范文一：大肠杆菌生长曲线的测定

(一)目的要求

1．通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线。

2．复习光电比浊法测量细菌数量的方法。

(二)基本原理

大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。 用于测定细菌细胞数量的方法已在上述实验作了介绍。本实验用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。也可以直接用试管或带有测定管的三角瓶(图15-5)测定“klett units”值的光度计。如图15—6所示，只要接种1支试管或1个带测定管的三角瓶，在不同的培养时间(横坐标)取样测定，以测得的klett units为纵坐标，便可很方便地绘制出细菌的生长曲线。如果需要，可根据公式1 klett units=OD/0.002换算出所测菌悬液的OD值。

(三)器材

1．菌种 大肠杆菌

2．培养基 LB液体培养基70ml，分装2支大试管(5ml/支)，剩余60ml装入250ml的三角瓶。

3．仪器或其他用具 722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。

(四)操作步骤

1．标记

取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接种

分别用5ml无菌吸管吸取2.5ml大肠杆菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有50ml LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。

3．培养

将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

4．比浊测定

用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。 本操作步骤也可用简便的方法代替：

1．用1ml无菌吸管取0.25ml大肠杆菌过夜培养液转入盛有3~5ml LB液的试管中、混匀后将试管直接插入分光光度计的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒将试管及比色暗室全部罩上，形成一个大的暗环境，另以1支盛有LB液但没有接种的试管调零点，测定样品中培养0h的OD值。测定完毕后，取出试管置37℃继续振荡培养。

2．分别在培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培养物试管按上述方法测定OD值。该方法准确度高、操作简便。但须注意的是使用的2支试管要很干净，其透光程度愈接近，测定的准确度愈高。

(五)实验报告

1．结果

(1)将测定的OD600值填入下表：

(2)绘制大肠杆菌的生长曲线

2．思考题

(1)如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同？两者各有什么优缺点？

(2)细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短？若细胞密度为103/ml，培养

4.5h后，其密度高达2×108/ml，计计算出其代时。

(3)次生代谢产物的大量积累在哪个时期？根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多？

范文二：大肠杆菌生长曲线的测定

大肠杆菌生长曲线的测定

蔡小鹏

(南京工业大学生物与制药工程学院制药1104班)

【摘要】通过比浊法对大肠杆菌生长曲线进行测定。因为细菌悬液的浓度与光密度成正比，所以可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌悬液的浓度。将培养12h的大肠杆菌进行发酵罐培养，在不同时间段取样，用分光光度计对大肠杆菌的生长曲线进行测定，测定结果显示:大肠杆菌生长曲线基本符合迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期4个时期。

【关键字】比浊法;发酵罐培养;生长曲线

大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。除某些菌型能引起腹泻外，一般不致病，能合成维生素B和K，对人体有益。大肠杆菌是肠杆菌科的一员，经常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究。 1实验材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌种

大肠杆菌

1.1.2培养基

1.1.2.1种子培养基

蛋白胨1%，酵母粉0.5%，Nacl0.8%，硫酸卡那霉素800μL/L(灭菌后同冻存管一起加入摇瓶)

在烧杯中加入1.5g/150mL蛋白胨、0.75g/150mL酵母粉、1.2g/mL Nacl, 再加入适量(少于150ml)的蒸馏水，搅拌使之充分溶解，再补充水定容至150ml，[1]保持自然PH。平均分装3瓶后，121?灭菌20min

1.1.2.2发酵培养基

在烧杯中加入6g/L蛋白胨、3g/L酵母粉、1.5g/L无水硫酸镁、0.013g/L无水氯化钙、5g/L硫酸铵、1.5g/L柠檬酸三钠、3g/L磷酸二氢钾、0.075g/L七水合硫酸亚铁，再加入适量的(少于1L)蒸馏水，搅拌使之充分溶解，再补充水定容至1L。121?灭菌20min。

1.2器材

超净工作台，高压灭菌锅，分光光度计，发酵罐及相应装置，摇床，移液枪，枪头，酒精灯，接种环，三角瓶，玻璃棒，烧杯

1.3接种

1.3.1种子培养基接种

选取单菌落生长明显的平板，用接种环挑取适量的菌落转移到灭过菌的种子培养基三角瓶中。

将接种好的种子培养基放到摇床中，200rpm/min转速，37?，培养12-14 h。 1.3.2发酵罐接种

将灭过菌的发酵液装入发酵罐中，安装好发酵罐。将三瓶种子液混合均匀，

向发酵罐中加入60mL种子液，再加入1mL硫酸卡那霉素和30g糖(已灭菌)。 1.4生长曲线的测定

1.4.1原理

在液体培养基中，微生物随着培养时间的增加而不断增加，逐渐使培养基混浊，这一变化，可以用分光光度计测定，并可根据不同的时间里测定的数值而做出该种微生物的生长曲线。

1.4.2方法及步骤

以未接菌的培养液作为空白，在分光光度计上调零点。

用分光光度计，从0时开始，每隔2h测定三角瓶培养液的光密度值(OD)，每次测定时以未接菌的培养液为空白对照调仪器零点、测定波长600nm。 以时间为横坐标，以OD值为纵坐标，制作曲线，即为细菌在该培养条件下的生长曲线。

2实验结果与分析

2.1大肠杆菌生长曲线的测定

按照1.4.2的方法测得大肠杆菌的生长曲线的结果见表1。以时间为横坐标，以OD值为纵坐标绘制的生长曲线图如图1所示。

表1大肠杆菌的生长曲线的测定结果

时间/h 0 2 4 6 8

OD 0.25 0.35 0.775 2.425 5.025 时间/h 10 12 14 16 18

OD 5.125 5.005 3.375 2.785 2.122

图1大肠杆菌生长曲线图

2.2糖浓度变化

表2糖浓度变化测定结果

时间/h 0 2 4 6 8 糖浓度g/L 30 27.5 26.85 22.3 14.7 时间/h 10 12 14 16 18 糖浓度 12.29 10.6 10 9.73 9.02 3结论

从大肠杆菌的生长曲线可以看出培养4h后各菌株基本进入对数期，8h左右菌液浓度达到峰值，12h左右菌液浓度开始下降。各菌株都经历了迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期4个时期，因而OD值可以反应细菌的生长曲线。

【参考文献】

[1]梁海曼. 高压灭菌对培养基成分的影响. 植物生理学通讯,1995(5):389-392. 本人贡献率

范文三：大肠杆菌生长曲线的测定

生长曲线是微生物在液体培养基中所表现出来的生长、繁殖的规律，不同的微生物表现为不

同的生长曲线，而即使是同一种微生物在不同培养条件下，其生长曲线也不同。因此测定微生物

的生长曲线对于了解，掌握微生物的生长规律是有帮助的。

由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此可利用光电比色计测定菌悬液的光密度来推知菌

液的浓度。本实验是以活菌计数法与光电比浊法相对应来测定大肠杆菌在不同培养条件下的生长

曲线，从而观察分析大肠杆菌在这些培养条件下的生长情况。

培养了20小时的大肠杆菌悬液；肉汤蛋白胨培养基（液体、固体）；浓缩的肉汤蛋白胨液体

培养基（浓缩5倍）；无菌酸溶液（甲酸：乙酸：乳酸＝3：1：1）。

1毫升及5毫升无菌吸管；无菌试管；无菌生理盐水；

无菌平皿；血球计数器；显微镜；光电比色计；无菌离心管；离心机等。

1．将经20小时培养的大肠杆菌培养物，倒入无菌离心管内离心（3000r.p.m×10），以无菌生理盐水洗涤三次后，制成约9亿毫升的菌悬液（用显微镜直接计数法），作为种子。上述过程

都必须注意严格无菌操作。

2．取盛有200毫升培养基经灭菌的三角瓶三瓶，分别标明A、B、C，按5%接种量，将上述种子接入，置37?振荡培养。在B瓶培养了4小时后取出，加入10毫升无菌酸溶液，然后 继续振荡培养。在C瓶培养了6小时后取出，加入10毫升无菌浓缩肉汤蛋白胨液，再继续振荡培

养。

3．间隔一定时间，即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20小时后，从A、B、C三角瓶中各取5毫升菌液放于无菌试管中，置冰浴。并作适当稀释，使菌悬液的光密度控制在0.0－0.4范围内，再置光电比色计中进行比浊测定（400－440毫微米波长），用未接种的肉汤蛋白胨液

为空白对照。记下光密度值。

另外，A管在比浊测定以前，以无菌操作吸取0.1毫升菌液于肉汤蛋白胨琼脂平板上，用玻

璃刮棒涂抹均匀后，置37?培养30小时后计数。

4．按间隔时间全部测完了以后，以菌悬液光密度值（O.D.）为纵坐标，培养时间为横坐标

再绘制一条A培养条件下的生长曲线。

1．比较A、B、C三组生长曲线有什么不同？说明原因，标出A组生长曲线的四个时期的位置及名称。

2．两条A生长曲线有什么不同？为什么？

范文四：大肠杆菌生长曲线

四川大学

化 学 实 验 报 告

课程名称 生 物 工 艺 学 实 验 课 程 号 309119060 学 院 轻 纺 与 食 品 学 院 专 业 轻工生物技术 学生姓名 赵凤佼 学 号 0843095035 指导教师 周荣清 成绩评定 实验日期 2011-06-20~2011-06-22

一、实验名称:大肠杆菌生长曲线的制作

二、实验目的:

1.通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生长特征与规律，绘制生长曲线。

2.掌握光电比浊法测量细菌数量的方法。

三、实验仪器及药品:

1.菌种:大肠杆菌。

2.培养基:LB培养基100ml，分装两支大试管(5ml/支)，剩余90ml装入250ml三角瓶。

3.仪器和其他药品:722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管和无菌吸管等。

四、基本原理:

在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次，将一定量的细菌转入新鲜培养液中，在适宜的培养条件下细胞要经历延迟期、对数期、稳定器和衰亡期4个阶段。以培养时间为横坐标，细菌数目的对数或生长速率为纵坐标所绘制的曲线成为该细菌的生长曲线。不同的细菌在在相同的培养条件下其生长曲线不同，同种细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不同。

当光线微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比;而光密度或透光度可以通过光电池精确测出。因此，可利用一系列菌悬液测定的光密度及其含菌量，做出光密度—菌数的标准曲线，然后根据样品液所测得的光密度，从标准曲线中查处对应的菌数。

本实验用分光光度计进行光电比浊，测定不同时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。

五、关键步骤及注意事项:

1.测定OD值时，要求从低浓度到高浓度测定

2.严格控制培养时间

1 / 4

六、操作步骤:

1.标记

取11支无菌试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。

2.接种

分别用5ml无菌吸管吸取2.5ml大肠杆菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有90mlLB培养液的三角瓶，混合均与后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌试管中。

3.培养

将已接种的试管置于摇床37?振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

4.比浊测定

用未接种的LB培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之间。

七、详细实验过程记录:

时间 实验进度要求 具体操作 备注 2011-06-20 分组(2人/组);准备、小试管3支，大试管3支，250ml三角 上午 清洗实验仪器。 瓶1个，5ml吸管3支，洗净干燥。 2011-06-20 准备、清洗实验仪器;(1)清洗仪器:6cm小培养皿8套，9cmLB培养基不加琼下午 配置LB培养基。 培养皿48套，4个150ml三角瓶+玻珠，脂。

5ml吸管1支，0.5ml吸管12支，1ml

吸管12支，洗净干燥。

(2) 配置1000mlLB培养基(5组用

量):蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCL10g，

蒸馏水1000ml，NaOH稀溶液调节PH至

7.0后，分装入250ml三角瓶封装，于

120?灭菌20min。

2011-06-20 一次接种。 取湿热灭菌后LB培养液分装2支试管 晚上 各5ml，一支接入E.coli斜面菌种，一

支做空白对照，静置培养。

2011-06-21 观察一次接种生长情用5ml无菌吸管吸取3 ml大肠杆菌过夜一次接种中接入上午 况;二次接种。 培养液(培养10~12h)转入盛有90mlLBE.coli的LB培

培养液的三角瓶，混合均与后分别取养液浑浊，未接

5ml混合液放入编号为1#~11#的11支种的对照组培养

无菌试管中，置于摇床37?振荡培养液澄清。

(振荡频率250r/min)。

2011-06-21 接种菌液分别培养0、按编号将各组相同培养时间编号的试 上午 ~ 1.5、3、4、6、8、10、管分组统一放置于摇床中，按时取出置2011-06-22 12、14、16、20h，将标于冰箱保存。

上午 有相应时间的试管取

出，立即放冰箱中贮存。

2011-06-22 光电比浊测定各培养时用未接种的LB培养基作空白对照，选 上午 间段的细菌培养液OD用600nm波长进行光电比浊测定。从早

2 / 4

值。 取出的培养液开始依次测定，对细胞密

度大的培养液用LB液体培养基适当稀

释后测定，使其光密度值在0.1~0.65

之间。

2011-07-04 整理实验数据，分析实

验结果，完成实验报告

撰写。

八、实验报告:

1.结果

(1)将测定的OD值填入表V-1:

表V-1 细菌培养液OD值测定结果

培养对照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20 时间/h

取出12:30 13:15 14:45 15:45 17:45 19:45 21:45 23:45 01:45 03:45 07:45 12:30

时间

OD值 0.048 0.094 0.278 0.504 0.533 0.723 0.773 1.065 1.217 1.291 1.160 0

(2)绘制大肠杆菌的生长曲线:见 。

大肠杆菌生长曲线

1.4

1.2

1

0.8系列1OD值0.6

0.4

0.2

0

0510152025

培养时间

图V-4

实验结果分析:

通过比浊测定法和稀释平板菌落计数法对大肠杆菌生长曲线进行了测定，测定结果显示:大肠杆菌生长曲线基本符合延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期的划分，但是与典型生长曲线存在明显差异，延缓期较短，稳定期延长到十小时以上。

本次试验因采用以培养10—12小时的大肠杆菌，故延迟期较短。在培养3小时之后进入对数期，生长速率逐渐增大，在培养15小时之后，菌数不再发生变化，进入稳定期。由于培养时期较短，故无衰亡期。

2.思考题

3 / 4

3个/ml，培养5小时(3)细菌生长繁殖所经历的4个时期中哪个时期的时代最短,若细胞密度为10

8候其密度高达2X10个/ml，计算出其代时。

答:对数生长期时间最短。细菌经过迟缓期进入对数生长期，并以最大速率生长和分裂，导致细菌数量呈对数增长，此时细菌生长呈平衡生长，即细胞内各成分按比例有规律的增加，所有细胞组分呈彼此相对稳定速度合成。对数生长期细菌的代谢活性及酶活性高而稳定，细胞大小比较一致，生活力强。

在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需时间为代时，以G表示。

细菌的比生长速率 μ=(lgNt-lgNo)/(t-to)×2.303=(8lg2-3)/ 5 ×2.303=2.4417h ?G=t-to lnNt-lnNo=μ(t1-to)

? G=(lnNt-lnNo)/μ=ln(Nt/No)/μ=(5+ln2)/ 2.4417=2.3316(h)

(4)次生代谢产物的大量积累在哪个时期,根据细菌生长规律，采用哪些措施可以使次生代谢产物积累更多,

答:稳定期次级代谢产物大量积累。由于营养物质消耗，代谢产物积累和PH等环境变化，环境条件逐步不适应细菌生长，导致细菌生长速率降低至零(即细菌增加的数量等于细菌死亡的数量)，对数生长期结束，进入稳定生长期。稳定生长期的活细菌数最高并维持稳定。如果及时采取措施，补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等可以延长稳定生长期，获得更多的菌体物质或代谢产物。

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范文五：重组大肠杆菌DH5_生长曲线的测定

收稿日期 :2010-01-17; 修回日期 :2010-05-14

基金项目 :江苏省博士后科研资 助项目 (2009); 扬州大 学科技 创新培育基金项目 (2009CX J032)

, .

重组大肠杆菌 D H 5 生长曲线的测定

王升智 , 高 波 , 周智慧 , 周辉云 , 吴 晗 , 岑 宁

(扬州大学 动物科学与技术学院 , 江苏 扬州 225009)

中图分类号 :S852. 61

文献标识码 :B

文章编号 :1004-7034(2010) 11-0096-03

关键词 :重组大肠杆菌 DH 5 ; OD 600值 ; 生长曲线 ; 质粒 DNA

摘 要 :为了探讨重组大肠杆菌适宜的培养时间 , 试验将携带质粒的重组大肠杆菌 DH 5 单菌落液体 培养至 OD 600值为 0. 6左右 , 按一定比例接种于 LB 液体培养基中进行培养 , 分别在 0, 1. 5, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20小时时取菌液 , 用分光光度计测定 OD 600值 , 以培养时间为横坐标 、 OD 600值为纵坐 标作重组菌生长曲线图 , 同时提取质粒比较不同培养时间质粒量的变化 。 结果表明 :重组大肠杆菌 DH 5 的生长经历了迟缓期 、 对数期 、 稳定期 、 衰亡期 4个时期 , 符合细菌生长的规律 ; 重组大肠杆菌 生长至平台期时提取质粒的量最多 。

大肠杆菌 DH 5 是大肠杆菌的一种菌株 , 由于其 转化率高 , 是基因工程中最常用的宿主菌之一 , 常用 于分子克隆、 质粒提取和蛋白质的表达 , 但 DH 5 在

基本培养基中生长缓慢 [1]

。生长曲线是描述生物生

长的一种特殊的曲线 [2]

, 以细 菌的培养时间为横 坐 标、 其数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的 曲线称为该细菌的生长曲线。生长曲线是细菌在液 体培养基中所表现出来的生长、 繁殖的规律 , 不同的 细菌在相同的培养条件下生长曲线不同 , 即使是同一 种细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不 相同。因此 , 测定细菌的生长曲线 , 了解其生长繁殖 规律 , 对人们根据不同需要有效地利用和控制细菌生 长具有重要意义。测定微生物生长曲线的方法有很 多 , 有血细胞计数法、 平板菌落计数法、 称重法、 比浊 法等。其中 , 比浊法测定细菌生长曲线的原理是细菌 悬浮液的浓度与悬浮液的混浊程度成正比 , 因此可利 用光电比色计测定细菌悬浮液的 OD 值来推测菌液 的浓度 , 并用所得的 OD 值与对应的培养时间作图 , 即可绘出该细菌在一定条件下的生长曲线。

试验通过光电比浊 法测定重组大肠杆菌 DH 5 的生长曲线 , 并检测不同培养时 间其所携带的质 粒 DNA 量的变化 , 以期为分子克隆中重组菌培养 时间 的设定提供参考依据。 1 材料与方法 1. 1 材料

携带质粒 pc DAN3. 0的重组大肠杆菌 DH 5 , 扬

州大学分子生物学实验室保存。 1. 2 培养基与试剂

LB 液体培养基 :胰蛋白胨 2. 5g 、 酵母粉 1. 25g 、 N a C l 2. 5g , 加纯化水 200mL 溶 解 , 调 p H 值至 7. 4左右 (用 p H 值试纸比色 ), 定容至 250mL, 于高压蒸 气灭菌锅内 121 灭菌 20m i n 。

LB 固体培养基 :胰蛋白胨 2. 5g 、 酵母粉 1. 25g 、 N a C l 2. 5g 、 琼脂粉 2. 5g , 加纯化水 200mL 溶解 , 调 pH 值 至 7. 4左 右 (用 pH 值 试 纸 比 色 ), 定 容 至 250mL , 于高压蒸气灭菌锅内 121 灭菌 20m in 。

含氨苄西林的培养基 :将氨苄西林 (浓度为 5%) 加入冷却至 30 左右的液体培养基和固体培养基 中 , 混匀 , 使其工作浓度为 0. 5 。固体培养基立即 铺平板 , 4 保存。

质粒 DNA 提取 试剂 :溶液 (50mm o l/L葡萄 糖 , 25mm o l/LTris-C , l 10mm ol/LEDTA, p H 值为 8. 0) 、 溶液 (0. 4m ol/LNa OH 与 2%SDS 等体积混 合 ) 和溶液 (乙酸钾 147. 2g , 冰乙酸 57. 5m L , 加纯 化水定容至 500mL , 调 p H 值至 4. 8), 4 保存。

TE 缓冲液 :100mm o l/LTris-C , l 10mm o l/LED-TA, pH 值为 8. 0, 121 高压蒸气灭菌 20m in 。 1. 3 方法 1. 3. 1 重组大肠杆菌 DH 5 的复苏及 初培养 将 -70 冻存的重组大肠杆菌划线接种于含氨苄西林 的 L 固体培养基上 , 于 37 恒温培养箱中培养 12~16h 。从平板上挑取单个菌落接种于 20mL 含氨苄 西林的 LB 液体培养基中 , 于 37 、 200r /min 的摇床 中培养至 OD 600值为 0. 6左右。 1. 3. 2 重组大肠 杆菌 DH 5 的转接 种 取 13支 25mL 试管 , 每支加入 6mL LB 液体培养基 , 按 1︰ 600. 6H e il ong jiang An i m a l Sc i ence

兽医科技 2010年 11月 (上 )

接种到 12支试管中 , 1支不接种 , 作为阴性对照。将

13支试管于 37 、 200r /min 的恒温摇床中培养。

1. 3. 3 菌液 OD 600值的测定 分别于培养的 0, 1. 5,

3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20小时时取出 4mL 菌液

测定 OD 600值 , 每个时间点重复测定 3次。

1. 3. 4 质粒的提取 将试管中剩下的 2mL 菌液用 碱裂解法提取质粒 , 再通过琼脂糖凝胶电泳检测。 1. 3. 5 重组大肠杆菌 DH 5 生长曲线的绘制 以重 组大肠杆菌 DH 5 菌液培养时间为横坐标 , 所测菌液 的平均 OD 600值为纵坐标 , 绘出重组大肠杆菌 DH 5 的生长曲线。

2 结果与分析

2. 1 不同培养时间重组大肠杆菌 DH 5 的 OD 600值 测得培养 0, 1. 5, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20h 的重组大肠杆菌 DH 5 及阴性对照组的 OD 600值 , 每 个时间点测 3次 , 结果见表 1。

表 1 重组大肠杆菌 DH 5 不同培 养时间的 OD

600

值 项目

培养 时间 /h

01. 53468101214161820 0. 0140. 0660. 1960. 3620. 8681. 2581. 2721. 3631. 2981. 2731. 1921. 016 OD 600值 0. 0150. 0680. 1980. 3630. 8701. 2571. 2701. 3691. 2981. 2721. 1901. 018 0. 0120. 0670. 1980. 3640. 8691. 2601. 2711. 3671. 2991. 2731. 1941. 019 由于细菌悬液的浓度与混浊度呈正比 , 因此测得

的 OD

600

值可以反映出菌液的密度 , 密度越大 , 说明生 长的细菌越多。由表 1可以看出 , 随着培养时间的延 长 OD 600值先增大 , 后又逐渐减小 , 说明重组大肠杆菌 DH 5 菌悬液中的细菌总数随着培养时间的延 长经 历了一个先增多、 后减少的过程。试验设立了阴性对 照组 , 其 OD 600值为 0, 这就排除了外界杂菌生长的可 能性 , 消除了干扰因素。

用 SPSS 统计软件进行单因素方差分析 , 结果以 平均值 标准差表示 , 见表 2。

表 2 重组大肠杆菌 DH 5 不同培 养时间的 OD

600

值 间的差异分析

培养时间 /hOD 600值 培养时间 /hOD 600值 00. 014A 0. 002101. 271G 0. 001 1. 50. 670B 0. 001121. 366H 0. 003 30. 197C 0. 001141. 298I 0. 001 40. 363D 0. 001161.

272G 0. 002 60. 869E 0. 001181. 192J 0. 002 81. 258F 0. 002201. 018K 0. 002 注 :同列数据肩标大写字 母不同 表示差 异极显 著 (P <0. 01);="" 相="" 同表示差异不显著="" (p="">0. 05) 。

由表 2可以看出 , 除了培养的第 10小时和第 16小时之间差异不显著外 , 其他各时间点所测 OD 600值

2. 2 重组大肠杆菌 DH 5 的生长曲线

以重组大肠杆菌 DH 5 菌液培养的时间为横坐 标 , 以各时间点所测得菌液的平均 OD 600值为纵坐标 , 绘制出重组大肠杆菌 DH 5 的生长曲线 , 见图 1。

图 1 重组大肠杆菌 DH 5 的生长曲线图

从图 1可以看出 , 重组大肠杆菌 DH 5 生长的 4个时期区分非常明显。 0~3h 为迟缓期 , 重组大肠 杆菌适应新的环境 , 繁殖的速度很慢 ; 4~9h 为对数 生长期 , 此时营养物质很充分 , 重组大肠杆菌呈对数 快速增长 ; 10~16h 为稳定期 , 由于培养基中的营养 物质不断地被消耗掉 , 重组大肠杆菌新陈代谢产生的 毒性物质的积累以及 pH 值下降等因素的影响 , 重组 大肠杆菌繁殖的速度逐渐下降 , 而死亡的细菌数开始 逐渐增加 , 增殖数与死亡数渐趋平衡 , 细菌总数处于 稳定的状态 ; 17~20h 为衰亡期 , 由于营养物质逐渐 减少 , 而毒性物质越来越多 , 重组大肠杆菌的繁殖速 度就逐渐减缓 , 死亡菌数明显增多 , 衰亡的速度超过 繁殖的速度 , 细菌总数就呈现下降趋势。

2. 3 质粒 DNA 琼脂糖凝胶电泳的检测

取培养不同时间的重组菌液 1mL, 采用标准碱 裂解法小量提取 质粒 pcDNA3. 0, 质粒 DNA 溶解于 20 L TE 缓冲液中 , 各取 5 L 样品用 0. 8%琼脂糖 凝胶进行检测 , 用凝胶成像系统拍照 , 结果见图 2。

M. -H i nd d i gestM arker ; 1~12. 培养时间分别为 1, 1. 5, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20h 。

图 2 pcDNA 3. 0质粒 DNA 电泳结果

电泳图片上条带的亮度和大小可以反映出所提 取质粒量的多少 , 而所提取质粒量的多少又可以反映 出携带这种质粒的细菌增殖的多少。从图 1可以看 出 :培养 0~1. 5h 内没有出现条带 , 从培养的第 3小 时才开始出现明显的条带 , 随着培养时间延长 , 条带 ; 16; 97

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兽医科技

18小时开始 , 条带亮度开始逐渐减小。此结果 与重 组大肠杆菌 DH 5 生 长所表现出来的迟缓、 对 数生 长、 稳定和衰亡 4个生长时期相一致。 3 讨论

一定数量的细菌接种于合适的液体培养基中 , 在 适宜的温度下培养时 , 其生长过 程具有一定的规 律 性。试验将重组大肠杆菌 DH 5 接种于 LB 液体 培 养基 , 于 37 培养 , 其生长也符合这一规律 , 经历了 迟缓、 对数生长、 稳定、 衰亡 4个生长时期 , 该结果与

饶可扬 [3]

的结论相一致。

本次试验中 , 对质粒 pc DNA 3. 0进行小提定量 , 根据电泳图中质粒超螺旋条带的亮度也可以看出重 组大肠杆菌 DH 5 的生长经历迟缓、 对数生长、 稳定、 衰亡 4个时期 , 与绘制的生长曲线图所得出的结论也 是相一致的。

大肠杆菌的生长繁殖速度较快 , 17~30m i n 即可 繁殖 1代 , 故生长至高峰期所需 时间较其他细菌 要 短。此次试验结果表明 , 重组大肠杆菌 DH 5 生长的 迟缓期约为 1. 5h , 对数生长期为 5h , 稳定期为 6h , 从开始生长到生长高峰期大约需 6. 5h 。

大肠杆菌 DH 5 的细菌总数虽然是在稳定期最 多 , 但是在对数生长期细菌形态、 生物活性都很典型 , 对外界环境因素的作用敏感 , 因此研究细菌性状或是

做质粒的转化时选择此时期最好。例如抗生素作用 对该时期的细菌效果最佳。

大肠杆菌 DH 5 是实验室常规试验经常用到的 细菌 , 常用于分子克隆、 质粒提取和蛋白质表达。而 在重组大肠杆菌的培养过程中 , 掌握其培养时间是很 重要的。培养时间过长或过短都会影响质粒提取的 效果。通过此次试验可以看出 , 培养时间一般应控制 12~14h 。因为此时重组大肠杆菌处于稳定时期 , 细 菌总数是最多的 , 其所携带质粒的量也是最多的。 4 结论

(1) 重组大肠杆菌 DH 5 的生长周期经历迟缓 期、 对数生长期、 稳定期、 衰亡期 4个阶段。培养 0~3h 为迟缓期 , 4~9h 为对数生长期 , 10~16h 为稳 定期 , 17~20h 为衰亡期。

(2) 重组大肠 杆菌 培养 至 12~16h 可使 质粒 DNA 的量最多 , 提示此阶段提取质粒较为适宜。 参考文献 :

[1] 张晓云 , 张艳军 , 李志敏 , 等 . 腺嘌呤对大肠杆菌 DH 5 及其耐乙

酸突变株 DA19生长 和代谢 的影 响 [J ].微 生物 学报 , 2007, 47(3):430-434.

[2] 王 宏伟 . 生 长曲 线预 测新 模型 [J ].中 州大 学学 报 , 1994(2):

74-78.

[3] 饶可扬 . 大肠杆菌生长曲线测定实 验方案的改进 [J].大 连教育

学院学报 , 1995(1):109-110.

(009)

收稿日期 :2010-01-23; 修回日期 :2010-03-02

基金项目 :江苏畜牧兽医职业技术学院院级助农项目 (ZN 2009042)

, .

海安县鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定及

多价灭活苗的研制

刘明生 1, 2

, 甘辉群 1

, 陆桂平 1

, 徐小琴 1

, 王 涛 1

, 徐 勇

2

(1. 江苏畜牧兽医职业技术学院 , 江苏 泰州 225300; 2. 南通市苏鹏禽业有限公司 , 江苏 海安 226661)

中图分类号 :S852. 61

文献标识码 :B

文章编号 :1004-7034(2010) 11-0098-03

关键词 :鸡 ; 大肠杆菌 ; 分离鉴定 ; 多价灭活苗

摘 要 :为了确定海安县鸡大肠杆菌 病的病原并研制多 价灭活苗 , 试验对从海安县 兽医站门诊及 12个大型养殖场具有疑似大肠杆菌病病变的 252只病死鸡进行了病原分离及鉴定 。 结果表明 :共分 离 、 鉴定出大肠 杆菌 226株 , 定 型 198株 ; 共测 出 23个血 清型 , 其中 O 78(32株 ) 、 O 18(26株 ) 、 O 2(21株 ) 、 O 88(17株 ) 、 O 1(13株 ) 、 O 11(10株 ) 6种血清型占定型菌株的 60. 1%, 为海安县大肠杆菌优 势血清型 ; 将此 6种优势血清型大肠杆菌制成多价灭活苗免疫雏鸡 , 安全性好 , 保护率高 。 大肠杆菌是家禽最常见的病原菌之一 , 近几年鸡 大肠杆菌病的流行愈加迅速。国内许多地方开展了

相关的调查研究 , 累计报道能致病的血清型有 60多 种 , 且不同地区差别很大。由于大肠 杆菌血清型众 多 , 给防治工作带来了极大困难。因此 , 国内外一致 认为用当地分离株制苗的预防效果最佳。笔者从当 地采集的 252份病料中分离、 鉴定出 226株鸡致病性 大肠杆菌 , 经过血清型鉴定共有 23个血清型 , 用其中

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H e il ong jiang An i m a l Sc i ence

and V ete ri nary M ed ici ne

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