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1. 朗伯——比尔（Lambert －beer ）光吸收定律： A ＝－lgT ＝εb c
A ——吸光度，又称光密度“O.D”。
T ——透光度， T ＝I / I 。， I 。——为照射到吸收池上的光强，I ——为透过吸收池的光强。
ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L·mol －1·cm －1）。
b ——样品光程（cm ），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。
C ——样品浓度（mol/L）。
由上式可以看出：吸光度A 与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。
2. DNA 和RNA 的OD 值
2.1 原理
嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。DNA 钠盐的紫外吸收在260nm 附近有最大吸收值（图3-25），在230nm 处为吸收低谷，其吸光率（absorbance ）以A260表示，A260是核酸的重要性质，RNA 钠盐的吸收曲线与DNA 无明显区别，蛋白质在280nm 处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm 处，对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1μg／mL 的核酸水溶液在260nm 处的吸光率，天然状态的双链DNA 的比吸光系数为0.020，变性DNA 和RNA 的比吸光系数为0.022。据朗波－比尔光吸收定律A ＝-lgT ＝εbc知，c ＝A/εb，而b 通常为1cm ，所以，通常以1OD 值相当于50μg／mL 双螺旋DNA ，或40μg／mL 单螺旋DNA （或RNA ），或20μg／mL 寡核苷酸计算。
2.2 纯度
DNA 和RNA 的纯度可以通过测定260nm ，230nm 和280nm 的紫外吸收值来测定，纯的DNA OD260／280在1.8-1.9，OD260／230应大于2.0，纯的RNA OD260／280在1.9-2.0，如果DNA 比值高于1.8-1.9，可能有RNA 没有去除干净，如果DNA 比值小于1.8-1.9，可能含有酚或者蛋白质（RNA 中含有酚或者蛋白质比值也会降低），若OD260／230小于2.0说明有残存的盐或小分子杂质污染。
2.3 浓度
DNA 和RNA 的量，据朗波－比尔光吸收定律A ＝-lgT ＝εbc知测量样品的浓度为c ＝A/εb，又知ε＝0.020，在b ＝1cm 的情况下，c ＝A/（0.020×1）＝50×A ，则未稀释的样品的浓度为50×A ×稀释倍数（μg／mL ）＝50×A ×稀释倍数/1000（mg ／mL ）
2.4 注意事项：
1) 比色杯应为石英杯，玻璃杯在此波长时读数不准。
2) 检测时应使OD260值在 0.15 到1.0之间，数值比较准确。
3) 这种比值测定的方法仅仅适用于核酸浓度大于0.25ul ／ml 的时候，浓度小于0.25ul ／ml 的时候测量误差较大。
4) 既含有RNA 又含有蛋白质也可能使比值维持在1.8，这个时候要根据电泳情况鉴定是不是含有RNA ，或者测定一下是不是含有蛋白质；
5) A260/A280比值可提供DNA 纯度的一个参考，但A260/A280 比值会受pH 影响。如果未调pH ，比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值，建议在10 mM Tris Cl, pH 8.5
中检测，此时纯净的DNA A260/A280比值应为1.8-2.0（注意应使用同样缓冲液作为对照）。
6) 进行OD 值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD 值。
7) 可以在220-330 nm 之间进行扫描，此扫描可以检测是否有其它因素影响OD 260，如在
325 nm 处有吸光值说明有污染物或比色皿不干净。)
8) DNA 的量与260 nm 处的吸光度值（OD 值）成正比，在引物设计时，1个OD 值的合
成DNA 的重量约为33 mg。
吸光度值-拷贝数计算
1A260 吸光度值=ds DNA50mg/ml
=ss DNA33mg/ml
=ss RNA40mg/ml
(OD260) x (dilution factor) x [33 或40或50]/ (1000) = mg/ml MW = 克/摩尔
1 摩尔= 6.02 x 1023 摩尔分子(拷贝数) 平均分子量:
dsDNA=(碱基数) x (660 道尔顿/碱基)
ssDNA=(碱基数) x (330 道尔顿/碱基)
ssRNA=(碱基数) x (340 道尔顿/碱基) 拷贝数计算公式:
(6.02 x 10的23次拷贝数/摩尔) x (浓度g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml. 例：3000 碱基质粒， 浓度100 ng/ml ， MW = 3000 bp x 660 dalton/bp = 1.98 x 10的6
次 daltons，1 mol = 1.98 x 10的6次 g. (6.02 x 10的23次拷贝数/摩尔) x (1x 10的-7次克/微升) / (1.98 x 10的6次 克/摩尔)
= 3 x 10的10次 copies/ml.
oligo’s:(mg/ml) / MW x 10的6次 = mM
紫外分光光度法测细菌od值[最新]
注意事项:
1. 一般测菌体密度的OD的波长范围是580nm-660nm，波长在紫外范围内才能够
测量
2. 如用水做空白，需要离心洗涤菌体(不会做);如用不接种的培养基做空白
就不需要洗涤,不接种的培养基要和接种的同时培养,以求条件一致
3. OD值最好控制在0.1-0.4内，在这个区间得到的值很可靠，最好不要超过
1.0;如果大于2.0，要稀释后再测，OD太大时，分光光度计的灵敏度会显
著降低
4. 测吸光值的整个实验过程中，要保持发酵液或菌体的稀释倍数一致，可保证
整个实验点有可比性(吸光值与稀释倍数不一定成正比);取值的时候要连
续读数，重复3次的数最好
5. 进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。当测
定200 ml溶液中的OD值为1.5时，溶液整体的OD量应该为1.5OD/ml ×
0.2L = 0.3OD
透射比和吸光度
透射比和吸光度
当一束平行光通过均匀的溶液介质时，光的一部分被吸收，一部分被器皿反射。设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则
在进行吸收光谱分析中，被测溶液和参比溶液是分别放在同样材料及厚度的两个吸收池中，让强度同为I0的单色光分别通过两个吸收池，用参比池调节仪器的零吸收点，再测量被测量溶液的透射光强度，所以反射光的影响可以从参比溶液中消除，则上式可简写为
透射光强度(It)与入射光强度(I0)之比称为透射比(亦称透射率)，用T表示，则有
:
溶液的T越大，表明它对光的吸收越弱；反之，T越小，表明它对光的吸收越强。为了更明确地表明溶液的吸光强弱与表达物理量的相应关系，常用吸光度(A)表示物质对光的吸收程度，其定义为
:
则A值越大，表明物质对光吸收越强。T及A都是表示物质对光吸收程度的一种量度，透射比常以百分率表示，称为百分透射比，T％；吸光度A为一个无因次的量，两者可通过上式互相换算。
朗伯比耳定律
朗伯—比耳定律(Lambert－Beer)是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。当入射光波长一定时，溶液的吸光度A是吸光物质的浓度C及吸收介质厚度l(吸收光程)的函数。朗伯和比耳分别于1760年和1852年研究了这三者的定量关系。朗伯的结论是，当用适当波长的单色光照射一固定浓度的均匀溶液时，A与l成正比，其数学式为:
A = kl (此即称为朗伯定律，k为比例系数 ) ＇＇
而比耳的结论是，当用适当波长的单色光照射一固定液层厚度的均匀溶液时，A与C成正比，其数学表达式为
:
(此即称为比耳定律，k称为比例系数)
合并上述k的数值取决于吸光物质的特性外，其单位及数值还与C和l所采用的单位有关。l通常采用cm为单位，并用b表示。所以k的单位取决C采用的单位。
当C采用重量单位时，吸收定律表达为
:
(a称为吸光系数，单位为)
当C采用摩尔浓度时，吸收定律表达为
:
(ε称摩尔吸光系数，单位为)
有时在化合物的组成不明的情况下，物质的摩尔质量不知道，因而物质的量浓度无法确定，就不能用摩尔吸光系数，而是采用比吸光系数
用1cm吸收池时的吸光度，这时吸光度为
:
(c的质量百分浓度)
ε、a、三者的换算关系为：
，
在吸收定律的几种表达式中，
吸收光谱的纵坐标也用ε或ε
(Mr为吸收物质的摩尔质量) 在分析上是最常用的，ε也是最常用的，有时表示物质的吸收强度。，其意义是指质量分数为1％的溶液，表示，并以最大摩尔吸光系数是在特定波长及外界条件下，吸光质点的一个特征常数，数值上等于吸光物质的浓度为
，液层厚度为1cm时溶液的吸光度。它是物质吸光能力的量度，可作为定性分析的参考和估计定量分析的灵敏度。
朗伯比耳定律
朗伯－比耳定律的推导如下：根据量子理论，光是由光子所组成，其它能量为。因此，吸收光的过程就是光子被吸光质点(如分子或离子)的俘获，使吸光质点能量增加而处于激发状态，光子被俘获的几率取决于吸光质点的吸光截面积。如图13.12所示，
如有一束强度为Io的单色平行光束，垂直通过一横截面积为S的均匀溶液介质。在吸收介质中，光的强度为Ix(Ix在光束通过介质的过程中，因光能量不断被吸收而逐渐变小)，当光束通过一个很薄的介质层db后，光强减弱了dIx，则厚度为db
的吸收层对光的吸收率为
量子理论表明，光束强度可以看作是单位时间内流过光子的总数，于是
可以看作是光束通过吸收介质是每个光子被吸光物质吸收的平均几率。另一方面，由于液层厚度db为无限小，所以在这个小体积单元中，所以吸光质点所占的吸收截面积之和dS与横截面积S之比也可看作为该截面上光子被吸收物质吸收的几率。因此就有：
如果吸收介质中含有m种不同的吸光质点，而且它们之间没有相互影响，设ai为第I种吸光质点对指定波长的吸收截面积，dni为第I种吸光质点在db小体积单元之中的数目，则
代入上式，则得到
:
当光束通过液层厚度为b时，对上式两边积分，得到
:
根据吸光度的定义，
截面积S是均匀介质的体积V与液层度b之比，即
，代入上式，得到
式中NA为阿佛加德罗常数。为第I种质点在均匀介质中的浓度Ci，当V的单位为L时，Ci为摩尔浓度。将0.4343NAai合并为常数，当Ci为摩尔浓度时，该常数εi，则得到
上式表明，当一束平行单色光通过一个均匀吸收介质时，总吸光度等于吸收介质中各吸光物质吸光度之和，即吸光度具有加和性，这是进行多组分光度分析的理论基础。当吸收介质中只含有单一种吸收物质时，上式简化为
——朗伯－比耳定律的常用表达式
与测量仪器有关的因素
从理论上来说，朗伯－比耳定律上适用于单色光(即单一波长的光)，但是紫外－可见分光光度计从光源发出的连续光经单色器分光，为了满足实际测量中需要有足够光强的要求，入射光狭缝必须有一定的宽度。因此，由出射光狭缝投射到被测溶液的光束，并不是理论要求的严格单色光，而是由一小段波长范围的复合光，由分子吸收光谱是一种带状光谱，吸光物质对不同波长光的吸收能力不同，在峰值位置，吸收能力最强，ε最大，用表示，
其他波长处ε都变小，因此当吸光物质吸收复合光时，表现吸光度要比理论吸光度偏低，因此导致比耳定律的负偏离。在所使用的波长范围内，吸光物质的吸光系数变化越大，这种 偏离就越显著。例如，按图13.13 的吸收光谱，选择宽度作为入射光时，吸 光系数变化较小，测量造成的偏离就比较小，若选择谱带Ⅱ的波长宽度作为入射光时，吸光系数的变化很大，测量造成的偏离也就很大。所以通常选择吸光物质的最大吸收波长(即吸收带峰所对应的波长)作为分析的测量波长，这样不仅保证有较高的测量灵敏度，而且此处的吸收曲线往往较为平坦，吸光系数变化比较小，比耳定律的偏离也比较小。对于比较尖锐的吸收带，在满足一定的灵敏度要求下，尽量避免用吸收峰的波长作为测量波长。投射被测溶液的光束单色性(即波长范围)越差，引起的比耳偏离也越大，所以，在保证足够的光强前提下，采用窄的入射光狭缝，以减小谱带宽度，降低比耳定律的偏离。
与样品溶液有关的因素
● 当吸收物质在溶液中的浓度较高时，由于吸收质点之间的平均距离缩小，邻近质点彼此的电荷分布会产生相互影响，以致于改变它们对特定辐射的吸收能力，即改变了吸光系数，导致比耳定律的偏离。通常只有当吸光物质的浓度小于0.01
吸收定律才成立。
● 推导吸收定律时，吸光度的加和性隐含着测定溶液中各组分之间没有相互作用的假设。但实际上，随着浓度的增大，各组分之间甚至同组分的吸光质点之间的相互作用是不可避免的。例如，可以发生缔合、离解、光化学反应、互变异构及配合物配位数的变化等等，会使被测组分的吸收曲线发生明显的变化，吸收峰的位置、强度及光谱精细结构都会有所不同，从而破坏了原来的吸光度与浓度之间的函数关系，导致比耳定律的偏离。
● 溶剂及介质条件对吸收光谱的影响十分重要。溶剂及介质条件(如值)经常会影响被 的稀溶液中，测物理的性质和组成，影响生色团的吸收波长和吸收强度，也会导致吸收定律的偏离。
● 当测定溶液有胶体、乳状液或悬浮物质存在时，入射光通过溶液时，有一不忿光会因散射而损失，造成“假吸收”，使吸光度偏大，导致比耳定律得正偏离。质点的散射强度与照射光波长的四次方成反比，所以在紫外光区测量时，散射光的影响更大。
● 此外，吸收定律的偏离还与溶液的折射率有关，摩尔吸光系数ε
是真实摩尔吸光系数
和溶液折射率的函数
当稀溶液时，n基本不变，ε也基本不变，而当浓度高时，n变大，ε变小，导致比耳定律的偏离。
主要组成部件
各种型号的紫外－可见分光光度计，就其基本结构来说，都是由五个基本部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器及信号指示系统，如图13.14 。
1. 光源（辐射源)
★ 对光源的要求
在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射；应有足够的辐射强度及良好的稳
定性；辐射能量随波长的变化应尽可能小；光源的使用寿命长，操作方便。
★ 光源的种类
分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。前者用于可见光区，
如钨灯、卤钨灯等，后者用于紫外光区，如氢灯和氘灯等。
● 钨灯和碘钨灯可使用的波长范围为340～2500nm。这类光源的辐射能量与施加的外加电压有关，在可见光区，辐射的能量与工作电压的4次方成正比，光电流也与灯丝电压的n次方(n＞1)成正比。因此，使用时必须严格控制灯丝电压，必要时须配备稳压装置，以保证光源的稳定。
● 氢灯和氘灯可使用的波长范围为160～375nm，由于受石英窗吸收的限制，通常紫外光区波长的有效范围一般为200～375nm。灯内氢气压力为10Pa时，用稳压电源供电，放电十分稳定，光强度且恒定。氘灯的灯管内充有氢同位素氘，其光谱分布与氢灯类似，但光强度比同功率的氢灯大3～5倍，是紫外光区应用最广泛的一种光源。
主要组成部件
2. 单色器
★ 单色器的作用
单色器是能从光源的复合光中分出单色光的光学装置，其主要功能应该是能够产生 光谱纯度高、色散率高且波长在紫外可见光区域内任意可调。单色器的性能直接影响入
射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度、选择性及校准曲线的线性关系等。
★ 单色器的组成
单色器由入射狭缝、准光器(透镜或凹面反射镜使入射光变成平行光)、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几个部分组成。其核心部分是色散元件，起分光作用。其他光学
元件中狭缝在决定单色器性能上起着重要作用，狭缝宽度过大时，谱带宽度太大，入射光单色性差，狭缝宽度过小时，又会减弱光强。
★ 色散元件的类型
能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅。
● 棱镜有玻璃和石英两种材料。它们的色散原理是依据不同波长的光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长分开。由于玻璃会吸收紫外光，所以玻璃棱镜只适用于350～
3200nm的可见和近红外光区波长范围。石英棱镜适用的波长范围较宽，为185～4000nm，即可用于紫外、可见、红外三个光谱区域。
● 光栅是利用光的衍射和干涉作用制成的。它可用于紫外、可见和近红外光谱区域，而且在整个波长区域中具有良好的、几乎均匀一致的色散率，且具有适用波长范围宽、分辨2
本领高、成本低、便于保存和易于制作等优点，所以是目前用的最多的色散元件。其缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。
3 .吸收池
吸收池用于盛放分析的试样溶液，让入射光束通过。吸收池一般有玻璃和石英两个材料做成，玻璃池只能用于可见光区，石英池可用于可见光区及紫外光区。吸收池的大小规格从几毫米到几厘米不等，最常用的是1厘米的吸收池。为减少光的反射损失，吸收池的光学面必须严格垂直于光束方向。在离精度分析测定中（尤其是紫外光区尤其重要），吸收池要挑选配对，使它们的性能基本一致，因为吸收池材料本身及光学面的光学特性、以及吸收池光程长度的精确性等对吸光度的测量结果都有直接影响。
主要组成部件
4. 光敏检测器
★ 检测器的作用
检测器是一种光电转换元件，是检测单色光通过溶液被吸收后透射光的强度，并把
这种光信号转变为电信号的装置。
★ 对检测器的要求
检测器应在测量的光谱范围内具有高的灵敏度；对辐射能量的影响快、线性关系好、
线性范围宽；对不同波长的辐射响应性能相同且可靠；有好的稳定性和低的噪音水平等。
★ 检测器的种类
检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。
● 光电池
主要是硒电池，其灵敏度光区为310～800nm其中以500～600nm最为灵敏，其特点 是不必经放大就能产生，可直接推动微安表或检流计的光电流。但由于它容易出现“疲
劳效应”、寿命较短而只能用于低档的分光光度计中。
● 光电管
光电管在紫外－可见分光光度计上应用很广泛。它以一弯成半圆柱且内表面涂上一层光敏材料的镍片作为阴极，而置于圆柱形中心的一金属丝作为阳极，密封于高真空的
玻璃或石英中构成的，当光照到阴极的光敏材料时，阴极发射出电子，被阳极收集而产生光电流。结构如图13.15所示。
随阴极光敏材料不同，灵敏的波长范围也不同。可分为蓝敏和红敏两种光电管，前者是阴极表面上沉积锑和铯，可用于波长范围为210～625nm，后者是阴极表面上沉积银和氧化铯，可用波长范围为625～1000nm，与光电池比较，光电管灵敏度高、光敏范围宽、不易疲劳的优点。
● 光电倍增管
光电倍增管实际上是一种加上多级倍增电极的光电管，其结构如图13.16所示。所示外壳由玻璃或石英制成，阴极表面涂上光敏物质，在阴极C和阳极A之间装有一系列次级电子发射极，即电子倍增极D1、D2??等。阴极C和阳极A之间加直流高压(约1000V)，当辐射光子撞击阴极时发射光电子，该电子被电场加速并撞击第一倍增极D1，撞出更多的二次电子，依此不断进行，像“雪崩”一样，最后阳极收集到的电子数将是阴极发射电子的10～10倍。与光电管不同，光电倍增管的输出电流随外加电压的增加而增加，且极为敏感，这是因为每个倍增极获得的增益取决于加速电压。因此，光电倍增管的外加电压必须严格控制。光电倍增光的暗电流愈小，质量愈好。光电倍增管灵敏度高，是检测微弱光最常见的光电元件，可以用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。 56
5. 信号指示系统
它的作用是放大信号并以适当的方式指示或记录。常用的信号指示装置有直流检流计、电位调零装置、数字显示及自动记录装置等。现在许多分光光度计配有微处理机，一方面可以对仪器进行控制，另一方面可以进行数据处理。
紫外-可见分光光度计的类型
1. 单光束分光光度计
其光路示意图如前面的图13.14所示，经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。国产722型、751 型、724型、英国SP500型以及Backman DU－8型等均属于此类光度计。
2. 双光束分光光度计
其光路示意于图13.17。经单色器分光后经反射镜(M1)分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，另一束通过样品池，光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。双光束分光光度计一般都能
自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差。这类仪器有国产710型、730型、740型等。
3. 双波长分光光度计
其基本光路如图13.18所示。由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长(λ1和 λ2)的单色光；利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池，然后经过光电倍增管和电子控制系统，最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值
。对于多组分混合物、混浊试样(如生物组织液)分析，以及存在背
景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。通过光学系统转换，使双波长分光光度计能很方便的转化为单波长工作方式。如果能在λ1和λ2处分别记录吸光度随时间变化的曲线，还能进行化学反应动力学研究。
光度计的校正
通常在实验室工作中，验收新仪器或仪器使用过一段时间后都要进行波长校正和吸光度校正。建议采用下述的较为简便和实用的方法来进行校正。
镨玻璃或钬玻璃都有若干特征的吸收峰，可用来校正分光光度计的波长标尺，前者用于可见光区，后者则对紫外和可见光区都适用。
可用K2CrO4标准溶液来校正吸光度标度。将0.0400gK2CrO4溶解于1L的0.05mol·L
1
o
－
KOH溶液中，在1cm光程的吸收池中，在25C时用不同波长测得的吸光度值列于表13.5 。
表13.5 铬酸钾溶液的吸光度
仪器测量条件的选择
仪器测量条件的选择包括测量波长的选择，适宜吸光度范围的选择及仪器狭缝宽度的选择。
1. 测量波长的选择
通常都是选择最强吸收带的最大吸收波长获得最高的分析灵敏度。而且在
作为测量波长，称为最大吸收原则，以
附近，吸光度随波长的变化一般较小，波长的稍许偏
移引起吸光度的测量偏差较小，可得到较好的测定精密度。但在测量高浓度组分时，宁可选
用灵敏度低一些的吸收峰波长(ε较小)作为测量波长，以保证校正曲线有足够的线性范围。如果
所处吸收峰太尖锐,则在满足分析灵敏度前提下，可选用灵敏度低一些的波长进行
测量，以减少比耳定律的偏差。 2. 适宜吸光度范围的选择
任何光度计都有一定的测量误差，这是由于测量过程中光源的不稳定、读数的不准确或实验条件的偶然变动等因素造成的。由于吸收定律中透射比T与浓度C是负对数的关系，从负对数的关系曲线可以看出，相同的透射比读数误差在不同的浓度范围中，所引起的浓度相对误差不同，当浓度较大或浓度较小时，相对误差都比较大。因此，要选择适宜的吸光度范围进行测量，以降低测定结果的相对误差。根据吸收定律
微分后得
写成有限的小区间为
即浓度的相对偏差为
要使测定结果的相对偏差()最小，上式对T求导应有一极小值，即
解得
，
表明当吸光度
或
时，仪器的测量误差最小。这个结果也可以从图13.19表示，
即图中曲线的最低点。当A大或
小时，误差都变大。在吸光分析中，一般选择A的测量范围为0.2～0.8(T％为65～15％)，此时如果仪器透射率读数误差(
)为1％时，由此引起的测定结果相对误差(
)约为3％。
在实际工作中，可通过调节待测溶液的浓度或选用适当厚度的吸收池的方法，使测得的吸光度落在所要求的范围内。
3. 仪器狭缝宽度的选择
狭缝的宽度会直接影响到测定的灵敏度和校准曲线的线性范围。狭缝宽度过大时，入射光的单色光降低，校准曲线偏离比耳定律，灵敏度降低；狭缝宽度过窄时，光强变弱，势必要提高仪器的增益，随之而来的是仪器噪声增大，于测量不利。选择狭缝宽度的方法是：测量吸光度随狭缝宽度的变化。狭缝的宽度在一个范围内，吸光度是不变的，当狭缝宽度大到某一程度时，吸光度开始减小。因此，在不减小吸光度时的最大狭缝宽度，即是所欲选取的合适的狭缝宽度。
显色反应条件的选择
显色反应条件的选择包括显色剂及其用量的选择、反应酸度、温度、时间等的选择。 1. 显色剂及其用量
显色反应中的显色剂应该是它与待测离子显色反应的产物组成恒定、稳定性好、显色条件易于控制；产物对紫外、可见光有较强的吸收能力，即ε大；显色剂与产物的颜色对照
性好，即吸收波长有明显的差别，一般要求
Δ＞60nm。表13.6列出了几种常见的显
色剂。 显色剂选定了以后，还必须选择显色剂的用量。生成化合物的显色反应可用下式表示
显色剂选定了以后，还必须选择显色剂的用量。生成配合物的显色反应可用下式表示
式中，M代表待测金属离子，R为配位体显色剂，βn为配合物累积稳定常数。从上式可见，当R的平衡浓度[R] 一定时，M生成MRn的转化率才一定。对βn很大的稳定配合物来说，只要显色剂适当过量时，显色反应都会基本定量完成，显色剂过量的多少影响不明显；而对于βn小的不稳配合物或可行成逐级配合物时，显色剂的用量关系较大，一般就需过量较多或必须严格控制用量。如以CNS作为显色剂测定钼时，要求生成红色的Mo(CNS)5配合物进行测定，当CNS浓度过高时，会生成
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而使颜色变浅，ε降低；而用CNS测定
-
Fe(Ⅲ)时，随CNS浓度增大，配合物逐渐增加，颜色也逐步加深。因此，必须严格控制CNS
－
的用量，才能获得准确的分析结果。显色剂用量可通过实验选择，在固定金属离子浓度的
情况下，作吸光度随显色剂浓度的变化曲线，选取吸光度恒定时的显色剂用量。
表13.6一些常用的显色剂
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。
显色反应条件的选择
2. 反应的酸度
介质的酸度往往是显色反应的一个重要条件。酸度的影响因素很多，主要从显色剂及金属离子两方面考虑。
★多 数显色剂是有机弱酸或弱碱，介质的酸度直接影响着显色剂的离解程度，从而影响显
色反应的完全程度。当酸度高时，显色剂离解度降低，显色剂可配位的阴离子浓度降低，显色反应的完全程度也跟着降低。对于多级配合物的显色反应来说，酸度变化可行成具有不同配位比的配合物，产生颜色的变化。在高酸度下多生成低配位数的配合物，可能没有达到金属离子的最大配位数，当酸度低(pH大)时，游离的配位体阴离子浓度相应变大，使得可能生成高配位数的配合物。如Fe(Ⅲ)与水杨酸的配合物随介质pH值的不同而变化如下表所示。对于这一类的显色反应，控制反应酸度至关重要。
★不 少金属离子在酸度较低的介质中，会发生水解而形成各种型体的羟基、多核羟基配合
物，有的甚至可能析出氢氧化物沉淀，或者由于生成金属离子的氢氧化物而破坏了有色配合物，使溶液的颜色完全褪去。例如在pH比较高时
＝
在实际分析工作中，是通过实验来选择显色反应的适宜酸度的。具体做法是固定溶液中 待测组分和显色剂的浓度，改变溶液(通常用缓冲溶液控制)的酸度(pH)，分别测定在不同pH溶液的吸光度A，绘制A～pH曲线，从中找出最适宜的pH范围。 3. 显色的时间
由于各种显色反应的速度不同，控制一定的显色时间是必要的，尤其是对一些反应速度较慢的反应体系，更需要有足够的反应时间。值得注意的是，介质酸度、显色剂的浓度都将会影响显色时间。 4. 反应的温度
吸光度的测量都是在室温下进行的，温度的稍许变化，对测量影响不大，但是有的显色反应受温度影响很大，需要进行反应温度的选择和控制。特别是进行热力学参数的测定、动力学方面的研究等特殊工作时，反应温度的控制尤为重要。
此外，由于配合物的稳定时间不一样，显色后放置及测量时间的影响也不能忽视，需经实验选择合适的放置、测量的时间。 参比溶液的选择
测量试样溶液的吸光度时，先要用参比溶液调节透射比为100％，以消除溶液中其他成分以及吸收池和溶剂对光的反射和吸收所带来的误差。根据试样溶液的性质，选择合适组分的参比溶液是很重要的。 1. 溶剂参比
当试样溶液的组成较为简单，共存的其他组分很少且对测定波长的光几乎没有吸收以及显色剂没有吸收时，可采用溶剂作为参比溶液，这样可消除溶剂、吸收池等因素的影响。 2. 试剂参比
如果显色剂或其他试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，只是不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。这种参比溶液可消除试剂中的组分产生吸收的影响。 3. 试样参比
如果试样基体在测定波长有吸收，而与显色剂不起显色反应时可按与显色反应相同的条件处理试样，只是不加显色剂。这种参比溶液适用于试样中有较多的共存组分，加入的显色剂量不大，且显色剂在测定波长无吸收的情况。 4. 平行操作溶液参比
用不含被测组分的试样，在相同条件下与被测试样同样进行处理，由此得到平行操作参比溶液。
干扰及消除方法
在光度分析中，体系内存在的干扰物质的影响有以下几种情况：干扰物质本身有颜色或与显色剂形成有色化合物，在测定条件下也有吸收；在显色条件下，干扰物质水解，析出沉
淀使溶液混浊，致使吸光度的测定无法进行；与待测离子或显色剂形成更稳定的配合物，使显色反应不能进行完全。
可以采用以下几种方法来消除这些干扰作用：
1. 控制酸度
根据配合物的稳定性不同，可以利用控制酸度的方法提高反应的选择性，以保证主反应进行完全。例如，双硫腙能与Hg、Pb、Cu、Ni、Cd等十多种金属离子形成有色配合物，其中与Hg生成的配合物最稳定，在0.5其他离子在此条件下不发生反应。 2. 选择适当的掩蔽剂
使用掩蔽剂消除干扰是常用的有效方法。选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用，掩蔽剂以及它与干扰物质形成的配合物的颜色应不干扰待测离子的测定。 3. 利用生成惰性配合物
例如钢铁中微量钴的测定，常用钴试剂为显色剂。但钴试剂不仅与Co有灵敏的反应，而且与Ni、Zn、Mn、Fe等都有反应。但它与Co在弱酸性介质中一旦完成反应后，即使再用强酸酸化溶液，该配合物也不会分解。而Ni、Zn、Mn、Fe等与钴试剂形成的配合物在强酸介质中很快分解，从而消除了上述离子的干扰，提高了反应的选择性。 4. 选择适当的测量波长
如K2Cr2O7存在下测定KMnO4时，不是选KMnO4溶液的吸光度，K2Cr2O7就不干扰了。 5. 分离
若上述方法不易采用时，也可以采用预先分离的方法，如沉淀、萃取、离子交换、蒸发和蒸馏以及色谱分离法(包括柱色谱、纸色谱、薄层色谱等)。此外，还可以利用化学计量学方法实现多组分同时测定，以及利用导数光谱法、双波长法等新技术来消除干扰。
(525nm)，而是选λ＝545nm。这样测定
2+
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H2SO4介质中仍能定量进行，而上述
吸光度和透光度
吸光度和透光度
当一束平行光通过均匀的溶液介质时，光的一部分被吸收，一部分被器皿反射。设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则
在进行吸收光谱分析中，被测溶液和参比溶液是分别放在同样材料及厚度的两个吸收池中，让强度同为I0的单色光分别通过两个吸收池，用参比池调节仪器的零吸收点，再测量被测量溶液的透射光强度，所以反射光的影响可以从参比溶液中消除，则上式可简写为
透射光强度(It)与入射光强度(I0)之比称为透射比(亦称透射率)，用T表示，则有
:
溶液的T越大，表明它对光的吸收越弱；反之，T越小，表明它对光的吸收越强。为了更明确地表明溶液的吸光强弱与表达物理量的相应关系，常用吸光度(A)表示物质对光的吸收程度，其定义为
:
则A值越大，表明物质对光吸收越强。T及A都是表示物质
对光吸收程度的一种量度，透射比常以百分率表示，称为百分透射比，T％；吸光度A为一个无因次的量，两者可通过上式互相换算。
朗伯比耳定律
朗伯—比耳定律(Lambert－Beer)是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。当入射光波长一定时，溶液的吸光度A是吸光物质的浓度C及吸收介质厚度l(吸收光程)的函数。朗伯和比耳分别于1760年和1852年研究了这三者的定量关系。朗伯的结论是，当用适当波长的单色光照射一固定浓度的均匀溶液时，A与l成正比，其数学式为:
A = kl (此即称为朗伯定律，k为比例系数 )
而比耳的结论是，当用适当波长的单色光照射一固定液层厚度的均匀溶液时，A与C成正比，其数学表达式为
:
(此即称为比耳定律，k称为比例系数)
合并上述k的数值取决于吸光物质的特性外，其单位及数值还与C和l所采用的单位有关。l通常采用cm为单位，并用b表示。所以k的单位取决C采用的单位。
当C采用重量单位时，吸收定律表达为
: ＇＇
(a
称为吸光系数，单位为)
当C采用摩尔浓度时，吸收定律表达为
:
) (ε称摩尔吸光系数，单位为
有时在化合物的组成不明的情况下，物质的摩尔质量不知道，因而物质的量浓度无法确定，就不能用摩尔吸光系数，而是采用比吸光系数，其意义是指质量分数为1％的溶液，用1cm吸收池时的吸光度，这时吸光度为
:
(c的质量百分浓度)
ε、a、
，三者的换算关系为：
(Mr为吸收物质的摩尔质量)
在分析上是最常用的，
表示，并 在吸收定律的几种表达式中，ε也是最常用的，有时吸收光谱的纵坐标也用ε或
以最大摩尔吸光系数表示物质的吸收强度。ε是在特定波长及外界条件下，吸光质点的一个特征常数，数值上等于吸光物质的浓度为，液层厚度为1cm时溶液的吸光度。它是物质吸光能力的量度，可作为定性分析的参考和估计定量分析的灵敏度。
