中,在低温处理的整个过程中,ASA含量均高于对照,初期上升明显.

2468lO

处I甲人数/d

Daysafterchilling 图4GSH含量的变化

Fig.4ChangesinGSHcontent 2468lO

处胛人数/d

Daysafterchilling 图5ASA含量的变化

Fig.5ChangesinASAcontent 2.3超氧阴离子和膜脂过氧化产物MDA含量的变化

超氧阴离子伤害植物的机理之一在于启动膜脂过氧化,从而造成膜脂过氧化产物MDA含量 ?

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3期左敏等:低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧化系统的影响

的增加[1.如图6所示,在低温胁迫前8d,尽管两优培九中().一的含量在逐渐上升,但始终保持在一个较低的水平,始终低于对照.当胁迫继续进行时,0的含量迅速增大,10d时为对照的 1.33倍.在汕优63中,仅在处理中期(6d左右) 时低于对照,其他时间均高于对照. bD

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处理人数/d

Daysafterchilling 图6O:一含量的变化

Fig.6Changesin02一content

处理灭数/d

Daysafterchllling 图7MDA含量的变化

Fig.7ChangesinMDAcontent 由图7中可看出,与()的产生速率相对应, 两优培九的MDA含量在低温胁迫的前期(0,6 d)略微有所上升,但并没有太大的变化,一直维持在比较低的水平,仅在末期高于对照;而低温则能导致汕优63的MDA在体内的迅速积累,在低温处理的过程中,汕优63的MDA含量除在8d左右时低于对照外,其它时间均高于对照. 2.4过氧化物酶(POD)同功酶谱的变化

根据酶学特性原理,将P()D酶带按透明度及带宽分为一级带(酶带色深而宽),二级带(酶带色浅而较宽),三级带(酶带色极浅而窄),以此来表示酶活性的变化u.如图8,9所示,正常情况下 (即对照中),两优陪九和汕优63主要表达三组同工酶,分为I区,11区和IlI区.两优培九中,与常温对照相比,低温处理情况下,无论是I区,11区还是III区,POD同工酶带均有所增加,且一些酶带颜色变深,说明低温能诱导两优陪九中P0D 同工酶的表达.而在汕优63中,与常温对照相比,低温处理2d后,1区中即有两条二级带变为一

级带,活性减弱,II区,l1I区颜色亦变浅,处理

中期,与对照相比,谱带数目无明显变化,颜色继

续变浅,说明酶活性持续减弱,处理后期,谱带有

明显的消失现象,以III区最为明显,说明低温对

其P0D酶活性影响较大.

1.2—2daysLiangyoupeijiu;DI2—2days'

Liangyoupeijiuinchillingtemperature

图8两优陪九POD电泳图

Fig.8ChangesofPODEnzymesinLiangyoupeijiu

inchillingtemperature S2—2days'Shanyou63;DS2—2daysShanyou63 inchillingtemperature(sflrlaeasbelow)

图9汕优63POD电泳图

Fig.9ChangesofPODEnzymesinShanyou63

inchillingtemperature 2.5叶绿体自发荧光的变化

水稻叶片横切面经波长488nITI光激发后,

在激光共聚焦扫描显微镜下观察到其叶细胞产生蓝,绿两种颜色的图像.其中绿色图像为水稻叶

片细胞壁外观形态扫描图像(非自发荧光图像由

FilterBlueReflection所采集)蓝色图像为检测到

的细胞组份自发荧光图像,发射波长680nrfi,蓝

色为仪器所设置的伪彩色.将蓝色图像进行数字

化图像分析处理,低温使两优陪九和汕优63中的

西北农业l5卷

荧光分子均遭到破坏,自发荧光强度范围变窄.峰

值变小,平均自发荧光强度(象素荧光强度)降低. 但仍存在品种间差异,与常温对照相比,两优陪九

的自发荧光量在处理过程中虽有下降,但幅度较小,趋势较为平缓;而在汕优63中,处理2d时, 自发荧光量即有急剧下降,此后虽有短暂回升,但 I250l251StdDet01

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lOd后,下降仍然明显.本试验表明,与汕优63 相比,两优陪九叶绿体自发荧光受低温影响较小, 耐受低温的能力较强,虽然在低温胁迫下,2个品种的荧光强度均有所减弱,但两优培九减弱程度较小,表明其光合系统受低温伤害较小,说明两优培九幼苗的抗冷力要强于汕优63. CounlCounI

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图10低温对水稻叶片自发荧光强度的影响 Fig.10Effectsofchillingtemperatureonauto-fluorescentintensityofriceleafcells

3期左敏等:低温对水稻幼苗叶绿体自发荧光及抗氧化系统的影响

3讨论

环境胁迫下秧苗体内活性氧所造成的氧化伤害是一种普遍现象u引,植物的光合器官是对光, 温反应敏感的部位u,植物细胞因其本身的有氧 .状况和类囊体膜上存在许多光敏感部位和不饱和脂肪酸而更易受到活性氧的伤害l8_.正常情况下,植物体内由于抗氧化的酶促和非酶促两大保 -护体系的存在,活性氧的产生与清除处于平衡状态,从而使植物免遭这种伤害!;当植物处于逆境时,体内发生一系列的生理生化变化,一些酶的活性和一些物质的含量受到不同程度的影响,这种平衡可能会被打破,活性氧的积累和所造成的膜脂过氧化是需氧生物遭受逆境伤害的重要特

征[2.由本试验可以看出,低温处理lOd后,无论是两优培九还是汕优63,部分抗氧化酶的活性和抗氧化物质的含量与常温对照相比均有不同程度的降低.在两优培九中表现为SOD活性和 GSH,ASA含量的降低,在汕优63中则表现为 SOD,CAT,GR活性和GSH含量的降低,POD 同工酶的表达在汕优63出现明显的酶带消失和酶活性减弱.()的产生速率和MDA的含量二者均高于对照.这表明低温对水稻是有害的,低温引起水稻抗氧化系统的保护能力的改变,()z一大量产生,攻击细胞膜脂和其他生物大分子,产生膜脂过氧化产物MDA,使膜结构和功能受到破坏.

已有研究表明,逆境胁迫时,自由基和活性氧的积累引发叶绿素a的降解,破坏叶绿体的结构 '和功能,降低叶片捕捉和利用光能的能力,影响光能在叶绿体中的分配,使植物光合器官利用光能 -

的能力降低,从而积累过量的光能造成对植物的伤害卜.本试验中,低温处理导致叶绿体自发荧光的下降,而荧光强弱是PSII活性的表现], '意味着低温降低了PSII活性,这与前人的研究结果一致‰.

-本研究同时表明,在低温胁迫下,两优培九和汕优63的抗性存在品种间差异.在低温处理前期和中期,与同时期的常温对照相比,两优培九的 SOD,CAT和GR活性的增加幅度和维持时间要强于汕优63低温诱导了两优培九POD同工酶结构和功能的改组,而汕优63的同工酶谱带则出

现明显的消失.这说明在对抗低温胁迫时,两优培九的保护酶适应低温的能力要强于汕优63. ASA和GSH在叶绿体中组成ASA—GSH循环系统,清除氧自由基,排除过氧化物,保护光合器官.低温胁迫下,与同时期的常温对照相比, 汕优63的GSH和ASA含量的上升幅度和维持时间要强于两优培九,说明汕优63的非酶促保护能力强于两优培九.SOD酶是植物体内抗氧化系统中首要的清除酶,随着处理时间的延长,两个品种SOD酶活性呈下降趋势,与其相对应,Oz一产生速率呈上升趋势.在低温胁迫前8d,两优培九中0.的产生速率虽逐渐上升,但仍低于对照, MDA含量亦低于对照.这说明此时植物体内的活性氧清除系统正在发挥积极作用.胁迫后期, ().一的产生速率迅速增大,MDA含量亦增大,推测可能是活性氧清除系统的平衡已被破坏.而在低温胁迫下的大部分时间内,汕优63的O一产生速率和MDA含量均高于对照.说明两优培九受低温伤害的膜脂过氧化程度较轻,膜结构破坏较小.在低温处理过程中,两优培九叶绿体自发荧光强度下降幅度小于汕优63,且自发荧光强度基本上强于汕优63,表明两优陪九PSII活性受低温的影响较小.因此,两优培九在对抗低温光抑制方面要优于汕优63,可能是其通过启动防御伤害的保护性反应来保护自身的光合器官以免受到伤害.

植物对逆境抵抗能力的强弱与细胞生理生化的一系列适应性变化有关,因此不能以单一指标的变化来判断低温对水稻幼苗的影响.两优培九

的幼苗在低温处理下活性氧的清除能力得到了加强,活性氧在体内的积累降低,这可能是由于两优培九在经历过处理初期的锻炼以后,逐渐适应了低温的环境,各种抗氧化酶的活性也得到了提高. 而低温显然对汕优63伤害较大,虽然各项指标互有升降,但是由于其酶促和非酶促保护系统之间的平衡被打破,因此其活性氧含量增加,膜脂过氧化程度加剧,从而使组织遭到破坏.由本试验可以看出,两优培九的幼苗要比汕优63对低温更加适应,抗氧化酶似乎起主要作用,这也可能是其产量高的原因,但同时,两优培九启动保护体系对抗抗低温逆境的伤害也是有限度的,持续的低温也可能会对细胞造成不可逆的伤害.

参考文献:

[1]邓应德,刘阳梅.陈志兵.丰源A及其杂交组合生长后期耐冷性生理基础的初步研究[J].杂交水稻,2005,20(2):58,

26?西北农业l5卷

60.

[2]刘景花.低温冷害对绿色食品水稻的影响及防御措施[J]. 黑龙江气象,2003,l:23,25.

[3]何洁,刘鸿先,王以柔,等.低温j植物的光合作用[J].植物生理学通汛.l986(2):l,62.

[4]李美茹.刘鸿先.以柔.低温.r水稻幼茼叶片细胞膜膜脂过氰化和膜磷脂脱酯化反应[J].广西植物998,18(2): l73,L76.

[5]梁颖,王二三根.(:a针对低温下水稻幼苗的保护作用[J].作物.2001.27(1):59,64.

[6]KrauseGH.WeisE.Chlorophyllfluorescenceandphoto

symhesis[J].PlantMoIBoil,1991,42j3l3,349.

[7]StewretRC,BewbyJD.Lipidperoxidationassociatedwith acceleratedagingofsoybeanaxes[J].PlantPhysio1.1980. 65:245,248.

[83张志良.植物生理学实验指导(第2版)[M].北京:高等教

育出版社.1990.154,157.

[9]YangCW,Pengcl,(;henYz.Dailychangesofcompo neTllsofxanthopyllcycleandantioxidantsystemsinleaves ofriceatdifferentdevelopingstage[J].AetaPhysiolPlant, 2001,23(4):36l,369.

[10]EllmanGl.Tissuesulfhydrylgroups.[J].ArchBiochem Biophys.l959.82:70,77.

r儿]Fanakak,SLldaY,KondoN.()zonetoleranceandthea scorbate—dependenthydrogenperoxidedecomposingsystem inchloroplasts[J].PlantCellPhysiol,1985,26:ld25,

143L

[12]王爱国,罗广华.植物的超氧物自由基与羟睦反应的定最

关系[J].植物生理学通讯.199o,6:55,57.

[13]赵世杰,李德全.现代植物,丰理学实验指南[M].北京:科

学出版社,1999.

[14]蔡志全,曹坤芳,粥玉兜.夜间低温胁迫对两种生长下藤黄

幼曲叶片荧光特性和活性氧代谢的影响LJ].应用生态学

报.2003.14(3):326,331.

[15]姚允聪.王有年.赵晓芳.低温条件下君迁子幼苗SODI刮

1二酶谱带与活性研究[J],北京农学院:报,1994,10:49,

55.

[16]肖用森.王正.郭绍川.低温胁迫对杂叟稻及亲木幼

苗内活性氧清除剂的影响[J].杂交水稻,1990,5:39,

d2.

r17]薛国希,高辉远.**民.低温下壳聚糖处理对黄瓜幼苗生

理牛化特性的影响[J].植物生理与分子生物学.

20O4.30(4):441,448.

[18]HalliwellB.GutterdgeJMC.Freeradicalsinbiologyand medicine2ndClarendon[J].Oxford.1989.1,59

[1(j]刘家忠.龚明.植物抗氧化系统研究进展[J].云南师范

大学.1999.(6);l,儿.'

[2O]苏维埃,王文英.李棉柱.植物类脂及脂肪酸的分析技术

[J].植物生理学通讯.1980(3):54,60J.

[21]AsadaK.Thewater-watercycleinchloroplasts:scaven—

gingofactiveoxygensanddissipationof~xcessphoton[J].^ AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBio1.1999.50:601,

639.

r22]LidonFC,l,oureiroAS,VieiraDE.Photoinhibitionin. chillingstressedwheatandmaiz[J].Photosynthetica, 2001.39(2):161,166.

[23]LongSP.EastTM,BakerNR.(;hillingdamagetopho—

tosynthesisinyoungZeamays.I.Effectsoflightand temperaturevariationonphot0syntheticC()2assimilation LJ.ExpBot,1983.34;177,l88.

[24]PcwlesSB.Photoinhibitionofphotosynthesisinducedby visiblelight[J].AnnRevPlantPhysicl.1984.35:15,44.

[25]周艳虹,黄黎峰,喻景权.持续低温弱光对黄瓜叶片气体交

换,叶绿素荧光猝灭和吸收光能分的影响[J].植物生理

与分子生物学,2004.30(2):l53,160.

[26]刘鹏.赵世杰,盂庆伟.冷锻炼对甜椒叶片光合作用及其

低温光抑制的影响[J].植物生理与分子生物学,

2002.28(1):51,58.

[27]方学智.朱祝军,孙光闻.不同浓度cd对小白菜生&及抗

氧化系统的影响[J].农,环境科学.2004.23(5):877

880.

[28]HunerNPA,QquistG,HurryVM.Photoinhibitionand lowtemperatureacclimationincoldtolerantplants[J]. PhotosynRes,l993.37:19,39.

[29]SomersaloS,KrauseC-H.Reversiblephotoinhibitionof unhardenedandcold—acclimatedspinachleavesatchilling Iemperature[J].Plama,1990,180:181,187.

范文三：叶绿体的分离与荧光观察

叶绿体的分离与荧光观察

姓名：学号：实验时间：2014.11.18

1. 实验目的

（1）通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。

（2）观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。

2. 实验原理

叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。

叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L 氯化钠或0.4 mol／L 蔗糖溶液) 中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r／min 的条件下离心2min ，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000 r／min 的条件下离心5min ，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光) 的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光) ，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光) ，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光．这种荧光称为次生荧光(或间接荧光) ，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。

利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间．有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。

3. 实验材料和用品

（1）材料：新鲜菠菜叶

（2）试剂：0.35 mol／L 氯化钠溶液、0.01％吖啶橙染料

（3）器材：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、500ml 烧杯、250ml 量筒、滴管、10ml 刻度离心管、纱布、无荧光载玻片和盖玻片

4. 实验步骤

（1）选取新鲜的嫩绿菠菜叶，去除叶梗及粗脉，洗净擦干，称30g 放于150ml 0.35 mol／L NaCl溶液中。

（2）将叶、液同装入组织捣碎机中，匀浆3—5min ，转速5000 r／min 。

（3）将匀浆用纱布（6层）过滤于500ml 烧杯中。

（4）取滤液4ml 在1000 r／min 下离心2 min。

（5）取上层清液在3000 r／min 下离心5min （沉淀为叶绿体和细胞核混合物) 。

（6）将沉淀用2-3ml 0.35mol／L NaCl溶液悬浮。

（7）取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜下观察。

（8）另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01％吖啶橙橙染料，混匀，盖上盖片，在荧光显微镜下观察。

5. 实验结果

Pic1 pic2

Pic3

Pic1是普通光学显微镜下观察到的未染色叶绿体图片，pic2是在落射式荧光显微镜下观察到的未染色叶绿体图片，叶绿体有自发荧光，是红色，pic3是落射式荧光显微镜下观察到的染色过得叶绿体图片，核酸在荧光下发绿光，橙色的叶绿体是显微镜荧光和叶绿体自发荧光叠加的最终效果。

6. 讨论与结论

（1）取菠菜叶时要去梗。

（2）差速离心前要配平。

（3）在用盖玻盖染色的叶绿体叶时，溢出的液体要用滤纸吸干净。

（4）真正做荧光染色时用的载玻片与盖玻片是石英的，背影标准应该是无色，但是由于本实验用的载玻片与盖玻片不纯，有背景色。

（5）荧光观察时选视野对焦距要用普通光源，调好后再换激发光源。

（6）由于荧光染料会有不同程度的衰减，选好视野后，应该先拍照再观察。

范文四：菠菜叶绿体的分离及荧光观察

菠菜叶绿体的分离及荧光观察

实验目的：

1. 学习荧光显微镜的基本原理。

2. 普通光镜下观察植物叶片中的叶绿体形态特征，并利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光。

3. 吖啶橙染色后观察叶绿体及核碎片中的DNA 。

实验原理：

荧光显微镜的激发滤片能使标本产生的特定波长的光通过，阻止对激发荧光无关的光。阻挡滤片可以阻挡掉没有别标本吸收的激发光，有选择地透过荧光。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光) ，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光) ，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。

将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。沉降顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体溶酶体、内质网与高尔基体、核蛋白体。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L 氯化钠或0.4 mol／L 蔗糖溶液) 中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r／min 的条件下离心2min ，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000 r／min 的条件下离心5min ，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

实验步骤：

1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g 于150ml0.35mol ／L NaCI溶液中，装入组织捣碎机。

2. 利用组织捣碎机低速(5000r／min) 匀浆3~5min。

3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml 烧杯中。

4. 取滤液4ml 在1000r ／min 下离心2min 。弃去沉淀。

5. 将上清液在3000r ／min 下离心5min ，弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核) 。

6. 将沉淀用0.35mol ／L NaCl溶液悬浮。

7. 取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察：①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察；③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0．01％吖啶橙荧光染料，在荧光显微镜下观察。

8. 在叶片反面沿叶脉撕一片透明薄膜，滴一滴生理盐水，观察叶片表面的气孔。实验结果：

图一叶片表面的气孔从右侧的图片中可以看出，保卫细胞呈半月形，内有叶绿体（箭头所指）。

图二菜叶表面的圆形颗粒在实验中发现菠菜的表面有很多白色的小点，很像虫卵，但在显微镜下发现圆形颗粒通过一根细管（箭头所示）与叶脉相连。（此照片不是很清晰，但在显微镜下可以看到很明显的细管）由此推测，叶片表面的白点很可能是虫卵，且可通过与叶脉相连的细管吸取营养。

图三叶绿体在普通光镜与荧光显微镜下的图像左图中绿色的圆形或椭圆形颗粒为叶绿体；右图中火红色的荧光是由叶绿体发出的。

图四吖啶橙染色后图片

图中橘红色的颗粒为叶绿体的激发荧光，黄色颗粒为核DNA 的激发荧光，背景为绿色说明此载玻片中含有很多杂质，可以受激发出荧光。

实验总结：

通过本次实验观察到了植物叶片中叶绿体的形态、大小及荧光特性。学习了荧光显微镜的基本原理。实验中发现部分细胞中有一部分叶绿体可自由转动，而其他叶绿体固定不动，这可能是由于处于不同部位的叶绿体受光的照射强度不同，而照射强度大的叶绿体为了避免损伤会自发的地向照射强度小的方向转移。但实验中采用的底光源使视野中的光强度基本是一致的，所以叶绿体的转动也可能是由于胞质环流造成的。

范文五：叶绿体的分离和荧光观察

细胞生物学生物实验

题目:叶绿体的分离和荧光观察

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一、实验目的:

1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。

二、实验原理:

叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol,L氯化钠或0.4 mol,L蔗糖溶)中进行(以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r,min液

的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000 r,min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0,5?的条件下进行;如果在室温下，要迅速分离和观察。

荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光(这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。

利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间(有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。

三、实验仪器:

1. 器材:普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、500ml烧杯2

个，250ml量筒1个，滴管，10ml刻度离心管，纱布若干，无荧光载片

和盖片各4片。

2. 材料:新鲜菠菜。

3. 试剂:0.35 mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。

四、实验步骤:

1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml0.35

mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。

2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀浆3~5min。

3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

4. 取滤液4ml在1000 r/min下离心2 min。弃去沉淀。

5. 将上清液在3000 r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为p为叶绿体

(混有部分细胞核)。

6. 将沉淀用0.35 mol/L NaCl溶液悬浮。

7. 取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜

下观察: ?在普通光镜下观察;?在荧光显微镜下观察;?取叶绿体悬

液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0(01,吖啶橙荧光染料，加无荧

光盖片后即可在荧光显微镜下观察。

五、实验结果:

1. 普通光镜下，叶绿体为橄榄形，呈绿色，高倍镜下可看到基粒(深绿色)。

荧光显微镜下，自发荧光为火红色，次生荧光为桔红色。 2. 图片:

图1 光镜下的叶绿体(10×40) 图2 荧光显微镜下的叶绿体(未染色,10×40)

图3 荧光显微镜下的叶绿体(用0.01,吖啶橙染色,10×40)

六、注意事项:

1. 使用荧光显微镜时要注意操作规范，以免损坏仪器。

2. 差速离心时注意掌握好离心机转速，从而成功分离叶绿体。 3. 叶绿体稀释倍数要适当，使观察视角内叶绿体数量便于观察。

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