范文一：骨骼肌成肌细胞移植研究

骨骼肌成肌细胞移植研究

张斌 1　黄富国 2

　　 【摘　要】 　　目的　 回顾近年国内外骨骼肌成肌细胞移植的相关研究进展 。　 方法　 广泛查阅近期成肌细胞培 养 、 移植方法改进 、 移植前受体和细胞准备 、 支架材料的选取 , 以及机体免疫情况对移植效率的影响等相关文献 , 探讨如 何提高成肌细胞移植效率 。　 结果　 近年成肌细胞移植技术不断改进 , 移植效率不断提高 。　 结论　 骨骼肌成肌细胞移 植具有潜在的临床价值和广泛的应用前景 。

【关键词】 　　 组织工程　　成肌细胞　　移植

中图分类号 :Q 813. 1　 R 685　　文献标识码 :A

D EVELOP M ENT IN TRANSPLANTATI ON OF THE SKEL ETAL M USCL E MYOB LAST ZH A N G B in , H UA N G F ug uo . D ep a rt m en t of O rthop ed ics , P eop le ’ s H osp ita l of S ichuan P rov ince , Cheng d u S ichuan , 610072, P . R . Ch ina Corresp ond ing au thor :H UA N G F ug uo

【 Abstract 】 　　 Objective 　 To review the research p rogress in tran sp lan tati on of the skeletal m u scle m yob last . M ethods 　 T he recen tly 2pub lished articles concerned w ith the m yob last tran sp lan tati on w ere review ed , including m yob last cu ltu re , modified tran sp lan t m ethods , p reparati on of the reci p ien t , scaffo ld cho ice , and an influence of the reci p ien t’s i m m un ity on the tran sp lan tati on . How to i m p rove the efficiency of the m yob last tran sp lan tati on w as also discu ssed . Results 　 T he techn iques of the m yob last tran sp lan tati on w ere i m p roved and tran sp lan tati on efficiency w as increased . Conclusion 　 T he tran sp lan tati on of the skeletal m u scle m yob last has a great po ten tial value in clin ical p ractice and a p rom ising fu tu re in its clin ical app licati on .

【 Key words 】 　　 T issue engineering 　　 M yob last 　　 T ran sp lan tati on

　　临床上利用传统方法治疗骨骼肌严重损伤和许多 遗传性疾病 (如肌营养不良症 ) 效果不佳 。 组织工程学 的诞生给组织和器官的修复带来了光明的前景 , 利用 预先构建具有生命活性的种植体 , 植入体内 、 修复组织 缺损 , 替代组织 、 器官的一部分或全部功能 , 从而达到 提高生活 、 生存质量 , 延长生命活动的目的 。 肌组织工 程的研究是利用不同来源的肌细胞替代和修复相应的 肌组织 , 如成肌细胞修复骨骼肌 , 其目的在于使再生组 织成为具有正常功能的骨骼肌组织 , 治疗原有的缺陷 或功能障碍 。

1　历史回顾

自 M au ro 等 (1961) 发现骨骼肌卫星细胞可能是 产生肌细胞的前体细胞以来 , 肌再生及其相关问题已 成为近代肌组织创伤修复研究的焦点 , 许多学者对非 创伤性肌病尤其是遗传性肌组织疾病的病因 、 病理基 础作了较为深入的研究 。 W eb ster 等 (1990) 指出杜兴 肌营养不良 (D uchenne m u sclar dystrop hy , DM D ) 患 者的成肌细胞缺乏是由于成肌细胞过度消耗并继发再

作者单位 :1四川省人民医院骨科 (成都 , 610072) ; 2四川大学华 西医院骨科 (成都 , 610041)

通讯作者 :黄富国 , 副教授 , 硕士导师 , 研究方向 :创伤修复与功能 重建 生能力不足 ; 并发现再生组织由纤维组织和脂肪组织 代替 。 进一步的研究认为 , 成肌细胞移植入受体体内并 与受体肌细胞融合为杂合的肌纤维是成肌细胞移植治 疗肌肉固有疾病的基础 ; 成肌细胞与宿主肌纤维融合 产生合胞体肌细胞 (混合肌纤维 ) 携带正常基因 , 由此 产生相应正常的产物 , 而治疗了宿主的基因缺陷 。 从 90年代初期开始了较深入的成肌细胞移植研究 。

2　研究现状

目前肌组织种子细胞的选材及培养方面有了较为 成熟的技术 , 但移植的效果并不令人满意 。 原因包括移 植前细胞的准备 、 支架材料的选取 、 受体准备和机体免 疫情况等 。

2. 1　成肌细胞培养

骨骼肌组织工程研究的种子细胞是成肌细胞 。 成 肌细胞培养最经典的就是按照类似 B lau 等 [1]的方法 , 采用胰蛋白酶与胶原酶混合分步酶消化法分离出成肌 细胞 。 以 F 12为基础培养基 , 通过添加不同浓度的血 清 , 并辅以缓冲液配制成常规的生长培养基或者融合 培养基 。

近年来成肌细胞培养的条件与技术不断改进 , 并 对影响成肌细胞增殖与分化因素展开了研究 , 如各种 生长因子 、 激素等 。 N ap ier 等 [2]发现类胰岛素生长因 ? 9 4 8

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子 (in su lin 2like grow th facto r , IGF 2 ) 可以防止 成肌细胞凋亡 , 在协同因子的作用下可促进成肌细胞 增殖 , 但却不是直接的刺激因子 ; Stew art 等 [3]指出 IGF 2II 的作用则在于加强成肌细胞的分化功能 。 IGF 2I 在非大鼠的原代培养基或 L 6细胞系的分化培养 基中 , 在低浓度水平就有活性 ; 微量的表皮生长因子 (ep iderm al grow th facto r , EGF ) 在绵羊原代成肌细胞 的培养中显示了高促进合成代谢的能力 ; 牛血清中提 取的生长激素对绵羊成肌细胞增殖没有影响 , 然而在 L 6系大鼠成肌细胞培养时 , 高浓度的生长激素却显示 抑制蛋白质的分解等 。 Ku jaw a 等 (1986) 研究发现透明 质酸具有促进成肌细胞增殖 、 抑制分化的作用 , 并对成 肌细胞融合的抑制不是永久性的 , 不同于其它抑制融 合和生成肌纤维的过程 。

2. 2　如何提高成肌细胞移植的效率

组织工程培养成肌细胞的目的在于用工程化的细 胞来修复受损组织 , 并达到改善组织功能的要求 。 但成 肌细胞移植实验开展以来 , 无论是对遗传性肌病还是 肌组织的严重损伤 , 其修复效率并不令人满意 。 虽然有 证据证明移植的成肌细胞成活并融入受体组织 , 但对 受体功能的改善还远没有达到令人满意的程度 。 涉及 成肌细胞移植过程的各个方面的改进都将影响到移植 效率的提高 , 并进一步影响到受体功能的改善 , 从更深 层次上来说 , 它关系到成肌细胞移植或细胞介导的基 因治疗的前景 。

2. 2. 1　成肌细胞悬液浓度　简单地提高细胞移植的 浓度并不能无限制的增加植入的成肌细胞与宿主肌纤 维的融合 [4]; R ando 等 [5]研究 , 成肌细胞悬液在 5×104~2×105个 5Λl 时 , 成肌细胞数与宿主细胞融合 率呈正相关 , 再提高成肌细胞浓度 , 其融合率并不增 加 。 Yao 等 [6]发现植入的成肌细胞部分作为肌前体细 胞保存下来 , 似乎也证明了局部组织存在有活性的成 肌细胞数量上的饱和问题 。

2. 2. 2　多点注射成肌细胞　成肌细胞缺乏移动性 , 这 也被许多研究所证实 [4, 5, 7]。研究发现损伤并不诱导注 入的成肌细胞迁移 [5], 而在 DM D 患者中 , 肌纤维间密 集的纤维和脂肪组织的沉积抑制了肌前体细胞的移 动 , 且影响了成肌的效率 。 为了克服此问题 , 多数研究 者都采用了多点注射成肌细胞悬液的方法 。 然而 , 成肌 细胞移植的注射点增加有限 , 对成肌细胞分布范围的 改善作用仍不令人满意 。

2. 2. 3　成肌细胞移植前受体的准备　成肌细胞移植 进入受体组织内 , 其存留 、 增殖 、 分化并与宿主细胞融 合为杂合肌纤维 , 整个过程不仅与移植细胞的活性有 关 , 还与移植受体的全身或局部的状态有密切的关系 。 面对不同的情况 , 有针对性地改善机体全身或局部组 织条件 , 将有利于细胞移植效率的提高 。

例如为了提高植入的成肌细胞的移动性 , 虎蛇毒 素曾被用来预处理受体肌肉 [8], 虽然此方法提高了成 肌细胞的移植效率 , 但虎蛇毒素具有导致肌红蛋白尿 , 乃至肾功能不全的危险 , 临床可行性较差 。 To rren te 等 [8]也研究了虎蛇毒素及基质金属蛋白酶 (m atrix m etallop ro teinases , MM P s ) 等预处理受体肌肉的作 用 :发现在提高成肌细胞迁移性方面 , 胶原酶 、 基质溶 解因子和虎蛇毒素的混合物比胶原酶和基质溶解因子 的混合物更有效 , 而虎蛇毒素的效率最低 ; 并同时发 现 , MM P s 明显有利于成肌细胞的迁移 。

对遗传性肌病的处理则有所不同 , 由于肌组织内 成熟肌纤维的功能障碍 , 在早期诱使自身的成肌细胞 代偿性增殖 、 融合 , 然而新生的肌纤维仍改变不了其基 因的缺陷 , 此时移植的成肌细胞又往往受到宿主自身 成肌细胞的竞争性抑制 , 因此在成肌细胞移植前对受 体施行适当的处理以抑制其自身的成肌细胞活性是有 必要的 。 90年代 , M o rgan 等通过对受体局部组织用 X 线照射的方法提高了成肌细胞移植的效率 。 后来的研 究 证实 , 接受成肌细胞移植的动物经高剂量的 X 射线 照射后 , 其自身体内的肌前体细胞被破坏 , 移植的成肌 细胞可以移动到接受移植而出现肌再生的组织附近 ; 同 时没有接受 X 射线照射的对照组 , 就几乎没有观察 到成肌细胞的移动 。 W ern ig 等 [9]研究了经 X 射线照射 后再生的肌纤维的功能 , 发现虽然肌纤维再生明显增 加 , 但由于神经再生的缺乏 , 其再生肌纤维的功能明显 受限 。

在目前的研究中 , 对移植受体的处理虽然有一定 的效果 , 但均不是很理想 。

2. 2. 4　移植成肌细胞的准备　已知多种生长因子影 响体外培养的成肌细胞的增殖 、 分化后 , 许多研究者尝 试利用生长因子的刺激来提高成肌细胞移植效率 。 K ino sh ita 等 [10]在成肌细胞移植前 2d , 将碱性成纤维 细胞生长因子 (basic fib rob last grow th facto r , bFGF ) 100ng m l 加入培养基中 , 发现培养基中的单核成肌细 胞数增加 34%, 而肌小管的形成却减少 。随后 , 将 Β2半 乳糖苷酶标记的成肌细胞植入没有作预处理的肌肉 中 , 3d 后移植细胞的存留数在实验组和对照组没有 显示出差别 , 而 4周后发现实验组的 Β2半乳糖苷酶阳性 肌纤维数明显多于未用 bFGF 组 (超过 4倍 ) 。 Ito 等 [11]采用类似的方法 , 将半刀豆球蛋白 A 20Λg m l 在移植 前 2d 加入成肌细胞培养基 , 然后植入未作预处理的 同种异体肌组织 , 移植 4d 后 , 发现实验组成肌细胞迁 移的范围是对照组的 3倍多 。 这些实验为提高人类成

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肌细胞移植效率作了有益的探索 。

近年来 , 更多的研究则集中在改良移植细胞自身 性状上 。 To rren te 等 [8]则在研究针对移植受体作预处 理工作的同时 , 比较了能产生 MM P s 的 C 2C 12成肌细 胞系和不能产生 MM P s 的转基因 T n I L acZ 细胞系的 短期和长期移植效率 。 结果发现移植 2d 后 T n I L acZ 细胞系的迁移能力较差 , 而 C 2C 12成肌细胞系通过产 生 MM P s , 植入的细胞自身对移植部位的肌肉组织作 了处理 , 表现为移植的成肌细胞迁移能力明显加强 , 是 前者的 4~5倍 ; 而移植 15d 后 , T n I L acZ 细胞系的迁 移距离才略有增加 , C 2C 12成肌细胞则已显示出与宿 主肌纤维的融合率明显增加 。

2. 2. 5　支架材料的选择　在成功地培养出成肌细胞 后 , 支架材料的选取就成了工作的重点 。 所谓支架材料 就是细胞依托生长的三维框架结构 , 应具有良好的组 织相容性和细胞相容性 , 并有与细胞生长配合良好的 降解过程 。 从组织结构上看 , 骨骼肌组织由大量成束的 肌纤维细胞组成 , 电镜下可见与其细胞紧贴的是基膜 , 其主要化学成分为 型胶原 。 正常情况时基膜满布毛 细血管 , 营养并支持肌纤维 , 而在受伤时 , 基膜又是肌 细胞再生的 “地图” , 能诱导肌纤维再生 。 基膜只要未受 损伤 , 比如在冻伤的情况下 , 肌组织就能再生性修复 , 完全恢复肌肉的结构与功能 。 在完整基膜的诱导下 , 大 量毛细血管沿基膜生长 , 形成新的基膜 。 因此 , 基膜在 再生时作为微骨架或支架 , 引导肌细胞再生 。 那么基膜 作为一种天然支架材料 , 能与机体相容 , 能诱导并引导 再生 , 能逐渐被分解 、 替代 , 是一个优良的支架材料 。 在 成肌细胞移植的应用上 , 基膜或 型胶原的获取相当 困难 , 如果寻找其类似物 , 型胶原凝胶是较理想的支 架材料之一 。

型胶原本身具有促进成肌细胞贴壁 、 促细胞分 化 , 提高成肌细胞融合率等功能 。 将成肌细胞混合于 型胶原溶液中 , 在 37℃孵箱内形成含活成肌细胞的胶 原凝胶 。 如果在从液态到固态的过程中 , 使其按需要塑 形 , 在特定的力学环境下 , 可塑形为管状 、 螺纹管状及 片状等 , 成为人体管型组织工程研究的含活成肌细胞 的支架 , 可用于多种管型组织工程组织的研究 , 如组织 工程血管 、 肠管及食管等 。 但 型胶原在植入受体后 , 如果不及时降解 , 也会给再生肌组织的功能带来负面 影响 。 因此 , 近年来许多学者在积极的寻找新型材料 , 使植入的成肌细胞能在受体内更好的生长 、 繁殖 、 分 化 、 成熟 , 更好地行使其功能 [12]。

L i 等 [12]在应用转基因的成肌细胞移植治疗神经 退化性疾病的实验中发现 , 用胶原将聚乙烯对苯二酸 酯 (po lyethylene terep h thalate , PET ) 涂层包裹的纱 线作为支架材料比单纯用胶原为支架材料的效果更 好 :与支架材料复合后的成肌细胞在体外培养的条件 下 , 分别测其生存能力 、 形态 、 神经营养因子 (ciliary new ro trop h ic facto r , CN T F ) 的分泌情况 , 发现用 PET 作为支架材料的复合体产生比以胶原为支架材料的复 合体多 8倍的活性细胞 , 而 CN T F 的分泌量是后者的 4倍 。 由此可以看到 , 良好的支架材料会给成肌细胞移植 带来更好的移植效率 。

2. 2. 6　克服移植免疫　由于组织相容性抗原的存在 , 除了自体移植以外 , 移植免疫是研究工作首要考虑的 问 题 。 临床上研究和应用最多的是同种异体移植 (allograft ) 问题 , 克服其免疫排斥反应常规的方法仍 是使用免疫抑制剂 。 研究证明 , 许多临床常用的免疫抑 制剂如环磷酰胺 、 环孢素 A 等都对抑制成肌细胞移植 引 起 的 免 疫 应 答 无 效 或 效 果 甚 微 [13, 14], 许 多 研 究 [7, 10, 11, 15, 16]认为 , 在小鼠与灵长类动物中 FK 506是有 效的免疫抑制剂 , Skuk 等 [15]在灵长类的动物实验中 发现成肌细胞移植时使用 FK 506可使移植的细胞存 活 1年以上 , 而撤消 FK 506后 , 移植细胞即被排斥 。 Sm ythe 等 [17]的研究却表明消耗 T 细胞比使用 FK 506更有效 , 并且 , 无论在组织相容性或不相容性的宿主中 均明显增加成肌细胞迁移的范围 , 认为它可以成为成 肌细胞移植的长期辅助方法 。 而在选用狗的实验中显 示无论自体移植还是同种异体移植 , 当不使用免疫抑 制剂时 CD 4+和 CD 8+淋巴细胞 2周内就开始渗透 , 标 志细胞免疫的出现 [18]; 单独使用 FK 506仅抑制抗体的 产生 , 标记的移植细胞存留仍不理想 , 当联合使用 FK 506、 环孢素 A 和 R S 61443时 , 显示良好的移植效 率 。 但同种异体移植的免疫排斥反应并不能完全避免 , 探讨改进抑制免疫的方法仍在不断地进行 。 白细胞介 素 12的 p 40亚单位 (p 40subun it of in terleuk in 12, I L 2 12p 40) 基因转染产物因抑制了辅助性 T 细胞介导的 免疫反应 , 所以 I L 212p 40的基因转染也是抑制同种异 体和基因改良细胞免疫排斥的有力手段 [19]。而单克隆 抗体的应用也是较有前途的疗法 , 如应用 O KT 单克隆 抗体处理受者 [20], 也有用抗 T 细胞抗原受体独特型的 单抗来防治排斥反应 , 这些在动物实验中已获得一定 效果 , 临床正在进一步研究 。 Schneider 等 [21]用表达 CTLA 42Ig 的 转 基 因 成 肌 细 胞 联 合 使 用 暂 时 的 抗 CD 154抗体 , 明显提高了同种异体移植的存活时间 。 Guerette 等 [22]研究了结合淋巴细胞表面的单克隆抗 体和重组体分子 CTLA 42Ig 用于主要组织相容性抗原 不相容的个体之间的移植 , 当联合使用抗 CD 4+、 抗 CD 8+以及抗淋巴细胞功能相关抗原和 CTLA 42Ig 时 比单独使用 CTLA 42Ig 处理移植效率明显高 , 但长期 ? 1 5

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效果仍较差 。 Pavlath 等 [23]短期使用环孢素 A 联合细 胞内黏附分子 21及白细胞功能相关分子 21的单克隆 抗体亦使移植的同种异体成肌细胞在较长时期内不被 排斥 。

当然 , 要彻底消除移植免疫 , 应尽量使用自体的细 胞移植 。 对于遗传性肌病 , 可以在自体肌组织中取得成 肌细胞并扩增后 , 用基因转染的方法 , 将正常的基因导 入其细胞的 DNA 中 , 再将细胞回植入机体肌组织 , 当 细胞与注射部位的肌细胞融合后 , 正常基因表达正常 产物从而起到治疗原有疾病的目的 。 M o isset 等 [24]采 用带 C M V 启动子的腺病毒多重转染 , 驱动 6. 3kb 的人 类抗肌萎缩基因 (c DNA ) , 并在体外测试其基因表达 。 在这些细胞的培养中 , 可以检测出抗肌萎缩 m RNA , m RNA 值与腺病毒转染率呈比例 。 当用转染有人类抗 肌萎缩基因 (dystrop h in ) 的 m dx 鼠较成肌细胞再植入 肌组织 , 在移植后 10、 24d , 大量标记肌细胞表达人类 抗肌萎缩基因 。 同时 , 人类抗肌萎缩 m RNA 也利用 R T 2PCR 技术检测到 。在 DM D 中 , 其自身成肌细胞培 养存在严重增殖能力不足的问题 。 H uard 等 [25]则将成 肌类基因转染到成纤维细胞中 , 即用逆转录编码得到 的 M yoD 1c DNA 导入 T n IL acZ 鼠的真皮层成纤维细 胞使之转化为类成肌细胞 , 增殖后用于移植 。 体内 、 外 实验均发现转染后的细胞能与其肌细胞融合 , 也能表 达抗肌萎缩蛋白 、 肌纤维蛋白和 Β2半乳糖苷酶 , 移植 30 d 后 Β2半乳糖苷酶阳性点仍明显可见 。 免疫应答是成 肌细胞移植用于临床的难点 , 也是目前研究的重点之 一 。

3　展望

骨骼肌成肌细胞应用前景广阔 。 将自体的成肌细 胞培育 、 增殖 , 甚至复合支架材料制成一定的形状后用 于修复骨骼肌严重缺损部位是传统治疗的一种良好替 代方法 , 而传统疗法往往需要牺牲一定部位的肌组织 。 早在上世纪 90年代初 , Gasson 和 L aw 就先后将成肌 细胞移植治疗人类的肌营养不良症 , 部分患者获得较 好临床效果 。 对于遗传性肌营养不良症 , 成肌细胞移植 的目的不仅在于提供大量的健康细胞再生肌纤维 , 更 在于通过移植细胞与宿主细胞的融合 , 带给宿主正常 的基因信息 。 成肌细胞移植不仅应用于修复骨骼肌 , 甚 至可用于再生能力差的心肌修复 , 这就表明在提高梗 塞后左心室功能方面 , 新生动物的骨骼肌成肌细胞同 心肌细胞一样有效 [26, 27]。

研究表明成肌细胞是哺乳动物体内能大量增殖 、 并具有较小迁移能力的前体细胞 , 具有与宿主肌纤维 融合的能力 , 可作为载体用于目的基因的转移 [28, 29]。 现在已可通过基因工程获得能表达人类 因子 、 促红 细胞生长素 [30]、 克隆形成刺激因子等基因产物的成肌 细胞株 , 为肌组织工程研究及临床应用奠定了基础 。

4　存在问题

成肌细胞移植作为肌组织严重损伤 、 遗传性肌病 以及基因治疗的潜在性治疗手段 , 如对于 DM D 在鼠 模型中成肌细胞移植成功 , 免疫排斥反应很容易被克 服 , 然而 , 类似的实验在人体 , 效果却不理想 。 基因治 疗 , 通过病毒载体或质体直接注入也在动物实验中获 得了成功 , 但用于临床仍有较大差距 。 目前仍有许多的 问题值得进一步探索 :肌前体细胞的最佳来源是什么 ? 怎样获得充足的细胞 ? 成肌细胞移植的最佳载体是什 么 ? 植入的细胞或基因的作用范围有多远 ? 移植的同 种异体细胞或引进的蛋白质的免疫排斥如何克服 ? 是 否引入的抗肌萎缩基因引起肌肉功能的改善 ? 基因治 疗能否在心肌上取得成功 ? 是否通过细胞或基因治疗 可以改善大量严重受损的骨骼肌 ? 每一个问题的解决 都需要更深入的研究 。

5　参考文献

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(收稿 :2005201214　　修回 :2005209222)

(本文编辑 :周淑英　李古波 )

?致读者?

关于中英文摘要书写格式要求

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交流 。英文摘要格式要求 :文题为英文大写 。作者在 3名以内 (包括 3名 ) 全部列出 , 超出 3名 , 后加 “ et a l ” 。姓名及省 、 市名用汉语拼

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希望作者在投稿或 (和 ) 修改稿时 , 按上述要求认真补充完整 , 并注意规范使用医学专业词汇 。

本刊编辑部

2006204218

?

358? 中国修复重建外科杂志 2006年第 20卷第 8期

范文二：骨骼肌卫星细胞的研究现状

骨骼肌卫星细胞的研究现状

阎振鑫 S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学专业 成都)

摘要:肌卫星细胞是目前公认的骨骼肌干细胞,负责骨骼肌生长和损伤修复。干细胞研究

成为医学研究领域的热点, 肌卫星细胞移植成为治疗骨骼肌损伤萎缩和心肌坏死的新的治疗 方案, 具有广阔的前景。 肌卫星细胞的体外培养中大多采用胰酶胶原酶两步消化法得到细胞 悬液。 在原代培养中最关键的是细胞的纯化。 防止成纤维细胞的污染, 主要是采用查速铁壁 的方法将细胞分离。 胰岛素多肽家簇、 MyoD 转录因子家族和 MEF2家族等对肌肉的形成起 重要的调控作用。

关键词:骨骼肌 卫星细胞 体外培养 干细胞移植

肌卫星细胞是小的单核梭形细胞, 是源于胚胎中胚层的干细胞, 在正常骨骼肌中, 它位 于基底膜与肌纤维浆膜之间, 处于静止状态。 当受到外界刺激, 在应激状态下可以分裂、 增 生,形成新的肌纤维,是骨骼肌再生的储备力量,负责骨骼肌的生长和损伤修复。因此 , 肌 卫星细胞特有的成肌能力倍受重视 [1-4]。目前,干细胞研究成为医学领域研究的热点,肌肉 干细胞因直接参与分化骨骼肌而受世人关注。 胚胎和成体内都存在肌肉干细胞, 成人体内存 在两类具有干细胞样特性的细胞,一类称为卫星细胞 (Satellite Cells , SC) 也叫成肌祖细胞 (Myogenic Progenitor Cell, MPC) , 另一类称为肌源干细胞 (Muscle Derived Stem Cell, MDSC) , 也叫群旁细胞 (Side Population S, SP) ,后者在数量上远少于前者。目前公认的肌肉干细胞 主要是指肌肉卫星细胞 [5]。

近年来,国外有报道将肌卫星细胞移植到冻伤的骨骼肌中,可改善肌肉功能 [6]。组织缺 损或器官功能障碍是人类保健中发生频繁、 危害性大、 花费高的问题之一。 近年来随着组织 工程技术的发展, 应用肌组织工程技术, 进行骨骼肌再生代替以往的手术方法修复动力性瘫 痪, 以其特有的优点避免了以往手术的缺陷, 为瘫痪肌肉的动力修复开创了一个崭新的研究 前景。 另外, 骨骼肌可能会通过分泌低分子量细胞因子即骨骼肌源性抑瘤物显著抑制肿瘤细 胞生长 [7-10]。现就肌卫星细胞的研究现状作一综述。

1肌卫星细胞的体外培养

1961年 Mauro 首先发现了肌卫星细胞,并推测肌卫星细胞实质上是一种处于休眠状态 下的成肌细胞 [11],是肌细胞核的一种来源。肌卫星细胞作为肌组织工程技术的种子细胞, 它的体外培养、鉴定及生物学特性已有大量实验研究,取得了显著的成果 [ 12 ]。培养肌卫星 细胞的材料来源,目前多数取自兔、鼠、犬、鸡等的肌肉组织,人体肌卫星细胞的培养已有 报道,培养方法多采用胰酶、 胶原酶分步消化,分离出单个成肌细胞,通过差速贴壁法去除 混杂的成纤维细胞, 再进行单层细胞培养。 在这些步骤中纯化卫星细胞防止纤维细胞的污染 是关键,在这个步骤中较好的做法是:采用 PrePlate 差速贴壁法进行细胞纯化,去除杂质细 胞的污染。将细胞接种于明胶包被的培养瓶中培养 2h ,贴壁细胞为 P1P ;未贴壁细胞悬液 转皿培养 12h ,贴壁的细胞为 P1P2;未贴壁细胞悬液再转皿培养 24h ,贴壁的细胞为 P1P3, 未贴壁细胞悬液转皿培养 24h ,贴壁的细胞为 P1P4;再次将未贴壁的细胞悬液转皿培养 24小时,贴壁的细胞为 P1P5。 P1P5培养 3d 后换液,以后隔天换液 1次,倒置显微镜下观察,

待细胞生长至 70%汇合度后传代培养。

骨骼肌卫星细胞属于组织干细胞, 其体外培养的优点是取材方便, 产量大, 具有较强的 增殖分化能力,营养条件好 , 如培养基中加入 15 %~20 %的动物血清 (即生长培养基 ) ,成肌 细胞以分裂、 增殖为主。 一旦成肌细胞长满整个培养瓶, 相互接触时, 增殖将明显受到抑制, 表现为相邻成肌细胞相互融合,形成肌小管, 表现出分化倾向。 降低培养液中营养条件, 如 动物血清不超过 5 %(即融合培养基 ) ,能明显促进分化,使单位数目的成肌细胞形成肌小管 的百分比增加。因此骨骼肌卫星细胞在肌组织工程研究中具有广阔的应用前景 [13],临床应 用奠定了良好的基础。

2 调控肌卫星细胞发育的相关基因及各因子

胰岛素样生长因子 (IGFs)属胰岛素多肽家簇, 主要包括 IGF-1和 IGF-2两种, 分别由 70和 67个氨基酸组成,结构上有 62 %相同 , 据文献报道肌肉损伤后 15 h可见再生骨骼肌细胞 和肌卫星细胞表达 IGF-1。 IGF-1和 IGF-2在发育骨骼肌中高水平表达,但在成熟骨骼肌水 平很低 [14]。睫状神经营养因子 (CNTF)是一种具有神经营养功能的酸性蛋白质,近年来的研 究发现它对肌肉也有营养作用 , 其作用途径可分为两个方面:一方面通过对肌肉的直接营养 作用维持正常骨骼肌的形态和功能,参与神经肌肉损伤的修复。坐骨神经损伤后,大量的 CNTF 被释放, 同时骨骼肌睫状神经营养因子受体 α亚单位 (CNTFRα)的表达量增加数十倍, 这种 CNTF 和 CNTFRα的协同作用可能在神经肌肉损伤修复中具有重要作用。另一方面 CNTF 能改善去神经所致的骨骼肌萎缩和继发性功能丧失, 现已有人开展了用 CNTF 防止骨 骼肌去神经性萎缩的药效动力学研究。

MyoD 转录因子家族对于肌形成是必须的 [15],作为成肌调节因子 (MRF)家族四成员 (MyoD、 MRF5、 myogenin 、 MRF4) 之一,肌分化因子 (MyoD)不仅可促使静止期的肌卫星细 胞向成肌细胞转化 , ,且能把许多种类型细胞 (如成纤维细胞、脂肪细胞等 ) 转化为成肌细胞, 并可促进成肌细胞进一步融和、分化为成熟的肌纤维。在肌形成肌肉特异基因转录调控中 MyoD 起着总开关的作用,可以结合到肌细胞生成素 (myogenin)、肌酸激酶 CK 、肌球蛋白、 结蛋白等基因启动子区发挥重要调控作用, 促进它们的转录激活。 MyoD 基因家族成员以肌 肉特异性基因转录激活物的形式发挥作用 [16], 它们具有 bHLH 结构域 , 与肌肉特异性基因调 控区常见的顺式作用元件 E-box 结合。

MEF2(myocyte enhancer - bingding factor2) 家族的 4个成员 MEF2A - D的表达有助于肌 肉特异性基因的激活 [17 ],它们与 MyoD 基因家族成员具有正协同作用。目前在小鼠中已经 证实, myogenin 中含有 MEF2转录因子的结合位点, MyoD 家族的其它成员中尚未见相关 报道。目前有两种机制来解释 MEF2转录因子的作用模式 : MEF2 通过其转录激活结构域直 接与肌肉特异性基因启动子或增强子结合, MEF2可能作为生肌作用的一种强制性辅助因子 (cofactor)与 MyoD/ E12 杂和二聚体发生相互作用 [18 ,1 9 ]。

图 1 MyoD基因家族成员与其它因子的相互作用 [20]

3 肌卫星细胞移植对骨骼肌及心肌再生的作用

Koh 等 [21]1993年首次报道了将卫星细胞 C2C12系成功移植到正常小鼠心脏, 并观察形 成具有骨骼肌细胞特征的多核肌管, 从此掀开了骨骼肌卫星细胞移植治疗心梗的新篇章。 由 于卫星细胞可以从病人自身获得, 此研究在临床上具有广阔的应用前景。 肌卫星细胞作为一 种治疗心肌梗死的供体细胞具有较多的优点, 包括在体外有增殖能力, 在缺血组织内仍然能 够成活, 能够进行自体移植等, 但其标记问题一直是困绕人们的难题之一, 尤其是超微结构 研究方面。 但目前在供体细胞的选择、 标记追踪方面存在很多的分歧, 治疗机制也不十分清 楚 [22-23]。

长期失神经支配的骨骼肌, 肌卫星细胞含量下降, 肌细胞核数量也下降, 肌纤维变性坏 死。 当神经再支配时,由于肌卫星细胞耗竭,肌细胞再生能力下降, 影响了骨骼肌功能的恢 复。 因此, 增加骨骼肌中的肌卫星细胞能够促进肌纤维的再生, 可提高神经修复手术的疗效。 由于近年来对肌卫星细胞成肌规律的进一步了解, 骨骼肌再生修复动力性瘫痪的研究受到了 医学工作者们的重视并已取得了瞩目的进展, 为瘫痪肌肉的动力修复开创了一个崭新的研究 前景。

4 肌组织工程的应用前景

肌卫星细胞作为肌组织工程的种子细胞来修复瘫痪肌肉, 以恢复肌肉动力的功能有广阔 的前景和实用价值。目前,肌卫星细胞与Ⅰ 型胶原凝胶复合研究较多,Ⅰ 型胶原能促进肌卫 星细胞贴壁,而且在体外能很好地促进肌卫星细胞分化,使肌卫星细胞融合的百分比增加。 目前研究较多的是肌卫星细胞的体外培养及增殖, 将该细胞移植到体内的成肌效应目前研究 甚少。 因为肌组织工程技术距临床应用还有很大的差距, 所以还需大量的研究工作来完善肌 组织工程技术,为临床应用打下坚实的理论与实验基础。

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范文三：小鼠骨骼肌细胞使用说明

小鼠骨骼肌细胞

小鼠骨骼肌细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。

派瑞金提供的小鼠骨骼肌细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠骨骼肌细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV 、HBV 、HCV 、支原体、真菌及其他类型的细菌。

小鼠骨骼肌细胞注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。

3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件; 建议使用派瑞金的完全培养基。

4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。

小鼠骨骼肌细胞产品简介： 产品名称：小鼠骨骼肌细胞 组织来源：小鼠肌肉组织

产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶

小鼠骨骼肌细胞简介：

小鼠骨骼肌细胞分离自鼠肌肉组织，细胞多呈梭行，具有一定的方向性。刚开始的细胞呈单个圆形或梭形，处于有丝分裂后期，细胞的活动性强，核成椭圆形，位于细胞中央，胞质内嗜碱性逐渐变为嗜酸性。

本公司生产的小鼠骨骼肌细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度75%~85%，且不含有HIV-1、HBV 、HCV 、支原体、细菌、酵母和真菌等。 5、培养基信息：

小鼠骨骼肌细胞培养基类型：

DMEM 培养基(GIBCO，添加NaHCO3 1.5g/L，Sodium Pyruvate0.11g/L)； 添加因子：优质胎牛血清10%，细胞生长因子等。

小鼠骨骼肌细胞使用方法：

1. 取出25cm 2 培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。 2. 待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。 3. 细胞传代

1) 吸出25cm 2培养瓶中的培养基，用PBS 清洗细胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL 至培养瓶中，37℃温浴3min 左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化； 3) 用吸管轻轻吹打混匀，按1:2的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL ，放入37℃，5% CO2细胞培养箱中培养；

4) 待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

小鼠骨骼肌细胞注意事项：

1. 培养基于4℃条件下可保存3-6个月。

2. 在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。

3. 传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。

4. 该细胞只可用于科研。

备注：由于实验所用试剂与操作环境的不同，以上方法供各实验室参考。

小鼠骨骼肌细胞其他相关小鼠原代细胞：

小鼠小肠粘膜上皮细胞 小鼠肺微血管内皮细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞 小鼠气管上皮细胞 小鼠气管平滑肌细胞 小鼠肺成纤维细胞 小鼠支气管上皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞 小鼠肺大动脉内皮细胞 小鼠肺动脉成纤维细胞 小鼠肺大静脉内皮细胞 小鼠气管和支气管上皮细胞 小鼠胰岛细胞 小鼠胰腺星状细胞

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小鼠视网膜微血管内皮细胞 小鼠小梁网细胞

小鼠视网膜色素上皮细胞 小鼠视网膜muller 细胞 小鼠虹膜色素上皮细胞 小鼠晶状体上皮细胞 小鼠角膜上皮细胞 小鼠视网膜神经节细胞 小鼠角膜成纤维细胞 小鼠脉络膜血管细胞 小鼠牙乳头细胞

小鼠肝外胆管上皮细胞 小鼠肝Kupffer 细胞 小鼠骨髓间充质干细胞 小鼠下丘脑神经元细胞 小鼠睾丸支持细胞

小鼠心肌微血管内皮细胞 小鼠真皮微血管上皮细胞 小鼠胚胎成纤维细胞 小鼠心脏干细胞 小鼠神经干细胞

小鼠骨髓来源内皮祖细胞 小鼠椎间盘髓核细胞 小鼠肾足突细胞

小鼠肾小管平滑肌细胞 小鼠肾成纤维细胞 小鼠尿道上皮细胞 小鼠输尿管上皮细胞 小鼠肾管状上皮细胞 小鼠心肌细胞

小鼠心肌成纤维细胞 小鼠主动脉内皮细胞

小鼠膀胱成纤维细胞

小鼠血管外膜成纤维细胞

小鼠主动脉平滑肌细胞

范文四：骨骼肌细胞的收缩机制

骨骼肌细胞的收缩机制-------------滑行学说

洪伟

,丽水学院生物,科学师范12,29,

【摘要】:Huxley等人哎20世纪50年代初提出了用肌小结中粗、细肌丝的相互滑行来解释肌肉收缩的机制。这一理论就是滑行理论(sliding theory)。 【关键词】:肌丝滑行 神经细胞

【肌丝滑行理论】:是肌肉收缩机制的一种理论。主要指:横纹肌收缩时在形态上的表现为整个肌肉和肌纤维的缩短，但在肌细胞内并无肌丝或它们所含的分子结构的缩短，而只是在每一个肌小节内发生了细肌丝向粗肌丝之间的滑行。结果使肌小节长度变短，造成整个肌原纤维、肌细胞和整条肌肉的缩短。其证据是:肌肉收缩时，肌细胞的暗带长度不变，明带长度变短，而肌球蛋白(粗肌丝)在暗带，肌动蛋白(细肌丝)在明带。

【神经细胞作用原理】:当一个神经冲动传递到突触小体，引起去极化使得Ca2+进入细胞膜，使突触小泡向前移动并释放出乙酰胆碱(ACH)，乙酰胆碱(ACH)与后膜上的受体结合，引起终板电位并向两侧扩布到两侧的肌细胞膜形成动作电位，并沿细胞膜传递到肌细胞的横管系统使两侧终池释放出Ca2+，Ca2+与肌钙蛋白结合使原肌球蛋白发生变化，暴露出肌动蛋白于横桥结合的位点，接着横桥和肌动蛋白相结合后横桥分解ATP获得能量使横桥循环把细肌丝不断地向肌节中心M线拉，最终达到肌肉收缩。横桥周期的长短决定着肌肉的缩短速度，肌浆中Ca2+浓度升高是引起肌肉收缩的触发原因。

【参考文献】:河南职工医学院院报2004年16卷4期

范文五：L6细胞胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型

中国组织工程研究与临床康复

基础医学

第 13 卷 第 2 期 2009–01–08 出版

January 8, 2009 Vol.13, No.2

Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research

L6细胞胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型*

杨 亮1，迟 戈2，张 俊3，王良君1，刘丽娜1，樊 淼1，刘海东1，李伟伟1，张健飞3，杨 菁4，隋鸿锦3

Skeletal muscle models of insulin resistance induced by L6 cell line

Yang Liang1, Chi Ge2, Zhang Jun3, Wang Liang-jun1, Liu Li-na1, Fan Miao1, Liu Hai-dong1, Li Wei-wei1, Zhang Jian-fei3, Yang Jing4, Sui Hong-jin3 Abstract

1

Department of Anatomy, 4 Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Medical Sciences, Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, 2 China; Liaoning Food and Drug Administration Technical Evaluation Center, Shenyang 110001, Liaoning Province, China; 3 Department of Anatomy, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China Yang Liang, Assistant Lecturer, Department of Anatomy, School of Medical Sciences, Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China yl36584269@163. com Correspondence to: Yang Jing, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Biochemistry and Molecular Biology,, School of Medical Sciences, Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China Sui Hong-jin, Professor, Master’s supervisor, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China Supported by: the Key Program of Education Department of Liaoning Province, No. 20072202* Received: 2008-09-01 Accepted: 2008-11-26

BACKGROUND: In insulin resistance models, 3T3-L1 adipocyte induced by free fatty acids or HepG2 hepatoma carcinoma cell induced by hyperinsulinism are common. However, the reports on target tissue of myoblast in insulin resistance skeletal muscle cell models are few. OBJECTIVE: To establish a skeletal muscle model of insulin resistance by using L6 cell line induced with high insulin method. DESIGN, TIME AND SETTING: The in vitro cytology observation was performed at the Department of Biochemistry and Molecular Biology, Liaoning Medical University between June 2007 and May 2008. MATERIALS: L6 cell line was supplied by the Cell Center of Peking Union Medical College. And theα-MEM medium was purchased from America Gibco Company. METHODS: L6 cell line was cultured withα-MEM medium for 14 days, until myotube could be observed by coomassie brilliant blue staining. The differentiated cells were inoculated in the 24-well board as 1×106/well and were cultivated by α -MEM with 2% bovine serum. After L6 cells covered the board, α-MEM serum-free medium with 2% bovine serum albumin (BSA) was added in each aperture for another 5 hours culture under starved condition. In the experimental group, HEPES buffer solution (Contains: 136 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 1.25 mmol/L MgSO4, 1.2 mmol/L CaCl2, 2% bovine -7 serum albumin, and 20 mmol/L HEPES, pH=7.4) with 1×10 mol/L insulin was added into apertures of the board for 1 hour culture; in the control group, HEPES buffer solution without insulin were added into apertures, cultured for 1 hour. After that, eliminated the supernatant and washed with HBS buffer solution, 100 μL HBS buffer solution with 0.1 mmol/mL glucose was added to each apertures, placed on the ice board to extract the supernatant after cultivating for 10 minutes. MAIN OUTCOME MEASURES: The appearance of myotube like structure was observed by coomassie brilliant blue staining, and the content of glucose in the supernatant was detected by using glucose oxidase method. RESULTS: The myotube like structure could be found only after L6 cell line differentiation. At hours 1 and 3 cultured with α-MEM serum-free medium, the contents of glucose in the supernatant were basically similar in two groups (P > 0.05), but the glucose content in the experimental group was obviously higher than that of the control group at 5 hours of culture (P < 0.05).="" conclusion:="" the="" insulin="" resistance="" model="" of="" skeletal="" muscle="" can="" be="" successful="" established="" by="" 5="" hours="" cultivation="" of="" α-mem="" serum-free="" medium="" combined="" with="" insulin="" stimulation="" at="" concentration="" of="" 1×10-7="">

Yang L, Chi G, Zhang J, Wang LJ, Liu LN, Fan M, Liu HD, Li WW, Zhang JF, Yang J, Sui HJ. Skeletal muscle models of insulin resistance induced by L6 cell line.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2009;13(2): 248-251(China) [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]

摘要

背景：在胰岛素抵抗的细胞模型中，以游离脂肪酸诱导 3T3-L1 脂肪细胞和高胰岛素诱导的 HepG2 肝癌细胞最为常见，对分 布最为广泛靶组织骨骼肌的胰岛素抵抗模型报道较少。 目的：拟使用 L6 细胞株建立胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于 2007-06/2008-05 在辽宁医学院生物化学与分子生物学教研室完成。 材料：L6 细胞株由中国协和医科大学细胞中心提供。α-MEM 培养基为美国 Gibco 公司产品。 方法： 复苏后的 L6 细胞置于α-MEM 培养基中诱导培养 14 d， 以考马斯亮蓝染色观察肌管出现来确定 L6 成肌细胞株分化完 成。将分化后的细胞建立胰岛素抵抗模型，按 1×10 /孔接种于 24 孔板内，用含体积分数为 0.02 胎牛血清的α-MEM 培养， 以 L6 细胞贴满 24 孔板的板底为宜。换液后，向各孔内分别加入含体积分数为 0.02 牛血清白蛋白的α-MEM 无血清培养基 饥饿培养 5 h。 设立 2 组， 实验组的板孔内加入含 1×10-7 mol/L 胰岛素的 HEPES 缓冲液 （136 mmol/L NaCl， mmol/L KCl， 4.7 1.25 mmol/L MgSO4，1.2 mmol/L CaCl2，0.2%牛血清白蛋白，20 mmol/L HEPES，pH 7.4）孵育 1 h；对照组的板孔内加 入不含胰岛素的 HEPES 缓冲液孵育 1 h。弃上清后用 HBS 缓冲液冲洗，每孔内分别加入含 0.1 mol/L 葡萄糖的 HBS 缓冲液 100 μL，孵育 10 min 后取出置于冰板上快速回收上清。 主要观察指标：考马斯亮蓝染色观察 L6 细胞出现肌管结构情况，葡萄糖氧化酶法检测上清中葡萄糖浓度。 结果： 诱导前 L6 细胞未见肌性结构出现， 诱导分化后 L6 细胞内出现肌管结构。 使用α-MEM 无血清培养基饥饿培养 1， h， 3 两组上清中葡萄糖浓度基本相似（P > 0.05）；使用α-MEM 无血清培养基饥饿培养 5 h 后，实验组上清中葡萄糖浓度明显 高于对照组（P < 0.05）。="" 结论：="" 诱导分化成肌后的="" l6="" 骨骼肌细胞经α-mem="" 无血清培养基饥饿培养="" 5="" h，="" 在胰岛素浓度为="" 1×10-7mol/l="" 的刺激下可形="" 成胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型。="" 关键词：l6="">

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杨亮，等. L6 细胞胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型

www.CRTER.org 辽 宁 医 学院 基 础 学院，1 解剖教研 室，4 生物化学与 分 子 生 物学 教 研 室， 辽宁省锦州市 2 121000； 辽宁省 食 品 药 品监 督 管 理 局 技 术审 评 中 心， 辽宁省沈阳市 110001；3 大连医 科 大 学 解剖 教 研 室， 辽宁省大连市 116044 杨 亮， 1980 男， 年生， 辽宁省葫芦 岛 市 人 ，汉 族 ， 2004 年辽宁医学 院毕业， 助教， 主 要 从 事 解剖 学 方 面的研究。 yl36584269@ 163.com 通讯作者：杨 菁， 副教授， 硕士 生导师， 辽宁医学 院 基 础 学院 生 物 化 学 与 分子 生 物 学教研室， 辽宁省 锦州市 121000 通 讯 作 者： 隋 鸿 锦， 教授， 硕士生 导师， 大连医科大 学解剖教研室， 辽 宁 省 大 连 市 116044 辽 宁 省 教育 厅 资 助 课 题 (200722 02)*

中图分类号:R587.1 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2009)02-00248-04 收稿日期： 2008-09-01 修回日期： 2008-11-26 (54200809010002/ ZS·Z)

杨亮，迟戈，张俊，王良君，刘丽娜，樊淼，刘海东，李伟伟，张健飞，杨菁，隋鸿锦. L6 细胞胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模 型[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(2):248-251 [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]

医学院生物化学与分子生物学教研室完成。 0 引言 胰岛素抵抗是指生理浓度的胰岛素效应 低于正常，主要表现为胰岛素抑制肝释放葡萄 糖能力及促进周围组织(骨骼肌)利用葡萄糖能 力的下降，为调节血糖在正常水平，机体代偿 性分泌过多胰岛素，即高胰岛素血症，最终导 致各种代谢疾病的发生和发展 。长期胰岛素 抵抗和高胰岛素血症会引发一系列密切相关 的临床异常，如肥胖病尤其是内脏型肥胖、糖 调节受损、2型糖尿病、脂肪肝、高血压、脂 代谢紊乱等[2-6]。 胰岛素抵抗发生主要的靶器官和靶组织 是肌肉、肝脏和脂肪组织，目前胰岛素抵抗的 发病机制尚不完全清楚，建立胰岛素抵抗细胞 模型可以在细胞及分子水平深入分析胰岛素 抵抗的发生机制，体外筛选防治胰岛素抵抗的 药物，以及解决无法广泛开展人体和动物试验 的局限性。在目前现有的细胞模型中，以游离 脂肪酸诱导3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗模 型和高胰岛素诱导的HepG2肝癌细胞的胰岛 素抵抗模型为常见

[7-8] [1]

L6细胞株由中国协和医科大学细胞中 材料： 心提供。

试剂与仪器 α-MEM 胎牛血清 考马斯亮蓝(R-250)、结晶牛胰 岛素、胰酶、牛血清白蛋白 葡萄糖氧化酶试剂盒 CX31 显微镜 来源 美国 Gibco 公司 圣马军马厂 美国 Sigma 公司 中生北控生物科技股份 有限公司 日本 OLYMPUS 公司

实验方法：

L6细胞株的诱导分化培养： 复苏后的L6细胞在

含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM中培养，每 隔2 d传代。待细胞长满后，改用含体积分数为 0.02胎牛血清的α-MEM中培养，每隔 1 d传代， 共培养14 d。

细胞骨架考马斯亮蓝(R-250)染色：使用考马斯

亮蓝(R-250)对诱导后的细胞骨架进行染色，观 察L6细胞是否有肌管结构出现。 将诱导培养后的 细胞用PBS清洗后，以2.5%戊二醛固定30 min， PBS清洗3次；然后加入1% TritonX-100浸泡 10 min，蒸馏水漂洗3次；再加入0.2%考马斯亮 蓝(R-250)溶液，染色30 min，用蒸馏水漂洗。 在相差显微镜下可见胞质内微丝逐渐明显，背地 清亮时立刻终止，漂洗，透明，中性树胶封固。

胰岛素抵抗模型的建立[2]：①将诱导分化后的

， 涉及骨骼肌细胞的胰岛

素抗模型较少，国内仅有原代培养骨骼肌细胞 胰岛素抵抗模型相关报道[9]。由于原代培养存 在组化鉴定、纯度筛选、培养困难等问题，因 此若能找到合适的骨骼肌细胞株来取代现有 的骨骼肌原代培养方式，对于建立骨骼肌胰岛 素抵抗模型有着重要意义。 L6细胞株是骨骼肌发育分化研究中常用 的细胞模型

[10-14]

细胞按1×106/孔接种于24孔板内，用含体积分 数为0.02胎牛血清的α-MEM培养，以L6细胞贴 满24孔板的板底为宜。换液后，向各孔内分别加 入含体积分数为0.02牛血清白蛋白的α-MEM无 血清培养基饥饿培养1，3，5 h，用HBS缓冲液 (136 mmol/L NaCl， mmol/L KCl， 4.7 1.25 mmol/L MgSO4, 1.2 mmol/L CaCl2)冲洗2遍。 ②实验组

-7

，成肌过程是一个成肌细胞的

诱导增殖和分化的过程，包括成肌细胞内部控 制的决定、多核细胞的产生、肌小管的形成以 及分化为成熟的肌纤维细胞，分化成熟后的细 胞具有骨骼肌的生物学特性

[15-19]

的板孔内加入含1×10

mol/L胰岛素的HEPES

。基于以上原

缓冲液(136 mmol/L NaCl，4.7 mmol/L KCl， 1.25 mmol/L MgSO4，1.2 mmol/L CaCl2，0.2% 牛血清白蛋白，20 mmol/L HEPES，pH 7.4)孵 育1 h；对照组的板孔内加入不含有胰岛素的 HEPES缓冲液孵育1 h。弃去上清，用HBS缓冲 液冲洗2遍。③每孔内分别加入含0.1 mol/L葡萄 糖的HBS缓冲液 100 μL， 孵育10 min后取出置 于冰板上，快速回收上清。

上清中葡萄糖浓度测定：采取葡萄糖氧化法检

因，实验通过对L6细胞株进行分化诱导后，使 其具有骨骼肌的生物学特点，并在此基础上拟 对骨骼肌细胞采用高胰岛素诱导的方法建立 胰岛素抵抗模型。 1 材料和方法 设计：细胞学体外观察。 时间及地点：于2007-06/2008-05在辽宁

测上清中葡萄糖浓度。使用葡萄糖氧化酶试剂盒

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杨亮，等. L6 细胞胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型

进行检测，具体步骤严格按说明书操作。 主要观察指标：①考马斯亮蓝(R-250)染色观察L6 细胞出现肌管结构情况。②葡萄糖氧化酶法检测上清中 葡萄糖浓度。 设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，干预 实施为全部作者，评估为通讯作者。均经过系统培训， 未使用盲法评估。 统计学分析：由第四作者采用SPSS 11.0软件包对 两种不同检测方法的检出效果进行t检验分析，数据以 x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。="" 2="">

_

显高于对照组，差异有显著性意义（P < 0.05）="">

α-MEM 无血清培养基饥饿培养后不同时间点两组上清 中葡萄糖浓度的比较 Table 1 Comparison of glucose concentration of cells culture supernatants at different time points after cultured with α-MEM serum-free medium under starved condition _ -5 (x±s, n=6, 10 mol)

Group Control Experimental

a

表 1

1h 65±14 69±8

3h 68±21 73±16

5h 70±19 85±14a

P < 0.05,="" vs.="" control="">

3

讨论 实验通过诱导L6细胞株， 使其分化成为具有骨骼肌

2.1 诱导分化前后L6细胞骨架考马斯亮蓝(R-250)染 色结果 相差显微镜下观察可见， 诱导分化前L6细胞相 互交织，细胞界限不清，以梭形为主，也可见不规则三 角形、多角形等，立体感差，其形状与成纤维母细胞相 似，未见肌性结构出现，见图1。

的生物学特性的肌细胞，并通过考马斯亮蓝染色观察肌 纤维出现，以确定L6细胞株分化完成。有文献报道，L6 细胞株成熟的标志为肌小管的形成以及出现肌纤维细 胞，通常可以通过苏木精-伊红染色的切片来鉴定 方面

[23-24] [20-22]

。

考马斯亮蓝染色的方法主要是应用于细胞骨架染色 ，而实验结果发现该方法也可以对分化后的 L6细胞染色， 并可以观测到肌纤维的形成。 该方法与苏 木精-伊红染色相比，具有速度快、染色时间短、便于 操作等优点。 胰岛素最主要的生物学效应是促进机体组织细胞 葡萄糖代谢， 故通常所言胰岛素抵抗即指机体对胰岛素

Figure 1 图 1 Before differentiation of L6 cell line, no myotube like structure could be found (Coomassie brilliant blue staining, ×100) 诱导分化前 L6 细胞未出现肌管结构 (考马斯亮蓝染 色，×100)

促进葡萄糖摄取利用的效应产生了抗性。生理浓度的 胰岛素不能使细胞达到其相应代谢水平，只有提高胰 岛素浓度才能达到预期代谢水平，表现为血液中胰岛 素浓度和血糖浓度增高

[25-30]

。因此实验使用葡萄糖氧

诱导分化后，L6细胞边界清晰，以梭形为主，立 体感强，细胞核小且深染，细胞内出现肌性结构，见 图2。

化酶法检测各孔上清中葡萄糖浓度，通过1，3，5 h无 血清条件培养后，发现在5 h无血清条件下，通过浓度 在1×10

-7

mol/L胰岛素孵育1 h的L6细胞上清中葡萄糖

浓度明显高于对照组，并由此判断骨骼肌细胞胰岛素抵 抗的形成。此方法为分析胰岛素抵抗、药物筛选提供一 种稳定可靠的骨骼肌细胞模型。 4

[1]

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Figure 2 图2

After differentiation of L6 cell line, myotube like structure could be found (Coomassie brilliant blue staining, ×100) 诱导分化后 L6 细胞出现肌管结构（考马斯亮蓝染色， ×100）

[2] [3] [4]

2.2

上清中葡萄糖浓度葡萄糖氧化酶法检测结果

[5]

使用α-MEM无血清培养基饥饿培养1，3 h，两组上清 中葡萄糖浓度基本相似（P > 0.05） ；使用α-MEM无血 清培养基饥饿培养5 h后，实验组上清中葡萄糖浓度明

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杨亮，等. L6 细胞胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型

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来自本文课题的更多信息-课题背景：建立与人接近的胰岛素抵抗的动物和细胞模

型是筛选胰岛素增敏剂的关键环节之一。

作者介绍：通讯作者杨菁副教授为硕士生导师，先后主

持了与本实验相关领域的辽宁省教育厅课题“地黄寡糖对血 管性痴呆的保护作用及机制探讨” ，辽宁省自然科学基金课题 “地黄寡糖对血管性痴呆的治疗作用及机制探讨” ，辽宁省博 士后基金“小牛血清质量标准提高及药效学研究”等课题。

偏倚或不足：实验虽然建立 L6 骨骼肌细胞株胰岛素抵

抗模型，但由于此过程需要对分化后的 L6 骨骼肌细胞株在 α-MEM 无血清培养基饥饿培养 5 h，因此细胞在无血清的 情况下容易脱壁，对实验结果造成影响。在最后的模型鉴定 阶段，孵育后的细胞取出置于冰板上，尽管这样可以准确的 终止 L6 骨骼肌细胞株对葡萄糖的摄取，但同时细胞也不能 再继续使用，对模型治疗学的意义进行研究受到限制。

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