蒋-校长
范文一：肺表面活性物质相关蛋白A的免疫调节功能
肺表面活性物质相关蛋白 A 的免疫调节功能 050
孙 雨
()第二军医大学附属长海医院儿科 ,上海 200433
( ) 摘要 :肺表面活性物质相关蛋白 A SP2A是肺表面活性物质相关蛋白中最重要的成分之一 。作者概述 了 SP2A 的分子结构与免疫的关系 ,以及对微生物 、炎症细胞 、炎症介质和抗体等的作用 ,提示 SP2A 具有广泛 的免疫调节功能 。最后提出一些值得研究的问题 。
关键词 :肺表面活性物质相关蛋白 A ;免疫调节
() 文章编号 :1001 - 103X200103 - 0126 - 03 中图分类号 : R392. 12 文献标识码 :A Ξ 1 ( ) 肺表面活性物质 PS是由脂质和蛋白质组成的 。SP2A 分子结构与补体细胞和病原发生相互作用
混合物 ,其中 90 %是磷脂 ,8 %,10 %是特异性的肺 ( ) C1q 相似 ,可能与 C1q 受体 C1qR结合而发挥广泛
( ) 表面活性物质相关蛋白 SP,目前共发现 SP2A 、SP2 的生物学作用 :如与 B 细胞 C1qR 相互作用 ,可促进
B 、SP2C 及 SP2D4 种蛋白 ,其中 SP2A 含量最丰富 ,约B 细胞产生 Ig ; 与吞噬细胞 、内皮细胞上的 C1qR 相 占总量的 50 % 。有关肺表面活性物质的结构 、代谢 互作用 ,促使这两类细胞吞噬作用增强 ; 与单核Π巨 等已有较详细的论述 ,本文不再重复 。人们对 PS 的 噬细胞 、嗜中性粒细胞 、嗜酸性粒细胞上的 C1qR 相 认识主要在调节肺表面张力 、维持肺泡在呼吸活动 互作用 ,可促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用 中的稳定性方面 。随着对 PS 研究的深入 ,对磷脂如 () ADCC,特别在感染早期 、特异性抗体较少时 ,这种
2 ,3 何发挥作用 ,以及 SP 尽管量少但在调节磷脂作用上 作用 更 为 重 要。由 于 SP2A 分 子 结 构 与 免 疫 相 有重要地位等已有明确的认识 。90 年代 Enhorning 关 ,使其具有广泛的免疫调节功能 。 提出 PS 与气道稳定性可能有关的观点后 ,引起学者 2 SP2A 对微生物的作用
们重新评价 PS ,掀起了 PS 研究又一热潮 ,已经明确 211 SP2A 缺乏时机体对细菌感染抵抗力降低 通过PS 不单能降低肺表面张力 ,还可维持小气道稳定性 ( ) 对 SP2A 缺乏〔SP2A - Π- 〕动物 的 观 察 , 以及与哮喘发病关系密切 。许多研究显示 SP2A 有 ( ) 发现 SP2A - Π- 鼠 改 变 了 对 感 染 的 易 感 性 。Le2
4 免疫方面系列作用 ,为了系统认识 SP2A 与免疫的关 Vine 等用基因打靶技术 ,使鼠体内缺乏 SP2A mR2
( ) ( ) 系 ,本文就 SP2A 免疫调节功能研究结果作一综述 。 NA 和蛋白 , SP2A - Π- 鼠和对照鼠 野生鼠都接
1 SP2A 的分子结构与免疫的关系( ) ( 受了气管内接种 B 组溶血性链球菌 GBS,SP2A - Π
SP2A 是由肺 ?型细胞和气道的 clara 细胞合成 ) - 鼠增加了对感染的易感性 ,表现为感染后肺匀浆
( ) 的 。人类至少有 2 个表达基因 SP2A ?和 SP2A ?, 菌落计数明显增加 ,且播散到脾脏 ,吞噬细菌的肺泡 这两个基因仅有 6 个氨基酸序列不同 。人类 SP2A 巨噬细胞减少 。后来又证实给予外源性 SP2A 时 SP2
( ) 结构基因长 4 . 5kb ,含有 5 个外显子 。小鼠 、大鼠和 A - Π- 鼠 吞 噬 细 菌 的 肺 泡 巨 噬 细 胞 数 明 显 增
56 ( ) 兔只有一个基因 。人 SP2A 单体由 228 个氨基酸残 加。Korfhagen TR 等也报告 SP2A - Π- 鼠清除基组成 ,经翻译后修饰 ,如糖基化 、硫化和羟化等形 绿脓杆菌要比野生鼠低得多 。这些资料表明 , SP2A
成不同分子量单体 。分泌型 SP2A 是由 6 个 3 聚体 在肺的常态免疫环节中可能起重要作用 。
亚单位 组 成 的 18 聚 体 大 分 子 。SP2A 分 子 由 N2端 212 SP2A 对吞噬细胞摄取微生物的影响域 、胶原样域 、颈域及糖识别域 4 部分组成 。因含胶 SP2A 可与多种微生物发生相互作用 ,能加强吞
噬细胞对某些微生物的摄取 ,用免疫荧光等技术观 原样域 、糖识别域以及与糖结合必须有钙参与 ,故属
察应用 SP2A 可增加肺泡巨噬细胞对金黄色葡萄球C 型凝集超家族成员 。SP2A 必须多聚化才能与免疫
17 6 8 菌作用 。 、J 大肠杆菌、绿脓杆菌、A 型流感病毒、5
9 312 SP2A 对趋化作用的影响 呼吸道合胞病毒等的摄取 。SP2A 至少通过两种机1 制增强对微生物摄取 ,一种直接作用为调理素 ,另一 Hoffman 等 报道 , 去脂的 PS 制剂对肺泡巨噬 种间接作用为活化配体 。SP2A 可作为一种调理素 , 细胞的移行无直接作用 ,但能增强内毒素血清诱发 包裹微生物 ,使微生物容易被吞噬 。免疫电镜可提 的肺泡巨噬细胞的移行 。虽不能肯定是 PS 蛋白成 供 SP2A 作为一种调理素的强有力的证据 。把 SP2A 分的作用 ,但用胰蛋白酶或加热处理去脂的 PS 制剂 与 J 大肠杆菌和肺泡巨噬细胞共同孵育 ,可见细菌 5 可使上述作用丧失 。纯化的 SP2A 能加强肺泡巨噬 表面 、巨噬细胞膜外以及被吞噬细菌和吞噬小泡的 7 1 界面存在大量的 SP2A。SP2A 作为一种活化配体 和腹膜巨噬细胞移行 。
通过不同机制间接增强吞噬细胞摄取 。SP2A 具有 313 SP2A 对吞噬细胞氧自由基产生的影响 肺是体类似 C1q 的结构 ,实验显示 SP2A 使 IgG 调理的颗粒 内各脏器中与氧关系最密切的一个 。众
所周知分子氧为维持生命所必需 ,但分子氧又有毒
1 性作用 ,其毒性来自氧还原的中间产物如过氧化物 摄取能力增强。SP2A 还可与 J 大肠杆菌脂多糖5 - 7 10 ( ) ( ) 阴离 子 自 由 基 O、过 氧 化 氢 HO、羟 自 由 基 2 2 2 中脂质 A和嗜血杆菌外膜 P 相互作用 ,增强肺2 (() ) ’OH和单线态氧 ′O等 ,为了防止过多活性氧对 2 泡巨噬细胞对 J 大肠杆菌和嗜血杆菌的摄取 。SP2 5 肺产生损伤 ,肺内存在着一系列抗氧化剂如过氧化 A 还可与 A 型流感病毒的涎酸相互作用 ,以剂量依 物歧化酶 、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等灭 8 赖方式增强肺泡巨噬细胞对 A 型流感病毒摄取。 活活性氧 ,以维持肺的正常功能 。已有实验证实 SP2 值得注意的是 SP2A 与微生物相互作用 ,并非都起调 A 可 影 响 吞 噬 细 胞 产 生 氧 自 由 基 。Van Iwaarden
11 H 等观察 理作用 ,有的甚至起相反作用 。Koziel 1 等 报 道 纯 化 的 SP2A 能 增 强 肺 泡 巨 噬 细 胞 产 生 SP2A 对人巨噬细胞与卡氏肺囊虫的结合和吞噬的 - 1 O,而 Weber 等用狗的肺泡灌洗液提取 SP2A ,却抑 2 影响 。用异硫氰酸荧光素体外标记卡氏肺囊虫和肺
制肺巨噬细胞呼吸爆发 ,此现象引起关注 ,进一步研 泡巨噬细胞 ,观察发现肺泡巨噬细胞结合卡氏肺囊
究发现是在提取 SP2A 过程中因构象改变 ,实际已灭 虫与吞噬卡氏肺囊虫均与肺囊虫表面的 SP2A 水平 4 ( ) 活 。最近 LeVine 等 发现 SP2A - Π- 鼠感染绿脓 呈负相关 ,当外源性加入低浓度 SP2A 时 ,巨噬细胞 - 杆菌 1 小时后 , 外周血多形核细胞产生的 O与野 2 ( ) 与卡氏肺囊虫结合减少 30 % P < 0="" .="" 05;巨噬细胞吞="" (="" )="" 生鼠相似="" ,而感染="" gbs="" sp2a="" -="" π-="" 鼠的肺泡巨噬细="" (="" )="" 噬卡氏肺囊虫减少="" 20="" %="" p="">< 0="" .="" 05。sp2a="" 该抑制作="" -="" 胞产生="" o较野生鼠明显减少="" 。当外源性="" sp2a="" 存="" 2="" 用可被="" edta="" 或抗="" sp2a="" 抗体逆转="" ,提示="" sp2a="" 水平增="" -="" 5="" 在时="" o产生增加="" 。这些资料显示="" ,="" sp2a="" 对氧自="" 高="" ,与囊虫表面结合="" ,妨碍肺泡巨噬细胞识别卡氏肺="" 2="">
囊虫 。另外 ,SP2A 还可抑制肺泡巨噬细胞对血清已 由基的影响是复杂的 ,其是否增强吞噬细胞产生氧 调理好的酵母的吞噬 ,因此 SP2A 能否起调理作用 , 自由基 ,取决于吞噬细胞类型 、SP2A 构象和吞噬物
12 可能与微生物的种类相关。的结构 。
3 SP2A 对炎症细胞的作用 4 SP2A 对炎症介质的作用
311 SP2A 对单核细胞增生的影响 肺源性单核细胞SP2A 对细胞因子的产生和分泌有广泛的影响 ,
15 的低反应状态 ,过去一直认为 具体研究结果是 : ?Kremlev SG 等报道 SP2A 能增
α部分由于 PS 的脂质成分作用 ,未论及肺表面活性物 强伴刀豆蛋白诱导的人外周单核细胞分泌 TNF2、 质相关蛋白成分的作用 。从单核细胞活性的进一步 αβIL21、IL21、IL26 ,SP2A 亦能增强鼠的外周血细胞 、肺
4 研究表明 ,SP2A 有重要的地位 。纯化的 SP2A 具有抑 α泡巨噬细胞释放 TNF2; ?LeVine AM 等应用 SP2A 制 PHA 和抗 CD3 激活的人外周单核细胞增生且呈 ( ) - Π- 鼠观察感染绿脓杆菌 2 小时后 ,支气管肺泡 13 ,14 α 浓度依赖方式,对螨过敏诱发的外周单核细胞 灌洗液中 TNF2、IL26 水平较野生鼠明显升高 ,提示
α增生也有抑制作用 ,在培养液中加入甘露糖 ,有对抗 SP2A 对 TNF2、IL26 的分泌有抑制功能 。两者结果
αSP2A 对单核细胞活性的抑制作用 ,SP2A 的糖识别域 是相反的 ,如何解释 ? SP2A 对 TNF2、IL26 究竟是如 可能与淋巴细胞表面的碳水化合物结合而 发 挥 作 何影响的 ,对不同细胞类型的影响是否存在差异 ,或 14 用。因此 , 肺源性单核细胞的低反应状态 , 不仅 者是受纯化技术的影响 , 值得进一步探索 ; ?Cheng
16 与磷脂相关 ,而且 PS 的蛋白成分 SP2A 亦起一定的 观察 SP2A 对 Ionomycin 诱导嗜酸性粒细胞产 G 等
( ) 生和释放 IL28 的影响 , 他们把 SP2A 、Ionomycin 和嗜 ? SP2A 的免疫调节功能酷似分泌型 IgA SIgA, 价值
酸性粒细胞共同培养 24 小时 ,用 EL ISA 法测定无细 如 SIgA 与细菌病毒等结合有利于巨噬细胞吞噬或 胞上清液和细胞溶解产物中的 IL28 。结果发现 SP2A 清除 。在呼吸性细支气管和肺泡 ,缺少固有层 ,无 B
以浓度依赖方式减少嗜酸性粒细胞产生和释放 IL2 淋巴细胞 , 因而不能产生 SIgA , SP2A 是否能部分替 ( ) 8 ,加入 SP2A 抗体 PE完全逆转上述作用 。该资料代 SIgA 功能 ? 小儿反复上呼吸道感染 ,易发生支气 10
表明 SP2A 通过抑制嗜酸性粒细胞产生和释放 IL28 管炎或婴幼儿哮喘是不是因缺乏 SP2A 而致免疫功 13 而具有调节过敏性炎症的潜能 ; ?Borron P 等报 能紊乱 ,感染蔓延和气道反应性增高 ? 同时反复呼 告应用 SP2A 可抑制 PHA 诱导的人外周单核细胞增 吸道感染患儿是否存在 SP2A 先天缺乏或暂时性缺 生及释放 IL22 , SP2A 浓度愈高 , 可测的 IL22 浓度愈
乏的可能性等均值得进一步研究 。 低 ,认为是由 SP2A 阻断体外 T 细胞激活起关键性作
用的共刺激信号所致 ; ?SP2A 与大鼠肺泡巨噬细胞 参考文献 表面的 SP2A 受体结合 ,能提高卡介苗诱导的肺泡巨 17 α噬细胞产生 TNF2和一氧化氮。上述资料表明 , () 2962 . Wright J R. J . Physiol Rev ,1997 , 77 4: 9311
SP2A 对细胞因子等的产生和分泌有广泛的影响 ,说 () 2 Morgan BP. J . Crit Rev Clin Lab Sci , 1995 , 32 3: 2652298 . 明其具有调节免疫细胞功能 。 () 3 Sengelov H. J . Crit Rev Immunol ,1995 ,15 2: 1072131 .
4 LeVine AM , Kurak KE ,Bruno MD , et al . J . Am J Respir Cell Mol 5 SP2A 对过敏原和抗体的作用
18 () Biol ,1998 ,19 4:7002708 . SP2A 可抑制过敏原与抗体结合 。Madan T 等LeVine AM , Kurak KE , Wright J R , et al . J . Am J Respir Cell Mol 5 () 报道 3 周培养的烟曲菌的滤液抗原 3WCF、不同纯 () Biol , 1999 , 20 2: 2792286 . 化烟曲苗糖基化抗原和非糖基化抗原与 SP2A 相互 Korfhagen TR , LeVine AM , Whitsett JA. J . Biochim Biophys Acta , 6
( 作用 ,结果发现 SP2A 与 3WCF 抗原 、纯化抗原 Gp 55() 1998 ,1408 2 - 3:2962302 .
Pikaar J C , Voorhout WF , Van Golde LM , et al . J . J Infect Dis , 7 ) 和 Gp结合 ,但不能与去糖基化抗原结合 ,提示 SP245 () 1995 ,172 2: 4812489 . A 与某些抗原结合是通过糖识别域介导的 ,该功能
Benne CA , Benaissa Trouw B ,Van Strijp JA ,et al . J . Eur J Immu 2 8 域与抗原的碳水化合物残基相互作用来实现这一过 14 () nol ,1997 ,27 4:8862890 . 程 。Wang J Y 等亦报道 SP2A 以剂量依赖方式抑
Reena Ghildyal , Carol Hartley , Annalisa Varrasso , et al . J . J Infect 9 制过敏原诱导的组胺释放 。在相关病人身上也有此
() Dis , 1999 ,180 6:200922013 . 现象 ,例如在烟曲菌病病人 ,观察到 SP2A 具有抑制
Mcneely TB , Coonrod JD. J . Am J Respir Cell Mol Biol , 1994 , 11 10 特异性 IgE 与特异性抗原结合阻断嗜碱性粒细胞释 18 () 1:1142122 . 放组织胺。支气管哮喘患者哮喘发作时肺泡灌 19 Koziel H , Phelps DS , Fishman JA , Armstrong MY , et al . J . Am J 11 洗液中 ,磷脂含量无明显变化 ,总蛋白量增高,但 20 () Respir Cell Mol Biol ,1998 ,18 6:8342843 . SP2A 含量却减少,说明 SP2A 消耗增加 ,间接反应 Rosseau S , Guenther A , Seeger W , et al . J . J Infect Dis , 1997 , 12 SP2A 有抑制过敏原与抗体结合及抑制组织胺释放 15 () 175 2: 4212428 . 方面的贡献 。此外 , Kremlev SG 等报道 SP2A 能增 Borron P , Veldhuizen RA , Lewis J F , et al . J . Am J Respir Cell 13 强鼠脾 B 细胞产生 IgA 、IgG 和 IgM ,且与对照组比较 () Mol Biol ,1996 ,15 1:1152121 . 每种球蛋白皆呈几倍增长 ,提示 SP2A 也可通过影响 Wang J Y , Shieh CC , You PF , et al . J . Am J Respir Crit Care 14 Ig 的产生和分泌来调节 B 细胞功能 。 () Med ,1998 ,158 2:5102518 . 6 存在问题及展望() Kremlev SG , Phelps DS. J . Am J Physiol ,1994 ,267 6:7122719 . 15 综上所述 ,SP2A 是一种具有多种免疫调节功能 Cheng G , Ueda T , Nakajima A , et al . J . Int Arch Allergy Immu 2 16
的特异性蛋白质 。近年来发现许多疾病的肺泡灌洗 ( ) nol ,1998 ,117 suppl 1:59262 .
Weikert LF , Lopez J P , Abdolrasulnia , et al . J . Am J Physiol Lung 17 液中 SP2A 减少 ,但疾病状态下 SP2A 减少是原因还
() Cell Mol Physiol ,2000 ,279 2:2162223 . 是结果 ? SP2A 对免疫的调节客观地位如何 ? 通过 Madan T , Kishore U ,Shah A , et al . J . Clin Exp Immunol , 1997 , 18 外源性补充或拮抗 SP2A 等改善 SP2A 浓度有无医用() 110 2:2412249 .
() Liu M ,Wang L , Enhorning G. J . Clin Exp Allergy , 1995 . 25 11: 19
105321060 .
( ) Hohlfeld J ,Fabel H , Hamm H. J . Eur Respir J ,1997 ,10 2:4822 20
491 .
范文二：酵母活性物质对断乳仔猪红细胞免疫功能的影响
酵母活性物质对断乳仔猪红细胞免疫功能
的影响
动物医学进展,2007,28(8):9-12
ProgressinVeterinaryMedicine 王
(1.
酵母活性物质对断乳仔猪红细胞免疫功能的影响
玲,蒲万霞,扎西英派,索朗斯珠,孟晓琴,李芸.,程胜利,孟聚诚,
中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃兰州730050;2.西藏农牧学院畜牧兽医系,西藏林芝
3.甘肃中医学院,甘肃兰州730000)
华兰英
860000;
摘要:选取28日龄断奶的[杜x(大×长)]三元杂交仔猪l0头,平均初始体重为5.62kg?1.16kg,
随机分为2组,每组5头.对照组饲喂基础日粮,试验组在相同的基础日粮中添加酵母培养物,剂量为l0
mL/只,连续服用10d.应用红细胞C3b受体花环(ErythrocyteC3bR,E-C3bR)试验和红细胞免疫复合物
花环(ErythrocyteICR,E—ICR)试验,探讨酵母活性物质对断乳仔猪红细胞免疫功能的影响.结果发现,试
验组红细胞C3b受体花环率(E—C3bRR)和红细胞免疫复合物花环率(E-ICRR)在服药后第l周,第2周与
对照组相比,差异均极显着(P<0.01),第3周无明显差异.试验组E—C3bRR和E—ICRR,在服药后第l
周,第2周与服药前相比差异亦极显着(P<0.01),第3周差异不显着.结果表明,口服酵母活性物质可增
强断乳仔猪红细胞免疫功能,增强机体免疫力.
关键词:酵母活性物质;红细胞免疫;C3b受体;断奶仔猪
中图分类号:$852.4文献标识码:A
酵母菌含有极丰富的蛋白质,其培养物富含维
生素,矿物质,消化酶,促生长因子以及肽,多种必需
氨基酸和必需脂肪酸,是继动物蛋白和植物蛋白之
后的另一类重要蛋白质来源.这些特殊营养成分可
刺激免疫系统的防御能力,减少肠内有毒物质的产
生,对机体免疫功能具有促进作用.故酵母菌及其
文章编号:1007—5038(2007)08—0009—04
发酵产品可作为优质的饲料添加剂,有一定的开发
应用价值.E-C3bRR形成的机制是红细胞表面的
C3b受体(CR1)连接补体致敏的酵母菌Ll],红细胞
通过细胞膜上的CR1将抗原异物携带到肝,脾网状
内皮系统,由巨噬细胞将抗原异物清除,同时红细胞
胞浆中过氧化物酶可将黏附上的抗原异物加以杀
收稿日期:2007—05—2l
基金项目:甘肃省科技厅推广应用项目(5QS054一A81-153—18);兰州市科技计划项目
作者简介:王玲(1969一),女,甘肃张掖人.助理研究员,硕士,主要从事新兽药研究. 崇鬻崇泰崇谍素糸目*{{?辛豢
ProkaryoticExpressionandImmunogenicity ofHA1ProteinofAvianinfluenzavirus WURan—wei.,ZHANGWan—po,HUSi—shun,XIAOYun—cai,BIDing—ten (1.CollegeoJVeterinaryMedicine,HuazhongAgrilculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430
070,Chinal
2.CollegeoJ'FoodScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hu
bei,430070,China)
Abstract:TheHAgenewasclonedbyRT—PCRfromallantoicfluidinfectedwithH9N2AIV.Themajor
antigendomainHA1wasclonedfromthefull—
lengthHAandfurthersubclonedtOtheprokaryoticexpres—
sionvectorpGEX-KGresultingintherecombinantplasmidpKG—
HA1whichwasusedtOexpressthefu—
sionproteinGSTHA1inE.coli.TheimmunocompetenceofthepurifiedGST—
HA1wasdemonstratedby
WesternblotandELISA.TheresultssuggestedthatthefusionGST—
HA1proteinscouldonlyreactwith
thepositiveantibodiesagainstH9subtypesAIVbutnotwithH5andH7antibodies.Thehightit
eranti—
bodiesfromBalb/cmicevaccinatedwiththecommixtureofthepurifiedexpressionproductsa
ndadjuvant
couldspecificallyreactwithH9N2AIV.TheHAlproteininthisstudylayedafoundationforth
edistin—
guishablediagnosisandthevaccine'sdevelopment. Keywords:Avianinfluenzavirus;GST-HA1protein;prokaryoticexpression
10动物医学进展2007年第28卷第8期(总第167期)
伤.红细胞表面CR1的多少以及C3b免疫黏附功
能的状况都直接体现着红细胞免疫功能的高低.
ICR花环率显示了结合状态的CR1数目,CR1是先
通过C3b与IC结合,处于结合状态之后,连接于
CR1的C3b再与酵母菌黏连形成ICRL2].测定一
定数量红细胞中的红细胞C3b受体花环率(E—
C3bRR)和红细胞免疫复合物花环率(E,ICRR),可
作为红细胞免疫功能的一项指标.
本试验研究探讨了酵母活性物质对断乳仔猪红
细胞免疫功能的影响,为兽用微生态制剂的研究,预
防治疗幼畜腹泻,提高饲料利用率及其对畜禽营养
提供参考.
1材料与方法
1.1茵种
活性酵母(Saccharomycescerevisiae)由兰州 啤酒厂提供,经分离,复壮,转接培养于液体培养基 中培养37?,72h,备用.
1.2试验设计
选取7日龄起补饲开食料,常规管理模式下的 [杜×(大×长)]三元杂交28日龄断乳仔猪1O只 (购自兰州市榆中猪场),平均初始体重为5.62kg ?1.16kg,随机分为2组,每组5只.试验猪均打 耳号标记,自由采食,自由饮水,免疫和消毒程序按 猪场常规方法进行.对照组饲喂基础日粮,试验组 按10mL/只剂量灌服酵母活性物质,每日1次,连 续lOd(即断乳前5d至断乳后5d);分别于服药前 1周,服药后第1周,第2周,第3周于前腔静脉采 血,肝素抗凝,4?冷藏保存.
1.3试验器材
血细胞记数板,计数器,洁净载玻片,刻度离心 管,5OL微量移液器,恒温水浴箱,多用途台式恒 温振荡器DDHZ_3o0.
1.4小鼠血清
成年Balb/c小鼠1O只,购自甘肃省肿瘤研究 所.眼静脉丛采血,分离血清,分装刻度离心管,置 一
2O?保存备用.
1.5C3b致敏酵母制备
将新鲜酵母用0.1mol/L(pH7.1)PBS液洗涤1 次,水浴煮沸30min;纱布过滤,再加PBS液离心洗涤
3次,用PBS液配成2×10.个/mL酵母悬液.此液分 成2份,1份用0.1mol/L(pH7.1)PBS做2倍稀释 为未致敏酵母多糖;另1份与等量小鼠血清混合,37 ?作用20min,即为致敏酵母多糖.此时两种酵母多 糖浓度均为1.0×10个/rod.
1.6红细胞悬液制备
从试验仔猪前腔静脉采血1mL,肝素抗凝.取 0.3mL抗凝血加入0.1mL(pH7.1)PBS液离心, 洗涤1次;用淋巴细胞分离液(Ficol1分离液,天津 灏洋生物制品科技有限公司)除去其他血细胞,保留 沉底红细胞;再将红细胞用PBS液洗涤,离心3次; 用pH7.2Hank's液配成1.25×1O个/mL的红细 胞悬液.
1.7红细胞C3b受体花环试验
取C3b致敏的酵母悬液及红细胞悬液各5OL 混匀,37?水浴30min;然后加pH7.2HankS液 100L,混匀;再加2.5mL/L戊二醛25L,固定 5min;平行涂片2张,自然干燥,甲醇固定2rain,用 Wright—Giemsa复合染色30min;高倍镜检,以1个 红细胞黏附2个或2个以上酵母者为1个花环,计 数200个红细胞,求出花环率L3].
1.8红细胞免疫复合物(IC)花环试验
除酵母菌(1×10.个/mL)不加小鼠血清致敏 外,其余步骤均与红细胞C3b受体花环试验相同. 1.9数据处理
试验数据以平均数?标准差(又?SD)表示,全 部数据均采用SPSS统计处理软件进行方差分析和 多重比较,确定组间差异显着性.花环形成百分率 =(红细胞花环数/200)×100oAL4].
2结果
2.1红细胞C3b受体花环试验
结果见表1和图1.由表1得出,按a:==0.05 检验标准,服药前组间差异不显着(P>0.05).服 药后第1周,第2周活性酵母组与对照组相比差异 均极显着(P<0.01),第3周无明显差异(P> 0.05).组间均数差异值为2O.170,组间差异极显着 (PG0.01).活性酵母组内因素(不同时间)比较
结果说明,服药后第1周,第2周与服药前相比,差 异亦极显着(PG0.01),第3周则差异不显着.在
试验过程中,活性酵母组的红细胞致敏酵母花环率 在服药后前2周明显升高,第2周达最高值,第3周 则呈明显下降趋势(图1).
王玲等:酵母活性物质对断乳仔猪红细胞免疫功能的影响 表1试验猪红细胞C3b受体花环试验结果
Table1TheresultsoferythrocyteCSbreceptorrosettetest
注:与对照组相比,"-k-k"表示差异极显着.
Note:Comparingwithcontrolgroup,"-k-k"showsverysignificantdifference(Pd0.01).
70
60
l0
0
+活性酵母组Livingyeastproducts 州'/删
Time
图1活性酵母组与对照组对E—C3bRR的影响 Fig.1EffectofdifferenttreatmentsonE-C3bRR
2.2红细胞免疫复合物花环试验
由表2可以看出,按a—O.05检验标准,服药前组 间差异不显着(P>0.05),服药后第1周,第2周活 性酵母组与对照组相比差异极显着Pd0.01,第3周 无明显差异(P>0.05).组间均数差异值为2.405, 组问差异极显着P<0.O1.活性酵母组内因素比较 结果说明,服药后前2周与服药前相比,差异亦极显 着PdO.O1,第3周则差异不显着(P>0.05).在试 验过程中,活性酵母组的红细胞免疫复合物花环率在 服药后前2周明显升高,于第2周达最高值,其后至第 3周则呈下降趋势;对照组红细胞免疫复合物花环率 在服药后第3周明显升高且高于对照组(图2). 表2试验猪红细胞lC受体花环试验结果
Table2Theresultsoferythrocyte-immunecomplexrosettetest
注:与对照组相比,"-k-k"表示差异极显着. Note:Comparingwithcontrolgroup,"-k-k"showsverysignificantdifference(P<0.01)
3讨论
红细胞免疫在免疫调控中占有很重要的地位, 是机体免疫系统重要的组成部分L5].红细胞不仅具 有呼吸功能,而且具有识别,黏附,杀伤抗原,清除免 疫复合物(IC)的功能.近年来,红细胞免疫功能的 研究不断深入到兽医领域,研究发现许多疾病的发 病机理中,红细胞免疫缺陷和免疫功能低下占有很 重要的地位.影响免疫功能的疾病,其红细胞上 C3b受体的数量都出现明显的减少,其原因是病原 对红细胞膜上的C3b受体的破坏和血液中红细胞免 疫黏附抑制因子的活性增强.C3b受体花环率反映 红细胞膜上处于自由,未结合状态的C3b受体数量, 是衡量红细胞免疫功能状态的主要指标.
动物医学进展2007年第28卷第8期(总第167期) +活性酵母组Livingyeastproducts Ol23
时间/用
Time
图2活性酵母组与对照组对E-ICRR的影响 Fig.2EffectofdifferenttreatmentsonE—ICRR 本试验结果表明,活性酵母组的E—C3bRR率 和E_ICRR率与对照组相比,在服药后前2周差异 极显着(P<0.01),表明此阶段试验组的红细胞免 疫系统的活性明显高于对照组.采用SPSS统计处 理软件进行方差分析和多重比较,按a一0.05检验 标准,组内因素各个水平(即服药前,药后1周,药后 2周,药后3周)的差异具有统计学意义;组内因素 (不同时间)效应,组内因素与组间因素的交互效应 的P值均小于0.O1,亦具有统计学意义.对照组E— ICRR率在服药后第3周明显升高且高于活性酵 母,可能是因为随着仔猪日龄的增长,其新陈代谢功 能增强,机体免疫功能亦不断增强之缘故.而活性 酵母组在药后3周出现E—C3bRR率和E—ICRR率 都明显下降的趋势,表明酵母活性成分在增强红细 胞免疫功能时效果显着但持续时间较短,可能是服 药后期随着自身抗体增多,免疫复合物蓄积增加,导 致红细胞运输免疫复合物的负担过重,使红细胞膜 上的C3b受体消耗过多所致.
此外,通过观察猪只的精神,采食,饮水,粪便及 活动情况,发现酵母活性物质除能显着提高早期断 奶仔猪红细胞C3b受体花环率,增强红细胞免疫功 能外,还可降低腹泻发生率,促进生长,表明酵母活
性物质作为一种新型饲用型免疫增强剂具有很好的
发展和应用前景.
参考文献:
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EffectsofLivingYeastProductsonImmunityofErythrocyteinWeanlingPiglets WANGLing,PUWan-xia,ZhAXIYing-pai,SUOLANGSi—zhu.,MENGXiao—qin,
LIYun.,CHENGSheng—li,MENGJu—cheng.HUALan-ying
(1.LanzhouInstituteoy'Animal&VeterinaryPharmaceuticsSciences,CAAS,L口
nzh0",G口",730050,C^口;
2.TibetanAgricultureandHusbandryUniversity,Linzhi,Tibetan,860000,China; 3.GansuCollegeoy'TraditionalChineseMedicine,Lanzhou,Gansu,730000,Chi口)
Abstract:10three—
waycrossbredpiglets[Durocx(LandracexYorkshire)]weanedat28dayswereran—
domlydividedinto2groups,eachwith5piglets,meanweight5. 62kg+1.16kg.Controlgroupinbasal
diets,thetreatmentgroupwithlivingyeastproducts(LYP)atlOmlleveltoeachpigletfor10da
ys.The
experimentsweredesignedtostudytheeffectofLYPonimmunityoferythrocyteinweanling
piglets
througherythrocyteC3breceptorrosettetestandimmunecomplexrosettetest.Theresultsind
icatedthat
thegroupaddedLYPhadverysignificantdifference(P<O.O1)comparedwithcontrolgroupatE-C3bRR
andBICR(P<O.O1)inearlyweek(week1andweek2),andinthe3rdweekshowednOdifference.
Inthe
treatmentgroup,theeffectsoftwotestsindifferenttimealsoshowedverysignificantdifferencecompared
withthatbeforeadministration(P<O.01).Inconclusion,LYPcanincreasetheimmunityoferythrocyte.
reducethediarrheaoccurrence,havepositiveeffectondigestandimmunityforweanlingpiglets.
Keywords:livingyeastproducts;immunityoferythrocyteC3breceptor;weanlingpiglets 42O8642O
o/0,UI.U?
范文三：茯苓调节免疫功能活性物质及指纹图谱研究
湖北中医学院
硕士学位论文
茯苓调节免疫功能活性物质及指纹图谱研究
姓名:金惠
申请学位级别:硕士
专业:中药学
指导教师:刘焱文
20080510原创性声明
本人郑重声明:所里交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究工作所取得的成果。除文串已经注臻弓用的内容外,本论 文不合其他任何个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本 声明的法律结果由本人承担。
日期:桫多年厂月铂 日期:善矿莎年.歹月谚日
论文作者签名:胁
学位论文使用授权说明
本人完全了解湖北中医学院关于收集、保存、使用学位论文的规 定,即:
按照学校要求提交学位论文的印刷本;学校有权保存学位论文的 印刷本;在不以赢利为目的的前提下,学校可以公布学位论文的部分 或全部内容。保密论文在解密后,遵守此规定
论文作者签名夕曩导师签名;支、烛文
日期.硼年歹月编中文摘要
茯苓为多孔蔼辩真菌茯苓 .的干燥菌核,收载
于版中国药典。 《神农本草经》将茯苓列为上品,具有渗湿利水、健脾宁
心之功效。现代药理学研究表明,茯苓具有调节免疫功能、抑制肿瘤、抗炎等药
理作用。
本论文淡调节免疫功能作为药理指标,对茯苓调节免疫功能活性物质进行
了研究。采用溶剂法和化学法,将茯苓分为茯苓乙醇总提物、乙酸乙酯萃取物、
正丁醇萃取物、水溶性物质、茯苓多糖的降解产物及其羧甲基化衍生物等个部
位,对以上部位进行了调节免疫功能生物活性筛选,确定了茯苓多糖降解产物、
羧譬基化衍生物和茯苓乙酸乙酯提取物冀主要有效部位。
采用正交设计优选法对茯苓多糖的提取工艺进行了研究,获得了可靠的技
术参数;采取 降解法,获雩导降解多糖;采用二次碱化法制备羧学基茯苓多
糖,考察了反应状态、反应介质、反应时间、反应温度、物料比等影响化学合成
反应的重要因素,最终褥捌水溶性爨显改善的羧甲基茯苓多糖,采用酸碱漓定法
测定取代度.,.可达到.。
采溺溶裁法和色谱法,从茯苓主要有效部位乙酸乙酯提取物中分离得到 个单体成分,鉴定了其中个化合物,分别为麦角甾醇,、茯
苓酸 ,、 齐墩果酸 ,、 去氢依布里酸
,、
羟基羊毛甾烷,,一三烯酸
多一魏?旌乏鑫,王董,,,从焉为进
一步研究茯苓药效物质基础研究奠定了一定基础。
采用高效液糍色谱法,割定了茯苓主要有效部位乙酸乙酯提取赣的指纹雷 谱,通过对不同产地茯苓样品的图谱进行比较,标定了个共有峰,共有峰在 内完全分离。指纹图谱各项技术参数均符合国家药荽食茹监督管理局颁布 的《中药注射剂指纹图谱技术要求暂行》相关要求,方法重现性和稳定性良 好,从而为评价茯苓内在品质提供了科学依据,并为制定茯苓提取物与国际
接轨
的质量评价方法提供了参考依据。
关键词: 茯苓; 调节免疫功能; 茯苓多糖;
羧甲基茯苓多糖; 三萜类: 指纹图谱; ..
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前 言
随着人民生活品质的不断提高和生活节奏的加快,人们保健意识逐渐增强,
身体健康已成为人们对生活的重要诉求。传统中药作为一种天然、安全、有效的
保健品资源,越来越得到人们的青睐和重视。众多中药保健产品在改善人们生活
和增强人民体质方面发挥了巨大的作用。
茯苓为传统中药,收载于版中国药典,《神农本草经》将其列为上品,
具有渗湿利水、健脾宁心之功效。现代药理学研究表明,茯苓具有调节免疫功能、
抑制肿瘤、抗炎等多方面的药理作用,效果显著。茯苓作为药食两用的中药资源,
既可与诸多中药配伍组方,又可大剂量单用,临床治疗多种疾患;而且可制成茯
苓饼、茯苓糕、茯苓饼干等多种保健食品,获得良好的社会效益和经济效益,因
此茯苓的深度开发具有广阔的市场前景。
湖北省罗田县九资河茯苓品质优良,驰名中外,历史悠久,为湖北省道地药
材。近年来,湖北罗田建成了茯苓生产基地,保证了药材的质量。为了充分
发挥湖北道地药材的优势,本实验室对茯苓调节免疫功能的活性物质和质量评价
方法进行了研究,旨在为深度开发茯苓药材资源和打造湖北道地药材的品牌提供
科学依据。
第一章文献综述
茯苓为多孔菌科真菌茯苓 .的干燥菌核,收载
于版中国药典,具有渗湿利水、健脾宁心之功效,其饮片为茯苓菌核去皮
后切制而成。临床上常将茯苓用于水肿尿少、痰饮眩季、脾虚食少、便溏泻泄、
心神不安、惊悸失眠等症。现代药理学研究表明,茯苓具有抑制肿瘤、抗炎、调
节免疫功能等多方面的药理作用乜,效果显著。上世纪国内外学者对茯苓进行了
大量的研究。近年来,随着科学技术的不断进步,茯苓倍受国内外学者关注,对
茯苓的化学成分、药理作用和临床应用也取得了一些进展,现概述如下:
化学成分研究概况
诸多文献报道,茯苓主要化学成分为多糖和三萜类成分。
.茯苓中的多糖成分及其衍生物
茯苓多糖为茯苓的主要化学成分。 等从发酵茯苓菌核中分得 了个多糖成分,其中种水溶性多糖为由葡萄糖,半乳糖和甘露糖组成的杂多 糖;等眵从茯苓中分离出糖蛋白等物质,发现其中多糖和蛋白质的比例为 :;丁琼等拍从茯苓的菌丝体中分得了、、、等个多
糖成分,其中主要由线型?一一葡聚糖组成;等的研究结
果进一步表明,由高纯度的线型葡聚糖连接而成的是茯苓菌 核的主要成分,还有少量带有?葡萄糖支链的一葡聚糖组成的 。截止目前为止,已从茯苓的菌核及液体培养菌丝中分离出种多糖, 其名称和结构组成见表:
将茯苓多糖进行一定的结构修饰后,可分别得到羧甲基化、硫酸酯化、羟 丙基化、羟乙基化、甲基化等茯苓多糖衍生物,不同程度的改善了水溶性。
其中,
羧甲基化衍生物具有较好水溶性和较高生物活性。
表茯苓多糖成分.茯苓中的三萜类成分
国内外学者对茯苓的三萜类成分进行了大量的研究,至目前为止,已从茯 苓菌核及其菌丝体中发现三萜类物质个,见表
表茯苓三萜类成分.乙酰氧基. 【.羟基.羊毛甾一一?,?一? ,‘
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【,.二羟基去氢依布里酸 ,【 ,.过氧去氢土莫里酸
.羟基茯苓酸 【
.去氧茯苓酸茯苓酸
注:去氢松香甲酸酯为三环二帖类物质 以上种三萜类成分可分为个类型:羊毛甾一一烯型:包括一烯型
见图和,开环型见图,分别见表化合物卜,?和化合物
:
图 图
羊毛甾,一二烯型:包括,一二烯型见图和,开 环型见图,分别见表化合物和化合物。 图 图
其他结构类型:包括齐墩果烷型三萜,见表化合物。
.其他成分
茯苓中还含有其他少量成分,包括辛酸 、十一酸
、月桂酸 、十二酸 、棕榈酸
等?列;组氨酸、甲壳素、蛋白质、卵磷脂、左旋葡萄糖、腺嘌呤、 胆碱、树胶、脂肪及酶等引;无机元素钙、镁、铁、钾、钠、锰、磷、硫、
硅、
铬、镉、铜、铅及氯”。.
药理作用研究概况
茯苓具有渗湿利水、健脾宁心之功效。现代药理学研究表明,茯苓具有抑制 肿瘤、抗炎、调节免疫功能等多方面的药理作用?,效果显著。 .调节免疫功能及抗肿瘤作用
茯苓中多种成分均具有调节免疫功能和抗肿瘤的作用。陈宏等耐发现茯苓多 糖 ~/能提高荷瘤小鼠体内的肿瘤坏死因子水平和明显提
高自然杀伤细胞活性;.等九发现茯苓多糖中?对人乳腺癌
细胞系有一定的抑制作用;纪芳等将茯苓多糖进行适当的结构修饰,制得羧
甲
基茯苓多糖后对荷瘤小鼠进行腹腔注射,发现不仅可提高荷瘤小鼠 淋巴细胞转化率和细胞杀伤活性,还可提高小鼠血清中一仅的含量,改善 荷瘤小鼠的免疫功能,具有抗肿瘤作用;张秀军等通过观察小鼠淋巴细胞的
增
殖作用和巨噬细胞吞噬功能的作用,发现体内外均能显著增强小鼠免疫功
能;徐琳本等‘叫发现口服液能明显提高免疫低下小鼠的胸腺、脾脏重量及
溶
血素抗体含量,增强巨噬细胞的吞噬功能和细胞活性,明显提高白细胞介素 一至正常水平,若使用至/,可使荷瘤小鼠的肿瘤坏死因子含 量明显增高,对、瘤株呈明显抑制作用,同时还对抗环磷酰胺的免疫抑 制作用;仲兆金,许先栋等?从茯苓中分离得到三萜类成分及其衍生物,对 细胞人慢性髓样白血病细胞抑制作用明显,可影响小鼠淋巴细胞增殖; 等?如发现茯苓三萜对多种肿瘤均具有抑制活性,可抑制如肺癌,卵巢癌,皮
肤
癌,中枢神经癌,直肠癌等。
.抗和保肝作用
注射液能显著提高慢性肝炎患者血清含量,降低、含量,
段会平等如通过观察对细胞的毒性及对
并具有使滴度下降的趋势。
和分泌的抑制效果,发现对..细胞株的%毒性浓度
.
为 /,对..细胞株、分泌的半数有效浓度分别
为.、. /,治疗指数值分别为.和.,其效果优于临床抗病
毒药物阿昔洛韦,从而表明羧甲基茯苓多糖在..细胞株培养中对和 分泌有良好的抑制作用;黄菁等盯在体外将转基因小鼠脾淋巴细胞分 别与不同浓度的共培养,用法观察对淋巴细胞的毒性作用,发现 能显著促进转基因小鼠分泌,并刺激混合淋巴细胞反应淋巴
细胞分泌,抑制分泌,且的使用剂量与一,?之间具
有显著的正相关性;陈春霞?发现注射液对四氯化碳引起的小鼠肝损害具有 保护作用,并可使血清谷一丙转氨酶显著降低,注射液还可能使肝脏部分切 除的大鼠的肝再生度明显提高,再生肝重和体重之比也明显提高。 .抗白血病作用
茯苓多糖及羧甲基茯苓多糖均具有抗白血病作用。刘可人等们发现茯苓多糖 对肿瘤细胞中的自由基具有一定的清除作用,同时可增加?在 水平的表达,降低在白血病放疗中的副作用;杨勇等?建立白血病动物模 型,随机分组并给予羧甲基茯苓多糖治疗,发现羧甲基茯苓多糖组能使 荷瘤小鼠生命延长.%,与化疗药物环磷酰胺合用后可使小鼠的生存 期延长.%。 组的生存期与模型组比较有统计学意义.,. 还可通过下调基因诱导癌细胞凋亡,表明有良好的抗白血病作用;杨 宏新等盯发现羧甲基茯苓多糖和硒酸酯多糖均具有抗白血病的生物学效应,
二者
合用有协同增效作用;杨宏新等町还发现、硒与化疗药物合用后具有协同抗 癌效应,能显著抑制癌细胞增生,下调基因的表达、诱导癌细胞凋亡,从而 延长白血病荷瘤小鼠的生存期,同时减轻环磷酰胺的毒副作用。 .抗衰老作用
,
安文林等”们将茯苓水提液与新生大鼠海马神经细胞原代细胞预孵育 再将细胞与叠氮钠孵育培养,与未进行预孵育组比较,发现茯苓组能明显抵
抗叠
氮钠引起的神经细胞线粒体还原的能力下降和微管结构紊乱,表明茯苓能维
持细胞线粒体的功能及微管结构,减缓衰老,具有防治某些神经退行性疾病如老
年性痴呆、血管性痴呆及帕金森氏病等的作用;候安继等嵋采用老龄大鼠组,
每日灌胃给药茯苓多糖制剂,测定血清中老化相关酶、老化代谢产物及清除老化
产物的多种酶一一一单胺氧化酶,丙二醛和超氧化物歧化酶
和?的含量。研究结果显示,与老龄对照组相比,茯苓多糖给药组能不同
程度增加血清中和活性,并降低含量,同时还发现茯苓多糖
具有抗寒和抗疲劳作用,说明茯苓多糖有较好的抗衰老作用。
.与抗癌药物合用增效,提高放,化疗效果作用
于滨等口列采用茯苓多糖与多种抗癌药物合并使用对小鼠移植性肿瘤进行试
验观察,发现茯苓多糖显著增强了环磷酰胺、、、平阳霉素、丝裂霉素、
更生霉素对小鼠的抑制作用和平阳霉素对食管癌的抑制作用,提高
了环磷酰胺对白血病小鼠、和长春新碱对的生命延长率,与抗
癌药合用有明显的增效作用;徐榕等孔发现茯苓中羊毛甾烷三萜类化合物与抗癌
药物合用,能促进小鼠巨噬细胞产生集落刺激因子,提高由线照射所
致白细胞减少症的小鼠的外周血自细胞水平和血小板的数量,明显促进粒细胞
增殖,引起造血细胞再生,表明茯苓可提高放、化疗的疗效。
.改善脑功能记忆作用
卢建中等眵采用 水迷宫实验和染铅实验测血铅和骨铅含量,结果显
示茯苓提取物各剂量组血铅和骨铅含量明显降低,与模型组比较,具有显著性差异.,茯苓提取物各剂量组能明显缩短小鼠到达平台的逃逸时间。茯苓提
取物高剂量组还可明显抑制小鼠大脑皮层和海马区抗原的表达,表明茯苓提
取物能促进染铅小鼠体内铅排除,对改善脑功能记忆有明显作用。
.抗炎作用
日本学者从茯苓日本产的甲醇提取物中分离得到三萜化合物,可以抑制
一乙酸引起的鼠耳肿,神长知宏等从茯苓的二氯甲烷提
一氧一一醇一
取物中分离出新三萜衍生物,确认该三萜衍生物对诱发的炎症有抑制作用。
.其他作用
陈焱陌们等发现茯苓多糖能有效防止草酸钙结石的形成,具有防石作用;张信
岳等发现从茯苓提取的茯苓多糖能抗单纯性疱疹病毒;日本学者发现茯苓三
萜及其衍生物抑制蛙口服五水硫酸铜引起的呕吐,茯苓中的三萜化合物引使胰岛
素的分化诱导活性增强,茯苓还具有抑菌作用,镇静作用,对心血管系统的作用等
坫们
临床应用研究概况
茯苓应用十分广泛,临床上常将茯苓用于水肿尿少、痰饮眩季、脾虚食少、
便溏泻泄、心神不安、惊悸失眠等症。多与其他中药配伍使用,有“十药九茯苓”
的说法,其代表方剂为四君子汤、五苓散、桂枝茯苓汤等。
.常规用法
茯苓具有利水消肿、健脾宁心之功,在临床应用上十分广泛。一般使用饮片
克,可与多种中药配伍,发挥其独有的疗效,如中医治疗各种水肿的基本
方剂一一五苓散,即是茯苓与白术、猪苓、泽泻、桂枝配伍使用,功专力强;周
欣等陆?采用茯苓为君药,使用茯苓导水方治疗水肿,取得良好治疗效果;潭畅等
陆取茯苓增强免疫,利水消肿之功,使用防己茯苓汤加味治疗类风湿关节炎,疗
效显著;使用茯苓为原料药所得成药一一桂枝茯苓丸是临床上常用于治疗妇科疾
病的药物,其加减用之可治疗辨证属于血瘀湿滞者的各科疾病,如子宫内膜异位
症、慢性盆腔炎、卵巢囊肿、子宫肌瘤、功能失调性子宫出血、风心病房颤伴血
栓、男科慢性前列腺炎等疾患?,均获良好疗效。
.大剂量应用
大剂量使用茯苓一般是指使用茯苓克以上,使用后利水效果显著增强。
高福泰哺町在苓桂术甘汤中重用茯苓治疗多涎症,患者服用后诸症好转,唾
液大减,
疗效显著;张丽等陆重用茯苓治疗慢性肺心病心衰水肿,消肿利尿效果明显,当
茯苓用量达到每日时亦未见中毒表现;林熙然等“蚰重用茯苓以适应“湿疹
不离脾失健运,湿热内生与外邪相博”的病机认识,采用复方茯苓汤治疗急性,
亚急性和慢性湿疹,治愈率达到%以上。
.饮片及服用
茯苓中化学成分主要以茯苓多糖和茯苓三萜类物质为主,难溶于水。市面上
茯苓规格一般为茯苓骰或茯苓厚片,若采用传统水煎方法,不利于有效成分的溶
出。魏有良?考查了不同规格的茯苓饮片对水煎液中所合成分的影响,发现茯苓
块和茯苓片各项指标均明显低于茯苓颗粒和茯苓粉,建议茯苓使用时打碎或用颗
粒。陈华‘引建议茯苓服用应研粉冲服,许腊英拍钉等对茯苓的炮制工艺进行系统化
研究后,发现边长为.的茯苓丁无论是在茯苓多糖的煎出效率还是外观形态
都明显优于其他片型,可推广应用。
第二章
茯苓调节免疫功能有效部位筛选研究
采用中药化学和现代药理学交叉的研究方法,将茯苓提取分离为不同的化学
部位,观察其在体外对正常小鼠淋巴细胞、刀豆蛋白活化的小鼠淋巴细胞 等调节免疫功能模型的影响,以期确定茯苓调节免疫功能生物活性部位。 材料
.
器械
?公司酶标仪型;公司二氧化碳培养箱;倒置光
学显微镜;台式离心机;微量加样器;血球计数板;、孔细胞培养板; .
动物
/小鼠,雄性,按照条件饲养,由上海市华生动物实验中心提供; .药材和试剂
药材:茯苓药材购自湖北省罗田县,经湖北中医学院中药鉴定室吴和珍老 师鉴定为多孔菌科真菌属茯苓 .;
试剂:磷酸盐缓冲盐水;,用双蒸水配制为/的溶液;二
购于
甲基亚砜,分析纯;一培养基;伴刀豆蛋白
公司,用双蒸水配成/的溶液,过滤除菌;脂多糖购于公
司,用双蒸水配成/的溶液,过滤除菌;
方法与结果
.供试品制备
..
乙醇提取物
取茯苓药材均匀粉碎, /乙醇回流提取,抽滤,取上清液回收乙醇, 得乙醇提取物号样;
..
乙酸乙酯提取物
取乙醇提取物,加适当水分散,采用乙酸乙酯萃取多次,直至乙酸乙酯层无 色,合并乙酸乙酯萃取液,回收溶剂,得乙酸乙酯提取物号样; ..正丁醇提取物
取乙酸乙酯萃取后的水液,用水饱和正丁醇萃取次,合并正丁醇液,减压 回收,得正丁醇提取物号样;
..
水液
取正丁醇萃取后的余液,水浴处理,浓缩至一定体积,得到水液号 样;
..
降解多糖
取茯苓药材提取后乙醇不溶部分,干后加入稀碱液提取,离心后取上清 液,调至,所得沉淀依次采用%乙醇、双蒸水、丙酮洗涤后进行 降解处理,即得降解多糖号样;
..
羧甲基茯苓多糖
取降解多糖适量,采用二次碱化法进行羧甲基化,得到水溶性羧甲基茯苓 多糖号样。
提取分离总流程,见图
萃取多次
匝亟翻
取液并回收
图提取分离流程图
.调节免疫功能生物活性有效部位的筛选研究
..对/小鼠正常淋巴细胞的影响
各提取物对/小鼠正常淋巴细胞的影响
小鼠禁水禁食,摘眼放血后断颈处死,无菌条件下开腹取出脾脏, 溶液清洗,无菌注射器芯挤压研磨,制得脾细胞溶液。离心×弃去 上清液和红细胞,经计数,稀释成每毫升× 个细胞的细胞悬液。取孔细 胞培养板,每孔接种上述细胞悬液 ,置于。,%:培养箱中培养。 小时后取出细胞培养板,每孔加入培养液 ,同时加入不同稀释浓度的药 物每孔 ;空白对照组加培养液 。每组浓度设个复孔,同样培养条 件下继续培养。实验终止前小时取出细胞培养板,每孔中加入工作液 ,终浓度. /。培养结束后,吸弃上清,每孔加入,振荡
。待还原产物完全溶解后,在酶标仪上选择为检测波长, 为参考波长,测定光密度值值,实验重复三次。计算细胞的存活率: %
细胞存活率试验组平均值】/空白对照组平均值】
所得结果以平均值?标准偏差表示,采用软件进行统计学分析, 作图。以浓度为横坐标,细胞存活率为纵坐标,做出药物作用的浓度曲
线,用以评价不同浓度的提取物对正常/小鼠的脾脏淋巴细胞的毒性。结 果见图?:
、
量
‘
零
善
景
‘;
皇
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图不同浓度的提取物对正常淋巴细胞的毒性
由图中可以看出,号样降解多糖和号样羧甲基茯苓多糖在低 浓度时可明显促进促进脾细胞增殖,而、、、号样品则不明显。从而提示 降解多糖和羧甲基茯苓多糖可能具有一定的免疫调节作用。 降解多糖和羧甲基茯苓多糖对/小鼠正常淋巴细胞的影响 取孔细胞培养板,每孔接种..中细胞悬液 ,置于。,%: 培养箱中培养。小时后取出细胞培养板,每孔加入培养液 ,同时分别加 入不同稀释浓度的降解多糖号样和羧甲基茯苓多糖号样,每孔 ; 空白对照组加培养液 。每组浓度设个复孔,同样培养条件下继续培养 。实验终止前小时取出细胞培养板,每孔中加入工作液 ,终浓 度/。培养结束后,吸弃上清,每孔加入,振荡。待
还原产物完全溶解,在酶标仪上选择以为检测波长,为参考波长测 定光密度值值,实验重复三次。计算细胞的存活率: %
细胞存活率【试验组平均值】/【空白对照组平均值】 所得结果以平均值?标准偏差表示,采用软件进行统计学分析, 作图。以浓度为横坐标,细胞存活率为纵坐标,做出药物作用的浓度曲 线,进一步细分不同浓度的降解多糖和羧甲基茯苓多糖对正常/小鼠的脾 脏淋巴细胞的毒性。结果见图:
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图不同浓度的降解多糖和羧甲基茯苓多糖对正常淋巴细胞的毒性 结果表明,号样降解多糖和号样羧甲基茯苓多糖在低浓度对正 常淋巴细胞有一定的促进作用,浓度达到一定水平后,对生长呈现出抑制作
用,
初步表现出一定的双向调节作用。
..对/小鼠体外异常增殖淋巴细胞的影响
对/小鼠体外异常增殖淋巴细胞的影响
小鼠禁水禁食,摘眼放血后断颈处死,无菌条件下开腹取出脾脏, 溶液清洗,无菌注射器芯挤压研磨,制得脾细胞溶液。离心×弃去 上清和红细胞,经计数,稀释成每毫升× 个细胞的细胞悬液。取孔细胞 培养板,每孔接种上述细胞悬液 ,于。,%:培养箱中培养。小 时后取出细胞培养板,每孔加入伴刀豆蛋白 终浓度为/, 同时加入不同稀释浓度的药物每孔 ;单纯活化对照组加伴刀豆蛋白 。每组浓度设个复孔。置,%
终浓度为/及培养液
及饱和湿度的培养箱培养。实验终止前小时取出细胞培养板,每孔中 加入工作液 ,终浓度. /。培养结束后,每孔加入,
振荡。在酶标仪上选择以为检测波长,为参考波长测定光密 度值值,实验重复三次。计算细胞的存活率:
细胞存活率试验组平均值】/空白对照组平均值】×% 所得结果以平均值?标准偏差表示, 并在软件中进行统计学分析, 软件作图。以浓度为横坐标,细胞存活率为纵坐标,做出药物作用的浓 度曲线,用以评价不同浓度的提取物对/小鼠体外异常增殖的淋巴细胞 的影响。结果见图,
扫,芎零三?盘》一只
‖/
图
不同浓度的提取物体外异常增殖的淋巴细胞的影响
由图上显示,号样乙醇提取物、号样乙酸乙酯提取物、号样正 丁醇提取物、号样水液低浓度时可一定程度协同伴刀豆球蛋白 作用,进一步促进淋巴细胞增殖,而号样降解多糖和号样羧甲基化 多糖作用不明显。
对/小鼠体外异常增殖淋巴细胞的影响
小鼠禁水禁食,摘眼放血后断颈处死,无菌条件下开腹取出脾脏, 溶液清洗,无菌注射器芯挤压研磨,制得脾细胞溶液。离心×弃去 上清和红细胞,经计数,稀释成每毫升× 个细胞的细胞悬液。取孔细胞 ,于。,%:培养箱中培养。小
培养板,每孔接种上述细胞悬液
时后取出细胞培养板,每孔加入脂多糖 终浓度为?/,同 时加入不同稀释浓度的药物每孔 ;单纯活化对照组加脂多糖 终 浓度为/及培养液 。每组浓度设个复孔,同样培养条件下继续 ,
培养。 实验终止前小时取出细胞培养板,每孔中加入工作液 ,振荡 。在酶标仪上
终浓度. /。培养结束后,每孔加入
选择以为检测波长,为参考波长测定光密度值值,实验重复三 次。计算细胞的存活率:
%
细胞存活率【试验组平均值/空白对照组平均值】×
所得结果以平均值?标准偏差表示, 并在软件中进行统计学分析, 软件作图。以浓度为横坐标,细胞存活率为纵坐标,做出药物作用的浓 度曲线,用以评价不同浓度的提取物对/小鼠体外异常增殖淋巴细胞的 影响。结果见图:
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图
不同浓度的提取物对/小鼠体外异常增殖淋巴细胞的影响。 从图中可得知,号样降解多糖和号样羧甲基化多糖在低浓度时 可明显协同脂多糖作用,进一步促进淋巴细胞增殖,而其他提取物则 作用不明显。
综上所述,根据实验结果,确定药物的半数有效浓度,结果见表: 表 各提取物对正常淋巴细胞和异常增殖的淋巴细胞的影响 量望地 里?:坚曼;魉 里鱼:曼望彭婴. .
...对小鼠淋巴瘤细胞的影响
取小鼠淋巴瘤细胞,溶液清洗,无菌注射器芯挤压研磨,制成 细胞溶液。离心×弃去上清和红细胞,经计数,稀释成每毫升, 个细胞的细胞悬液。取孔细胞培养板,每孔接种肿瘤细胞悬液 于。,%:培养箱中培养。小时后取出细胞培养板,每孔加入不同稀释浓度的药
物 ;空白对照组加培养基 。每组浓度设个
复孔, ?,%及饱和湿度的培养箱培养。实验终止前小时取出细 胞培养板,每孔中加入工作液 ,终浓度. /。培养结束后,用 微量加样器 吸弃上清,每孔加入,振荡。待还原产物
为参考波长测定光密度
完全溶解,在酶标仪上选择以为检测波长,
值值,实验重复三次。计算细胞的存活率:
细胞存活率【试验组平均值】/【空白对照组平均值】× 所得结果以平均值?标准偏差表示, 并在软件中进行统计学分析, 软件作图。以浓度为横坐标,细胞存活率为纵坐标,做出药物作用的浓 度曲线,用以评价不同浓度的提取物对小鼠淋巴瘤细胞的影响。结果见
图:,、,
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基口
一
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图不同浓度的提取物对小鼠淋巴瘤细胞的影响
图中结果表明,在低浓度时,各个样品对的抑制作用并不明显,浓 度增大至一定值后号样乙酸乙酯提取物显示对的有一定的抑制作 用。随浓度的增高,乙酸乙酯提取物号样抑制淋巴瘤的作用逐渐增强,表 现出一定的免疫调节及抑制作用和抑制淋巴瘤的趋势。
讨论
.
免疫应答包括特异性免疫和非特异性免疫,免疫调节剂一般通过激活淋巴 细胞,巨噬细胞和自然杀伤细胞细胞等免疫细胞,以及激活补体,促进细 胞因子生成等多途径发挥对免疫系统的调节功能作用,从而使免疫应答以恰
当的
形式保持在适合的水平。大量研究表明,淋巴细胞在免疫调节中起关键的作
用,
能识别、杀伤和排斥外来异己分子及癌变细胞,保证机体的健康。其中和淋 巴细胞尤为重要,是研究药物免疫调节功能的重要靶点。
.
在特异性抗原刺激下,由于和淋巴细胞表面具有识别有丝分裂原的受 体,若采用适当的有丝分裂原进行刺激,则可使相应的淋巴细胞发生增殖。从
大
刀豆中提取伴刀豆蛋白能在体外选择性激活细胞增殖,并促进细胞 和单核细胞产生细胞因子;而脂多糖,,对小鼠有作用
可刺激细胞发生增殖,利用这两种有丝分裂原可建立起相应的脾脏和淋 巴细胞的增殖模型,可用于快速、高效的筛选免疫调节药物。 .
是一种能接受氢原子的染料,商品名为噻唑蓝,化学名为
。
一, 一一一, 活细胞
线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉
淀在细胞中,而死细胞无此功能;进一步采用二甲基亚砜溶解细胞中的
蓝紫色结晶物,用适当波长处测定其吸收值值,可.接反映活细胞数量,
从而反映受试药物对淋巴细胞增殖的影响。
.本实验主要通过建立高效的、淋巴细胞增殖模型作为筛选平台,以淋巴
细胞为靶点,应用活细胞检测方法测定细胞存活率,对从茯苓中获得的几个部位
进行调节免疫活性生物活性的初步筛选。研究结果表明,降解多糖和羧甲基茯苓
多糖体外给药,均能明显促进/小鼠正常淋巴细胞和含有丝分裂原脂多糖
淋巴细胞的增殖,提示其具有增强淋巴细胞和淋巴细胞增殖的活性,;
乙酸乙酯萃取物可促进淋巴细胞的增殖,同时对淋巴瘤有抑制作用,呈现出抑
制淋巴瘤的趋势,表现出一定的双向调节作用。这也与文献报道们?蝴?茯苓调
节免疫功能的生物活性相一致,从而提示了茯苓调节免疫功能的生物活性物质基
础。由于对其他的免疫学指标如细胞、巨噬细胞、细胞因子等检测较少,在
今后还综合考虑各个免疫学指标及其相关作用,进一步研究其调节免疫功能的机
理。第三章 茯苓多糖提取工艺及其结构改造研究
茯苓多糖成分占获苓予熏%驻上,从茯苓中提取的茯苓多糖可用作多种产
品的原料。药理活性筛选实验表明,茯苓多糖及其羧甲基衍生物具有较强的
调节
免疫功能作用。茯苓多糖难溶于水,将其进行羧甲基亿处理后,可得到水溶性
极
大改善的羧甲基茯苓多糖,扩大了茯苓的应用范围。
第一节茯苓多糖的提取及优选工艺研究
仪器与试药
仪器:紫外分光光度计、电光分析天平十万分之一,水浴锅, 试药:硫酸、苯酚分析纯,蘅萄糖标准茹购蜜中国生物制品捡定新、 双蒸馏水。
方法及结果
。茯苓多耱含量测定
..溶液的制备
供试品溶液获苓药材粉碎过筛器,脱脂,称取,精密称定。 加入液提取,抽滤,取上清液续滤液至容量瓶中,加双蒸水溶解 至刻度,摇匀,密封保存。
对照品溶液精密称取?干燥至恒重的葡萄., 置于
氐棕色容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,配铡成./的对照苗 溶液。
..
标准蓝线的翻备
、. 、. 、
、.
分别精密移取葡萄糖对照品溶液.、.
.虹置札篡塞试管串,如双蒸水稀释至 , 精密量取精制%苯酚溶 液们. 加入,充分混合后,缓缓加入札浓硫酸,迅速摇匀,水浴 取姑,置于冰水浴中 取出,随行试裁律空白,在 处测其吸 收值,以浓度对吸收值进行线性回归计算,得回归方程为. .
《.,葡萄糖在.~. 内线性关系良好。结果见表
,标准曲线图见图:表标准曲线测定结果
图标准曲线图
..茯苓多糖含量测定。
,按“标准曲线的制
精密取茯苓多糖样品溶液.,加双蒸水稀释至
备”项下显色方法操作,测定。
.正交试验优选茯苓提取工艺
..
不同提取方法的比较 取茯苓细粉份过筛目,脱脂,每份, 精密称定,分别采用水煎煮法,超声水提取法,浓碱提取法,稀碱提取法提取
茯
苓多糖,测定多糖含量,结果见表:表 多糖提取方法比较 以上结果表明,稀溶液提取茯苓多糖含量最高,故采用稀溶液提 取茯苓多糖。在此基础上,为进一步提高茯苓多糖得率及茯苓药材附加值,
采用
正交设计对稀溶液提取法提取茯苓多糖进行优选。 ..试验因素及水平的考察 为防止温度升高,导致茯苓多糖水解,综合考 虑多种影响因素后,确定将提取温度始终控制在?,仅分别对溶液浓度, 提取时间,料液比三个因素进行考察:
稀碱浓度对多糖含量影响见图
一~
.
一/一
茴
.
慕
.
一
.
. . .
.碱的洌勃骘喻/
图. 溶液浓度对多糖含量影响
由图可看出,在碱浓度为?./之间时,提取多糖含量随碱度 的增高而提高,碱度达到./时, 提取多糖含量达到最大,之后基本维持 一定,碱度达到./后略为下降, 但仍含量可保持在%以上; 提取时间对多糖含量影响见图.:图.提取时间对多糖含量影响
图表明提取前期时间的长短对多糖含量的影响比较明显,提取小于, 所得多糖含量随时间的增加而变大,达到时提得含量达到最大值,之后再 延长时间,所提得含量变化不明显。
料液比对多糖含量影响见图.:
图.料液比对多糖含量影响
从图可知,料液比对多糖含量的影响亦较大,在料液比:~:段, 料液比增大,多糖含量明显增加,而在:~:段增加较为平缓,增加趋 势不明显,料液比达到:后,多糖含量变化不显著。
..试验因素及水平的确定 通过试验因素和水平的考察,本试验其因素水 平设计入下,见表?:表茯苓多糖提取因素水平表
..正交试验及结果 取茯苓细粉份过筛目,脱脂,每份,精密 称定,选用,正交表进行试验见表,抽滤,取上清液续滤液至 容量瓶中,加双蒸水溶解至刻度,摇匀。以多糖提取率为评价指标,进行 提取工艺优选。试验结果见表,方差分析结果见表:
表正交试验及结果表方差分析表结果
方差分析结果表明,、、三个因素中,各因素对茯苓多糖提取率影响的 大小顺序为,其中料液比因素对茯苓多糖提取影响极显著., 提取时间因素具有显著性差异.,碱的浓度因素无显著性意 义。根据极差分析结果,选择各因素最佳水平为,即采用./碱液, 料液比:,提取。
..验证实验 精密称取茯苓粉末份,按照优选的最佳工艺,精密称取 .药粉,加入./的溶液,。搅拌,提取茯苓多
糖,结果平均提取率为. ,.%提取率高于正交实验中各提
取条件条件,结果见表,表明工艺稳定可行,提取茯苓多糖含量高。
表验证实验结果
讨论
.苯酚一硫酸法广泛用于多糖含量测定,操作简便,反应灵敏,其原理是多糖
在硫酸的作用下,先水解为单糖分子,迅速缩合为糖醛衍生物,与苯酚形成橙黄
色化合物,在处有最大吸收。采用苯酚一硫酸法时,可以葡萄糖等单糖为
对照制作标准曲线,测定多糖在处的吸收值,以单糖的测定结果表示多糖
的含量。同时,在样品的处理中;采用低浓度混合盐洗涤,促使蛋白质和小分子糖的溶解?,从而消除其对结果的干扰。本实验在研究茯苓多糖的显色方式后,
又在小试的基础上确定了茯苓多糖的含量测定方法。
.经比较多种提取方法后,我们发现浓碱液提取的物料,质地粘稠,难于抽
滤,不适应于工业生产;稀碱液提取茯苓多糖效率最高,其原理可能是由于茯苓
多糖分子在稀碱溶液中呈三股螺旋结构,具有相对伸展的柔顺构象,从而极大地
改善了溶解性四。近年来,以茯苓中提取的茯苓多糖为原料,开发出的茯苓饼干,
茯苓面包,药用辅料等产品市场需求大,经济效益高。本实验利用正交设计均衡
搭配的特点,以较少的实验次数得到了准确可靠的技术参数,验证实验表明
稳定
可行,可进行应用推广,从而创造更大的市场效益和社会效益。第二节 降解
茯苓多糖及羧甲基化茯苓多糖的制备
茯苓多糖难溶于水,亦难溶于醇,将其进行降解后,可获得降解茯苓多糖; 在此基础上再进行羧甲基化处理,可得到羧甲基茯苓多糖,水溶性明显改 善。能有效调节免疫功能,可作为原料添加于各种保健产品中,应用前景十 分广阔。
仪器与试药
.药材:罗田县九资河镇茯苓基地提供。
.仪器:型增力电动数显搅拌器,金坛时宏华仪器厂;一/低
温冷却液循环泵,郑州长城科工贸有限公司;型磁力加热搅拌器,金坛 市大地自动化仪器厂;型低速离心机,北京医用离心机厂;一型数显 恒温水浴锅,常州奥华仪器有限公司。
: 。
”?: 一。
.试剂:偏高碘酸钠,氢氧化钠,丙三醇,硼氢化钠等,国药集团化学试剂有 限公司,均为分析纯。
方法与结果.
.降解茯苓多糖的制备
将提取所得茯苓多糖悬浮于水溶液中,向其中加入适量偏高碘酸钠,避光低 温搅拌反应三天,反应终止后加入丙三醇,透析,取透析物加入硼氢化钠反应
一
定时间,调值,室温水解,透析,真空冷冻干燥,得粉末状降解茯苓多糖。 .羧甲基化茯苓多糖的制备
采用一步法制备羧甲基化茯苓多糖,将降解多糖溶于溶液中,再加入 醚化剂一氯乙酸与之发生反应。
主反应式:
一。 :
?????????一?
副反应式: ??? ..反应各影响因素考察
反应状态以多糖得率为指标,下同考察降解多糖溶于不同浓度 溶液中对合成得率的影响,结果见表:
表 反应状态对合成的影响
反应介质 考察体系含有不同的反应介质对合成得率的影响,结果见表 ?:
表 反应介质浓度对合成的影响
反应温度 考察体系处于不同温度下进行反应对合成得率的影响,结果见 表:
表 不同反应温度对合成得率的影响
反应时间 考察反应时间的不同对合成得率的影响,结果见表: 表 不同反应时间对合成得率的影响
反应时间
物料比 考察反应中加入的降解多糖原料与反应加入的摩尔比不同对 得率的影响,结果见表:
表 不同料液比对得率的影响
: : : :.
物料比
..羧甲基化反应 综合考虑以上各个因素及反应成本等多方面原因,确定 采用二次碱化法制备羧甲基化茯苓多糖。取降解茯苓多糖,溶于/ 溶液中,向反应体系中加入.倍量一氯乙酸及%乙醇溶液进行反应,反应中 止加醇至%,调值至中性,过夜。离心,弃上清液,取不溶物透析,减 压干燥,得到淡黄色粉末状羧甲基产物。经波谱分析、性状表征与文献报道
羧甲
基化茯苓多糖对比一致,证明反应成功。
..羧甲基化产物的表征
性状羧甲基茯苓多糖呈淡黄色粉末状,每热水中约可溶解.克, 水溶液无色透明,粘度小,流动性好。
取代度的测定根据文献报道方法测定所制得的羧甲基茯苓多糖取代度为 .,取代度较高,反应利用率高。
溴化钾压片法测定降解多糖,羧甲基茯苓多糖的红外光谱,结果与文献 ‘一致,见附图、。
测定降解多糖、羧甲基茯苓多糖氢谱,结果与文献们一致,见附图、 。
一致见附图、
测定降解多糖、羧甲基茯苓多糖碳谱,结果与文献
。
讨论
.
茯苓多糖难溶于水,将其进行羧甲基化后,可得到水溶性多糖?羧甲
基茯苓多糖。文献报道,羧甲基茯苓多糖具有调节免疫功能、抗肿瘤,保
肝、降谷丙转氨酶等多种生物活性,未见不良毒副反应。本实验所制得的羧甲基
茯苓多糖在室温下,每热水中约可溶解.克,溶解度良好,可开发为
功能性保健食品,药剂辅料等,应用前景十分广阔。.
降解可对茯苓多糖进行选择性氧化作用,保留结合的葡萄
糖主链,而仅切断其结合的葡萄糖侧链,得到线型降解多糖,从而降低了
分子量,一定程度上改善了其溶解性。在反应中采用利用蛋白质易溶于低浓度电
解质溶液的性质,同时采用用流动水透析处理,除去了小分子糖、寡糖及其他副
产物,使后续羧甲基化反应环境相对纯净,减少了副反应的发生。
.
从的红外光谱图可看出,茯苓多糖羧甲基化后,原处红移至。出强峰,为羧甲基盐的伸缩振动, 附近出现较强次
甲基振动吸收峰。此两峰均可表明羧甲基的存在。而”中中的化学
位移值受成盐和多糖结构的影响,移动到 ,证实了羧甲基的存在。
.
羧甲基化反应受众多因素影响,如反应时间、反应温度、醇水比、碱化程
度、一氯乙酸的用量等。本实验采用二次碱化法,减少了副反应产物羟乙酸钠的
生成,提高了一氯乙酸的利用度,取代度较传统方法有较大的提高。反应后透析
保证了的纯度,同时采用酸碱滴定法测定其取代度,结果表明取代度较高,
技术参数可靠,方法可行。
第四章 茯苓乙酸乙酯提取物化学成分研究
药理活性筛选试验表明,茯苓乙酸乙酯提取物具有较强调节免疫功能的生物
活性,并表现出一定抑制淋巴瘤作用。本论文对茯苓乙酸乙酯提取物的化学成分
进行了初步的提取分离和结构鉴定研究,以期为进一步研究其药效物质基础和作
用机理奠定基础。
仪器与试药
茯苓药材购自湖北省罗田县,经湖北中医学院中药鉴定室吴和珍老师鉴定为
多孔菌科真菌属茯苓 .,取其作为试验药材。
所用试剂均为分析醇或化学醇。
显色剂:碘蒸气、磷钼酸试液、%硫酸乙醇试液、茴香醛试液、.%香草醛
试液等。
硅胶:青岛海洋化工厂生产,试剂级。
旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂。
,。
:
: 。
?: 一。
提取分离
取茯苓粗块,置多功能提取罐中,用%乙醇回流提取次,合并
提取液,减压浓缩至一定体积,加适量水充分搅拌分散;用乙酸乙酯反复苹取,
合并萃取液并回收,得到乙酸乙酯提取物。取适量乙酸乙酯提取物,拌入一定量
的硅胶,硅胶色谱柱分离,以石油醚一乙酸乙酯系统梯度洗脱,得到不同比例洗
脱流分。经检识,合并相似流分,再经反复硅胶色谱柱、凝胶柱
色谱、凝胶柱色谱分离纯化,得到个成分,其分离流程图如下图:茯苓粗粉 %乙醇回流提取,回收
,
圈
加适量水充分搅拌分散,用乙酸乙酯
反复萃取,合并萃取液并回收
硅胶拌样,采用石油醚一乙酸乙酯
?系统梯度洗脱
~流例 ~流例
~流侧 ~流例~?流例
氯仿一甲醇等系统
组分;再分别经硅
凝胶柱色
图 提取分离流程图
结构鉴定
化合物:白色无定形粉末,反应呈阳性,提示该混
合物可能为三萜类化合物;谱,在高场 .?.之间呈现堆积的甲基和 亚甲基质子信号,提示可能为甾体类成分;进一步分析,发现其波谱数据与麦
角
甾醇波谱数据极其类似,再经检测,发现其 值与麦角甾醇 值一致; 将此样品与麦角甾醇标准品混合后于种展开系统展开,均仅显示个斑点。综 合对比其它波谱数据,与文献报道麦角甾醇的数据基本一致,故鉴定化合物 为麦角甾醇,信号归属见表,图谱见附图、,化学
结构式见图:
?信号归属
表 化合物与麦角甾醇的
图麦角甾醇
/:
化合物:白色针状结晶,反应呈阳性,
:
.,,?,.,,?,
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.,,,.×,,,?,?,.,
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,,.,,,,一,.,,一;数据见表.以上数据与文献数据一致,故鉴定化合物?为
茯苓酸
,化学名为‖酸基羟基羊毛甾烷一,,一二烯一一 酸.”信号归属见表,图谱见附图、,化学结构式见图: 表 化合物?与茯苓酸的信号归属
图茯苓酸
范文四：海洋免疫活性物质论文
浅谈海洋免疫活性物质
食品科学与工程学院
一、前言
所谓生物活性物质，是指来自生物体内的对生命现象具有影响的微量或少量物质。海洋生物活性物质，则是指海洋生物体内所含有的对生命现象具有影响的微量或少量物质、主要包括海洋药用物质、生物信息物质、海洋生物毒素产生物功能材料等海洋生物体内的天然产物如活性蛋白质、活性多糖、活性脂与脂肪酸类、生物碱、萜类、糖苷类、内酯、皂苷、甾醇、多酚和聚醚类。
随着环境污染的加剧和人类寿命的延长以及现代人不良的生活习惯，心脑血管疾病、恶性肿瘤、糖尿病、老年性痴呆症等疾病日益严重地威胁着人类健康，艾滋病、玛尔堡病毒病、伊博拉出血热等新的疾病又不断出现，仅病毒病世界上平均每年就新增2－3种。人类迫切需要寻找新的、特效的药物来治疗这些疾病。人们纷纷将目光投向海洋。海洋占地球表面积的3/4，拥有巨大的潜力！人们希望利用海洋生物活性物质开发出增进健康、预防疾病的营养食品、保健食品。
二、现状与发展
自 60 年代以来, 美、日、法等国家相继建立了一批高水平的研究机构, 广泛开展了对生物活性物质的筛选。由于成效不大, 样品采集保存困难, 分离鉴定繁杂, 这一领域的研究进展缓慢。 随着现代科学技术的迅猛发展, 80 年代后期, 对海洋生物活性物质的研究又出现了新的高潮。 目前, 已在海洋天然产物中发现了 2000余种活性物质[ 1 ], 作用方式多种多样, 主要涉及海洋毒素、药用活性物质、作为生物功能材料的海洋活性物质三个方面。其中，药用活性物质又包括抗微生物作用的生物活性物质、抗肿瘤抗癌作用的生物活性物质和影响心血管系统机能的生物活性物质。
1、海洋活性物质筛选
2、筛选是研究和开发海洋生物活性物质的第一步。传统的筛选方法是利用实验动物或其组织器官对某种化合物或混合物进行逐一的试验，速度慢，效率低，费用高。近年来，活性物质筛选逐步趋向系统化、规模化、规范化，特别是分子生物学技术的发展，使得活性物质的筛选技术有了很大的改进。目前国际上发明了以分子水平的药物模型为基础的大规模筛选技术，即使用生命活动中具有重要作用的受体、酶、离子通道、核酸等生物分子作为大规模筛选中的作用靶点，来进行活性物质的筛选，这些方法简便、快速、命中率高、费用低，有的还可以用机器人进行操作。美国还发明了用基因工程受体，如以癌基因和抑癌基因为作用靶点进行抗肿瘤药物筛选，建立了60株人癌细胞株组成的板块筛选系统。而目前国内对海洋生物活性物质的筛选主要还是使用传统的方法。
2、海洋生物活性物质生源材料的培养
能获得丰富的生源材料是开发海洋生物活性物质的基础。富含生物性物质生源材料的大规模培养是关键的问题之一。解决这一问题，一是通过人工栽培或养殖富含活性物质的海洋生物；二是利用生物技术培养生源材料。
目前，国际上对生物技术在海洋生物活性物质研究和开发中应用研究得最多的是基因工程。在医药研究领域，基因工程多肽和蛋白质类药物、单克隆抗体及新型诊断试剂的研究和开发，是现代生物技术影响最大、效益最好、发展最快的领域。但是，海洋基因工程药物研
究仅是开始。目前为止，世界上尚未有转化成工业化生产的海洋基因工程药物产品。
海洋生物发酵工程主要是通过对富含活性物质的海洋微生物进行发酵培养，研究表明，海洋生物活性物质的初始来源，大部分甚至全部来自海洋微藻和微生物等低等海洋生物。
利用生物反应器培养微藻开发海洋生物活性物质，也是世界上的一个研究热点。但这项技术目前还未达到大规模实用化的阶段。有些海洋异养微藻可以通过发酵进行培养，也是一种生物反应器技术，美国有公司利用发酵法培养异养微藻，生产EPA 和DHA ，已经达到工业化生产的阶段。
酶的生产和应用的技术过程称为酶工程。国外从耐寒、耐高温、耐高压和耐高盐度的海洋微生物中，分离出了一些特殊的酶类，如，对热稳定的DNA 聚合酶、在组织培养中有分散细胞作用的胶原酶、能催化卤素进入代谢产物中的卤素过氧化物酶、超氧化物歧化酶、极端酶等等。这不仅可提供工业特殊用酶，也为获得新的生物活性物质提供极好的生物资源库。
国内应用生物技术进行海洋生物活性物质研究和开发，也做了不少工作。其中利用基因工程技术开发海洋蛋白类药物起步较快，先后开展了别藻蓝蛋白、海葵毒素、鲨鱼软骨蛋白、芋螺毒素、降钙素等药用基因克隆与表达的研究，已形成了一定的优势。海洋微藻光生物反应器技术，海洋微生物活性物质的筛选和发酵培养，应用细胞工程技术开发生物活性物质等研究工作都已经启动。但总的来看，还是处于刚刚开始的阶段。
3、海洋生物活性物质分离纯化和产品制备技术
开展海洋生物活性物质的研究，其最终目的是将其开发成产品投放市场，因此海洋生物活性物质的分离、纯化及产品制备等技术，是海洋生物活性物质的重要研究领域。
近年来，有许多新的、先进的技术应用于海洋生物活性物质的分离、纯化及产品制备过程中，如超临界流体萃取、双液相萃取、灌注层析、分子蒸馏、膜分离等现代分离技术，提高化合物活性的分子修饰、组合化学技术，加速药物研制的计算机辅助药物设计技术等。近十几年来，我国已经有一大批海洋药物和海洋保健食品投放市场，如PSS ，硫酸软骨素，脱溴海兔毒素，头孢菌素，玉足海参素渗透剂，鱼油胶囊，β胡萝卜素等，这些产品都是通过对海洋生物中天然存在的活性物质的提取、分离、纯化等过程而研制得的，其中有些经过化学修饰，进一步提高了其作用效果。
三、前景
对海洋生物活性物质的研究, 已展现出诱人的前景, 尤其在抗癌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎, 以及作用于神经系统和心血管系统等方面。当前, 对新药的研究难度大为增加, 尽管有若干新药问世, 但大都缺乏重大突破。而海洋生物活性物质, 往往具有独特的化学结构和高活性, 可作为先导化合物。如竽螺毒素有数 10 种, 虽属同源蛋白质, 但具很高的选择毒性, 肽链结构的微弱变化就可以有效地调节其生物活性。这为寻找高选择性的药物或农药提供了重要线索。
四、我国研究和开发中存在的主要问题及对策
随着科学技术的发展，现有的技术将不断完善，新的技术会不断出现，将带动海洋生物活性物质的研究与开发以更快的速度发展。
目前我国海洋生物活性物质的研究和开发与世界先进国家相比还存在相当差距。科技投入不足是重要原因之一。其次是科技力量分散，中试环节薄弱等。
如果国家和地方政府应加大资金投入，相关企业从自身利益出发也应给予充分的重视，提前介入有关的研究与开发；全国应建立相应的海洋生物活性物质研究开发中心（或基地），中心既要有较高水平的研究技术队伍，又要配备比较先进齐全的设备；要发挥高校、科研院所和生产企业三方面优势，共同努力，加快培养相关的研究技术人才，同时吸引更多从事本领域研究和开发的留学人员归国参与该领域工作；建立全国从事海洋生物活性物质研究开发的协调组织和全国海洋生物活性物质数据库。 那么相信不久海洋生物活性物质的生态优势和直接经济效益便会显现出来了！
范文五：中草药免疫生物活性物质的提取
中草药免疫生物活性物质的提取
摘要：本论文考察了在其他条件相同的情况下，改变提取所用的酒精浓度，对黄芪、人参还有熟地进行相应的提取处理，采用比色法来测定所提取到的免疫活性物质的含量。结果表明，在相同的情况下，对于人参皂苷，70%的酒精浓度提取的效果最好；对于黄芪多糖，80%的酒精浓度提取效果最好；对于熟地多糖，80%的酒精可以得到最多的量。
关键词：酒精、人参皂苷、熟地多糖、黄芪多糖
Extraction of Chinese herbal active substances
Abstract: This paper examines how the alcohol’s concentration can influence the extraction of Astragalus, ginseng, and rehmannia . The results show that, under the same conditions, the ginsenoside, best concentration of alcohol is 70%; for astragalus polysaccharides, is 80% and for radix rehmanniate polysaccharide is 60% .
Keywords: Alcohol, ginseng, Radix Rehmanniate polysaccharide, Astragalus Polysaccharide
一、 前言
说到免疫，一般都不会陌生。作为一种生理机能，人体依靠这种机能，从而破坏和排斥进入人体的外来物质，以及对人体自身产生的损伤以及肿瘤细胞进行处理[1]。免。免疫分为特异性免疫和非特异性免疫。非特异性成分不需要事先暴露，当有病原体侵入机体的时候，可以立刻响应对其产生相应的抵抗，可以有效地防止外界各种病原体的入侵。特异性免疫，顾名思义，便是在主体的寿命期内发展起来的，是专门针对某个特定的病原体产生的免疫。特异性成分即一般指的是针对某个特点的病原体产生的免疫，而非特异性，顾名思义便是对于病原体的选择没有特异性的专一，针对各种病原体的入侵，都可以有效的产生一定的防护。而产生免疫反应，这其中必然也少不了免疫系统的加入[2]。免疫系统是一个复杂的自适应系统，可以保护生物体不受外部病原体的侵害[3]。作为人体的八大系统之一，免疫系统主要有免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，是防卫病原体入侵最有效的武器，具有免疫监视、防御和调控的作用，可以发现并且清楚异物、外来病原微生物等引起的内环境波动[4]。其中免疫细胞可以自身合成人体自身免疫所需的部分免疫物质，如淋巴因子、抗体、溶菌酶等。但随着科学技
术的不断发展，目前发现除了人体自身可以形成部分的免疫物质外，很多我们日常生活中摄取的食物中也含有免疫活性物质。而中草药便是免疫活性物质的很大的一个来源。如果能够将中草药中的免疫活性物质最大程度地提取出来，与其他的产品相融合，在最大限度的避免摄入中药产生苦涩味的同时，也增加了关联产品的药用价值，必将有利于生物和人类健康的共同发展。
二、研究背景
2.1 黄酒的现状
黄酒，和葡萄酒、啤酒一起作为世界三大古酒，是一种以大米、黍米、玉米、水稻为主要原材料，小麦、大麦、麸皮等为辅助原材料，经过多步工序酿造而成的含酒精量14%-20%的低度酿造酒。黄酒营养价值丰富有利于健康，富含多种氨基酸，其中4种为未知氨基酸，8种人体自身不能合作的必需氨基酸（赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸）[5]，除此之外，黄酒内还含有钙、镁、磷等无机盐，以及一些微量原酸[5]。并且，黄酒中的镁，每100ml 中含有20~30mg，比白葡萄酒高10倍，比红葡萄酒高5倍，此外，绍兴的元红酒镁100ml 含锌0.85mg ，因此黄酒还具有促进食欲的作用；而黄酒中的铁的含量，绍兴元红酒和加饭酒中含铁1.2mg/100ml,比白葡萄酒高20倍，比红葡萄酒高12倍，因此适量饮用黄酒对心肌也具有一定的保护作用[6]。故有著名的专家说，外国人把啤酒称为“液体面包”，而中国黄酒应该称为“液体蛋糕”。目前市面上比较有名的有绍兴加饭酒、福建老酒、江西九江酒等，国内也以古越龙山、会稽山和塔牌较为有名。可是，虽然黄酒的营养价值比胜于法国的红酒和德国的啤酒，但是，黄酒目前的市场占有量、国际知名度却是少之又少。据我所知，目前在国外除了一些唐人街上中国人经营的饭店里面会偶尔看到黄酒的身影，其他时候，大部分的市场仍旧是被啤酒、白酒和红酒占据。而国内，黄酒的分散程度也是很小，除了江浙沪的人偶尔会在饭桌上见到黄酒的身影外，其他省份几乎很少可以看到其身影。但是即使浙江绍兴的黄酒目前最为出名，但是深入了解绍兴本地人后发现，即使是他们，大多数时候摆上饭桌的也是红、白、啤酒，而非自己家乡的酒。很多时候，黄酒甚至只能沦为做菜的一种配料，陷入一种十分尴尬的局面。分析目前的市场原因，可能的原因有如下几个（1）黄酒的宣传和包装力度不够，不像其他几种酒在不断改进产品的同时也在着力打造自
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