范文一:限制性酶的酶切位点
各种限制性酶的酶切位点
Enzyme Name Sequence
AatI AGG!CCT AatII GACGT!C AccI GT!MKAC AccII
AccIII
AcyI
AflI
AflII
AflIII
AhaI
AhaII
AhaIII
AluI
AlwI
AlwI
AlwNI
AocI
AocII
AosI
AosII CG!CG T!CCGGA GR!CGYC G!GWCC C!TTAAG A!CRYGT CC!SGG GR!CGYC TTT!AAA AG!CT GGATCNNNN! !NNNNNGATCC CAGNNN!CTG CC!TNAGG GDGCH!C TGC!GCA GR!CGYC
ApaI GGGCC!C ApaLI G!TGCAC ApyI CC!WGG AquI C!YCGRG AseI AT!TAAT AspI
AspI
AspI
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AsuII
AvaI
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AvaIII
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BanII
BanIII
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BbiII/AcyI GR!CGYC
BbvI GCAGCNNNNNNNN! BbvI !NNNNNNNNNNNNGCTGC BbvII GAAGACNN! BbvII !NNNNNNGTCTTC BcefI
BcefI
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BsmAI
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BspHI
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BspMI ACGGCNNNNNNNNNNNN! !NNNNNNNNNNNNNGCCGT T!GATCA CC!SGG GCCNNNN!NGGC A!GATCT !NNNNNGATCC GGATCNNNN! !GCGCGC !GTCTC !GAGAC GAATGCN! G!CATTC GDGCH!C T!CATGA ACCTGCNNNN! !NNNNNNNNGCAGGT
BspMII T!CCGGA BsrI ACTGGN! BsrI C!CAGT BssHII G!CGCGC BstBI TT!CGAA BstEII
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CfrI
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DpnI GA!TC DraI TTT!AAA DraII RG!GNCCY DraIII CACNNN!GTG DsaI C!CRYGG EaeI
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EcoI
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EcoI
EcoI
EcoI
EcoI
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EcoRI Y!GGCCR C!GGCCG !CTCTTC !GAAGAG C!GGCCG TAC!GTA GGTCTCN! !NNNNNGAGACC G!GWCC AGC!GCT C!GGCCG !CTGAAG !CTTCAG CC!TNAGG CCTNN!NNNAGG RG!GNCCY G!AATTC
EcoRII !CCWGG
EcoRV GAT!ATC EcoTI C!CWWGG EcoTI ATGCA!T
EcoTI GRGCY!C EheI
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FinI
FinI
FnuHI
FokI
FokI
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GdiII
GsuI
GsuI
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HaeII
HaeIII
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HgaI !NNNNNNNNNNGCGTC HgiAI GWGCW!C HgiEII !ACCNNNNNNGGT HhaI GCG!C HinI GR!CGYC HinPI
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KspI
MaeI
MaeII
MaeIII
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MboII
MboII G!CGC GTY!RAC A!AGCTT G!ANTC GTT!AAC C!CGG GGTGANNNNNNNN! !NNNNNNNTCACC GGTAC!C CTCTTCN! !NNNNGAAGAG C!TAG A!CGT !GTNAC !GATC GAAGANNNNNNNN! !NNNNNNNTCTTC
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NruI TCG!CGA NsiI ATGCA!T Nsp()I RCATG!Y Nsp()V TT!CGAA NspBII
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PleI
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SacI GAGCT!C SacII CCGC!GG SalI G!TCGAC
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SauI
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SecI
SexI
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SfaNI
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SinI
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SnaBI
SnaI
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SplI G!GNCC CC!TNAGG AGT!ACT CC!NGG GDGCH!C C!CNNGG !CTCGAG GCATCNNNNN! !NNNNNNNNNGATGC GGCCNNNN!NGGCC G!GWCC CCC!GGG TAC!GTA !GTATAC A!CTAGT GCATG!C C!GTACG
SspI AAT!ATT SstI GAGCT!C SstII CCGC!GG SstIII !ACGT StuI AGG!CCT StyI
StySJI
StySJI
TaqI
TaqII
TaqII
TaqII
TaqII
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TspEI
TthI
TthII
TthII
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XbaI C!CWWGG !GAGNNNNNNGTRC !GYACNNNNNNCTC T!CGA GACCGANNNNNNNNNNN! !NNNNNNNNNTCGGTC CACCCANNNNNNNNNNN! !NNNNNNNNNTGGGTG CG!CG !GTSAC !AATT GACN!NNGTC CAARCANNNNNNNNNNN! !NNNNNNNNNTGYTTG T!CGA AT!TAAT T!CTAGA
XcyI C!CCGGG XhoI C!TCGAG
XhoII R!GATCY XmaI C!CCGGG XmaIII C!GGCCG XmnI
XorII
GAANN!NNTTC CGAT!CG
范文二:各种酶切位点的保护碱基(引物设计必看)
各种酶切位点的保护碱基
酶不同,所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下,在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的,我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments
(oligonucleotides)
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。
实验方法:用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。20%的PAGE(7 M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题
参看目录,选择共同的buffer。其实,双酶切选哪种buffer是实验的结果,takara公司从1979年开始生产限制酶以来,做了大量的基础实验,也积累了很多经验,目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的,通常按照常规的酶切体系,在37℃进行同步酶切。但BamH I在37℃下有时表现出star活性,常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同 buffer的,通常单切,即先做一种酶切,乙醇沉淀,再做另一种酶
切。
3.酶切底物DNA,切不开
1)底物DNA上没有相应的限制酶识别位点,或酶切位点被甲基化。
2)PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误,致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质,会影响酶切,据报道,通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。
3)酶切条件的确认,包括反应温度和反应体系等。同样的DNA,同样量,用不同的限制酶切情况可能不同,由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA,不同的反应体系,酶切效果也可能不同,由于一些空间因素或不可测因素造成的。
4)公司出售的限制酶都是液体状态,都是根据最佳反应体系配制了浓度,不可以再用buffer稀释,因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系,酶浓度越稀,相对活性越低,并且越不稳定,有时便会出现底物DNA不能被切断的现象。
不同公司的酶和buffer不要交叉使用,否则可能会影响酶切效果。
5)酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶,或将质粒DNA转入甲基化酶欠损的宿主菌中,重新制备DNA,也可以使用PCR的方法对DNA进行扩增,再做酶切。常用的有XbaI容易受甲基化影响,通常选用GM33做宿主菌转化。
6)底物不纯,含有限制酶阻害物质,影响酶切作用,需要重新纯化DNA。一般做乙醇沉淀纯化即可。如果质粒中含盐或酚等,都会影响酶切效果。
4.DNA经酶切后,电泳无带或出现smear现象
DNA或酶切试剂中混有DNase,在一定的温度或缓冲液的作用下,激发DNase的作用,将DNA降解。可以用DNA上的其他酶,也可以用此酶切其他DNA来检查问题所在。如果质粒酶切出现此情况,首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。
5.甲基化酶
M.Alu I, M.Bam H I, M.RcoR I不属于CG甲基化,dam甲基化,也不属于dcm甲基化。 甲基化酶作用后,DNA不能被相应的酶切断。
范文三:PCR酶切位点的设计
PCR酶切位点的设计
一、设计引物前应做的准备:准备载体图谱,大致准备把片段插在哪个部分,对片段进行酶切分析,确定哪些酶切位点不能用,准备一本公司酶的商品目录,便于查询各种酶的数据及两种酶是否可以配用。2.设计引物所要考虑的问题是两个位点应是载体上的,所以连接片段上没有这两个位点,且距离不能太近,往往导致两个酶都切不好。因此,紧挨在一起,只能切一个,除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点,最好是隔4隔。两个酶切点最好不要是同尾酶(切下来的残基不要互补),否则效果相当于单酶切。最好使用酶切效率高的。最好使用双酶切有共同的buffer的酶。
二、Tm。设计引物的时候先不管5端的修饰序列,把互补区的T值控制在55度以上,在加上酶切位点和保护碱基。高的T值引物就比较容易克服3端发卡,二聚体及3’非特异结合等问题。
三、引物间的自由能的绝对值,如果小于10一般是问题不大的。如果稍大,PCR时可以提高一下退火温度,一般是没有问题的。如果3,端形成二聚体,并且自由能绝对值较大,如果PCR没有条带,建议重新设计引物。此外,所加的三个核苷酸的保护序列经过尽心设计有时候也可以降低二聚体的自由能。在设计酶切位点时最好能尽可能多的利用引物本身的碱基。这是因为一个特异性引物一般都是20bp左右,在加上酶切位点序列和保护碱基,大致就是28bp。
四、设计时限制性酶切位点应该是在5端的顶端。在设计引物时,常在5端添加酶切位点,以利于PCR产物连接到载体。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。先利用软件设计出合适的引物,引物的3端是引发延伸的起点,因此一定要与模板准确配对,应尽量避免在引物3端的第一位碱基是A.(容易错配)引物3端最佳碱基是G或C,行程的碱基比较稳定。
五、酶切位点都需要保护碱基,以利于内切酶的有效切割,酶切位点前加保护碱基1,两个酶切位点至少隔上3个碱基,在做载体构建的时候设计引物扩增片段进行定向连接,除了酶切位点,还要在两端加一个3个核算的保护序列,否则PCR产物很难被酶切,因此就会导致连接失败,因为内切酶需要一定的辅助性碱基才能顺利切割,在没有辅助碱基的情况下,有的酶是可以切割的,比如:Shali和SpeI,他们不需要辅助性碱基即可切割。但大部分酶是需要辅助性碱基的。
所以引物顺序应是5,-保护碱基+酶切位点+引物配对区---3,,只要在5,端加保护碱基就可以了。其实保护碱基就是要给限制性内切酶一个结合位点,3端还有更长的引物序列存在。
范文四:不同的酶切位点
ApaI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5'GGGCC^C 3'
BamHI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' G^GATCC 3'
BglII (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' A^GATCT 3'
EcoRI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' G^AATTC 3'
HindIII (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' A^AGCTT 3'
KpnI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' GGTAC^C 3'
NcoI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' C^CATGG 3'
NdeI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' CA^TATG 3'
NheI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' G^CTAGC 3'
NotI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' GC^GGCCGC 3'
SacI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' GAGCT^C 3'
SalI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' G^TCGAC 3'
SphI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' GCATG^C 3'
XbaI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' T^CTAGA 3'
XhoI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' C^TCGAG 3'
Trx-tag 硫氧还蛋白标签是个融合标签,有利于蛋白可溶性表达。
His-tag 是纯化标签,能与Ni 柱亲和层析,便于下游蛋白纯化,2个His-tag 分别设计在N,C 端、自己通过选择酶切位点选择其中的一个就可以。
S-tag 是用于做western blotting 分子杂交鉴定的,能与 Anti-S-tag 产生抗原抗体反应。 thrombin 不是凝血酶,是凝血酶酶切位点,enterokinase 也不是肠激酶,而是肠激酶酶切位点,因为pET32是融合表达载体,为了让你可以得到非融合的目标蛋白,设计了这两个蛋白酶酶切位点,用于表达后的融合标签去除。
范文五:酶切位点的设计
(一)设计引物前应做的准备工作:
准备载体图谱,大致准备把片断插在那个部分
对片断进行酶切分析,确定一下那些酶切位点不能用 准备一本所买公司的酶的商品目录,便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用
(二)设计引物所要考虑的问题
两个位点应是载体上的,,所连接片断上没有这两个位点,且距离不能太近,往往导致两个酶都切不好。因此,紧挨在一起,只能切一个,除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。我看promega的说明书上说,最好隔四个。还有一种情况是:不能有碱基的交叉,比如AGATCTTAAG,这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶(切下来的残基不要互补),否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
最好使用较常用的酶(如hind3,bamh1,ecor1等),最好使用自己实验室有的酶,这样可以省钱。
Tm的计算,关于Tm的问题,很多的战友都有疑惑。其实园子里有很多的解释了。
Tm叫溶解温度(melting temperature, Tm),即是DNA双链溶解所需的温度。大家可以理解,这个温度是由互补的DNA区域决定的,
而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此,对于引物的Tm,只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。计算Tm时,只计算互补的区域(除非你的酶切位点也与模板互补)。不少战友设计的引物都Tm过低,是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了,最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。所以,设计引物的时候,先不管5'端的修饰序列,把互补区的Tm控制在55度以上(我喜欢控制在58以上,具体根据PCR的具体情况,对于困难的PCR,需要适当提高Tm),再加上酶切位点和保护碱基,这样的引物通常都是可用的,即使有小的问题,也可以挽回。Tm温度高的引物就比较容易克服3‘发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。简单的计算公式可以用2+4的公式。若你计算的Tm值达到了快90 ,不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物,总长分别为29、33个碱基,去掉酶切位点和保护碱基,分别为17、21个碱基。引物公司给的单子是70多度,实际用的只有50度,用55度扩的结果也差不多。 其它关于Tm值的计算,有用PP5.0进行评价的,需要考虑的参数包括:base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer。退一般退火温度为Tm-5度,退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去,如上所言,PCR几个循环后,引物外侧的序列已经参入了扩增片断中,所以你可以在预变性后多加几步,温度比你Tm值低些(这样可能会增加非特异性),Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Primer计算出来的。1.一般在5'端加保护
碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-VECTOR或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基2.有人的经验加入酶切位点的引物可以和未加入时使用相同的退火温度,结果也还是令人满意。 关于引物二聚体,最好用primer或是其他设计引物的软件进行计算一下,看看引物之间的?G(自由能)的绝对值,如果小于10,一般是问题的。如果稍大,PCR时可以提高一下退火温度,一般是没有问题的。如果3’端形成二聚体,并且自由能绝对值较大,如果PCR没有条带,建议重新设计引物。此外,所加的三个核苷酸的保护序列经过尽心设计有时也可以降低二聚体的?G。
在设计酶切位点时,最好能尽可能多的利用引物本身的碱基。这是因为,一个特异性引物一般都是20bp左右,再加上酶切位点序列和保护性碱基,大致就是28bp左右了。而我们在设计退火温度时,与引物的长度有关,比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些。如果我们能利用引物自身的部分序列,就可以有效地减少引物的长度。 还有,有些酶是离不开末端序列的,因此,在设计一个酶位点时,最好把该酶的性质弄清楚
设计时限制性酶切位点是应该在5’端的顶端。在设计引物时,常在5‘端添加酶切位点,以利于PCR产物连接到载体。 设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。先用软件设计出合适的引物,引物的3’端是引发延伸的起点,因此一定要与模板准确配对,应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。(容易错配)引物3’端最佳碱基的选择是G和C,因为他们形成的碱基配对比较稳
定。目的序列上并不存在的附加序列,如限制位点和启动子序列,可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列,但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。 酶切位点都需要保护碱基以利于内切酶的有效切割。酶切位点前加保护碱基 1,两个酶切点至少隔上3个碱基,在做载体构建的时候设计引物扩增片段进行定向连接,除了酶切位点,还要在两端加一个三个核苷酸的保护序列,否则PCR产物很难被酶切,因此就会导致连接失败,因为内切酶需要一定的辅助性碱基才能顺利切割,在没有辅助碱基的情况下,有的酶是可以切割的,比如:SalI和SpeI,他们不需要辅助性碱基即可切割,但大部分酶是需要辅助性碱基的。所以引物顺序应是:5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’ 下面是几个战友的讨论,请问:在引物的5‘端加限制酶切位点,只在酶切位点的5‘端加保护碱基可以吗,还是必须要在酶切位点的两侧加保护碱基,
是的,只要在5‘端加保护碱基可以了。其实保护碱基就是要给限制性内切酶一个结合位点,3‘端还有更长的引物序列在,当然不需要再加保护碱基了, 下面就来讨论一下这个问题:(下面引自NEB网站)
1、寡核苷酸近末端位点的酶切
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。(这里用的是寡核苷酸~~而不是末端带酶切位点的肽链~)实验结果
对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。然后NEB就提供了一个表,关于链长和切割效率的。我觉得这只能说明酶在作用于识别位点时所需占据的链长,并不能说明在设计酶切位点时要加那么长的保护碱基,比如我用的NotI,要加10个碱基,切25个小时才95,的效率,这还是用了20倍的酶量~我师姐只加了4个碱基,也没见出现问题。
2、线性载体近末端位点的酶切
将线性载体与相应内切酶(10 units/μg)在适宜温度及缓冲液条件下反应60分钟,随后进行连接和转化。切割效率=100%-(酶切产物转化子数/再连接产物转化子数)""近末端碱基对数"指的是从识别位点到DNA末端的碱基对数,但并不包括最初切割位点处留下的单链突出碱基。(解释一下:就像下面这个例子EcoRI酶切位点 NNNG AATTC
NNC TTAAG
它的近末端碱基对数就是3,而不是4)
还没有证据表明单链核苷酸能否提高切割效率,因此在设计PCR引物时应至少加上4个额外碱基。
Not I 7 100 (2) Bluescript SK- Spe I
4 100 (1) Bluescript SK-Ksp I
1 98 (2) Bluescript SK Xba I
拿NotI为例,我觉得NEB给出的这个表的意思是,用Spe I切
Bluescript SK载体,得到带7个近末端碱基对的NotI酶切位点,切1小时,效率是100,,以次类推。也就是说只有带4个末端碱基就能达到100,的效率,而不是像1所说的要加10个碱基,切25个小时。因为那是针对寡核苷酸的。
这是我的理解,欢迎大家讨论。因为我发现很多人都是依据那个表来加保护碱基,不管是求助还是应助别人。然后在5‘端直接加上所需的限制性酶切位点而无需考虑引入的位点和模板的互补配对情况另外保护碱基是不是也不需要与模板对应位置配对
以前讨论过这个问题,其实保护碱基的问题可以归纳为几条: 1)大多数常用酶,根据NEB公司切割线性化的双链DNA片段的实验数据添加,
2)某些比较常用的酶,根据NEB公司双酶先后切割的实验数据解决,参考的文件是NEB公司提供的,见附件
3)有些人随意添加3-6个碱基,也是一种做法,我不太赞同,毕竟不同的酶对保护碱基的要求差别很大
4)最通用的方法,用T载体克隆解决问题
1。由于内切酶在识别位点时要求位点的两侧都有几个碱基,设计引物的时候,要在位点的外侧至少再加几个碱基,
比如 3个碱基,酶切位点,引物。
2。进行PCR时,是不是要先在较低的温度下反应几个循环,就是以不含酶切位点时引物的Tm,10度,然后再在较高温度做,把引物、酶切位点、额外加入的碱基都包括在内,得到的Tm,10度。退火温
度通常都是不考虑加入的酶切位点及保护碱基的,但要考虑发卡结
构,及错误引发率之类的
这一段时间为了换载体,重新设计引物花了不少工夫,学了不少东西,
希望能和你共勉:
1.上下游引物前端个加一个限制性核酸内切酶位点,加保护碱基并不
是你所说的“内切酶在识别位点时要求位点的两侧都有几个碱基”,
只要求在引物5’端加保护碱基;如你需要在上游引物上加Bam H?
(5-GAAGCC-3)酶切位点,那么你的保护碱基可以为C、CG或CGC,
选择哪一个根据你的需要,是否影响Primer的Tm值。关于保护碱
基的问题,你可以查new England的相关资料。
Linearized vectors were incubated with the indicated enzymes (10 units/μg) for 60 minutes at the recommended incubation temperature and NEBuffer for each enzyme. Following ligation and transformation, cleavage efficiencies were determined by dividing the number of transformants from the digestion reaction by the number obtained from religation of the linearized DNA (typically
100-500 colonies) and subtracting from 100%. "Base Pairs from End" refers to the number of double-stranded base pairs between
the recognition site and the terminus of the fragment; this number does not include the single-stranded overhang from the initial cut.
Since it has not been demonstrated whether these single-stranded
nucleotides contribute to cleavage efficiency, 4 bases should be added to the indicated numbers when designing PCR primers. Average efficiencies were rounded to the nearest whole number;
experimental variation was typically within 10%. The numbers in parentheses refer to the number of independent trials for each enzyme tested (from Moreira, R. and Noren, C. (1995), Biotechniques, 19, 56-59).
Note: As a general rule, enzymes not listed below require 6 bases
pairs on either side of their recognition site to cleave efficiently.
Base pairs %Cleavage
Enzyme from End Efficiency Vector Initial Cut
Aat II 3 88 (2) LITMUS 29 Nco I
2 100 (2) LITMUS 28 Nco I
1 95 (2) LITMUS 29 PinA I
Acc65 I 2 99 (2) LITMUS 29 Spe I
1 75 (3) pNEB193 Sac I
Afl II 1 13 (2) LITMUS 29 Stu I
Age I 1 100 (1) LITMUS 29 Xba I
1 100 (2) LITMUS 29 Aat II
Apa I 2 100 (1) LITMUS 38 Spe I
Asc I 1 97 (2) pNEB193 BamH I Avr II 1 100 (2) LITMUS 29 Sac I BamH I 1 97 (2) LITMUS 29 Hind III Bgl II 3 100 (2) LITMUS 29 Nsi I BsiW I 2 100 (2) LITMUS 29 BssH II BspE I 2 100 (1) LITMUS 39 BsrG I
1 8 (2) LITMUS 38 BsrG I BsrG I 2 99 (2) LITMUS 39 Sph I
1 88 (2) LITMUS 38 BspE I BssH II 2 100 (2) LITMUS 29 BsiW I Eag I 2 100 (2) LITMUS 39 Nhe I EcoR I 1 100 (1) LITMUS 29 Xho I
1 88 (1) LITMUS 29 Pst I
1 100 (1) LITMUS 39 Nhe I EcoR V 1 100 (2) LITMUS 29 Pst I Hind III 3 90 (2) LITMUS 29 Nco I
2 91 (2) LITMUS 28 Nco I
1 0 (2) LITMUS 29 BamH I
Kas I 2 97 (1) LITMUS 38 NgoM IV
1 93 (1) LITMUS 38 Hind III Kpn I 2 100 (2) LITMUS 29 Spe I
2 100 (2) LITMUS 29 Sac I
1 99 (2) pNEB193 Sac I Mlu I 2 99 (2) LITMUS 39 Eag I Mun I 2 100 (1) LITMUS 39 NgoM IV Nco I 2 100 (1) LITMUS 28 Hind III NgoM IV 2 100 (1) LITMUS 39 Mun I Nhe I 1 100 (1) LITMUS 39 EcoR I
2 82 (1) LITMUS 39 Eag I Not I 7 100 (2) Bluescript SK- Spe I
4 100 (1) Bluescript SK- Ksp I
1 98 (2) Bluescript SK- Xba I Nsi I 3 100 (2) LITMUS 29 BssH II
3 77 (4) LITMUS 29 Bgl II
2 95 (2) LITMUS 28 BssH II Pac I 1 76 (3) pNEB193 BamH I Pme I 1 94 (2) pNEB193 Pst I
Pst I 3 98 (1) LITMUS 29 EcoR V
2 50 (5) LITMUS 39 Hind III
1 37 (3) LITMUS 29 EcoR I Sac I 1 99 (2) LITMUS 29 Avr II Sal I 3 89 (2) LITMUS 39 Spe I
2 23 (2) LITMUS 39 Sph I
1 61 (3) LITMUS 38 Sph I Spe I 2 100 (2) LITMUS 29 Acc65 I
2 100 (2) LITMUS 29 Kpn I Sph I 2 99 (1) LITMUS 39 Sal I
2 97 (1) LITMUS 39 BsrG I
1 92 (2) LITMUS 38 Sal I Xba I 1 99 (2) LITMUS 29 Age I
1 94 (1) LITMUS 29 PinA I Xho I 1 97 (2) LITMUS 29 EcoR I Xma I 2 98 (1) pNEB193 Asc I
2 92 (1) pNEB193 BssH II
寡核苷酸近末端位点的酶切
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。
32实验方法:用γ-[P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20?C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl2
(视酶的具体要求而定)。20%的PAGE(7 M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低
切割率% 酶 寡核苷酸序列 链长
2 hr 20 hr Acc I GGTCGACC 8 0 0
CGGTCGACCG 10 0 0
CCGGTCGACCGG 12 0 0 Afl III CACATGTG 8 0 0
CCACATGTGG 10 >90 >90
CCCACATGTGGG 12 >90 >90
Asc I GGCGCGCC 8 >90 >90
AGGCGCGCCT 10 >90 >90
TTGGCGCGCCAA 12 >90 >90 Ava I CCCCGGGG 8 50 >90
CCCCCGGGGG 10 >90 >90
TCCCCCGGGGGA 12 >90 >90 BamH I CGGATCCG 8 10 25
CGGGATCCCG 10 >90 >90
CGCGGATCCGCG 12 >90 >90 Bgl II CAGATCTG 8 0 0
GAAGATCTTC 10 75 >90
GGAAGATCTTCC 12 25 >90 BssH II GGCGCGCC 8 0 0
AGGCGCGCCT 10 0 0
TTGGCGCGCCAA 12 50 >90 BstE II GGGT(A/T)ACCC 9 0 10 BstX I AACTGCAGAACCAATGCATTGG 22 0 0
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA 24 25 50
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 27 25 >90
Cla I CATCGATG 8 0 0
GATCGATC 8 0 0
CCATCGATGG 10 >90 >90
CCCATCGATGGG 12 50 50 EcoR I GGAATTCC 8 >90 >90
CGGAATTCCG 10 >90 >90
CCGGAATTCCGG 12 >90 >90 Hae III GGGGCCCC 8 >90 >90
AGCGGCCGCT 10 >90 >90
TTGCGGCCGCAA 12 >90 >90 Hind III CAAGCTTG 8 0 0
CCAAGCTTGG 10 0 0
CCCAAGCTTGGG 12 10 75 Kpn I GGGTACCC 8 0 0
GGGGTACCCC 10 >90 >90
CGGGGTACCCCG 12 >90 >90 Mlu I GACGCGTC 8 0 0
CGACGCGTCG 10 25 50 Nco I CCCATGGG 8 0 0
CATGCCATGGCATG 14 50 75
Nde I CCATATGG 8 0 0
CCCATATGGG 10 0 0
CGCCATATGGCG 12 0 0
GGGTTTCATATGAAACCC 18 0 0
GGAATTCCATATGGAATTCC 20 75 >90
GGGAATTCCATATGGAATTCCC 22 75 >90 Nhe I GGCTAGCC 8 0 0
CGGCTAGCCG 10 10 25
CTAGCTAGCTAG 12 10 50 Not I TTGCGGCCGCAA 12 0 0
ATTTGCGGCCGCTTTA 16 10 10
AAATATGCGGCCGCTATAAA 20 10 10
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT 24 25 90
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 28 25 >90 Nsi I TGCATGCATGCA 12 10 >90
CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 22 >90 >90 Pac I TTAATTAA 8 0 0
GTTAATTAAC 10 0 25
CCTTAATTAAGG 12 0 >90 Pme I GTTTAAAC 8 0 0
GGTTTAAACC 10 0 25
GGGTTTAAACCC 12 0 50
AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG 24 75 >90 Pst I GCTGCAGC 8 0 0
TGCACTGCAGTGCA 14 10 10
AACTGCAGAACCAATGCATTGG 22 >90 >90
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA 24 >90 >90
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 26 0 0 Pvu I CCGATCGG 8 0 0
ATCGATCGAT 10 10 25
TCGCGATCGCGA 12 0 10 Sac I CGAGCTCG 8 10 10 Sac II GCCGCGGC 8 0 0
TCCCCGCGGGGA 12 50 >90 Sal I GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC 28 0 0
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG 30 10 50
ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 32 10 75 Sca I GAGTACTC 8 10 25
AAAAGTACTTTT 12 75 75
Sma I CCCGGG 6 0 10
CCCCGGGG 8 0 10
CCCCCGGGGG 10 10 50
TCCCCCGGGGGA 12 >90 >90 Spe I GACTAGTC 8 10 >90
GGACTAGTCC 10 10 >90
CGGACTAGTCCG 12 0 50
CTAGACTAGTCTAG 14 0 50 Sph I GGCATGCC 8 0 0
CATGCATGCATG 12 0 25
ACATGCATGCATGT 14 10 50 Stu I AAGGCCTT 8 >90 >90
GAAGGCCTTC 10 >90 >90
AAAAGGCCTTTT 12 >90 >90 Xba I CTCTAGAG 8 0 0
GCTCTAGAGC 10 >90 >90
TGCTCTAGAGCA 12 75 >90
CTAGTCTAGACTAG 14 75 >90 Xho I CCTCGAGG 8 0 0
CCCTCGAGGG 10 10 25
CCGCTCGAGCGG 12 10 75 Xma I CCCCGGGG 8 0 0
CCCCCGGGGG 10 25 75
CCCCCCGGGGGG 12 50 >90
TCCCCCCGGGGGGA 14 >90 >90 最后附上介绍new England限制性内切酶技术资料的一个很好的网站
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/cleavage_olig.htm
限制酶位点与翻译工具
http://www.bio-soft.net/sms/rest_trans_map.html