哈-哈88
范文一：实验动物设计模板
实验动物设计大纲
实验名称:普通小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV)感染
模型比较
课题来源:自选
设计班级:****级**本科**班
设计人员:**** **** **** ****
设计日期:****年**月**日
成都医学院实验技术教研室
2010年制
一、立题依据
(一)目的与意义
比较研究BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的特点,建立理想动物模型, 为研究发病机理和防治措施奠定基础。
(二)国内外研究现状
人呼吸道合胞病毒( human respiratory syncytial virus, RSV) 是全球婴幼儿下呼吸道感染首位病毒病原体, 几乎所有儿童两岁前感染过至少一次RSV[1],年龄越小病情越重, 再感染率高, 与哮喘发生密切相关[2]。免疫缺陷者更易感染, 临床症状更为严重,常致死亡[3]。每年住院治疗的50%-75% 婴幼儿毛细支气管炎和25% ~40% 的肺炎是RSV直接引起, 1 岁内婴儿RSV感染率68.8%, 1-2 岁感染率达82.6%~100%。婴儿期急性RSV 下呼吸道感染使非特应体质和特应体质儿童发生哮喘危险性都比普通儿童明显增加, 是哮喘的独立危险因素[4]虽然已有许多抗RSV 制剂和疫苗的研究, 但尚无安全有效的防治方法。
抗RSV 制剂的研究需要建立理想的动物模型, 但目前已建立的系列感染模型均不够满意。肺组织RSV抗原保护性免疫仅能维持数月, 福尔马林灭活疫苗不能起到保护作用反而加重病情, 至今RSV 仍无安全有效的治疗药物和预防疫苗, 脱氧核酶等新型抗RSV制剂正在研究中, 已在体外无细胞体系和细胞模型中表现抗病毒活性, 需要建立恰当的动物模型, 进一步在体内研究其抗病毒作用[5]。从RSV 发现至今,已建立的黑猩猩、猕猴、雪貂、牛、棉鼠、豚鼠和小鼠等感染模型各有优势和局限[6], 除灵长类动物可出现临床症状, 其他都是无症状隐性感染[7]。
BALB/c小鼠为近交繁殖产生，其对多种病原体具有易感性，利用小鼠建立模型的优点是它易获得, 遗传背景清楚而均一, 基因改造技术成熟, 已有多种商品化试剂, 是目前应用最广泛的实验动物。但小鼠不是RSV 自然宿主, 我们以往实验发现BALB/c 鼠感染RSV 没有临床症状, 肺内病毒复制水平相对低, 病毒滴度下降快, 带毒时间短, 限制了治疗效果的观察[8]。
裸小鼠采用nu,+雌鼠与nu,nu雄鼠交配方法产生，这种无毛小鼠是由于第11号染色体等位基因突变引起的，裸小鼠主要特征是无毛、裸体和无胸腺，缺乏成熟T细胞的免疫功能，B淋巴细胞正常，成年裸小鼠较普通小鼠有较高水平的NK细胞活性，目前未做过裸小鼠RSV感染模型，对其优势和局限尚不完全清楚。
(三)存在的问题
目前虽然已有许多抗RSV 制剂和疫苗的研究, 但尚无安全有效的防治方法，RSV感
染具体发病机制也不够清楚，其发病机制和抗RSV 制剂的研究需要建立理想的动物模型, 但目前已建立的系列感染模型均不够满意。
(四)解决问题的思路
复制BALB/c鼠和裸鼠RSV感染模型 ，不同时间空斑形成实验检测肺组织病毒滴度, 计数支气管肺泡灌洗液白细胞总数和分类情况, 免疫荧光和免疫组化检测RSV 抗原, 光镜和电镜检查肺组织病理学改变，比较研究BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的特点。
参考文献:
[1] BlackCP. SystematicReviewoftheBiologyandMedical Management of Respiratory Syncytial Virus Infection[J]. Respiratory Care, 2003; 48( 3) : 209- 233.
[2] Holt PC, S1y PD.Interactions between RSV infection, asthma and atopy: unraveling the complexities [J]. J Exp Med, 2002; 196( 10) : 1271- 1275.
[3] Meissner HC, RennelsMB, PickeringLK, et al.Risk of severe respiratory syncytial virus disease, identification of high risk infants and recommendations for prophylaxis with palivizumab[J].Pediatr Infect Dis J, 2004;
23( 3) : 284- 285.
[4] OddywH, de Merk NH, S1y PD, et a1. The effects of respiratory infections, atopy and breastfeeding on childhood asthma [J].Eur Respir J,
2002; 19( 5) :899- 905.
[5] ZhaoC- A,ZhaoX- D,YuH- Get al. Inhibitionofrespiratory syncytial virus replication in cultured cells by RNA cleaving DNAzyme [J].Chin J Pediatr, 2003; 41( 8) : 594- 598.
[6] Schmidt AC, Johnson TR, Peter JM, et al.Respiratory syncytial virus and other pneumoviruses: a review of the international symposium- RSV 2003[J].Virus Research, 2004; 106 : 1- 13.
[7] McArthur- Vaughan K, Gershwin LJ.A rhesus monkey model of respiratory syncytial virus infection[J].J Med Primatol, 2002; 31( 2) : 61- 73. [8] Lian G- L, Yu H- G, ZhaoX- D, et al.Establishment of respiratory syncytial virus infection model in mice[J]. J Xi’an JiaotongUniversity( Medical
Sciences) , 2003; 24( 4) : 329- 332.
二、实验设计方案
(一)实验设计目标，拟解决的关键问题
设计目标:比较研究BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的特点,以建立理想动物模型
拟解决的关键问题:BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型的复制，对试验性RSV 感染的模型进行分组与实验结果分析。
(二)实验设计
1、实验动物设计
(1)遗传背景
BALB/c鼠遗传背景:近交系BALB/c小鼠
裸小鼠遗传背景:采用nu,+雌鼠与nu,nu雄鼠交配方法产生的同源导入近交系小鼠
(2)微生物质量控制
BALB/c小鼠微生物质量要求:普通级动物要求。
裸小鼠微生物质量要求: SPF(无特定病原体)或无菌要求 (3)育种繁殖
BALB/c小鼠育种繁殖:
繁殖方法:近交繁殖
初始动物的选择:挑选一对或几对具有育种目标要求的性状的全同胞兄妹
性别鉴定:
1、雄鼠的生殖器距肛门较远
2、雄鼠生殖器与肛门之间长毛
3、雄鼠的生殖器较雌鼠大
4、雌鼠乳头较雄鼠明显
性成熟期:35-55日龄;实配年龄:60日龄左右;成熟时体重:20克以上
发情鉴定:动情期小鼠外阴部肿胀红润，抚摸其身体出现脊柱前凹、抬臀等行为现象
配种:动情前期交配
交配形式:采用全同胞兄妹交配形式
妊娠诊断:摸胎法、阴道涂片法、外形涂片法、直肠检查法
育种代数:作为亲本的全同胞兄妹(初始动物)记为0代，按雌雄1:1进行交配，所生后代记为第1代，从中又选留满意的一对或几对全同胞兄妹作亲本，按雌雄1:1
进行交配，以此类推，直到20代以上
个体选择:选择留繁殖力强，生活力强，特别是目标性状和基因
保种方法:平行线系统
扩大繁殖生产方法:交通信号灯方法
裸小鼠育种繁殖:
繁殖方法:近交繁殖(同源导入近交)
初始动物的选择:挑选一对或几对具有育种目标要求的性状的全同胞兄妹
性别鉴定:
1、雄鼠的生殖器距肛门较远
2、雄鼠的生殖器较雌鼠大
3、雌鼠乳头较雄鼠明显
发情鉴定:动情期小鼠外阴部肿胀红润，抚摸其身体出现脊柱前凹、抬臀等行为现象
配种:动情前期交配
交配形式:采用nu,+雌鼠与nu,nu雄鼠交配方法，雌雄比例为1:1，有时可采用1:2或1:3
妊娠诊断:摸胎法、阴道涂片法、外形涂片法、直肠检查法(平均每胎所得纯合子仔鼠能占仔数的55(0,，离乳率97,，1—4胎生育恒定，一年存活率达100, ，最长生存期可达752 d。)
育种代数:作为亲本nu,+雌鼠与nu,nu雄鼠记为0代，按雌雄1:1进行交配，所生后代记为第1代，从中又选留满意的一对或几对全同胞兄妹作亲本，按雌雄1:1进行交配，以此类推，直到20代以上
个体选择:选择留繁殖力强，生活力强，特别是目标性状和基因
保种方法:平行线系统
扩大繁殖生产方法:交通信号灯方法
(4)饲养管理
BALB/c小鼠饲养管理:
BALB/c小鼠环境标准:实验动物饲养室的温度为18-19?，相对湿度为40%-70%，每小时换气次数为10-20次，噪声在60分贝以下，每立方米空气中氨浓度在14mg以下，工作照度为150-300lx
BALB/c小鼠设施:开放系统
BALB/c小鼠笼器具:采用无毒塑料笼具，垫料选用具良好吸湿性、无毒性、无异味、尘埃少的材料如电刨花，垫料须经高压蒸汽灭菌
BALB/c小鼠饲喂:饲喂小鼠全价营养颗粒饲料，饲料的消毒灭菌应达到相应等级小鼠微生物控制的要求。饲喂采取“少量勤添”的原则，每周喂料3-4次，饮水应保证连续不断，每周换水2-3次，垫料每周更换1-2次
BALB/c小鼠饲养环境卫生消毒:做好室内的清洁、消毒、及饲料笼器具的清洗消毒，每次饲养完后，用苯扎溴铵擦拭笼架、地板，每月定期彻底喷雾消毒1次
裸小鼠饲养管理:
裸小鼠环境标准:实验动物饲养室的温度为18-19?，相对湿度为40%-70%，每小时换气次数为10-20次，噪声在60分贝以下，每立方米空气中氨浓度在14mg以下，工作照度为150-300lx，空气洁净度为100000级
裸小鼠设施:屏障系统或隔离系统
裸小鼠笼器具:采用无毒塑料笼具，垫料选用具良好吸湿性、无毒性、无异味、尘埃少的材料如电刨花，一般所有的笼具、垫料、饲料、饮水等都得经过灭菌消毒
裸小鼠饲喂:每周饲喂全价营养饲料2—3次。饲料、饮水、垫料及鼠笼均用双层包布包装高压蒸汽灭菌消毒。进室前经缓冲室紫外灯照射后去除外层包布，才能进入繁殖室及实验室
裸小鼠饲养环境卫生消毒: 繁殖室设在空气过滤十万级环境中放置层流柜作为裸小鼠繁殖饲养条件。启用前，先用2,新洁而灭全面擦拭，然后按消毒区域的容积用高锰酸钾15 g，In2加福尔马林15 mL混和熏蒸。最后经紫外灯照射，细菌培养阴性才使用。启用后我们的常规消毒是:进实验室前后紫外灯照射30 rain，每2周用2,新洁而灭擦拭墙壁、天花板，每一个月用过氧乙酸喷射消毒。每三个月用甲醛和高锰酸甲熏蒸一次(用备用实验室轮流消毒和使用)。每三个月将层流柜的过滤材料拆下进行清洗。每年更换一次过滤材料。饲养人员定期入繁殖室进行饲养管理操作。进室前需淋浴并用新洁而灭常规泡手、消毒、穿无菌衣、带袜的无菌裤、戴口罩、帽子。外层穿上手术隔离衣，并带手术胶手套及无菌纱手套。每次操作完毕，用新洁而灭抹台面及地面。常规每周换两次笼具，投放3 4 d的饲料与饮水。每周加两次鸡蛋和瓜子及一次维生素。
2、实验专业设计
选用BALB/c鼠和裸小鼠作为实验动物，感染RSV 后不同时间空斑形成实验检测肺组织病毒滴度, 计数支气管肺泡灌洗液白细胞总数和分类情况, 免疫荧光和免疫组化检测RSV 抗原, 光镜和电镜检查肺组织病理学改变
3、实验统计设计
结果用均数?标准差表示, 两两组间比较用t 检验, 各组间比较用方差分析。α= 0.05,P<0.05>
4、实验方法设计
(1) 实验技术路线
BALB/c小鼠 裸小鼠
D : E :感B :感染F :感C :感染A :对照
对照染3 3 天的染6 6 天的BALB/c
裸鼠 天的BALB/c 天的小鼠 BALB/c
裸鼠 小鼠 小鼠 裸鼠
不同时间空斑形成实验检测肺组织病毒滴度, 计数支气管肺泡灌洗液白
细胞总数和分类情况, 免疫荧光和免疫组化检测RSV 抗原, 光镜和电镜
检查肺组织病理学改变
(2) 实验技术方法
1)随机抽样:选正常成年健康体重相近的BALB/c小鼠30只和裸小鼠30只，分别将30只BALB/c小鼠和30只裸小鼠按体重由小变大编号后，从随机数字表中查取随机数字，依次抄录于小鼠编号下。具体方法:两种动物编号为1—30号，30只BALB/c小鼠按照能被3除的规律:不余到A组，余1到B组，余2到C组 ;30只裸小鼠BALB/c小鼠按照能被3除的规律:不余到D组，余1到E组，余2到F组
2)实验分组:实验分六组:
A :对照BALB/c 小鼠
B :感染3 天的BALB/c 小鼠
C :感染6 天的BALB/c 小鼠
D : 对照裸鼠
E :感染3 天的裸鼠
F :感染6 天的裸鼠
3)模型复制
病毒和细胞培养: Hep- 2 细胞接种RSV 标准A2 株病毒, 含2% 胎牛血清( FBS)
DMEM培养至病变达90%~100%, 吸取培养液, 4?, 3000g 离心10min收集上清, - 80?储存备用。
病毒接种: BALB/c小鼠和无特殊病原菌( specific pathogen free, SPF) 级8,12 周龄、雌性裸鼠，腹腔注射戊巴比妥钠0.06mg/g 麻醉后, 感染组鼻腔缓慢滴入2×106PFU/ ml RSV A2 株病毒液50μl, 阴性对照组滴入50μl 2% FBS DMEM。
4)取材
病毒分离和滴度分析:感染后不同时间处死小鼠, 无菌条件下取左肺、肝脏和 脾脏称重, 按10ml/g( wt/vol) 加入预冷组织平衡液, 匀浆制备肺脏、肝脏和脾脏组织悬液, 4?, 2500g 离心10min, 取上清接种于Hep2 细胞, 2% FBS 1640 培养基, 37 ?, 5% CO2 培养, 逐日观察细胞病变。同时取肺组织悬液上清空斑形成实验分析肺组织病毒滴度。
5) 相关指标测定:
空斑形成实验测定病毒滴度:3×105/ml Vero 细胞接种至6 孔板, 10%FBS 的1640 培养至单层致密无孔细胞, 接种10 倍倍比稀释的病毒液100μl, 每个浓度设复孔, 未感染病毒为对照孔。病毒吸附2h 后覆盖含1.5%的琼脂糖凝胶和2% FBS 的1640 培养基, 培养5 天, 5mg/ml MTT 显色, 计数空斑, 计算病毒滴度: PFU/ml= 稀释度× ×P= 该浓度下各孔空斑数; n= 复孔数; v= 每孔接种病毒液体积(ml)
支气管肺泡灌洗液白细胞计数:感染后第3 天、6 天和9 天处死小鼠, 气管插管, 预冷生理盐水0.5ml 灌洗2 次, 收集支气管肺泡灌洗液( BALF) , 血球计数仪计数白细胞总数。4?, 1000g 离心10min, 取细胞沉渣涂片,Wright 染色, 显微镜下计数200 个白细胞, 按中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞形态学特点分类计数。
直接免疫荧光实验:取感染后第3 天小鼠BALF 离心细胞沉渣涂片, 4?丙酮固定干燥, 按Light Diagnostics Respiratory panel 1 DFA 免疫荧光试剂盒说明书( Chemicon, USA) 鉴定RSV 抗原, 荧光显微镜下观察结果。
肺组织病理学检查:感染后第3 天、6 天处死小鼠, 取未经支气管肺泡灌洗 的右肺组织, 一部分4%多聚甲醛固定, 常规苏木素- 伊红( HE) 染色, 光镜观察形态结构。另一部分立即2.5%戊二醛固定, 送重庆医科大学电镜室包埋、制成超薄切片, 透射电镜检查。
免疫组织化学检查:RSV 抗原免疫组织化学染色SP 染色试剂盒( 北京中杉 生物技术公司) , 一抗是针对RSV 整个病毒抗原的山羊多克隆抗体( USBiological,
USA) 。4%多聚甲醛固定肺组织, 常规切片, 各步操作按试剂盒说明进行, DAB 显色后显微镜下观察。同一标本未滴加一抗的切片作阴性对照。图像分析采用北航真彩色病理图像分析系统4.0, 平均光密度反映染色强弱。
(三)可行性分析
1.小鼠易获得,易饲养;小鼠遗传背景清楚而均一, 基因改造技术成熟, 已有多种
商品化试剂,
2.实验器械容易解决;本实验模型操作不复杂;
3.实验所需费用不多; 实验时间不长。
(四)预期效果
裸小鼠和BALB/c 小鼠遗传背景、RSV 感染形式、炎症类型和发生发展过程一致, 裸小鼠既保留BALB/c 鼠的优点, 又有持续高水平病毒滴度, 感染更严重，持续时间更长,炎症反应更明显, 有利于抗RSV 药物效果评价和RSV 发病机理的研究，是较理想的小鼠模型。
(五)实验设计工作时间安排
1、共计1天 完成实验动物模型制备。
2、共计1天完成取材。
3、共计9天完成相关指标测定。
4、共计3天完成BALB/c 小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒( RSV) 感染模型特点的比较。
5、总共实验在15完成。
三、完成实验的条件
1、仪器设备情况:哺乳动物的手术器械、Y字型气管插管、注射器、气管插管、离心机、离心管、试管血球计数仪计、免疫荧光试剂盒、RSV 抗原免疫组织化学染色SP 染色试剂盒、荧光显微镜、
2、实验动物来源: 健康的BALB/c 小鼠和裸小鼠从四川大学华西医学中心购买，各30只。BALB/c 小鼠25元/只， 裸小鼠60元/只。
3、药品试剂来源:2% 胎牛血清( FBS)、10%FBS、 1.5%的琼脂糖凝胶、5mg/ml MTT、戊巴比妥钠0.06mg/g 、2×106PFU/ ml RSV A2 株病毒液、2% FBS DMEM、生理盐水、2.5%戊二醛、4%多聚甲醛、预冷组织平衡液、苏木素- 伊红( HE)
范文二：细胞动物实验模板
MnO@SiO纳米粒子毒性评价 342
方法一:MTT毒性试验
实验步骤:
1. 将样品配制成不同浓度10 μg/ml(稀释100倍)、100 μg/ml(稀释10倍)的 PBS
溶液;
o2. 在37C 分别将 HeLa 细胞放进步骤 1中配制的细胞培养液中; 3. 将细胞在培养液中孵育不同的时间(6 h、12 h). 典型实验结果:
参考文献:
方法二:台盼蓝染色实验(于超同学有更好的方法，请向他请教) 实验步骤:
1.
2.
3.
典型实验结果:
参考文献:
方法三:
实验步骤:
1.
2.
3.
典型实验结果:
参考文献:
细胞靶向性能的评价
方法一:利用荧光共聚焦显微镜研究
实验步骤:
1、靶向组:HeLa细胞，靶向材料，浓度:，25:C孵育15分钟。 2、细胞对照组: MCF-7细胞，靶向材料，浓度:，25 :C孵育15分钟。 3、温度对照组: HeLa细胞，靶向材料，浓度:，4 :C孵育15分钟。 4、封闭组:HeLa细胞，先用2%DMSO的叶酸水溶液，封闭。靶向材料，浓度:，25:C孵育15分钟。
5、材料对照组:HeLa细胞，非靶向材料，浓度和靶向组一样，25:C孵育15分钟。
典型实验结果:
参考文献:
方法二:利用流式细胞仪研究。
实验步骤:
1.
2.
3.
典型实验结果: 参考文献:
范文三：动物实验方案
大鼠血紅素再生法
1实验鼠要求：雄性，约四周大，体重小于70克，温度25±2℃，湿度 50%，光照周期各12小时，供给水为去离子水。 2饲料配方
基础饲料：采用AIN-76配方，碳水化合物全用玉米淀粉，矿物 质不加铁，铁小于3PPm 。
标准组饲料：基础饲料添加FeSO 4·7H2O ，铁含量分別有6、12、 18 及24 ppm，四种不同浓度饲料
试验饲料：样品提供铁质，加上基础饲料，铁含量分別为6、12、 18 及35 ppm，，四种不同浓度饲料。每一种样品需 要一套含四种浓度度之「试验饲料」，
3实验设计
（1）基础饲料组：6-7只鼠，全程基础饲料
（2）标准对照组：四组，每组6-7只鼠，再生期饲喂标准饲料，每组一个浓度。
（3）实验组：一个样品四组，每组6-7只鼠，再生期饲喂试验饲料，每组一个浓度。
4实验步骤
耗铁期：全部喂饲基础饲料，每周记录体重，尾巴采血追踪血红素变化， 直到降至6 g/dL 以下，大約需14 至21 天。
再生期：依体重分组，每组6-7只，一组饲喂基础饲料，四组饲喂标准饲 料，每组一种铁浓度。一种样品需要四组鼠，饲喂试验饲料，每
组一种铁浓度。定时记录饲料摄取量，10-14天采血测血红素 5分析项目及方法
铁量分析：测试样品灰化，灰分用浓盐酸溶解，适当稀释后，以原子吸收 光谱法配合铁标准溶液与铁标准检量线而定量
血紅素分析：取5mlHiCN 到一试管，加入20ul 老鼠静脉血，静置3-5分 钟，测其血红素。
6计算统计分析
再生期铁摄取量以各组饲料铁浓度乘以饲料摄取重量而得。大鼠的血液体积以每克体重有0.067 mL 估計，血紅素的含铁量以0.335% 計算。代表铁利用之生物指标可采用再生后血紅素浓度、再生期血红素浓度增加量或再生期血红素铁增加量，其計算原則列於表三。
表三 血红素再生法可用的铁利用率指标，铁可用率相关項目 计算原則 血红素增加量（mmol/L）：再生期之血红素浓度－耗铁期结束之血红素浓 度
血红素总铁量（μmol Hb/ rat ）：大鼠体重 ×0.067 ×血红素浓度 × 0.335%
血红素铁增加量（μmol Fe/ rat）：再生期之血红素总铁量－耗铁期结 束之血红素总铁量
7结果评定
若「试验饲料」各组之铁利用指标均显著高于铁浓度相当之「铁标准饲料」 组，而且试验样品之相对生物价大于100时，表示其铁可用率优于FeSO 4，可利用为促进铁吸收之健康食品。
若「试验饲料」各组之铁利用指标与铁浓度相当之「铁标准饲料」组无显
著差异或显著较低，而且其相对生物价低于100 时，表示其铁可用率不如FeSO4，并不适用为促进铁吸收之健康食品。
范文四：动物实验方案
中药保健醋抑脂动物实验研究
1实验材料
动物饲料配制普通基础饲料：玉米41.31%，麸皮33.08%，黄豆17.27%，鱼粉6.26%，食盐0.25%，贝壳粉0.50%，磷酸氢钙0.50%，新杨复合维生素0.01%，生长素0.4% 高脂饲料：普通基础饲料79% ，蛋黄粉10% ，熟猪油10%，胆固醇1%
15只大鼠
2实验内容和步骤
动物实验：将大鼠随机分为普通对照组、高脂模型组和保健醋饮料实验组（每组5只） 普通对照组：普通基础饲料
高脂模型组：高脂饲料
保健醋饮料组：高脂饲料，同时按10 mg/kg·bw ·d 的容量经口灌胃给予保健醋饮料 各组均自由饮食，连续喂养30天
喂养环境条件：温度23-25℃，性对湿度60-70% ，喂养时间30天
隔日记录进食量，每周称量体重
最后一次灌胃后，禁食6h ，取血放入冰箱中待用
测定：
血清胆固醇（TG ）、甘油三酰（TG ）及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C ）的测定：按试剂盒要求
低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C ）：按Friedwald 公式计算
LDL-C （mmoL/L）= TC-HDL-C-TG×0.456
同时计算动脉粥样硬化指数（AI ）和抗动脉粥样硬化指数（AAI ）：
AI=（TC-HDL-C)/HDL-C
AAI=HDL-C/TC
6.3结果讨论与分析
数据处理：
采用SPSS10.0对所测数据进行处理，实验结果以平均值±标准差（M ±SD ）表示。组间差异采用t 检验
范文五：动物实验方案2100
动物实验方案
一、 免疫原的准备
二、 动物实验分组
三、 免疫方法及剂量
四、 样品采集时间及保存方法
五、 动物实验检测指标
赵俊娜 2010-3-24
一、免疫原准备
一）、以PFBD-AP12A3C 、PFBD-EGFP 为载体的杆状病毒蛋白抗原准备
PFBD-AP12A3C 、PFBD-EGFP 感染HF 细胞。175c ㎡细胞瓶15瓶，收集细胞上清，用PH:7.2的PBS 洗细胞两次，用细胞刮挂下来细胞并与适量的PBS 混合，-80℃冰箱。反复冻融3次。离心，8000g/min,10min.上清做蔗糖梯度超速离心：，35000转离心2.5h ，脱糖，沉淀溶于无菌的PBS 中。取适量做Western Blot 分析。一抗为牛血清，1/40,二抗为HRP-SPA 。
蛋白浓度的确定：
二）、以Bac-VSVG-CMV-AP12A3C/YP12A3C/EGFP为载体的重组杆状病毒免疫原的准备。
高滴度病毒的获得及纯化：Bac-VSVG-CMV-AP12A3C/YP12A3C/EGFP重组杆状病毒F3代的毒感染Sf9 cell 175c ㎡细胞瓶20瓶，收集细胞上清。离心，12000r/min,15min.去除细胞碎片，上清转移到无菌的离心管中备用；纯化：准备35%的蔗糖垫子，25000转离心2.5h 。沉淀溶于无菌的PH:7.2的PBS 中。PBS 的量为总病毒液体积的0.5%。BacPAK 杆状病毒滴度快速检测试剂盒检测超离后的重组病毒的滴度。
二、动物实验分组情况
小鼠实验：
Bac-VSVG-CMV-AP12A3C 组、 Bac-VSVG-CMV-YP12A3C 组、Bac-VSVG-CMV-S-EGFP 组、PBS 组、A 型灭火疫苗组，Y 型灭火疫苗组，PFBD-AP12A3C 蛋白组、PFBD-EGFP 组共8组，每组11只。
三、 免疫方法及剂量
小鼠实验：
活毒方面：Bac-VSVG-CMV-AP12A3C/YP12A3C/EGFP重组杆状病毒以病毒量为1010 Pfu/ml,.接种4-6周龄Ba/c小鼠，每组11只，后腿肌肉注射，共免疫两次，间隔三周，并设PBS 免疫组作为阴性对照组。
蛋白方面：32，64ug. 接种4-6周龄Ba/c小鼠每组11只，共免疫两次，间隔三周，并设PBS 免疫组作为阴性对照组。
四、样品采集时间及保存方法
小鼠血清样品采集及保存：
尾静脉采血：于首免后三周，六周采血。左手保定小鼠，用酒精棉擦拭小鼠尾部，轻轻地弹小鼠尾部，直到小鼠尾部充血，然后用剪刀剪断尾部。抽血泵采血300ul 。37℃ ,2h。4℃过夜。12000r/min,5min。在超净台上做：吸取6ul 做ElISA 抗体效价检测，其余的放入在酶切管中做微量病毒中和试验。血清，-20℃保存备用。
五、动物实验检测指标
小鼠实验指标：
1、抗体水平检测（抗原为A VP1蛋白：用杆状病毒表达系统表
达）间接ELiSA 检测
2、微量中和抗体水平（固定病毒有限稀释血清法）
按照报道的改良的中和抗体检测方法，结合来检测免疫后第三、六周实验动物的特异的中和抗体水平。
方法：收集备检血清，56℃灭火30min, 按21 , ….28 倍比稀释血清，然后将稀释好的血清分别加入96孔细胞培养板中。每个稀释度做3个重复，每空50ul ，然后再在所加有血清的培养空中加入用DMEM 稀释为100Pfu 的FMDV A 50ul，37℃，CO 2 培养箱中作用1h,
然后于每空中滴加2-5×105 个/ml 的BHK-21 cell 悬液100ul ，轻轻摇匀后，放入培养箱内培养3-4天。观察细胞病变情况，计算备检血清中和FMDV 的特异性中和抗体的滴度。
3、免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-r 的分析（刺激原为A VP1蛋白）。 ⑴利用实时荧光定量检测免疫小鼠脾细胞IFN-r mRNA表达：免制备免疫小鼠脾细胞悬液，24孔板，每孔106个细胞。用5ug/ml蛋白刺激，。24h 收集细胞上清, 疫小鼠脾细胞总RNA 的提取一般提取RNA 的方法提取RNA ，等定样品的含量及纯度，-80℃保存备用；CDNA 的合成；SYBR Green 实时定量PCR ：24刺激物的收取利用实时定量的方法，检测免疫小鼠脾细胞中IFN-r mRNA 相对于B-actin mRNA 表达量，进行相对定量分析。(92bp)
⑵利用双抗体夹心ELISA 定量检测IFN-r 分泌情况。
免制备免疫小鼠脾细胞悬液，24孔板，每孔106个细胞。用5ug/ml蛋白刺激，。72h 收集细胞上清检测分泌水平。
⑶流式细胞仪检测小鼠脾细胞内分泌CD8+，CD4+T水平
4、攻毒实验：
现存的问题是不知道如何确定攻毒的剂量, 因为我们需要做在乳鼠上做LD50。如果不做的话，根据文献报道，用LD5010-8 ml -1 , 用104LD50,200ul., 病毒血症在36h 达到最高。（文献报道：攻毒后 12h 、24h 、36h 、48h 、60h 、72h 采血。） 我的方案是：
1、 LD5010-8 ml -1 , 用104LD50,200ul 后退内侧肌肉注射 2、 采血时间：
攻毒12h （大约早上七点）随机选取两只眼眶采血
攻毒36h (大约早上七点）随机选取两只眼眶采血
攻毒60h (大约早上七点）随机选取两只眼眶采血
攻毒84h (大约早上七点）随机选取两只眼眶采血
3、 TCID50检测血样中的病毒滴度
4、 提取血样及组织器官（脑，脾脏，肺脏，肾脏，肝脏，肌肉）
总基因组的提取，Realtime PCR检测攻毒后病毒在机体内的增值情况。引物（根据OIE 上报道）：
5’UTR (62)
Forward primer: CACYT YAAGR TGACA YTGRT ACTGG TAC; Reverse primer: CAGAT YCCRA GTGWC ICITG TTA
TaqMan ? probe: CCTCG GGGTA CCTGA AGGGC ATCC. 3D (17)
Forward primer: ACTGG GTTTT ACAAA CCTGT GA; Reverse primer: GCGAG TCCTG CCACG GA
TaqMan ? probe: TCCTT TGCAC GCCGT GGGAC.
ACTGGGTTTTACAAA CCTGTGA TGGCTTCGAAGACCCTCGAGGCTA TCCTC TCCTTTG CACGCCGTGGGAC CA TACAGGAGAAGTTGA TC TCCGTGGCAGGACTCGC 107bp
