范文一：化能自养细菌分离纯化

化能自养微生物的分离与纯化 一、实验目的

1. 学习土壤中采样、富集培养、分离纯化硝化细菌。

2. 学习硅胶平板制备，了解培养硝化细菌的培养基制备和培养方法。 二、实验原理

硝化细菌是化能自养菌类群中主要类群之一。包括亚硝化细菌和硝化细菌(或称亚硝酸氧化细菌) 两个亚群。

培养硝化菌的温度，因菌源而异，从中温环境下分离的菌株，最适生长温度为26～28℃，从高温环境下分离的菌株，40℃下生长良好。 三、实验材料

1. 菌源土样 合成氨车间周围和堆放合成氨场地周围土样。

2. 培养基 硝化细菌增殖培养基，硝化细菌分离培养基（见附录Ⅲ），牛肉膏蛋白胨培养基，马丁培养基，马铃薯葡萄糖培养基。 3. 试剂 格里斯氏试剂（亚硝酸盐试剂），二苯胺－硫酸试剂（硝酸盐试剂），见附录Ⅲ。

4. 其他物品 无菌水，无菌培养皿，无菌移液管，无菌微口滴管，无菌玻璃涂棒，透析袋，比色板，培养箱等。 四、实验内容 1. 采样

采集土样，选合成氨车间和堆放合成氨场地周围土样。 2. 富集培养

称取土样1 g，接入到盛有20 mL硝化细菌增殖培养液的250 mL锥形瓶中，28℃振荡培养10～14d ，每隔几天在白磁板上分别加2～3滴格里斯氏试剂及二苯胺-硫酸试剂，然后用无菌滴管取出1滴增殖培养液的培养物加于上面两试剂中，搅和均匀。检查增殖培养液中NO2-的减少（溶液由红色、粉红色变为无色）和NO3-的形成（NO3-氧化二苯胺的特有反应，溶液由无色变为深蓝色）。 3. 分离纯化

取富集培养液，通CO2气体30 min，然后静置30 min，再通过硅胶平板分离法进行分离纯化。

①制取硅胶平板 取等体积的盐酸(HCl比重1.09) 和硅酸钠(比重1.10) 溶液，徐徐加入，缓慢混合，均匀搅拌，分装于100～200mL 透析袋中，蒸馏水中透析48 h，其间换蒸馏水6～8次，待透析袋内的硅酸钠溶液无色透明后，高压蒸汽灭菌或过滤除菌。吸取预先配制并已灭菌的硝化细菌分离培养基1mL 、硅酸钠溶液10mL 于无菌培养皿内，静置片刻，待凝固后即可使用。

②硅胶平板分离 采用涂布分离法。取0.1～0.2mL 富集培养液滴于5～10个硝化细菌分离培养基硅胶平板上，涂布分离。然后将硅胶平板放在盛有少量水的干燥器里(防止水分蒸发，避免硅胶平板干裂) ，于28℃恒温下培养3～4周，当硅胶平板上出现硝化细菌极小的菌落后(多数菌落小于100μm) ，挑取10～20个单菌落，分别接种到硝化细菌增殖培养液中，28℃恒温下培养3～4周，依前述方法检验NO2-及NO3-。 4. 纯度检查

硝化细菌培养过程常会有异养型细菌伴生，所以必须用多种有机营养培养基检查培养物是否有异养菌污染。常用的有机营养培养基是：牛肉膏蛋白胨培养基检查异养型细菌，马丁氏琼脂培养基检查霉菌，马铃薯葡萄糖培养基检查酵母菌。 5. 镜检

对分离纯化的硝化细菌进行镜检及革兰氏染色。常见的硝化细菌特征见表2-5所示。 表2-5 常见的硝化细菌 属 硝化杆菌属 硝化球菌属 硝化刺细菌属 五、实验报告

1. 记录硝化细菌的分离方法及培养条件于下表2-6。 2 .分离、纯化硝化细菌菌株的记录于表2-7。 表2-6硝化细菌分离方法及培养条件 样品来源

分离方法

稀释度

培养基名称

培养温度

培养条件

细胞形态

短杆状、梨形或球形 球形

细长直感状、球形

鞭毛

单鞭毛，通常不运动 偏端鞭毛，运动 不运动

革兰氏染色结果 G- G- G-

表2-7分离、纯化硝化细菌菌株的记录 菌株编号

分离培养基

菌落特征

镜检结果

范文二：化能自养细菌Calvin循环相关基因的组织和调节研究进展_cropped

( ) 应用与环境生物学报 2006 , 12 4 : 589 ,594

C h in J A pp l E n viron B io l = ISSN 1006 2687X 2006 208 225

化能自养细菌 Calvin循环相关基因

3

的组织和调节研究进展

3 3 董 微 李大平

()中国科学院成都生物研究所 成都 610041

摘 要 Ca lvin循环是化能自养细菌同化 CO的主要途径 . 该循环大多数酶由 cbb基因编码 . 除保守的内在基因排列 2

次序外 ,不同化能自养细菌 cbb基因簇在基因大小和操纵子结构上存在差异 . 兼性化能自养菌 cbb操纵子比专性化能 自养菌受到更严格的调控 ,其调控作用主要由位于 cbb操纵子上游编码 L ysR 家族转录激活蛋白的 cbbR 基因执行 . 最 近的研究表明 ,另外一些蛋白因子也可能参与 cbb基因调控 . 尽管操纵子调控元件接收到的代谢信号仍是未知的 ,但一 般认为细胞的氧化还原状态起着关键作用 . 推测 cbb操纵子的表达调控整合于一个调控网络中 . 图 2 参 58 关键词 化能自养细菌 ; Ca lvin循环 ; cbb基因 ; CO同化 ; 调节 2

CL C Q936

Progre ss in O rgan iza t ion an d Regu la t ion of Ca lv in 2Ben son 2Ba ssham C yc le Gen e s

3in C hem oa u to troph ic Ba c ter ia 3 3DON G W e i & L I D ap ing

( )Chengdu Institu te of B iology, Ch inese A cadem y of S ciences, Chengdu 610041 , Ch ina

A b stra c t COfixa tion in the chemoau to trop h ic bac te ria occu rs via the Ca lvin2B en son2B a ssham cyc le, and mo st of the enzym e s 2

of the cyc le a re encoded by cbb gene s. The cbb gene c lu ste rs of va riou s bac te ria a re d iffe ren t in size and op e ron o rgan iza tion ex2 cep t the con se rva tive in te rna l gene a rrangem en t. The cbb op e ron s of facu lta tive chemoau to trop h ic bac te ria a re regu la ted mo re stric tly than tho se of ob liga te chemoau to trop h ic one s. A nd cbbR gene, wh ich is typ ica lly loca ted up stream of the regu la ted cbb op e ron, encode s a tran sc rip tiona l ac tiva to r of the L ysR fam ily and p lays an impo rtan t ro le in regu la tion of cbb gene s. A dd itiona l regu la to ry p ro te in s m ay a lso be invo lved. A lthough the m e tabo lic signa l rece ived by the regu la to ry componen ts of the op e ron s is still unknown, the redox sta te of ce ll is be lieved to p lay a key ro le. It is suppo sed tha t the regu la tion of cbb op e ron exp re ssion is in tegra ted in to a regu la to ry ne two rk. F ig 2 , R ef 58

Keyword s chemoau to trop h ic bac te ria; Ca lvin cyc le; cbb gene s; COa ssim ila tion; regu la tion 2

CL C Q936

[ 3 ] ( ) 机制 . 已知的碳还原途径包括戊糖磷酸循环 Ca lvin循环 、 CO. 其中 ,生物圈有机碳的形成主要基于自养生物同化 2[ 4 ] [ 5 ][ 6 ] 三羧酸循环 、羟基丙酸甲酯循环 和乙酰辅酶 A 途径 . 其 化能自养菌在 CO同化中起次要作用 . 但在植物不能生长的特 2中 , Ca lvin循环是化能自养细菌固定 CO的主要途径 . 2殊环境下 ,自养细菌固定 CO的作用就不可低估了 . 而且自养 2

过去二十多年在分子遗传学上的研究进展让探寻控制自细菌基因结构组织简单 ,是研究 CO固定相关基因的结构 、功 2

能 、表达调控以及构建基因工程菌的良好材料 ,在有效利用碳. 这种研究已在通过 Ca lvin循环固定 CO 养代谢机制成为可能 2 资源以及预防“温 室 效 应 ”等 方 面 具 有 重 大 的 理 论 和 实 际 意 的多种化能 自 养 细 菌 中 进 行 . 继 Tab ita FR 和 Ku sian B 的 综 [ 1, 2 ] 义 . 同时 ,由于化能自养细菌的生长和代谢需要一些特殊 [ 7, 8 ] 述 之后 ,有关 化 能 自 养 细 菌 固 定 CO的 文 章 可 谓 层 出 不 + - 2( ) 化 合 物 , 如 H、还 原 态 的 氮 化 合 物 NH、NO、硫 化 物 2 4 2 穷 ,但最近几年鲜见相关综述 . 本文将对化能自养细菌 Ca lvin2 - 2 + 2 + ( ( ( ) ) SO、HS、金 属 化 合 物 Fe 、M n 和 碳 化 合 物 CO、 2 3 2 循环相关基因的组织及其调节的最新进展进行总结 . )CH、CHOH 等作电子供体 , 从而在环境 、能源等多个领域倍 4 3

受关注 . 因此 ,化能自养细菌 CO同化基因的结构及表达调控 2

的研究逐渐成为一大热点 .1 化能自养细菌 cbb 基因的组织和基 在进化过程中 ,不同类群自养生物发展出不同的 CO同化2 因组定位

收稿日期 : 2006 204 207 接受日期 : 2006 204 221 ( ) 除了 1 , 5 2二磷酸核酮糖 羧化酶 /加氧酶 R ub isCO 、磷酸( ) 3 中国科学院知识创新重要方向项目 KSCX2 2SW 2114 资助 Suppo r2 ( )( ) 核酮糖激酶 PR K和景天庚酮糖 21 , 7 2二磷酸酯酶 FB P催化 ted by the Know ledge Innova tion P ro jec t of the Ch ine se A cadem y of Sc i2 的反应外 , Ca lvin循环的其余 10 个反应也与异养和兼性自养 ( )ence s KSCX2 2SW 2114

( ) 3 3 通讯作者 Co rre spond ing au tho r E2m a il: L idp @ cib. ac. cn的主要碳代谢有关 . 为避免基因名称含混不清 , Tab ita等人建

[ 9 ] 转录表达中具调节作用的基因 . 几个代表性化能自养细菌中的 议对该循环中 的 酶 基 因 使 用 统 一 术 语 . 用 cbb 表 示 编 码 与

Ca lvin循环功能相关或推测可能相关的酶与产物 ,以及在 cbbcbb基因操纵子及其相关基因的组织结构如图 1所示 .

[ 10 ] 图 1 部分代表性化能自养细菌 cbb基因的组织结构 [ 10 ]F ig. 1 O rgan iza tion of cbb gene s in som e rep resen ta tive chemoau to trop h ic bac te ria

) (基因及其产物的名称 : cbbR , CbbR L ysR 型转录激活蛋白 ; cbbLS ,分别编码 ?型 R ub isCO 的大小亚基 ; cbbM , ?型 R ub isCO; cbbE , PPE; cbbF , FB P / SB P; cbbP , PR K; cbbT , TKT; cbbZ , PGP; cbbG和 gap, GA P; cbbK和 pgk, PGK; cbbA , FBA / SBA; cbbB ,类甲酸盐脱氢酶基因. cbbX、cbbQ 和 cbbY 基因产物可能与 Ca lvin循环有关. 下标 c和 p 分别代表 R a lston ia eu tropha H16 cbb基因的染色体和质粒位点. 非功能基因用断开的箭头表示

() D e signa tion s of gene s and the ir p roduc ts: cbbR , CbbR L ysR 2typ e tran sc rip tiona l ac tiva to r; cbbLS , la rge and sm a ll subun it of fo rm ? R ub isCO , re sp ec tive2 ly; cbbM , fo rm ? R ub isCO; cbbE, PPE; cbbF, FB P / SB P; cbbP, PR K; cbbT, TKT; cbbZ , PGP; cbbG and gap, GA P; cbbK and pgk, PGK; cbbA , FBA / SBA; cbbB , fo rm a te dehyd rogena se2like gene. The func tion s of cbbX , cbbQ and cbbY gene p roducts a re po ssib ly re lated to the Ca lvin cycle. Ind ice s c and p refe r to ch romo som a l and p la sm id location s, re sp ec tive ly, of the cbb genes in R a lston ia eu tropha H16. Non2func tiona l genes a re ind ica ted by b roken a rrow s

( ) ) ( 在化能自养细菌中 ,兼性氢氧化和甲酸盐氧化细菌 R a lsto2 ,编码 R ub isCO 大亚基 cbbL 及 PR K cbbP 的基因在好 例如

() n ia eu tropha H16 之前被称为 A lca ligenes eu trophus H16 的 cbb氧 CO 氧化细菌 O. ca rboxydovorans OM 5 中以一个拷贝在染色 [ 11 ] [ 24 ] 基因位于染色体和大质粒 pH G1 两个不同的 复制子上 . 转 体 、另一个拷贝在质粒 pHCG3 上的方式被复制 . 在亚硝酸 移性质粒 pH G1 大 约 450 kb, 有 与 cbb 相 邻 的 氢 氧 化 体 系 基 氧化 菌 N itrobacter vu lga ris T3 发 现 了 两 个 不 相 连 的 cbb 基 因 [ 12 ] [ 25 ] () . 染色体簇 13 个基因 从 cbbB 到 cbbL 和质粒簇 12 个因 簇 . 尽管 N. vu lga ris的基因组 cbbR 2cbbLS 和 cbbFP 的典 型 c c

()() 基因 从 cbbA到 cbbL的相对定位是相同的 图 1,并分别形 排列是保守的 ,其组织结构与 R. eu tropha 和 X. f lavus基因簇 pp

))( ( 成 15. 2 kb cbb操纵子 和 12. 8 kb cbb操纵子 两个独立转 仅有部分相似性 . 不过 ,仅凭部分序列信息去 假设 cbbLS 上游 cp[ 13 ] 完整的 cbbR 为时尚早 . 在分析 cbbFPA 基因簇相关的反向 cbbF录单位 . 从 调 节 基 因 cbbR 到 cbbA 所 延 伸 的 区 域 平 均 有[ 13, 14 , 18 ] 93 %的核苷酸同源性 . 如此之高的同源程度暗示这两 上游序列时 ,也 发 现 与 cbbR 基 因 的 同 源 之 处 . 其 多 肽 产 物 与个簇可能起源于一次基因复制事件 . 另外 ,染色体簇至少包括 CbbR 蛋白的同源性分别与 3 个阅读框相关 ,表明该位点可能 一个附加基因 ———位于 cbbA 下游 的 cbbB ———编码未 知功能 cc 存在非功能 cbbR 拷贝 . [ 19 ] 的类甲酸盐脱氢酶蛋白 . 首次在 R. eu tropha H16 发现的反 有的化能自养菌则只有一个 cbb基因簇 . 如氢氧化菌 A ci2[ 20 ] 向调节基因 cbbR ,在染色体簇中形成一个单亚基操纵子 .( ) dovorax facilis 1990年前被称为 Pseudom onas facilisK仅在质 Ku sian B 等人认为 ,位于 cbbLS 下游的 cbbX 和 cbbY 基因

粒 pH G22 2a上携带 cbb 基 因 , 同 一 种 类 的 J 菌 株 只 有 染 色 体 单独或同时失活 ,既不限制操纵子其余基因的表达也不影响突 [ 15 ] [ 26 ] 变体的自养生长能力 . 但最近的研究发现 ,敲除化能自养细 cbb基因 . 尽管如此 , X. f lavus H4214定位在染色体上的 cbb [ 21 ] [ 22 ]菌 X an thobacter f lavus、O ligotropha ca rbox idovorans和 S ino2 基因簇至少包含 7个 Ca lvin循环酶基因 ,其排列与 R. eu tropha[ 23 ] rh izobium m eliloticbb操纵子 cbbLS 下游的 cbbX 基因 能造成 [ 21, 27 ] H16相应 的 基 因 基 本 相 似 . 分 别 编 码 X. f lavus GA P 和自养特性丢失 . 对 R. eu tropha cbb启动子远端区域的序列分析 PGK的 gap和 pgk基因同属一个操纵子 ,但并未与 cbb基因簇发现了两个开放阅读框 ,分别是编码转羟乙醛酶的 cbbT 和编 [ 28 ] 相连 .码磷酸乙醇酸磷酸酶的 cbbZ ,它们位于 cbb操纵子内的等效位

点 . 通过与已知序列的比较 ,尚未发现 cbbT序列与 cbbZ有显著 同时 ,在 嗜 热 氢 氧 化 菌 Pseudom onas hyd rogenotherm oph ila

TH 21 cbbLS 基因下游发现一个编码 267 个氨基酸的开放阅读

框 ,被命名为 cbbQ. 这个未知功能的 新基因与 R. eu trophus和 [ 16 ] X. f lavus cbbLS 下 游 的 cbbX 并 无 同 源 性 , 而 与 Pseudom onas 的同源性 . 尽管 H16 质粒 pH G1 上的 cbbZ 未表达 ,但已在p

aerug inosa和 P. stu tzeri反硝化基因簇的 n irQ 基因具有很高的R. eu tropha基因水平证实了 cbbZ与自养碳氧化和还原途径的 p[ 29 ] [ 30 ] 代谢相关 . 有趣的是 , cbbY与 cbbZ 基因产物表现出明显的同源同源性 ,n irQ 在功能上可取代 cbbQ . 目前已知唯一一个[ 16 ] 拥有 3套 R ub isCO 基因的专性自养氢硫氧化菌 H yd rogenovibrio 性 .

m a rinus的 cbbQ 2m 基因位于 cbbM 下游 ,表现出与其它 cbbQ 基有的化能自养菌与 R. eu tropha 相似 ,具两个 cbb基因簇 .

4 期 董 微等 : 化能自养细菌 Ca lvin循环相关基因的组织和调节研究进展 591

[ 31 ] 调控方面研究得最透彻的化能自养菌. R. eu tropha H16的两个 因和反硝化细菌 n irQ / norQ 基因很高的同源性 . 对 cbbQ 和

()n irQ / no rQ 的系统分析表明 ,与 n irQ 和 norQ 基因相比 , H. m a2 cbb操纵子在以 H作能源和有机自养 甲酸盐 生长细胞中均能 2[ 20 ] rinus的 cbbQ 2m 基因与 Th iobacillus in term ed ius和 T. neapolitan2 高表达 . 少数包含果糖和柠檬酸盐的底物引起部分去阻遏 , [ 32 ] [ 37 ] nus的 cbbQ 基因同源性更高 . 最高可达正常自养表达水平的三分之一左右 . 引起异养去阻

此外 ,还对其他很多化能自养菌的 cbb基因组织结构进行 遏底物的一个有趣特征是 ,在 H或甲酸盐存在时 ,混养生长过 2[ 38 ] 了广泛研究 . 研究发现 ,专性自养铁硫氧化菌 Th iobacillus ferro2 程中操纵子的诱导能达到自养生长的水平 . 该诱导不依赖于 [ 32 ] ox idans Fe1及其它菌株包含两套相同的 cbbLS 基因 . 在兼性 质粒上的 cbb操纵子. 但由其它底物引起的严格阻遏并未减轻.

厌氧硫氧化菌 T. den itrif icans检测到中间相隔大约 17 kb的 ?除了异养去阻遏 , R. eu tropha 的 cbb操纵子在不同生长条件下 [ 33 ] 型 R ubisCO 基因簇和 ?型 R ubisCO 基因 ,每套前面都有一个的表达与细胞氧化还原或能量状态决定的调控是协调一致的.

cbbR 基因 . 在 T. neapolitanus中 , cbbLS 基因与下游羧基化小体通过操纵子融合进行转录分析和研究 ,证实了在 R. eu tropha 已 [ 34 ] ( )ca rboxysom e基因成簇 . 锰氧化菌 S I8529A1 有一个由 cbbA 观察到 的 调 控 模 式 是 cbb 操 纵 子 的 启 动 子 活 性 变 化 的 结 [ 35 ] [ 11, 17 ] 和 cbbLS 组成的基因簇 ,类似光能自养菌 R hodobacter sphae2 果 .5’2端的 R ubisCO 基因和其余 cbb基因有显著的表达 roides cbb I型操纵子相应基因的排列 . 刘振盈等人发现 , 多能 差异 , R ubisCO 的表达量是 PR K的 5 倍. 这种表达差异的原因 硫杆菌具有与 R. sphaeroides同源的羧化酶 基因 ,并初 步将该 是 , R. eu tropha H16两个分别定位于染色体和大质粒 pHG1上 [ 36 ] 基因定位在 3. 0 kb的 Pst片段内 . 高度同源的 cbb 操纵子受 CbbR 调节的 cbbL 基因的 5’端上游启

综上所述 ,化能自养细菌的 cbb基因组织具有以下特点 :( )动子严紧控制. 磷酸烯醇丙酮酸盐或酯 PEP被确认为 CbbR 的

( )1 尽管 cbb基因 簇的基因数目和整体 排 列 具 有 种 特 异 负效应物 ,能够抑制 PcbbL 介导的转录 ,增强 CbbR 对 cbbL 启动 [ 39 ] 性 ,甚至少数具菌株特异性 ,但 cbbLSX 或 cbbLSQ 和 cbbFPT 的 子结合亲和性 . 靠近 cbbLS 基因的下游时常发生转录终止 ,造 基因顺序有相当大的保守性 ; 成高 cbbLS 转录水平 ,而位于操纵子下游较远处的其它基因转

( )2 无论基因转录活性如何 , cbb基因都能正常复制 ; 录就少得多. 过早的转录终止是 cbb 操纵子中基因表达差异的[ 40 ] ( )3 质粒 cbb基因分布广泛 ;重要机制 . 还未发现包含整个操纵子的初级转录产物. 其余

( ) 4 cbbR 是与 cbb操纵子相连的总调控基因 , 在 cbb基因 基因相应的转录本覆盖操纵子的不同部分 ,在大小上也有所不

()簇中形成一个单顺反子 monoc istron ic操纵子 . 它不仅存在于 同. 这些发现说明 ,初级转录产物的转录后加工或部分降解也可 兼性也存在于一些专性化能自养菌中 . 能与 R. eu tropha cbb操纵子基因的表达差异有关. 此外 ,已有间

接证据表明除 CbbR 外 ,还有其它的调控物在 R. eu tropha cbb操

纵子转 录 调 节 中 发 挥 作 用 , 目 前 正 在 深 入 进 行 这 方 面 的 研 2 化能自养细菌 cbb操纵子的调节 [ 41 ] R. eu tropha拥有目前已知最大的 cbb操纵子 ,是在 cbb基因究 .R. eu tropha cbb基因的调控如图 2所示.

[ 42 ] 图 2 化能自养菌 R a lston ia eu tropha H16 cbb调节子的定位和组织 [ 42 ]F ig. 2 Location and o rgan iza tion of the cbb regu lon of the chemoau to trop h R a l0 ston ia eu tropha H16 ( )( ) 基因产物的缩写 : CbbR ,与 cbb调控区操纵基因结合的 L ysR 型转录激活蛋白 ; R uB isCO ,由大亚基 CbbL 和小亚基 CbbS组成的 1 , 5 2二磷酸核酮 糖羧化酶 /加氧酶 ; cbbX 和 cbbY 基因产物功能未完全确定 ; PPE, 5 2磷酸戊糖 23 2差向异构酶 ; FB P,果糖 21 , 6 2二磷酸酯酶 /景天庚酮糖 21 , 7 2二磷酸酯 酶 ; PR K,磷酸核酮糖激酶 ; TKT,转羟乙醛酶 ; PGP, 2 2磷酸甘油磷酸酯酶 ; GA P, 3 2磷酸甘油醛脱氢酶 ; PGK,磷酸甘油酸激酶 ; FBA , 1 , 6 2二磷酸果 () 糖 /1 , 7 2二磷酸景天庚酮糖醛缩酶 ; CbbB ,类甲酸盐脱氢酶 类 FDH . 波浪线表示 cbb转录本. 位于 cbbS 下游 S 与 X 之间的发夹结构常常引起转录 提前终止 A bb revia tion s of gene p roducts: CbbR , L ysR 2typ e tran sc rip tional ac tiva to r b ind ing to the op era to r of the cbb con tro l region; R uB isCO , ribu lo se21 , ( ) ( ) 5 2b isp ho sp ha te ca rboxylase / oxygena se m ade up of la rge CbbL and sm a ll CbbSsubun its; cbbX , cbbY p roducts of unknown func tion; PPE, p en to se25 2 p ho sp ha te 3 2ep im era se; FB P, fruc to se21 , 6 2/ sedohep tu lo se21 , 7 2b isp ho sp ha ta se; PR K, p ho sp ho ribu lok ina se; TKT, tran ske to la se; PGP, 2 2p ho sp hoglyco late p ho sp ha ta se; GA P, glyce ra ldehyde23 2p ho sp ha te dehyd rogena se; PGK, p ho sp hoglyce ra te k inase; FBA , fructo se21 , 6 2/ sedohep tu lo se21 , 7 2b isp ho sp ha te a ldo la2 ) ( ) ( se; CbbB , fo rm a te dehyd rogenase FDH 2like p ro te in. W avy lines rep resen t cbb tran sc rip t. A ha irp in struc tu re sym bo l be tween S and X down stream of cbbS frequen tly cau se s p rem atu re tran sc rip tion te rm ina tion

X. f lavus的单个 cbb操纵子的调控模式与 R. eu tropha 的 R ub isCO. 这两种 cbbQ 基 因 还 能 激 活 E. coli 细 胞 中 来 自 H. 基本相似 ,但在测试过的底物上 , X. f lavus的异养生长未伴随 Therm olu teolus的 ?型 R ub isCO. cbbQ 和 cbbLS 在 E. coli中 的 任何操纵子的去阻遏 . H、甲醇和甲酸盐存在时 ,不同有机底 2 共表达能够影响 R ub isCO 的构象和活性 , 可见 CbbQ 在 R ub i2 物条件下的混养生长诱导 Ca lvin循环的关键酶 ,说明细胞的氧 [ 58 ] sCO 的翻译后调节中扮演重要角色 . 化还 原 或 能 量 状 态 能 产 生 cbb 操 纵 子 表 达 所 需 要 的 调 节 信

在从异养向自养生长转变过程中 ,兼性化能自养菌 Ca lvin[ 43, 44 ] .X. f lavus的单个 gap2pgk操纵子组成性表达 ,为细菌 号 循环至 少 需 要 R ub isCO 和 PR K 的 过 量 表 达 . 但 在 R. eu tro2[ 21, 27 ][ 19, 40 ]的异养和自养生长提供 GA P和 PGK,但它又能在自养生长细 中 , cbbLS / cbbM 和 cbbP与编码该循f lavus pha和 X.

胞中被诱导 ,表明 cbb和 gap2pgk操纵子存在协同调控 . 转录激 环其它酶的基因组成一个大的操纵子 . 这样的结构能确保这些

基因协同表达 . cbbLS 基因一前一后的排列是一个相当保守的 活蛋白 CbbR 控制 cbb和 gap2pgk 操纵子表达 ,从而实现这种协 [ 28, 45 ] 特征 ,并且通常形成一个双顺反子操纵子 . 兼性自养细菌 cbb 调 .X. f lavus的 cbb 操纵子启动子包含 3个可能的 CbbR 基因被严格控制 ,可能是由于异养生长过程中需要编码与中枢 结合位点 ,其中的反向重复序列 IR2 对 CbbR 的转录激活非常 碳代谢有关的相应同工酶的其它基因 .[ 46 ] 重要 . 而编 码 H yd rogenoph ilus therm olu teolus L ysR 型 转 录 激

活蛋白的 cbbR 位于 cbbLSQO YA 下游 ,在反向转录中位于 cbbF2

PT上游 . CbbR 与 cbbL 启动子上游和 cbbR 2cbbF 基因间隔区两3 结论与展望 [ 47 ] 个位点结合 . 与在 R. eu tropha 中观察的一致 , X. f lavus的最近 ,有关 CO 同化的分子生物学研究充分扩展了对化能 2

cbb操纵子倾向于显著的基因表达差异 . 研究发现 , cbbLSX 基 自养细菌 cbb基因组织和调节方面的认识 . 化能自养细菌 cbb 因 5 ’2端的 mRNA 量大约是 cbbFP部分转录本的 6 倍 . 这些发 基因簇在基因大小和操纵子结构上存在差异 , cbb操纵子具两[ 21 ] 现已被解释为初级大转录本被处理成稳定性不同的产物 .个调控特征 : CO 的有效性和对细胞的还原能力 . 细胞的氧化 2 同时 ,胞 内 NAD PH 浓 度 也 能 调 控 Ca lvin 循 环 相 关 基 因 表还原状态极有可能是调控网络中向 cbb基因传导代谢信号的 [ 48, 49 ] 达 . 源头 .

好氧氨氧化菌 N itrosom onas eu ropaea的 R ub isCO 操纵子由 不过仍有许多问题等待深入研究 . 例如 , 在 cbbLS 与其他cbb基因未串在一起的化能自养细菌中 , Ca lvin 循环的相关基 cbbLSQON 5个基因组成 . 研究表明 ,在限制碳源的情况下 , cbb

因又是 如 何 组 织 的 ? 羧 基 化 小 体 基 因 的 表 达 如 何 被 调 控 ? () (基因的转录受上游控制 ,而 am o 氨单加氧酶基因 、hao 羟 CbbR激活 Ca lvin循环相关基因转录的机制是什么 ? CbbR 是否 )胺氧化还原酶基因 和其他能量捕获相关基因则受下游调控 . 与羧基化小体基因表达调控有关 ? 除了 CbbR 还有哪些蛋白 与 am o基因不同之处在于 , cbb基因转录不需要 NH. 只有提 3因子对 cbb基因表达起调控作用 ? 作用方式与机制和 CbbR 有 供外能时 ,所有 5个 cbb基因才被转录 . 在活跃生长的细胞中 , 什么不同 ? cbb基因在一些组织模式方面的保密性又引发操纵

子基因共同起源的问题 ,以及它们从细胞现有基因库进行补充 R ub isCO 操纵子 5个 cbb基因的 mRNA 处在不同的水平 ,其可

的问题 . 能的原因是转录的过早终止 、快速 mRNA 处理和 mRNA 的降在探寻这些问题的过程中 ,不断增长的基因库资源将有助 [ 50 ] 解 . 还有研究者以 R. eu tropha 为宿主构建出氨氧化菌 N i2于对 cbb基因以及与中枢异养碳代谢相关的基因进行全面的 trosospira sp. 40K I的 cbb基因表达系统 ,可用于进一步研究 cbb系统分析 . 在不同化能自养细菌 , cbb基因调控对有机生长底 [ 51 ] 基因表达调控 .物作出不同响应 ,表明存在综合信号途径或一个以上与 cbb操

( 纵子控制有关的调节因子 . 当用醋酸 盐 和 果 糖 培 养 时 , 兼 性 有 机 自 养 菌 o rganoau2

) to trop hPseudom onas oxa la ticus能利用甲酸盐自养生长 ,同时 , 深入研究将有助于阐明化能自养细菌的信号 、信号传导和[ 52, 53 ] [ 54 ] R ub isCO 和 PR K 的 形 成 受 到 抑 制 . 在 A. facilis和 [ 55 ] Pa racoccus den itrif icans的醋酸盐或乙醇酸盐生长的细胞中 ,

也观察到 R ub isCO 的完全抑制 . CO限制导致酶显著增加 ,并 2参与 CO 同化基因控制的其它元件 . 2 [ 56 ] 产生大量特殊的含 R ub isCO 多面包含体 —羧基化小体 . 研

Referen ce s 究表明 ,羧基化小体在低浓度无机碳条件下能够提高 CO固定 2[ 57 ] [ 34 ] D u CH , Zhou JT, W ang J , Yan B , L u H , Hou HM. Con struc tion of a 1 效率 . 羧基化小体基因位于 cbbLS 基因下游 . 与兼性自养

菌 Pa racoccus versu tus 情 形 不 同 , 对 专 性 自 养 菌 Th iom icrospira gene tically enginee red m ic roo rgan ism fo r COfixation u sing a R hodop2 2 peloph ila而言 ,限制 CO不 能 刺 激 R ub isCO 的 合 成 . 兼 性 自 养 2seudom onas / Escherich ia coli shu ttle vecto r. FEM S M icrobiol L ett, 2003 ,

( ) 225 1 : 69 ,732 - ( ) 菌 T. in term ed ius 在 自 养 生 长 SO作 能 源 和 混 养 生 长 2 3 2 Pa rikh MR , Greene DN , W ood s KK, M atsum u ra I. D irec ted evo lu tion 2 - ( ) SO加谷氨酸盐 时含羧基化小体并表现出高 R ub isCO 活 2 3 of R uB isCO hyp ermo rp h s th rough gene tic se lec tion in enginee red E. co2 性 ,而在异养生长细胞既没有 R ub isCO 也没有羧基化小体 . 在 ( ) li. P rotein Eng D es S el, 2006 , 19 3 : 113 ,119 另一种兼性自养菌 Th iobacillus novellus的异养细胞中 ,没有形 3 Sh ive ly JM , van Keu len G, M e ije rW G. Som e th ing from a lmo st no th ing: 成羧基化小体 , R ub isCO 合成 也被完全抑制 . 在硝 化 细 菌 中 , ca rbon d ioxide fixa tion in chemoau to trop h s. A nnu R ev M icrobiol, 1998 , 52: 191 ,230 仅报 道 过 兼 性 自 养 菌 N itrobacter ag ilis 在 有 醋 酸 盐 时 表 现

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范文三：螺旋状专性化能自养铁氧化细菌ML_04菌株的分子鉴定_cropped

第 39 卷 第 5 期 年 10 月 2004 () 山 东 大 学 学 报 理学 版

Vol . 39 No . 5 Oct . 2004 JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY

() 文章编号 :167129352 20040520112204

螺旋状专性化能自养铁氧化细菌 ML204

菌株的分子鉴定

刘 缨 , 齐放军 , 刘相梅 ,郑力真 , 颜望明

( )山东大学 微生物技术国家重点实验室 , 山东 济南 250100

摘要 :对 1 株螺旋状专性化能自养铁氧化细菌 ML204 的 16S rDNA 基因 PCR 扩增产物进行了序列分析 ,并以 16S rD2

( ) NA 序列同源性为基础构建系统发育树 ,结果表明 ,ML204 菌株与氧化亚铁钩端螺旋菌 Leptospirillum ferrooxidans具

( ) 有较大的差异性 ,而与嗜铁钩端螺旋菌 Leptospirillum ferriphilum的相似度达 99. 7 %以上 ,属于同一类群.

关键词 :化能自养铁氧化细菌 ;16S rDNA ;系统发育分析 ;嗜铁钩端螺旋菌

中图分类号 :Q93 文献标识码 : A

Phylogenetic analysis for 16S rDNA sequence of the vibrio shaped

chemolithoautotrophic iron2oxidizing bacterium ML204

L IU Ying , QI Fang2jun , L IU Xiang2mei , ZHEN G Li2zhen & YAN Wang2ming

( )State Key Laboratory of Microbial Technology , Shandong Univ , Jinan 250100 ,Shandong , China Abstract : The sequence of 16S rDNA gene was analysed for the PCR product of a vibrio shaped , chemolithoautotrophic iron2oxi2 dizing bacterium ML204. A phylogenetic tree was constructed by comparing with the published 16S rDNA sequences of the relative bacteria species. In the phylogenetic tree ML204 and three Leptospirillum ferriphilum stains constitute a branch and L . ferriphi2 lum Fairview , L . ferriphilum ATCC49881 are the two closest relative with more than 99. 7 % sequence similarity. The results in2 dicate that strain ML204 is belong to Leptospirillum ferriphilum .

Key words :Moderately thermophilic iron2oxidizing bacterium ; 16S rDNA ; Phylogenetic analysis ; Leptospirillum ferriphilum 螺旋状专性化能自养铁氧化细菌是 1 类只能够 . 难点之 2 是缺乏足够和典型的理化鉴别特 大困难

利用二价铁为电子供体 ,氧作为电子受体的嗜酸性 征 ,在相当长的时间内无法对所分离的螺旋状专性

细菌. 由于这类细菌可以直接氧化硫化矿物 ,且大量 3 ,4 化能自养铁氧化细菌进行鉴别和分类 . 分布在持续浸提的含砷金精矿反应池中 ,表明这类 随着分子生物学的不断发展 ,一些分子生物学 细菌在微生物浸矿过程中具有重要的作用 ,对这类 技术如 G + C 含量的测定 、DNA2DNA 杂交技术 、16S 1 ,2 细菌的研究也开始引起人们的关注. rDNA 序列分析 、RAPD 技术 、16S223S 序列分析 、限制 专性化能自养铁氧化细菌在研究过程中存在较 性酶切位点分析等技术已应用于这类细菌的分类鉴

定 ,并成功地利用这些分子生物学特征 ,将螺旋状专 多技术难点. 难点之 1 是由于它们为化能自养 ,有机

性化能自养铁氧化细菌区分为 2 个不同的种 ,即氧 质的存在对其生长具有抑制作用 ,在琼脂糖或琼脂 ( ) 化亚铁钩端螺旋菌 Leptospirillum ferrooxidans 和嗜铁 固体帄板上难以生长 ,因而对其分离纯化带来了很

收稿日期 :2004202225

()基金项目 :国家自然科学基金资助项目 50174034 ,30170026

() 作者简介 :刘 缨 19762,女 ,助工 ,学士 ,主要从事自养微生物的分子生物学研究.

5 ,9 ( ) ( ) 钩端螺旋菌 Leptospirillum ferriphilum.23′, 反向引物 RC1492: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG10 5′2TACGGCTACCTTGTTACGACTT23′. PCR 反 应 体 系 本室曾成功地利用双层帄板技术,从云南腾

) (μμ( ) 100L为 : 10 ×PCR 缓冲液 10 L ,MgCl25 mmolΠ L2 冲地区高温温泉边酸性水中分离得到 1 株螺旋状专

μμμ( ) ( 10 L , dNTP 10 mmolΠL 4 L , 引 物 FC27 62 . 5 性化能自养铁氧化细菌 ML204 . 本研究中我们对该

μμ) ( ) molΠL和引物 RC1492 62 . 5molΠL 各 2 L , 模 板 菌株 16S rDNA PCR 扩增产物的序列进行了测定 ,对

μ((μ) μ) DNA 约 50 ngΠL4 L ,Taq DNA 聚合酶 5 UΠL1 . 5 所测序列进行了 16S rDNA 系统发育分析和酶切位

μL . 94 ?变性 5 min 后进入循环 ,94 ? 1 min ,52 ? 点分析 ,结果表明 ,该菌株与钩端螺旋菌属的嗜铁钩

1 min ,72 ?3 min ,33 个循环 ;最后 72 ?延伸 10 min. ( ) 端螺旋菌 Leptospirillum ferriphilum 属于同一类群 .

用 1 %的琼脂糖凝胶进行电泳分离 , 切下扩增 片段

条带 ,用 Omega Bio2Tek 公司的凝胶回收试剂盒 R ?( ) E. Z. N. A Gel Extraction Kit回收. 1 材料与方法 1 . 6 16S rD NA 的全序列测定

回收 纯 化 后 的 PCR 产 物 用 Beckman 公 司 的 1. 1 菌株 TM ( ) DNA 测序试剂盒 CEQDTCS2Quick Start Kit 进行 ML204 菌株由云南腾冲地区高温温泉边酸性矿

( 测序 PCR 反应 ,用 CEQ2000 XL 全自动 DNA 测序仪 水中分离得到. 螺旋状 , 革兰氏阴性 , 大小 0 . 25 ,

进行序列测定 . (μ) ) 0 . 30×1 . 00 ,3 . 00m. 菌落为圆形 , 琥珀色 , 直

1. 7 系统发育树的构建径 1,3 mm ,凸起 ,光滑. 中度嗜热嗜酸铁氧化细菌 ,

将菌株 MTH204 的 16S rDNA 序列提交到 Gen2最适生长温度 40 ?,最适生长 p H2 . 5 , 能氧化硫酸 Bank 数据 库 , 并 通 过 Blast 程 序 进 行 序 列 比 较 , 用 亚铁和黄铁矿 ,不能氧化硫磺 、硫代硫酸盐及四硫酸 Clustal X 及 Njplot 得出系统发育树状图. 盐 ,不能利用有机物为能源进行生长 ,属于化能自养 1. 8 限制性酶切位点分析型微生物.

用 DNAMAN 软件 ,选择 A ge ?, Apa ?, Avr ?, 1. 2 培养基

Bf r ?, EcoRV , Hind ?, Kpn ?, Mro ?, Nco ?, 11 在 9 K 培养基, 设计液体培养基配 的基础上 S ac ?, Sma ?, Ssp ?, Stu ?酶对氧化亚铁钩端螺 方如下 : ( ) ( 旋菌 L . ferrooxidans 、嗜铁钩端螺旋菌 L . ferriphi2 ) (基础盐 : NHSO3 g , KCl 0 . 1 g , KHPO0 . 5 4 2 4 2 4 ) lum和 ML204 菌株进行酶切位点分析 ,绘制酶切图 ) (g ,MgSO7? HO 0 . 5 g ,Ca NO0 . 01 g , ZnSO7? HO 4 2 3 2 4 2 谱 . 0 . 01 g ,微量元素液 1 mL ,用 HSO调 p H 至 2 . 5 ,加 2 4

水定容至 1 000 mL ,高压灭菌 . FeSO溶液过滤除菌 4

后加入 ,使终质量分数为 5 %.

微量元素液 :CuSO5? HO 1 g ,MnSO4? HO 1 g ,4 2 4 2

结果与分析 2 CoSO7? HO 1 g , NaBO4? HO 1 g , NaMoO2? HO 4 2 2 4 7 2 4 2

1 g ,加水定容到 1 000 mL .

2. 1 ML204 菌株的 16S rD NA 序列分析 1 . 3 ML204 菌体的培养和收集

ML204 菌株的 16S rDNA 序列扩增片段琼脂糖 ML204 菌株接种到液体培养基中 , 40 ?摇床培

凝胶电泳见图 1 . 扩增片段长 1 450 bp ,在 GenBank 中 () 养 6 d ,低速离心 3 000rΠmin ,10 min除去沉淀 ,高速

的序列登记号为 AY485647 . 以 16S rDNA 同源性为 () 离心 12 000 rΠmin ,30 s收集菌体.

基础构建系统发育树 ,见图 2 . 在系统树中 ,ML204 处 1 . 4 ML204 染色体 D NA 的提取

于 Leptospirillum f erriphilum 分 支 中 , 与 菌 株 L . f er2 染色体 DNA 的提取见《常见细菌系统鉴 定 手

riphilum Fairview 及 L . ferriphilum ATCC 49881 的相似

性最高 ,均为 99 . 7 % ; 与 L . ferriphilum Warwick 的相 12 册》. 似性 为 98 . 4 %. L . ferrooxidans 菌 株 在 另 1 个 分 支 1 . 5 ML204 菌株 16S rD NA 的 PCR 扩增 中 ,ML204 与 L . f errooxidans 分支中的各株菌相似性

以提 取 的 染 色 体 DNA 为 模 板 , 用 通 用 引 物 ( 在 92 . 7 %, 93 . 2 %之 间 ; 与 红 色 链 孢 霉 NitrospiraFC27 ,RC1492 扩增 16S rDNA 片段 ,引物由上海生工 ) moscoviensis 的相似性为 80 . 9 %.

( ) 生物 工 程 有 限 公 司 合 成. 正 向 引 物 FC27 : 5′2

()山 东 大 学 学 114 第 39 卷 报 理 学 版

2 . 2 16S rD NA 基因的限制性酶切位点分析

( ) 氧化亚铁钩端螺旋菌 L . ferrooxidans 、嗜铁钩

( ) 端螺旋菌 L . ferriphilum和 ML204 菌株的 16S rDNA 基因限制性酶切图谱见图 3 . ML204 菌株与 L . fer2 riphilum 的酶切图谱相近 , 而与 L . ferrooxidans 的酶 切图谱具有明显的差异.

3 讨论

( ) 迄今为止 ,钩端螺旋菌属 Leptospirillum 菌株报 道的很少 ,已报道的有 4 类 . 1972 年 ,Markosyan 报道 了 1 株螺旋状铁氧化细菌 ,并定种为氧化亚铁钩端 204 菌株 16S rDNA PCR 扩增片段的电泳图 ML图 1 ( ) 螺旋菌 L . ferrooxidans,这是有关钩端螺旋菌的首 () 1 : PCR 产物 ,2 :标记 DL22000.

Fig. 1 Electrophoresis for the 16S rDNA PCR product of 13 次报道 . 1992 年 , Golovacheva 等人报道了 1 株中度 ML204 strain

( ) 嗜热氧化亚铁钩端螺旋菌 L . thermof errooxidans , () 1 : PCR product , 2 : Marker DL22000.

图 2 基于 16S rDNA 序列同源性的菌株 ML204 和其他相关细菌的系统发育树

Fig. 2 Phylogenetic tree derived from the 16S rDNA sequence of ML204 and relative strains

图 3 16S rDNA 基因的限制性内切酶分析图谱 Fig. 3 Map of restriction endonuclease cutting sites within the 16S rDNA gene

14 但 L . thermof errooxidans 已 在 保 藏 过 程 中 丢 失.参考文献 : 2000 年 ,Bond 等人依据废弃黄铁矿样品中 DNA 提

取物的 16S rRNA 序列分析推测出的结果 ,报道可能 1 童雄. 微生物浸矿的理论与实践 M . 北京 :冶金工业出 还有 1 类钩端螺旋菌的存在 ,但该菌在实验室中一 版社 ,1997. 15 直未能成功分离和培养. 2002 年 , Coram 和 Rawl2 2 Rawlings D E. Heavy metal mining using microbes J . Annu ings 研究了 16 株钩端螺旋菌属的菌株 ,把它们分为 Rev Microbiol , 2002 , 56 : 65,91. 2 个不同的类群 ,其中 1 个类群是 L . ferrooxidans ,而 3 Johnson D B , Macvicar J H M , Rolfe S. A new solid medium 把另 1 个类群定名为 L . ferriphilum. L . ferrooxidans for the isolatation and enumeration of Thiobacillus ferrooxidans 和 L . f erriphilum 在形态 、生理生化特性方面无特征 and acidophilic heterotrophic bacteria J . J Microbial Meth 2 性差异 ,但基于分子生物学水帄的研究 ,如 G + C 含 ods , 1987 , 7 : 9,18. 量 、DNA2DNA 杂交 、16S rDNA 序列分析 、16S223S 序 16 4 Johnson D B , Mc Ginness S. A highly efficient and universal 列分析 、限制性酶切位点分析 ,两者均有不同. solid medium for growing mesophilic and moderately thermo2 Leptospirillum 属菌株在生物浸矿工业中的作用

philic , iron2oxidizing , acidophilic bacteria J . J Microbial 也逐渐得到人们的认识和关注. 通过 16S rDNA 序列

Methods , 1991 ,13 : 113,122. 分析 、荧光免疫技术 、DNA2DNA 杂交等技术 ,人们从

5 Amaro A M , Hallberg K B , Lindstr o?m EB , et al . An immuno2 工业化连续浸矿系统中常常检测到 Leptospirillum 属

logical assay for detection and enumeration of thermophilic bio2 菌株 ,并 发 现 它 们 在 浸 矿 微 生 物 种 群 中 占 优 势 地 17 ,20 mining microorganismJ . Appl Environ Microbiol , 1994 , 60 : 位. 1999 年 ,Rawlings 等人报道 , Leptospirillum 属

( ) 3470,3473.菌株比氧化亚铁硫杆菌 Thiobacillus ferrooxidans 、氧

6 Battaglia 2Brunet F , Clarens M , d’Hugues P , et al . Monitoring ( ) 化硫硫杆菌 Thiobacillus thiooxidans 具 有 更 高 的 氧

of a pyrite2oxidising bacterial population using DNA single2 化还原电势和更低的 p H 生长范围 , 生长不受高浓

度三价铁离子的抑制 ,在工业化生产的连续反应浸 strand conformation polymorphism and microscopic techniques 21 矿系统中 , Leptospirillum 对浸矿起主导作用. 2002 J . Appl Microbial Biotechnol , 2002 , 60 : 206 ,211. 年 ,Coram 和 Rawlings 还 发 现 , 从 南 非 Fairview 矿 区 7 Wulf 2Durand P D , Bryant L J , Sly L I. PCR2mediated detec2 砷黄铁矿连续浸提罐中检测到的螺旋菌都是 L . fer2 tion of acidophilic , bioleaching2associated bacteria J . Appl riphilum ;并报道了在螺旋菌属的菌株中 , L . f erriphi2 Environ Microbiol , 1997 , 63 : 2944,2948. lum 可以在 35 ?至 45 ?的温度下生长 ,而 L . ferro2 8 Novo M T M , De Souza A P , Garcia O J , et al . RAPD genom 2 16 oxidans 只对 35 ?以下的工业浸矿发挥重要作用. ic fingerprinting differentiates Thiobacillus ferrooxidans strains 由于钩端螺旋菌属在工业生产中具有重要的作 J . Syst Appl Microbiol . 1996 , 19 : 91 ,95. 用 ,该属细菌资源的发掘及其浸矿特性的研究 ,对生 9 Pizzaro J , J edlicki E , Orellana O , et al . Bacterial populations 物浸矿技术的发展和应用具有十分重要的意义. in samples of bioleached copper ore as revealed by analysis of 本室利用双层帄板技术 ,从云南腾冲地区高温 DNA obtained before and after cultivation J . Appl Environ 温泉边酸性水中分离得到 1 株螺旋状专性化能自养 Microbiol , 1996 , 62 : 1323,1328. 热铁氧化细菌 ML204 ,该菌株可有效浸出砷黄铁矿

中的铁和硫 ,在实际生产中具有潜在的应用价值. 为

10 刘缨 ,刘相梅 ,田克立 ,等 . 氧化亚铁钩端螺旋菌在固体 了进一步确认这 1 新分离的菌株 , 本研究对其 16S

帄板上的培养及形态观察 J . 微生物学通报 ,2003 ,30 rDNA 序列进行系统发育分析 , 结果显示 ,ML204 和

() 6:91,93. L . ferriphilum 具有很高的相似性 ,对其 16S rDNA 序

列进行限制性酶切位点分析 ,结果也表明 ,ML204 菌 11 Silverman M P , Lundgren D G. Studies on the chemoautotro 2 株与 L . ferriphilum 16S rDNA 序列的限制性酶切图 phic iron bacterium Ferrobacterium ferrooxidans . I. An im2 谱相近. proved medium and a harvesting procedure for securing high

cell yieldsJ . J Bacterial , 1959 , 77 : 642 ,647.

12 东秀珠 ,蔡妙英 . 常见细菌系统鉴定手册 M . 北京 :科

学出版社 , 2001. 399,400.

2oxidizing bacterium Leptospiril2 13 Markosyan G E. A new iron sp J . Biol J Armenia , 1972 , lum ferrooxidans nov. gen.

25 : 26,29.

()下转第 121 页

第 5 期 121 鲁 敏 ,等 :绿化植物受大气 SO、铅复合污染伤害特征及抗性表现 2

参考文献 : 结论 3 1 鲁敏 ,李英杰 ,鲁金鹏 . 绿化树种对大气污染物吸收净化

() 能力的研究 J . 城市环境与城市生态 ,2002 , 2:7,9. 污染物的排放在对植被产生伤害的同时植物对 ( ) 鲁敏. 北方防污绿化树种选择 J . 中国园林 ,2002 , 6: 这种因素的胁迫产生了适应性的改变 ,一些植物对 2 86,88. 污染物的敏感性 、耐性 、抗性或解除作用等方面产生 鲁 敏 , 李 英 杰 . 绿 化 树 种 对 大 气 金 属 污 染 物 吸 滞 能 力 10 多方向的演化. 通过观测调查冶炼厂附近栽植的 3 () J . 城市环境与城市生态 ,2003 , 1:51,52. 树木其生长发育及叶部受污染物伤害的反应判断 , 刘艳菊 ,丁辉 . 植物对大气污染的反应与城市绿化 J . 大气 SO、铅复合污染对植物造成的危害明显 ,不同 2 () 植物学报 ,2001 ,18 5:577,586. 4 的植物及在污染区所处的位置反映出了不同的伤害 薛姣亮 ,刘红霞 ,谢映帄 . 城市空气中铅在国槐树体内的 症状 ,从而表现出了不同的抗性程度. 一般来说 ,距 () 积累 J . 中国环境科学 ,2000 ,20 6:536,539. 5 离污染源越近 ,树木受到的伤害程度也越重 ;而相同 陈学泽 ,谢耀坚 ,彭重华 . 城市植物叶片金属元素含量与

() 大气污染的关系 J . 城市环境与城市生态 ,1997 , 1: 26 的植物栽植在污染源的主导风向的下风方向的树木

6 ,29. 比栽植上风方向的树木受害程度重. 常绿针叶树比

孔国辉 ,汪嘉熙 ,陈庆诚. 大气污染与植物 M . 北京 : 中 阔叶树抗性弱或敏感. 国林业出版社 ,l988. 试验结果表明 :对以 SO、铅为主复合污染物的 2 王秀琴 . 植物与大气污染 J . 商洛师范专科学校学报 , 7 抗性树种有 : 花曲柳 、桑树 、皂角 、山桃 、黄檗 、臭椿 、 () 2000 ,14 2:77,79. 紫丁香 、忍冬 、柽柳 、桧柏 、枸杞 、水蜡 、刺槐 、色赤杨 、

加拿大杨 、黄刺枚 、玫瑰 、白榆 、茶条槭 ; 敏感监测树 8

种有 :连翘 、榆叶梅 、锦带花 、风箱果 、云杉 、油松 、樟

子松 、山槐. 9 Zhou Q , Huang X , Cao Y , et al , Mitigative effect of La on 在城市生态环境和绿化建设中 ,合理应用以上 Glycine max geedlings under Pb2Cd conpound pollulion J . J

of Rare Earths. 1999 ,17 ;303,307. 筛选出的抗性树种和敏感树种 ,将在环境污染的治

10 段昌群 . 植物对环境污染的适应与植物的微进化 J . 生 理和监测中发挥积极的作用. () 态学杂志 ,1995 ,14 5:43,50.

()于善清

()上接第 115 页

14 Golovacheva R S , Golyshina O V , Karavaiko G L , et al . A Thiobacillus ferrooxidans , Thio2 for the rapid identification of bacillus thiooxidans and Leptospirillum ferrooxidans in leaching new iron2oxidizing bacterium , Leptospirillum thermoferroox2

idans sp . novJ . Microbiology , 1993 , 61 :744 ,750. ores environmentsM . Santiago Univ Chile : In Biohydromet 2 15 Bond P L , Smriga S P , Banfield J F. Phylogeny of microor 2 allurgical Processing , 1995. 9,18.

ganisms populating a thick , subaerial predominantly lithotro2 19 Dew D W , Lawson E N , Broadhurst J L . The Biox process for

phic biofilm at an extreme acid mine drainage site J . Appl biooxidation of gold2bearing ores or concentrates M . Berlin

Environ Microbiol ,2000 ,66 :384223849. Germany : Springer2Verlag , 1997. 45,80. 16 Coram N J , Rawlings D E. Molecular Relationship between 20 Sand W , Rohde K , Sobotke B , et al . Evaluation of Leptospi2

Two Groups of the Genus Leptospirillum and the Finding that rillum ferrooxidans for leaching J . Appl Environ Microbiol ,

1992 , 58 : 85,92. Leptospirillum ferriphilum sp . nov. Dominates South African 21 Rawlings D E , Tributsch H , Hansford G S. Reasons why Commercial Biooxidation Tanks that Operate at 40 ?J . Ap 2

pl Environ Microbiol , 2002 , 68 : 838,845. ‘Leptospirillum’2like species rather than Thiobacillus ferrooxi2 17 Goebel B M , Stackebrandt E. Cultural and phylogenetic anal 2 dans are the dominant iron2oxidizing bacteria in many com2

ysis of mixed microbial populations found in natural and com2 mercial processes for the biooxidation of pyrite and related ores

mercial bioleaching environments J . Appl Environ Microbi 2 J . Microbiology , 1999 , 145 : 5 ,13

()编辑 :于善清 ol ,1994 ,60 : 1614,1621. 18 Rawlings D E. Restriction enzyme analysis of 16S rDNA genes

范文四：细菌浸铀中的化能自养菌种类及活性研究

第 19 卷 第 3 期 Vol . 19 No . 3 江 西 科 学 J IAN GXI SCIENC E Sept ,2001 2001 年 9 月

() 文章编号 :1001- 3679 200103-015 3-0 4

细菌浸铀中的化能自养菌种类及活性研究

1 李 江,刘亚洁

2 ()1. 江西省抚州师范专科学校 生物系 ,江西 抚州 344000 ;2. 华东地质学院 资源与环境工程系 ,江西 抚州 344000

( ) 摘要 : 自某矿矿石及矿水中分离出了 3 种化能自养菌 : Thiobacillus Ferrooxidans T. f 、Thiobacillus Thiooxidans ( ) ( ) T. t和 Leptospirillum Ferrooxidans L . f 。通过最适条件培养和驯化 ,从变色时间 、二价铁的氧化速率 、氧化还

( ) 原电位 Eh的变化以及生长曲线特征等方面对其活性进行了比较研究 ,表明所分离的混合菌株已达到了较 高活性 ,可用于铀矿的细菌浸出 。

关键词 : 化能自养菌 ;驯化 ;生长曲线 ;细菌浸出

中图分类号 : X753 文献标识码 : A

The Species and Activity Research of Chemotroph Bacteria

Using in Uranium Leaching by Bacteria

1 2L I J iang,L IU Ya - jie

(1. Biology Department , Fuzhou Teacher’s College of Jiangxi , Fuzhou Jiangxi ,344000 PRC ;

)2. Resources and Environmental Engineering Department , East China Institute of Geology , Fuzhou jiangxi , 344000 PRC Abstract : Three species of chemotroph Bacteria has been separated from the ore and water of uranium an

( ) ( ) Mine They are Thiobacillus FerrooxidansT . f , Thiobacillus Thiooxidans T. tand Leptospirillum Fer2

( ) ooxidans L . f . It indicated that the mixed bacteria being separated have obtained rather high activity and can be applied in uranic bacteria leaching by the best fit condition’s culture and domestication and com2 paring from the time of color change , oxidation rate of bivalent ferric , Eh change and growth curve char2 acter .

Key words : Chemeotroph bacteria , Domestication , Growth curve , Bacteria leaching 某铀矿是我国最大的硬岩铀矿山之一 ,也是 ,设备要求 细菌浸出以其工艺条件较易控制 我国铀矿冶炼系统唯一的集选冶为一体的联合 简单 ,成本比较低廉而日益受到重视 。尤其是在 企业 。为 了 降 低 低 品 位 矿 石 、尾 矿 等 的 水 冶 成 当今 ,人类面临资源短缺 ,生态环境日益恶化的

本 ,提高企业的经济效益 ,该矿业公司与我院联窘境 ,细菌冶金技术更显出其优越性 ,并逐步展

( ) 合开发研究细菌冶金 又称细菌浸出技术在贫 现出其巨大的低成本回收资源 、保护生态环境的 矿 、尾矿处理中的应用效果 。 潜 力 。依靠细菌浸矿可以从其他方法所不能作

收稿日期 :2001 - 05 - 08 ;修订日期 :2001 - 06 - 27 基金项目 :国防科工委与华东地质学院攻关项目

() 作者简介 :李江 1966 - ,男 ,山东济南市人 ,江西抚州师专讲师 ,1988 年 7 月毕业于山东大学生物系 ,现在南昌大 学生命科学与食品工程学院攻读硕士学位 。

?154 ? 江 西 科 学 2001 年第 19 卷

( ) ) ( ) ( 用的低品位铀矿石 0 . 01 %, 0 . 05 %UO中回 Thiooxidans T. t 氧化硫硫杆 菌, Leptospirillum 38

( ) ) ( 收铀 ,而其所 耗 成 本 仅 为 其 他 方 法 的 一 半 或 更 FerrooxidansL . f 氧化亚铁微螺旋菌。低 。 T. f 能够氧化亚铁和低价无机硫化物 ,而以 0 - 1细菌浸出中的关键是高密度 、高活性 、能适 前者作用更强 ; T. t 只能利用 S或 FeS中的 S 2

1 应当地环境的多种微生物的菌群 。细菌浸出中 而获得能量 ; L . f 与 T. f 类似。

( 的微生物多为化能自养型细菌 Chemotroph B ac2 1 材料

) (teria亦有一些异养菌与之伴生 ,如酵母菌 、霉菌 1 . 1 样品 1 ) 等, 一般多耐酸 , 甚至在 p H = 1 以下仍能生 分别于 2000 年 5 月 17 日 ,10 月 23 日 ,11 月存 ,在农业生产 、能源开发 、冶金 、采矿及环境保 8 日从某矿废浸堆集液池 、S 矿矿窗下及矿井水 、护等方面具有极大的用途 ,且前景广阔 。细菌浸

Z 矿弃矿床及矿窗下取样 。样号及样品 p H 值见 出中 最 重 要 的 3 种 细 菌 是 以 Thiobacillus Fer2

表 1 。 ) ( ) ( rerooxidans T. f 氧化亚铁硫杆菌为代表的化

能 自 养 菌 : Thiobacillus Ferrooxidans , Thiobacillus

表 1 样品编号及 p H 值

编号 PO - 1 MS - 2 MS - 2 MZ - 1 MZ - 2 RE - L1 RE - S1

p H 值 4. 0 5. 5 6. 0 6. 0 / 1. 8 / 1 . 2 培养基 培养 。每 d 测定 p H 、Eh 值及注意记录培养液颜

1 . 2 . 1 9 K 培养基色变化 。若有褐黄色出现则开始测定铁的变化 ,

3 + 2 + ( ) A 液 : 称 取 NHSO 4 2 43 g , KC1 0 . 1 g , 计算每昼夜二价铁的消耗速率 ,至 Fe/ Fe达

) (KHPO0 . 5 g , MgSO7? HO 0 . 5 g , Ca NO0 . 1 2 4 423 2 70 %以上时则进一步富集培养 。最后将三种菌

种混合 ,用 9 K 或 Leathen 培养基加硫磺在最适条 g 。按顺序溶入 700 ml 自来水中 , 于 120 ?,100

kPa 下 灭 菌 30 min 。B 液 : 称 取 44 . 2 g FeSO? 件下分批培养 。4

2 . 2 菌种鉴定7 HO ; 加入 300 ml 无菌水及一定量的浓硫酸溶 2

2 . 2 . 1 生理生化特性鉴定 解 。然后将 A 、B 两液混合用浓硫酸调节 p H 值 。

根据选择培养基成分 、p H 值的变化以及是 1 . 2 . 2 Waksman 培养基2 + () 否消耗 Fe 和单质硫进行鉴定 。 称取 NHSO0 . 2 g , NaSO0 . 1 g , KHPO 42 4 23 2 4

2 . 2 . 2 显微镜活体镜检() 3 . 0 g , MgSO?7 HO 0 . 5 g Ca NO0 . 1 g ,按顺序 4232 - 1 利用压片法制作水浸片 ,以 10 gL? 的美蓝 溶入 1 000 ml 自来水中 ,于 120 ?,100 kPa 下灭

溶液为背景 ,在油镜下观察 。 菌 30 min 。接种后加质量分数为 w = 1 %硫磺 。

2 . 2 . 3 革兰氏染色1 . 2 . 3 Leathen 培养基

固定样品 ,进行革兰氏染色 ,后在油镜下观 () A 液 :称取 NHSO3 g , KC1 0 . 1 g , KHPO42 4 2 4

察 。 ) (0 . 5 g , MgSO7? HO 0 . 5 g ,Ca NO0 . 1 g ,按顺 4 23 2

2 . 3 菌种活性测定 序溶入 700 ml 自来水 ,于 120 ?,100 Pa 下灭菌

30 min 。B 液 :质量分数 w = 10 %的 MgSO7? HO 2 . 3 . 1 颜色变化 通过肉眼观察培养液由淡黄4 2

色变为铁锈红 溶液 10 ml 经过滤除菌 。然后将 A 、B 两液混合

色至深棕红色所需的时间 。用浓硫酸调节 p H 值 。

2 . 3 . 2 二价铁与三价铁的变化速率 采用啉啡罗2 方法

啉比色法测定二价铁及三价铁 , 2 . 1 菌种分离和培养 自接种开始定时测定二价铁的减少或三价铁的 按无菌操作分别取一定量矿样或矿水样依 增加情况 。 () (次加入 100 ml 9 Kp H2 . 0,2 . 5,100 ml 9 Kp H. 2 . 3 . 3 氧化还原电位的变化) () 3 . 0,3 . 5和 100 ml Waksman p H4 . 0,4 . 5,无菌用 p HS - 3C 型精密酸度计定时测定氧化还 (培养基中 分别分离 T. f 、L . f 和 T. t 三种化能 ( ) 原电位 Eh 值。 ) 自养菌,于 30 ?,90 r/ min振荡 ,进行加富富集 2 . 3 . 4 生长曲线

第 3 期 李 江等 : 细菌浸铀中的化能自养菌种类及活性研究 ?155 ?

) 吸取 10 ml 菌悬液接种入 100 ml 的 9 K 培养 2 所示。故选用选择性培养基分别分离 T. f , 基中 ,在 30 ?、90 r/ min 的振荡培养箱中培养 ,每 T. t 和 L . f 3 种菌 。经多次加富培养 ,使各培养 8 - 1隔 4 h 用比浊法测定菌数 , 以时间为横坐标 , 细 液中的细菌密度达到 10个 cellm?l 左右 。

菌数目为纵坐标作图 。 经革兰氏染色 , 3 种菌均为革兰氏阴性 ; 水

浸压片法观察可见 3 种菌均能运动 。根据《伯杰 3 结果与讨论 氏手册》鉴定 ,该矿样中分离出的化能自养菌分 3 . 1 菌种种类及特征 别为 T. f , T. t 和 L . f 。3 种菌菌体大小 、形状 、

氧化硫杆菌类属嗜酸性菌 ,均能在酸性环境 碳源 、需氧情况等特征见表 3 。

( 中生长 。但各种菌的最适 p H 及能源不同 如表

表 2 T. f , L . f 与 T. t 的最适生活条件

培养基类型 能源 振荡速度 种类 最适温度/ ? 最适/ p H 2 + - 1- 2 Fe、SO、S T. f 28,35 ,2. 5 或 Leathen 23 以上 2. 09 K 120 r/ min 2 + - 1 30,50 2. 5,3. 5 120 r/ min 以上 9 K 或 Leathen Fe、S L . f o - 1- 2 28,30 4. 0,5. 4 120 r/ min 以上 SO、S、S 23 T. t Waksman

表 3 T. f T . t 和 Lf 的主要特征 培养基中生长 ,且将二价铁变为三价铁 , 培养液

T. thiooxidans T. ferrooxidans L . ferrooxidans 菌种特性 颜色由淡黄色变为深棕红色 。而 T. t 只在含硫

0 . 5 ×1. 4 0. 5 ×0. 9 (0. 6,1) ×(1,1. 6) 大小/μm 的培养基中生长 ,且培养液的 p H 值可由 4 . 15 降 运动性 革兰+ + + () 低到 1 . 32 图 1甚至更低 。 氏染色 - - - 3 + 2 + 3 . 2 Fe/ Fe比值的变化 需氧情况 + + +

利用 C O 2+ + + 混合菌液中 ,T. f 和 L . f 在 9 K 培养基中的能 + -3 + + + + 利用 NH 、NO 4 3 源为二价铁 ,因此菌种活性的高低直接由 Fe/ 利用硫磺 3 + - 2 + 2 - Fe比值的变化来反映。样品培养初期 ,细菌 利用亚铁 - + + 活力较低 ,自接种后二价铁消耗至 50 %左右所需 + + - 利用硫代硫酸盐 () 时间为 5 d 96 h,如图 2 所示 。经 30 多代最适 3 前苏联微生物冶金专家阿拉日瓦耶娃博士认?为 T. f 亦可 条件下驯化培养后 , 细菌活力大大提高 , 二价铁 利用硫磺 。 () 消耗 70 %左右所需时间仅需 15 h 图 3。 T. f 和 L . f 均能在含二价铁的 9 K 或 Leathen

3 . 3 氧化还原电位的变化 需时间为 4 d ;驯化后样品 MS - 1 Eh 值由 580 mV

由于 培 养 液 中 的 氧 化 还 原 电 位 主 要 由增至 750 mV 所需时间仅为 21 h 。表明 ,混合菌 2 + 3 + 种经过多代 驯 化 培 养 后 , 已 完 全 适 应 了 培 养 条 Fe/ Fe决定 , 故氧化还原电位的变化是间接

2 件 ,活性大幅度提高 。判断培养液中二价铁氧化速率的指标。氧化

亚铁硫杆菌类在 Eh 400 mV,900 mV 之间均显3 . 4 生长曲线

3 示较强的氧化还原能力。混合菌种驯化前后 , 生长曲 线 可 以 反 映 细 菌 的 生 长 繁 殖 规 律 。 培养液 Eh 值随时间变化情况见图 4 和图 5 。驯 样品 MS - 1 的生长曲线如图 6 。该菌种在培养

( ) 化前样品 MS - 1 Eh 值由 650 mV 增至 750 mV 所 液中的生长分为 4 个阶段 : 迟滞期 lag phase 、

?156 ? 江 西 科 学 2001 年第 19 卷

( ) ( ) 对数期 log phase 、稳定期 stationary phase、衰 ;从第 20 h 开始进入稳定期 ,可持续 长率非常大

( ) 亡期 decline phase。经 过 多 代 驯 化 培 养 后 , 在4,5 h 以上 。

30 ?、p H 值 = 1 . 8,2 . 0 ,90 r/ min 振荡及 5 %接 以上结果表明 ,该菌株具极短迟滞期 , 对数

种量条件下 ,迟滞期仅 3 h ,比相同条件下 15 %接 增长期时间较长 ,细胞分裂一次所需代时极短 , 种量的中科院微生物所 TD - 10 氧化亚铁硫杆菌 细胞旺盛代谢 、生长的速率极高 ,且最大细菌密

4 8 - 1迟滞期还要短。从第 3 h 开始进入对数增长 度可达 2 . 0 ×10个 cellm?l 以上 ,菌种活性已达 期 ,一直维持 17 h 以上 ,而且在后 5 h 中菌数增 到较高程度 。

石的浸出效益 。

结论 4 某矿矿石和矿水中分离出了 3 种用于铀矿浸 参考文献 : 出的化能自养菌 : T. f , T. t 和 L . f 。经过多代最 1 姜成林 ,徐丽华 . 微生物资源学 M . 北京 : 科学出版 适条件的分批培养和驯化 ,从变色时间 ,二价铁的 社 ,1997. 168 - 172. 氧化速率 , Eh 的变化以及生长曲线的特征等多方 2 LASSON A. 复合硫化矿在台架规模柱式反应器中的 面表明 ,混合菌株均已达到较高的活性 。高活性 、 () 细菌浸出 J . 湿法冶金 ,1996 ,58 2:51 - 62. 高密度的取自于当地的混合细菌群将是细菌浸出 王恩德 . 环境资源中的微生物技术 M . 北京 : 冶金 3 工艺中高效益的最基本的前提 。本混合菌株可用 工业出版社 ,1997. 132 - 153. 于细菌浸出工艺实验 ,达到较高浸出率和较低酸 张传福 ,闵小波 ,柴立元 ,等 . 氧化亚铁硫杆菌生长迟 耗 ,并将大大提高该矿 S 矿区和 Z 矿区低品位矿 4 缓期的 影 响 因 素 J . 中 南 工 业 大 学 学 报 . 1999 , 30

() 5:489 - 492.

范文五：【doc】螺旋状专性化能自养铁氧化细菌ML-04菌株的分子鉴定

螺旋状专性化能自养铁氧化细菌ML-04菌

株的分子鉴定

第39卷第5期

Vo1.39No.5

山东大学(理学版)

JOURNALOFSHANDONGUNIVERSnY

2OO4年lO月

Oct.20o4

文章编号:1671-9352(2004)05-0112-04 螺旋状专性化能自养铁氧化细菌ML.04

菌株的分子鉴定

刘缨,齐放军,刘相梅,郑力真,颜望明

(山东大学微生物技术国家重点实验室,山东济南250100) 摘要:对l株螺旋状专性化能自养铁氧化细茵ML-04的16SrDNA基因PCR扩增产物进行了序列分析,并以16SrD.

NA序列同源性为基础构建系统发育树,结果表明,ML-04茵株与氧化亚铁钩端螺旋茵(Leptospirillumferrooxidans)~. 有较大的差异性,而与嗜铁钩端螺旋茵(却删一,呻一)的相似度达99.7%以上,属于同一类群.

关键词:4Lgg自养铁氧化细茵;16SrDNA;系统发育分析;嗜铁钩端螺旋茵 中图分类号:Q93文献标识码:A

Phylogeneticanalysisfor16SrDNAsequenceofthevibrioshaped

chemolithoautotrophiciron--oxidizingbacteriumML--04

LIUYing,QIFang—jun,LIUXiang—mei,ZHENGLi—zhen&YANWang—nling (StateKeylaboratoryofMicrobialTechnology,ShandongUniv,Jinan250100,Shandong,Cl

aim)

Ab5灯

act:Thesequenceof16SrDNAgenewasanalysedforthePCRproductofavibrios}laped,chemolithoautotrophiciron-oxi-

dizingbacteriumML-04.Aphylogenetictreewasconstructedbycomparingwiththepublished16SrDNAsequencesoftherelative

bacteriaspecies.InthephylogenetictreeML-04andtl1reeLeptospirillumferriphilumstains

constituteabranchandL.fe,T/~一

lumFairview,L.,呻

mATCC49881alethetwoclosestrelativewithlnorethan99.7%sequencesimilarity.Theresultsin—

dicatethatstrainML-04isbelongtoLeptospirillumferriphilum. Keywords:Mederatelythermophiliciron—

oxidizingbacterium;16SrDNA;Phylogeneticanalysis;Leptospirillumferriphihun 螺旋状专性化能自养铁氧化细菌是1类只能够

利用二价铁为电子供体,氧作为电子受体的嗜酸性

细菌.由于这类细菌可以直接氧化硫化矿物,且大量

分布在持续浸提的含砷金精矿反应池中,表明这类

细菌在微生物浸矿过程中具有重要的作用,对这类

细菌的研究也开始引起人们的关注"..

专性化能自养铁氧化细菌在研究过程中存在较

多技术难点.难点之1是由于它们为化能自养,有机

质的存在对其生长具有抑制作用,在琼脂糖或琼脂

固体平板上难以生长,因而对其分离纯化带来了很

大困难.难点之2是缺乏足够和典型的理化鉴别特

征,在相当长的时间内无法对所分离的螺旋状专性

化能自养铁氧化细菌进行鉴别和分类bJ.

随着分子生物学的不断发展,一些分子生物学

技术如G+C含量的测定,DNA.DNA杂交技术,16S

rDNA序歹分析,RAPD技术,16S-23S序列分析,限制

性酶切位点分析等技术已应用于这类细菌的分类鉴

定,并成功地利用这些分子生物学特征,将螺旋状专 性化能自养铁氧化细菌区分为2个不同的种,即氧 化亚铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferrooxidans)和嗜铁 收稿日期:2004-02—25

基金项目:国家自然科学基金资助项目(50174034,30170026)

作者简介:刘缨(1976-),女,助工,学士,主要从事白养微生物的分子生物学研究

第5期刘缨,等:螺旋状专性化能自养铁氧化细菌ML-04菌株的分子鉴定l13

钩端螺旋菌(Leptospirillumferriphilum)-9].

本室曾成功地利用双层平板技术[1,从云南腾 冲地区高温温泉边酸性水中分离得到1株螺旋状专 性化能自养铁氧化细菌ML.04.本研究中我们对该 菌株16SrDNAPCR扩增产物的序列进行了测定,对 所测序列进行了16SrDNA系统发育分析和酶切位 点分析,结果表明,该菌株与钩端螺旋菌属的嗜铁钩 端螺旋菌(Leptospirillumferriphilum)属于同一类群. 1材料与方法

1.1菌株

ML-04菌株由云南腾冲地区高温温泉边酸性矿 水中分离得到.螺旋状,革兰氏阴性,大小(0.25, 0.30)×(1.O0,3.O0)/lm.菌落为圆形,琥珀色,直 径1,3mm,凸起,光滑.中度嗜热嗜酸铁氧化细菌, 最适生长温度40?,最适生长pH2.5,能氧化硫酸 亚铁和黄铁矿,不能氧化硫磺,硫代硫酸盐及四硫酸 盐,不能利用有机物为能源进行生长,属于化能自养 型微生物.

1.2培养基

在9K培养基l?的基础上,设计液体培养基配 方如下:

基础盐:(Nit,)2S043g,KC10.Ig,K2I-IPO40.5

g,MgSO,'7H200.5g,Ca(N03)20.O1g,ZnS04'7H20

0.O1g,微量元素液1mL,用H2S04调pH至2.5,加

水定容至1000mL,高压灭菌.FeSO,溶液过滤除菌

后加入,使终质量分数为5%.

微量元素液:CuS04?5H/01g,MnS04?4H201g, COS04'7H201g,Na2B4o7'4H2o1g,NaMo04'2H20

1g,加水定容到1000mL.

1.3ML-04菌体的培养和收集

ML-04菌株接种到液体培养基中,40?摇床培

养6d,低速离心(3O00r/min,10min)除去沉淀,高速

离心(12000r/min,30s)收集菌体.

1.4ML-04染色体DNA的提取

染色体DNA的提取见《常见细菌系统鉴定手

册》.

1.5ML-04菌株16SrDNA的PCR扩增

以提取的染色体DNA为模板,用通用引物

FC27,RC1492扩增16SrDNA片段,引物由上海生工 生物工程有限公司合成.正向引物(FC27):5. AGAG]ATCcTC觚AG3,反向引物(RC1492): 5一TAcGGCTAcCT他1TrAcGACTr..3.PCR反应体系 (100)为:10×PCR缓冲液10,MgCl'(25retool/ L)10L,dNTP(10mmoLIL)4L,弓I物FC27(62.5 /maol/L)和引物RC1492(62.5/maol/L)各2,模板

DNA(约50n)4,TaqDNA聚合酶(5U/t~L)1.5 .

94?变性5min后进入循环,94?1min,52?

1min,72?3min,33个循环;最后72?延伸10min. 用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分离,切下扩增

片段条带,用OmegaBio-Tek公司的凝胶回收试剂盒 (E.Z.N.A@GelExtractionKit)回收.

1.616SrDNA的全序列测定

回收纯化后的PCR产物用Beckman公司的 DNA测序试剂盒(cEDTCS.QuickStartKit)进行 测序PCR反应,用CV,Q2OOOxL全自动DNA测序仪 进行序列测定.

1.7系统发育树的构建

将菌株MTH.04的16SrDNA序列提交到Gen. Bank数据库,并通过Blast程序进行序列比较,用 ClustalX及Njplot得出系统发育树状图. 1.8限制性酶切位点分析

用DNAMAN软件,选择AgeI,ApaI,Avr1I, BfrI,EcoRV,IBndHI,l,:pnI,MroI,NcoI,

Sac1I,SmaI,ssp工,Stu工酶对氧化亚铁钩端螺 旋菌(L.ferrooxidans),嗜铁钩端螺旋菌(L.ferriphi.

1um)和ML-04菌株进行酶切位点分析,绘制酶切图 谱.

2结果与分析

2.1ML-04菌株的16SrDNA序列分析

ML-04菌株的16SrDNA序列扩增片段琼脂糖 凝胶电泳见图1.扩增片段长1450bp,在GenBank中 的序列登记号为AY485647.以16SrDNA同源性为 基础构建系统发育树,见图2.在系统树中,ML-04处 于Leptospirillumferriphitwn分支中,与菌株.1厂er. riphilumFairview及L.ferriphilumATCC49881的相似 性最高,均为99.7%;与L.ferriphilumWarwick的相 似性为98.4%.L.ferroox/dans菌株在另1个分支 中,ML-04与L.ferroox/dans分支中的各株菌相似性

在92.7%,93.2%之间;与红色链孢霉(Nitrospira

moscoviensis)的相似性为8O.9%.

114山东大学(理学版)第39卷

一

2ooO

一1ooO

?----?—-?一

750

—5o0

—

25O

—loo

图1ML-04菌株16SrDNAPCR扩增片段的电泳图 1:PCR产物,2:标记(DI~2000). Fig.1Electrophoresisforthe16SrDNAPCRproductof

ML-04strain

1:PCRproduct,2:Marker(DL-2000).

2.216SrDNA基因的限制性酶切位点分析 氧化亚铁钩端螺旋菌(L.尼rr.眦池ns),嗜铁钩 端螺旋菌(L..

屉哪啪)和ML-04菌株的16SrDNA 基因限制性酶切图谱见图3.ML-04菌株与L.厂盯_ riphgum的酶切图谱相近,而与L.厂e船的酶 切图谱具有明显的差异.

3讨论

迄今为止,钩端螺旋菌属(Leptospirillum)菌株报 道的很少,已报道的有4类.1972年,Markosyan报道 了1株螺旋状铁氧化细菌,并定种为氧化亚铁钩端

螺旋菌(L.p,-r~),这是有关钩端螺旋菌的首

次报道[1引.1992年,Golovacheva等人报道了1株中度 嗜热氧化亚铁钩端螺旋菌(L.thermof~), 图2基于16SrDNA序列同源性的菌株ML-04和其他相关细菌的系统发育树? Fig.2Phylogenefictreederivedfromthe16SrDNAsequenceofML-04andrelative8ll~in$

lL

.

fe~dans

耋夏蓍喜虿墨雾薹耋摹蓦

lL

.

fernphHum

霉夏季蓍荤零睾

MI,O4145o

图316SrDNA基因的限制性内切酶分析图谱

Fig.3Mapofrestrictionendonucleasecuttings.

iteswithinthe16SrDNAgene

第5期刘缨,等:螺旋状专性化能自养铁氧化细菌ML-04菌株的分子鉴定ll5 但L.thermoferrooxidans已在保藏过程中丢失阻.

2000年,Bond等人依据废弃黄铁矿样品中DNA提

取物的16SrRNA序列分析推测出的结果,报道可能

还有1类钩端螺旋菌的存在,但该菌在实验室中一

直未能成功分离和培养l引.2002年,C0r硼和Rawl—

ings研究了l6株钩端螺旋菌属的菌株,把它们分为

2个不同的类群,其中1个类群是L.ferrooxidans,而

把另1个类群定名为三.ferriphilum.三.ferrooxidar~ 和L.ferriphilum在形态,生理生化特性方面无特征

性差异,但基于分子生物学水平的研究,如G+C含

量,DNA.DNA杂交,16SrDNA序列分析,16S一23S序 列分析,限制性酶切位点分析,两者均有不同". Leptospirillum属菌株在生物浸矿工业中的作用 也逐渐得到人们的认识和关注.通过16SrDNA序列 分析,荧光免疫技术,DNA—DNA杂交等技术,人们从 工业化连续浸矿系统中常常检测到Leptospirillum属 菌株,并发现它们在浸矿微生物种群中占优势地 位n锄].1999年,Rawlings等人报道,Leptospirillum属 菌株比氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillusfe,'rooxida,~),氧 化硫硫杆菌(Thiobacillusthiooxidans)具有更高的氧 化还原电势和更低的pH生长范围,生长不受高浓 度三价铁离子的抑制,在工业化生产的连续反应浸 矿系统中,Leptospidllum对浸矿起主导作用一.2002 年,Coram和Rawlings还发现,从南非Fairview矿区 砷黄铁矿连续浸提罐中检测到的螺旋菌都是. r—

riphilum;并报道了在螺旋菌属的菌株中,L.ferriphi— lum可以在35?至45?的温度下生长,而L.ferro. ox/dans只对35?以下的工业浸矿发挥重要作用. 由于钩端螺旋菌属在工业生产中具有重要的作 用,该属细菌资源的发掘及其浸矿特性的研究,对生 物浸矿技术的发展和应用具有十分重要的意义. 本室利用双层平板技术,从云南腾冲地区高温 温泉边酸性水中分离得到1株螺旋状专性化能自养 热铁氧化细菌ML-04,该菌株可有效浸出砷黄铁矿 中的铁和硫,在实际生产中具有潜在的应用价值.为 了进一步确认这1新分离的菌株,本研究对其16S

rDNA序列进行系统发育分析,结果显示,ML.04和L.居不啪具有很高的相似性,对其16SrDNA序

列进行限制性酶切位点分析,结果也表明,ML-04菌

株与L.ferriphilum16SrDNA序列的限制性酶切图

谱相近.

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(下转第121页)

第5期鲁敏,等:绿化植物受大气s02,铅复合污染伤害特征及抗性表现l2l

3结论

污染物的排放在对植被产生伤害的同时植物对

这种因素的胁迫产生了适应性的改变,一些植物对

污染物的敏感性,耐性,抗性或解除作用等方面产生

多方向的演化n...通过观测调查冶炼厂附近栽植的

树木其生长发育及叶部受污染物伤害的反应判断,

大气SO2,铅复合污染对植物造成的危害明显,不同

的植物及在污染区所处的位置反映出了不同的伤害

症状,从而表现出了不同的抗性程度.一般来说,距

离污染源越近,树木受到的伤害程度也越重;而相同 的植物栽植在污染源的主导风向的下风方向的树木 比栽植上风方向的树木受害程度重.常绿针叶树比 阔叶树抗性弱或敏感.

试验结果表明:对以sO2,铅为主复合污染物的 抗性树种有:花曲柳,桑树,皂角,山桃,黄檗,臭椿, 紫丁香,忍冬,柽柳,桧柏,枸杞,水蜡,刺槐,色赤杨, 加拿大杨,黄刺枚,玫瑰,白榆,茶条槭;敏感监测树 种有:连翘,榆叶梅,锦带花,风箱果,云杉,油松,樟 子松,山槐.

在城市生态环境和绿化建设中,合理应用以上 筛选出的抗性树种和敏感树种,将在环境污染的治 理和监测中发挥积极的作用.

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(于善清)

(上接第115页)

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(编辑:于善清)

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