1I4
诊断技术
“Lc
似球荡椭彳稚七2撕确
P.sP
熙法检测椭耐药性钴核杆菌773
张厚亮王维元冬维’
关键词分支杆菌,结核利福平药物耐受性聚合酶链反应
结核杆菌多耐药性菌株的出现已对公若健康的构成威
胁.多耐药性结棱杆菌菌株中对利福平耐药出现最多,对利
福平耐药的直接检测成为确认多重耐药性结核病的一个有
效工具.参考有关文献”J,应用多聚酵链反应扩增及对扩增
产物进行单链构象分析(WAt-at~hstrandm商poly—
mcrph~m,tER-Sr:L’P)对利福平耐药结核杆菌基因突变进行
检测,方法快速,操作简便,觋报告如下.
材科和方法
1.临床标本的处理(1)临床分离培养的结核杆菌菌
株.经常规方法鉴定.20份,用机械方法分解(French压力
仪4?以下处理,1400kg/cn)作为FCR的材料.(2)荧光
显微镜直接镜检法15份阳性的痰标本,用NaOH中和,沉
淀,离心.在踟?加热10分使其失活,再离心,取上清娘用
于PCR.
2.试剂(1)引物P,:5一
CIU.{5--’I’CCA2ECGATCAAGGAGT.出美国Pm一
椰珊公司合成.(2)酵试剂;TaqDNA聚合酵为华美生物公
司产品.(3)变样上样缓冲液:内含95%甲酡胺,20mmol几
Fj不A,0.05%二甲苯氰酚,0.05%溟酚蓝;(4)0.5X慨
突变分析腔:内含6%聚丙烯酰胺胶(30:0.8),10%甘油,
4.5mmoVL硼酸.10rrnnol/LFJm0.05%过硫酸铵,
0.呻5%N.N.N,N一四甲基乙二胺.(5)用于PCR阳性对
照的为1倒培养阳性的耐利福平药物的肺结榱病人痰标本:
(6)用于PCR阴性对照的为1例痰培养腭性的正常人痰标
本.(7)标准人型结核杆菌Rv,由湖北医学院病毒所提
供.
3.仪器Protean1I型电泳仪.垂直电泳槽及创破装置
为No-Rad公司产品.
4.实验方法(1)检测原理:利福平耐药是由于结核杆
菌的RNA聚台酶阻亚单位基因rPOB的某些密码子被取代
的结果.用PCR对rPOB的利福平区域进行扩增(产物为双
链DNA),经变性处理成单链DNA,加样于非变性聚丙烯酡
胺凝胶进行电诛.单链DNA中一个棱苷酸发生突变,导致
电泳后DNA泳动率的改变.根据电泳图谱可确认是否有基
因赛变.(2)操作方法:在5O总体反应液中含引物PI和
各0.5~mol/L,50mmoI几KC[,10mmol/LTris-HC1DH
8.3,1.5rrmd几IvigCl2,10%丙三醇,&NTP各20tanol/L,
耐热TaqDNA聚台酵1.25U.放大反应进行柏个循环(94
c,55?和72.c各1分),在.72-c延伸10分.(3)SSCP分
析:将放大后PER产物与100SSCP稀释液(10mmol几
EDTA,0.1%十二烷基硫酸钠)混台,取混合物3加
上样缓冲娘,95.c孵育10分,诛上冷却,将变性D上样
于0.5×MDE突变分析胶,室温条件下5W恒流电泳过夜
(25-c,16,18小时).然后凝胶用0,5mg/LEB染色20
分,紫外灯下观察结果.(4)结果观察:利福平敏感表型结核
杆菌SSCP模型与结核杆菌Rv参照菌株的SSCP模蟹一
致.利福平耐药性菌株躅核苷酸突变导致S9形态改
变.紫外光检测仪上观察凝腔,样品扩增产物形成的图谱
模型与参照菌株及阳性菌株比较,一致者为敏感型,不一致
者则有基因突变为耐药性菌株.很容易与敏感型区别.
结果和讨论
结棱杆菌耐药性的产生是由于在不同抗结核药物靶基
因中莲渐获l得新的突变的结果.异烟肼,链霉索,氟喹诺酮
的耐药性与基因KatG,inhA,rpsL,rrs,gyrA等突变有关,
而利福平耐药是由于结核杆菌的RNA聚台酶阻亚单位基因
的某些密码子被取代的结果J,而且在耐药性结核杆菌中对
利檀平耐药出现最多.对利福平耐药结核杆菌基因突变的
动率更为精确.除了手工方法外.可
以使用荧光紊标记引物5端使用自动测序仪检测荧光标记
的扩增DNA,在48,.72小时出结果,可对大量标本进行处
理且重复性好.
临床分离培养的纯结核杆菌菌株及镜检阳性痰标本.用
PCR-SSCP法检测其对利幅平的耐药率为17.1%(6/35).较
国外报道低(33.3%,13/39)尽管PCR技术在结核杆菌
作者单位:301600天津市静海县医院(张厚亮,王堆明).王口
分院(元冬雄)
天律医药1999年2月第27卷第2期
检测中已得到广泛应用,但PCR—SSCP法对利福平耐药性结
核杆菌测定报道较少.对于病例选择的差异及踺乏对患者
兰期追踪资料,而且试剂尚需标准化,统一化等同题,都有待
进一步探人研究.
参考文献
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sis:amol~AarstudvLancet,1994,344:293
(1998-03-02收稿I9984)6—16恪阿)
r纠正代谢性酸中毒诱发呼吸肌麻痹和抢救体
6叮
我皖于1987年1月至1994年7月,在门诊急诊采用碳
酸氢钠静脉滴注纠正代谢性酸中毒过程中,致4倒血钾进一
步降低而诱发呼嗳肌麻痹,现就其发生的原因,教训和抢救
体会讨论如下.
临床资料
4例均为女性,年龄26,59岁.均因纳差恶心,呕?士
和乏力3,8天,尿量减少(3O0--60Oml/d)1,3天就诊.既
往无心肺疾病.查体:呼吸I8,22次,血压12.7,16/8,
10.7kPa(95,120/60,80naaVlg).均神清合作,行走无
力,皮肤干燥.心率84,昵次份,律齐.呼吸音清晰.诊
断为饥饿性代谢性酸中毒和脱水.诱发原因:慢性胃炎2
倒,溃疡病1倒和可疑肝炎1倒.实验室检查结果回报前,4
例予以5%葡萄糖生理盐水静脉滴注.继因血二氧化碳结
音力(0cP)显着降低(当时血钾,钠等检查未能出结果),
静脉漓注液改用5%碳酸氢钠.输注过程中(化验结果及液
体人量见表1)4例均出现呼吸浅速,呼吸困难和紫绀.急行
气管切开3倒,气管插管1例,其中3倒采用人工呼嗳机辅
助呼吸.心电图均见高u波和Tu融合,其中2倒出现室性
早搏.低血钾致呼嗳肌麻痹诊断确立.在心电图监测下,3
讨论
本组4倒远端RTA具酸中毒伴低血钾.都以消化道症
状为主要表现就诊,致误诊为饥饿性酸中毒,由于此种酸中
毒时血钾不降低甚可增高,患者又少屎.因而开始治疗时未
补充钾盐,仅单纯补藏和纠正酸中毒.随酸中毒的减轻,血
钾进人细胞内,加之补液后血钾稀释,使4倒RTA原有的低
血钾在短时问内进一步下降至诱发呼吸肌麻痹.本文教{J}『
提示在纠正原因不明的代谢性酸中毒时,必须首先了解血钾
浓度.针对RTA代谢性酸中毒伴低血钾治疗时,应首先采
用碱性钾盐(不宜用氯化钾)补钾.然后纠正酸中毒或二者同
时进行为宜.关于纠正低血钾静脉滴注钾盐速度.传统观点
强调不可过快,氯化钾浓度以2gA左右为宜.车组3例
静脉滴注氯化钾浓度高达(10,20)g/L,输人速度达(2.2,
3.3)g/h,使患者在短时间内恢复了正常呼嗳,化险为夷.l
例死亡患者,我们认为与静骨末滴注钾盐速度过慢,呼吸肌较
长时间方恢复功能有关.由此可见,严重低血钾产生致命性
并发症时,杠电图监测下快速静脉滴注补钾盐是十分必要的
寰1患者发生呼嗳肌麻?前后血清co,CP
[标签:快照]
变色液体培养技术和基因芯片技术检测结核杆菌耐药的方法比较及其临床应用
变色液体培养技术和基因芯片技术检测结
核杆菌耐药的方法比较及其临床应用 临床肺科杂志2009年3月第l4卷第3期
?
检验?
变色液体培养技术和基因芯片技术检测结核杆菌
耐药的方法比较及其临床应用
张瑞梅刘成永申涛高春景
【摘要】目的利用变色液体培养法,基因芯片法检测痰标本结核杆菌耐药性,并与传统的比例法比较,评价这两种方法
快速检测结核分枝杆菌耐药性的临床应用价值.方法应用变色液体培养法和基因芯片法同时检测62例涂阳肺结核痰标本
MTB对R,H,s,E的耐药性,并与改良罗氏比例法结果进行比较.结果以比例法药敏结果为判断标准,则变色液体培养法测
定异烟肼耐药性的敏感性,特异性,阳性预测值(PPV),阴性预测值(NPV)及准确性分别为93%以上;同样,利福平为:94.4%以
上;链霉素:85.7%(12/14)以上;乙胺丁醇:66.7%(4/6)以上.以比例法药敏结果为判断标准,基因芯片法测定H耐药性的敏
感性,特异性,PPV,NPV及准确性分别为
75%(12/16),78.3%(36/46),54.5%(12/22),90%(36/40),77.4%(48/62);同样利 福平:83.3%(15/18),86.4%(38/44),71.4%(15/21),92.7(38/41),85.5%(53/62);链霉素:85.7%(12/14),87.5%(42/
48),66.7%(12/18),95.5%(42/44),87.1%(54/62);乙胺丁
醇:66.7%(4/6),94.6%(53/56),57.1%(4/7),96.4%(53/55),
91.9%(57/62).结论变色液体培养法测定痰标本结核菌H,R,s,E耐药性与比例法结果有较高的相符率,且简便,快捷,价
廉,安全,可作为MTB耐药性的快速筛选方法,适合基层医院使用.基因芯片法检测
MTB耐药性简便,快捷,但敏感性,特异性
比比例法和变色液体培养法低,同时实验室设备和人员的要求都不是普通医院所
能满足,目前可作为传统药敏试验的补充,要
广泛应用于临床尚需更深入的研究.
目前,结核杆菌耐药的检测仍以培养法为主,由于致病 菌结核分枝杆菌生长速度缓慢,结核杆菌和其他的临床上重 要的分枝杆菌的分离,鉴定和药物敏感试验需要几个星期或 更长的时间,该方法历时较长且繁琐,所做的药敏试验范围 窄,易受多种因素影响;快速测定结合分枝杆菌耐药性的 Baetec~60法因为仪器设备昂贵不能于大批推广";近年来, 多种分子诊断方法已用于分枝杆菌的直接检测,菌种鉴定和 药物敏感实验,极大缩短了诊断时间.但聚合酶链反应—— 单链构象多态性(PCRSSCP)分析和测序技术分析法也 有较高的实验要求或昂贵的仪器设备,虽然许多作者对此进 行了研究,但限于实验条件和技术水平,难以推广应用. 近10年来的研究已证明结核分枝杆菌耐INH 与过氧化氢酶——过氧化物酶的编码基因katG及烯酰基还 原酶编码基因inhA的缺失或突变有关,其中katG完全缺失 或点突变是最主要的耐药机制,最常见的突变位点是315位 Ser;耐RFP是由于其作用靶分子RNA聚合酶B亚单位的编 码基因rpoB突变所致,而且95%左右的突变发生在rpoB507 位至533位的27个氨基酸密码子(81bp)组成的区域内,其 中最常见的突变位点是531位的丝氨酸和526位的组氨酸; 耐SM是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL或16SrRNA 编码基因ITS突变所致,rpsL突变主要位于43和88位密码 子,其中43位密码子突变的发生率最高,rib突变常发生于 513位碱基.耐EMB与阿拉伯糖基转移酶的编码基因em- bABC操纵子突变有关,其中embB基因突变是耐EMB产生 的主要原因,绝大多数突变发生于306位密码子.因此,应用
基因芯片方法快速检测结核分枝杆菌耐药基因型是具有理论 基础的.
基金项目:江苏省徐州市科技计划资助项目(xz2006228) 作者单位:221004江苏,徐州市传染病医院结核科 材料与方法
一
,菌株
H,R,S,E的结核杆菌耐药菌株各10株(预实验用)为我 院细菌库保存的经常规生化反应鉴定为结核分枝杆菌的临床 耐药分离株.结核杆菌标准耐药菌株(H37Rv)购自国家菌 种保藏中心.
二,标本
64例涂阳痰标本取自我院结防门诊部临床确诊的肺结 核患者,其中未经治疗的初治肺结核患者30例,复治病人34 例.
三,试验药物
异烟肼,利福平,乙胺丁醇药粉购于沈阳红旗制药厂,链 霉素药粉为上海信谊药厂产品.比例法L.J培养基内含药浓 度按照中国防痨协会推荐的耐药标准:INH1g/ml,RFP50 ml,SM10g/ml,EMB5g/ml;变色液体培养基法的耐 药标准为INH0.2ml,RFP2.0ml,SM4.0rnl, EMB5.0g/ml.变色液体培养基由深圳市怡百世生物技术 有限公司提供.罗氏培养基购自南京普朗医用设备有限公 司,普通液体保存转移培养基购自珠海银科医学工程有限公 司.耐药基因检测芯片由宁波瑞芯生物技术有限公司和上海 微系统研究所提供.
四,实验前准备
64份涂阳痰标本用3%的氢氧化钠一半胱氨酸37?水 浴振荡20min,10000r/min离心5min,沉淀用液体培养基离
心洗涤2次,沉淀中加入液体培养基恢复体积至1ml,37%培 养24h,利用处理过的样品同时进行MTB的变色液体培养基 法检测,药敏试验和L-J培养法细菌分离测定及比例法药敏 试验.
五,变色液体培养法痰标本MTB耐药性检测
临床肺科杂志2009年3月第14卷第3期409 取0.5ml处理过的样品接种于变色液体培养基中37? 培养,同时接种所提供配套的的结核分枝杆菌鉴定微孔板,每 天观察1次,2周后隔天观察1次,如培养基变为紫红色或底 层有紫色颗粒沉淀时,报告分枝杆菌阳性,若鉴定孔不变色为 结核分枝杆菌,变紫红色为非结核分枝杆菌J,并观察报告 药敏结果.
变色液体培养基测定药物敏感性:对照孔加液体培养基 198ul和菌液2ul,再加入变色剂MTr/xTr1ul,溶剂50ul, 测试孔加入200ul菌悬液,再加入溶剂50lll,37?培养,每天 观察结果1次,当对照孔变紫红色后,取变色剂1ul加入各测 试孔底部,37?培养3h,观察结果.若测试孔变紫红色为耐 药,不变为敏感.
六,基因芯片法痰标本MTB耐药基因的检测
采用宁波瑞芯生物科技公司的结核杆菌耐药基因检测试 剂盒中的标本前处理试剂提取所有菌株的染色体DNA,置 4?保存;设计7对引物,分别扩增kinG,rpoB,ahpC,inhA,
IpsL,rrs和embB7个基因的部分片断,每条片断均包含各自 基因上的检测位点.耐药基因检测芯片上包括:针对kinG基 因315位,IpoB基因511,512,514,516,526,531位点,ahpC基 因启动子区域的一6,一10位,inhA启动子orfl阅读框前一 15,一8位,wsL基因,rrs基因以及embB基因306位的野生 型和不同突变型共同设计探针.用PCR扩增并ey5标记好 的DNA片段分别与DNA芯片杂交,扫描得到结果,根据信号
强度来进行分析.某一探针杂交信号较强,则表示样品在该 位点与该探针序列一致.如果根据526位密码子的DNA序 列设计一条野生型(未突变,药敏),一条或多条突变型(突 变,耐药)探针,若野生型的杂交信号远远大于其他突变型, 则说明该位点没有发生突变,反之则表示发生了与杂交阳性 点相对应的突变.
七,比例法测定
改良罗氏培养基比例法:参考《结核病诊断细菌学检测 规程》(1995年版),制备无药和分别含异烟肼,利福平,链霉 素,乙胺丁醇的改良罗氏鸡蛋培养基;菌悬液的制备,接种,结 果观察参考《结核病诊断细菌学检测规程》(1995年版).参 照文献方法略做改进.根据预试结果选择4种药物的耐药界 定浓度如下:链霉素4.0g/ml,异烟肼0.2ml,利福平40 g/ml,乙胺丁醇4g/ml.我国以比例法作为抗结核药物敏 感性实验的参照方法.耐药标准:含药培养基菌落数/对 照培养基菌落数?1%为耐药.
八,实验结果分析方法
实验结果采用表格登记原始数据,分析三种方法的准确 性灵敏度和特异性.结果统计学处理:用PENS3.1软件统 计分析.
结果
一
,标准参比株的结果
比例法的结果显示4O株结核杆菌药物敏感标准参比株 的四种药物共160项检测结果均与其提供的参比结果相同, 由此可见本实验比例法的结果较为准确,用它来评价变色液 体培养法和基因芯片法具有科学性和可靠性. 表1三种检测方法对结核杆菌药物敏感标准参比株检测比较 方法四种药物共160项检测结果
阳性阴性
比例法与变色液体培养法比较x=O.134,P=0.9078,无显着性 差异;比例法与基因芯片法比较x=O.1185,P=0.7307,无显着性差 异.
二,变色液体培养法和L—J培养法的比较64例涂片阳性 痰标本中,L—J培养阳性64例,阳性率为100.0%(64/64),变 色液体培养基阳性62例,2例阴性污染.污染率3.1%.L.J 培养基细菌生长天数最短12天,最长46天,均为26天.变 色液体培养基生长天数最短4天,最长20天,平均为10天. 变色液体培养基可将药敏试验结果时间为2,6天,而L.J培 养基为平均28天.选取62例两者均阳性的标本进行如下药 物敏感试验.
三,变色液体培养法和比例法检测四种药物耐药性比较 见表2.
表262例标本变色液体培养法和比例法检测四种药物耐药性比较 比例法62例四种药物共248次耐药检测中检出耐药共54个,检出率 21.8%,变色液体培养法248次耐药检测中共检出50个,检出率20.2%,两者 相比较x=O.1947,P=0.6591,无显着性差异.
3.
四,基因芯片法和比例法检测四种药物耐药性比较见表 表362例标本基因芯片法和比例法检测四种药物耐药性比较 比例法62例四种药物共248次耐药检测中检出耐药共54个,检出率 21.8%,基因芯片法248次耐药检测中共检出7O个,检出率28.2%,两者相比 较x=2.7527,P=0.0971,无显着性差异.从仅H耐药情况来看62次检测中 比例法检出16例(25.8%),而基因芯片法检出25例(4o.3%),两者相比较x =
2.3321,P=O.1267,无显着性差异.
五,如以比例法药敏结果为判断标准,则变色液体培养法 和基因芯片法测定H,R,s,E的敏感性,特异性,PPV,NPV及
准确性比较:如表4.
六,基因芯片法耐药基因检测结果
62例痰标本MTB检测出22例24个H耐药基因位点变 异,其中kinG315位,inhA启动因子,ahpC启动因子单独变异 分别为13例,4例和3例,有2例同时出现kinG315位,inhA 启动因子变异;12例比例法和基因芯片法均耐药的标本检测 410临床肺科杂志2009年3月第14卷第3期
到7例katG315位,3例ahpC启动因子单独变异,2例 katG315位,inhA启动因子同时变异;10例比例法敏感的标本 有6例katG315位,4例inhA启动因子变异.62例痰标本 MTB检测出2l例23个R耐药基因位点变异,其中rpoB基因 的531,526,516,513点单独变异分别为12例,4例,2例和1 例,511和516,526和513同时变异各1例;在15例比例法和 基因芯片法均耐药的标本检测到10例531点,2例526点,1 例516点单独变异,511和516,526和513同时变异各1例;6 例比例法敏感基因芯片法耐药的标本检测到2例531点,2 例526点,1例516和1例513点单独变异.62例痰标本 MTB检测出18例18个S耐药基因位点变异,其中15个rpsL 基因,3个rrs基因发生变异.62例痰标本MTB检测出7例 E耐药基因embB306位点变异.
表4变色液体培养法和基因芯片法测定H,R,s,E的 敏感性,特异性,PPV,NPV及准确性(表中数字均以百分比表示) 讨论
一
,分枝杆菌变色液体培养基是一种营养丰富的选择培 养基,其主要成分为磷酸盐缓冲液,谷氨酸钠,多种维生素, 多种微量元素,甘油,马血清,变色剂以及甲氧苄氨嘧啶,氨苄 青霉素,多粘霉素B,两性霉素B和萘啶酸等多种抗生素.丰 富的营养促进分枝杆菌生长,当有活的分枝杆菌存在,消耗培
养基中的氧,再通过分枝杆菌氧化还原系统使培养基中无色 四哇嗡盐还原成粉红色,红色或紫色胃腊不溶于水,以颗粒形 式分泌至细胞表面,这样分枝杆菌菌落就变成了用肉眼可以 观察到的红或紫色的菌落.从细菌生长周期看,变色液体培 养基平均生长天数明显短于L—J培养基.培养阳性率比较, 变色液体培养基也高于而L—J培养基,变色液体培养基分枝 杆菌生长速度明显快于L-J培养基.
本研究采用变色液体培养法检测了62例涂阳肺结核患 者痰标本MTB的药物敏感性并与传统的比例法比较.H药 敏结果:两法结果相同60例,不符2例,其中比例法敏感而变 色液体培养法耐药1例,比例法耐药而变色液体培养法敏感 1例;R药敏结果:两法结果相同61例,不符1例,为比例法耐 药而变色液体培养法敏感;s药敏结果:两法结果相同60例, 不符2例,为比例法耐药而变色液体培养法敏感;E药敏结 果:两法结果相同59例,不符3例,其中比例法敏感而变色液 体培养法耐药1例,比例法耐药而变色液体培养法敏感2例. 两法共有8个药敏结果4株检测结果不一致.用基因芯片法 检测这8个不一致的药敏结果中有4个结果支持变色液体培 养法,1个结果支持比例法.如以比例法药敏结果为判断标 准,则变色液体培养法测定H,R,S,E耐药性与比例法测定结 果的符合率分别为96.8%,98.4%,96.8%,95.2%.如以比 例法药敏结果为标准,变色液体培养检测62例临床痰标本 MTB药敏结果与比例法检测的单个药敏结果总符合率为 96.8%(240/248),菌株的总符合率为93.5%(58/62).本 研究表明,变色液体培养检测临床痰标本MTB的H…RS耐 药性具有较高的敏感性,特异性和准确性,药敏结果与比例法 检测结果的总符合率为较高.检测E耐药性的敏感性较低, 可能与标本较少有关,尚有待进一步研究.
基因芯片始创于90年代初,又称DNA芯片,是近年来发
展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法.是目前分子 生物学最前沿的方法.其基本原理是将多种探针固定在玻璃 等基质上,然后与待测样本的DNA或RNA与探针杂交,通过 检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量 和序列信息.由于该法同时将大量探针固定于支持物上,所 以一次可以对样品大量序列进行检测和分析,从而解决了传 统核酸印迹技术的操作繁杂,自动化程度低,操作序列数量 少,检测效率低等不足.目前,基因芯片技术已在结核分枝杆 菌的基因分型与菌种鉴定,耐药性测定及基因组比较分析研 究中得以应用,其中尤以耐药性测定最为引人关注. 本研究还同时采用基因芯片法检测这62例涂阳肺结核 患者痰标本MTB的药物敏感性并于传统的比例法比较.两 法检测H药敏结果相符48例,不符14例,其中比例法敏感而 基因芯片法耐药l0例,比例法耐药而基因芯片法敏感4例;R 药敏结果相符53例,不符9例,其中比例法敏感而基因芯片 法耐药6例,比例法耐药而基因芯片法敏感3例;S药敏结果 相符54例,不符8例,其中比例法敏感而基因芯片法耐药6 例,比例法耐药而基因芯片法敏感2例;R药敏结果相符57 例,不符5例,其中比例法敏感而基因芯片法耐药3例,比例 法耐药而基因芯片法敏感2例.两法共有36个药敏结果l5 株检测结果不一致.其中5株比例法耐药而基因芯片法敏 感,l0株比例法敏感而基因芯片法耐药.如以比例法药敏结 果为判断标准,则基因芯片法测定H,R耐药性的准确性分别 为77.4%,85.5%,与崔振玲"等报道的基本一致;测定s,E 耐药性的准确性分别为87.1%,91.9%.如以比例法药敏结 果为标准,基因芯片法检测62例临床痰标本MTB单个药敏 结果与比例法检测结果总符合率为85.5%(212/248),菌株 的总符合率为72.6%(45/62).因此,基因芯片法检测肺结 核患者痰标本MTB的H,R,S,E药物敏感性与比例法的相符
率较高,有较高的敏感性,特异性和准确性,但有一部分假阳 性和假阴性.分析其假阴性的原因有:本研究是应用基因芯 片技术直接检测临床标本中MTB耐药基因,由于标本中含有 抑制因子,菌量少或非结核细菌DNA的干扰,建立在PCR基 础上的耐药基因检测的敏感性较低,易出现假阴性结果; katG基因除315位变异外还发现318,321,337,379,394位等 密码子发生突变,rpoB基因还有512,513,514,515,517,518,
522,524位等密码子发生突变,embB基因除306位变异外, 还有274,285,330,406,630位等密码子发生突变,还有em— bC,embA基因突变.另外,目前仍有5%,35%的耐药分 离株未能检测出耐药基因突变,说明可能存在其他的耐药机 制,因此,临床标本耐药基因突变检测阴性并不完全意味着药 临床肺科杂志2009年3月第14卷第3期411 物敏感,而敏感株的耐药基因可能存在不改变酶活性的同 义突变或与耐药无关的错义突变而被判定为耐药,则可引起 假阳性;或因为在一群体中耐药个体数目尚未达到一定比 例但因为检测过程中高度灵敏的PCR扩增而出现假阳 性.我们发现INH与RFP耐药基因突变的假阳性有60% (6/lO)同时出现,这些假阳性菌株的基因突变可能已出现, 但低水平耐药在其它生物学的检测方法中不能够被有效检 出.
本研究表明,变色液体培养法和基因芯片法快速检测痰 标本MTB耐药性均具有较高的敏感性和特异性,但如以比例 法药敏结果为判断标准,基因芯片法测定痰标本H,R,S,E耐 药性的敏感性,特异性,PPV,NPV及准确性低于变色液体培 养法,单个药敏结果总符合率和菌株的总符合率亦较变色液 体培养法低.分析其原因可能为:建立在PCR基础上的耐药 基因检测的敏感性较低,一般每毫升痰中含10000个菌以上 才能获得可靠的阳性结果;基因芯片的制备要考虑许多因
素,杂交是一个非常复杂的过程,杂交反应的质量和效率直接 影响到检测结果的准确性.而变色液体培养法操作简单,影 响因素较少,结果相对准确;本研究所用基因芯片只设计了常 见耐药基因位点,这些位点没有突变不能完全说明MTB没有 耐药.某些耐药基因位点突变与耐药表型之间的关系并不完 全一致(如embB306,katG315),导致较多的假阳性和假阴性. 分析变色液体培养法检测结核分枝杆菌耐药性较之比例 法有以下优点:(1)变色液体培养基生长天数最短4d,最长 20d,平均为10d.变色液体培养基可将药敏试验结果时间 缩短为2,6d,而L—J培养基为平均28d.(2)变色液体培养 检测肉眼即可观察结果,不需特殊仪器设备,非常适合基层推 广使用.变色液体培养法完全有可能在结核菌药敏测定中起 重要作用.基因芯片法较比例法快速,高效,敏感性,特异性 和准确性亦较高,可直接检测痰标本而成为MTB耐药性的快 速筛选方法,是传统药敏方法的补充,但因其敏感性,特异性 和准确性亦均较变色液体培养低,且基因芯片制备比较复杂, 样品的准备与标记又较为繁琐,且需RCR扩增,检测成本较 高,又需要昂贵的仪器设备,且易出现假阳性和假阴性,故基 ?
因芯片技术要广泛应用于结核菌药敏测定还有待更深入的研 究.
参考文献
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本刊常用的不需要标注中文的缩略语
慢性阻塞性肺病急性发作期(AECOPD)
支气管肺泡灌洗液(BALF)
双水平正压无创通气(BiPAP) 慢性阻塞性肺病(COPD)
第一秒用力呼气容积,秒容积(FEV) 第一秒用力呼气容积与用力肺活量比值,一秒率(FEV,/FVC)
用力肺活量(FVC)
重症监护病房(ICU)
最低抑菌浓度(MIC)
)
无创正压通气(NIPPV)
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)
动脉血二氧化碳分压(PaCO) 动脉的氧分压(PaO)
聚合酶链反应(PCR)
结核菌素纯蛋白衍生物(PPD) 动脉血氧饱和度(SaO)
纤支气管镜肺活检(TBLB)
中国结核杆菌利福平耐药株rpoB基因531、526、516位点碱基突变特点
? ? ? ?中国结核杆?菌利福平耐?药株rpo?B基因53?1、526?、516位?点碱基突变?特点
基金?项目:
? 广东省?科技计划项?目(编号:?
2?017B3?18800?377,2?017B0?21800?060)曹?翌明孟繁荣?刘志辉:
? 广州?市胸科医院?广东广州5?10095?李丽:
? 茂名农?垦医院广东?茂名525?200通讯?作者:
? 刘志辉?中国结核杆?菌利福平耐?药株rpo?B基因53?
1、?52
?6、516?位点碱基突?变特点曹翌?明李丽孟繁?荣刘志辉B?ASE M?UTATI?ON CH?ARACT?ERIST?ICS I?N THE? POIN?TS OF? 531,? 526 ?AND 5?16 OF? RPOB? GENE? OF R?IFAMP?ICIN-?RESIS?TANT ?TUBER?CULOS?IS BA?CILI ?STRAI?NS CA?O YiM?ing, ?LI li?, MEN?G Fan?rong,? et a?l
【?摘要】目的?深入了解中?国结核杆菌?利福平耐药?株rpoB?基因53
? 1、5?2
6?、516三?个高突变率?发生位点的?碱基突变特?点,为全面?理解结核杆?菌利福平耐?药机制提供?科学依据。?方法计算机?检索Pub?Med数据?库,对截止?2017年?3月31日?发表的中国?结核杆菌利?福平耐药株?rpoB基?因突变研究?的文献数据?进行整合分?析。结果纳?入分析文献?49篇,获?得3 31?9株利福平?耐药结核杆?菌rpoB?基因各位点?碱基突变的?详细信息,?其中257?株(7.7?4%)未检?测到突变、?3 062?株(92.?26%)检?测到rpo?B基因突变?。在3 0?62株rp?oB基因突?变株中:
? 53?
1、?52
?6、516?位点突变的?发生率分别?为54.4?4%(1 ?667/3? 062)?、27.0?7%(82?9/3 0?62)和8?.92%(?273/3? 062)?;531位?点碱基突变?以TCG/?TTG突变?为主,占9?3.58%?(1 56?0/1 6?67);5?26位点碱?基突变主要?有CAC/?GAC、C?AC/TA?C、
CAC?/CGC、?CAC/C?TC、CA?C/AAC?等类型,分?别占33.?53%(2?78/82?9)、26?.30%(?218/8?29)、1?3 27%?(110/?829)、?10.13?%(84/?829)、?8.08%?(67/8?29);5?16位点碱?基突变主要?有GAC/?GGC、G?AC/GT?C、GAC?/TAC等?类型,分别?占35.5?3%(97?/273)?、35.5?3%(97?/273)?、16.8?5%(46?/273)?。结论中国?结核杆菌利?福平耐药株?rpoB基?因53
? 1、52?
6、?516位点?碱基突变以?单碱基突变?为主,突变?率最高的5?31位点碱?基突变主类?型较为单一?,而52
? 6、5?16位 碱?基突变主类?型则相对分?散。
?【关键词】?结核杆菌r?poB基因?利福平耐药?循证分析d?oi:10?.3969?/j.is?sn.16?71-33?2X.20?17.07?.003利?福平(ri?fampi?cin,R?FP)作为?目前结核病?短程化疗的?关键药物,?其主要作用?机制为与结?核杆菌(M?ycoba?cteri?um tu?bercu?losis?,MTB)?RNA聚合?酶β亚单位?结合而干扰?转录和RN?A延伸。M?TB对RF?P产生耐药?主要因其编?码RNA聚?合酶β亚单?位的rpo?B基因突变?所致,这已?是不争的事?实,并由此?开发了多种?RFP耐药?分子检测方?法
,?1,。这些?方法的研究?及其逐步应?用,为我们?掌握MTB? rpoB?基因突变的?分子特征及?它们与耐药?表型之间的?关系积累了?丰富的资料?。但是单个?研究往往样?本量较小,?菌株代表性?也不强,难?能从中抽象?出MTB ?rpoB基?因突变的总?体特征。遵?从当今日益?推崇的循证?医学理念,?于2017?年开始我们?即对Pub?Med数据?库中MTB? rpoB?基因突变研?究文献予以?密切关注,?并对中国M?TB株的研?究数据进行?循证分析,?2-3,。?在分析RF?P耐药MT?B株rpo?B基因50?7-533?位利福平耐?药决定区(?rifam?pin r?esist?ance-?deter?minin?g reg?ion,R?RDR)序?列突变特征?(相关数据?另文发表)?过程中,我?们发现其5?3
1?、52
? 6、51?6位点的基?因突变各具?其特点,现?报道如下。?1资料与方?法
1?.1文献纳?入与排除标?准纳入标准?:
?
?研?究对象为包?括中国大陆?及香港、澳?门、台湾来?源的RFP?耐药MTB?株;
??研究菌株?RFP耐药?表型明确;?
?基?因突变位点?、碱基与氨?基酸变化等?突变信息均?有良好提供?。排除标准?:
?
?重?复报道文献?;
??二次研究文?献;
??中、英文?以外其它语?种发表的文?献。
?1.2文献?检索以“r?poB A?ND My?cobac?teriu?m tub?ercul?osis ?AND C?hina”?、“rpo?B AND? Myco?bacte?rium ?tuber?culos?is AN?D Hon?g Kon?g”、“r?poB A?ND My?cobac?teriu?m tub?ercul?osis ?AND M?acon”?和“rpo?B AND? Myco?bacte?rium ?tuber?culos?is AN?D Tai?wan”检?索式在Pu?bmed数?据库中检索?,末期检索?日期为20?17年3月?31日。 ? 1.3?文献筛选严?格按照纳入?和排除标准?筛选文献,?2名专业人?员独立阅读?所获文献的?题目和摘要?,在排除明?显不符合纳?入标准的文?献后,对可?能符合纳入?标准的文献?查阅(对P?ubmed?数据库中非?免费全文文?献借助广东?省科技图书?馆原文传递?系统公共平?台获得)并?研读全文,?以确定其是?否真正符合?纳入标准。?
?
1.?4数据提取?由2名专业?人员独立选?择文献、提?取资料并交?叉核对,意?见不一致时?由第三位研?究者决定取?舍。提取的?主要资料包?括:
? 第一作者?姓名、研究?机构、Pu?bmed标?识码PMI?D、文献发?表年度、菌?株来源、研?究菌株总数?以及突变类?型、位点、?碱基变化、?氨基酸(A?A)变化、?突变株数量?(N)等。?
1.?5统计学分?析对纳入研?究文献的基?因突变计数?资料信息进?行合并计算?。2结果2?.1纳入研?究的基本特?征依检索策?略检出13?0篇文献,?通过阅读文?题与摘要3?1项研究明?显不符合文?献纳入标准?;对所剩9?9篇文献进?行全文查找?、研读全文?,最终49?篇文献纳入?本研究(包?括中文12?篇、英文3?7篇),获?得3 31?9株利福平?耐药结核杆?菌中国株r?poB基因?各位点碱基?突变的详细?信息。纳入?文献的基本?情况见表1?。2.23? 319株?利福平耐药?结核杆菌中?国株rpo?B基因53?
1、?52
?6、516?位点碱基突?变情况在3? 319株?利福平耐药?结核杆菌中?国株中,2?57株未检?测到rpo?B基因任何?位点的突变?,占7.7?4%;其余?3 062?株(92.?26%)则?在rpoB?基因的不同?位点检测到?多种不同类?型的突变。?在3 06?2株rpo?B基因突变?株中:
? 53
? 1、5?2
6?、516位?点突变的发?生率分别为?54.44?%(1 6?67/3 ?062)、?27.07?%(829?/3 06?2)和8.?92%(2?73/3 ?062);?531位点?碱基突变以?TCG/T?TG突变为?主,占93?.58%(?1 560?/1 66?7);52?6位点碱基?突变主要有?CAC/G?AC、CA?C/TAC?、CAC/?CGC、C?AC/CT?C、CAC?/AAC等?类型,分别?占33.5?3%(27?8/829?)、26.?30%(2?18/82?9)、13?.27%(?110/8?29)、1?0.13%?(84/8?29)、8?.08%(?67/82?9);51?6位点碱基?突变主要有?GAC/G?GC、GA?C/GTC?、GAC/?TAC等类?型,分别占?35.53?%(97/?273)、?35.53?%(97/?273)、?16.85?%(46/?273)。?具体情况见?表2。3讨?论对于MT?B RFP?耐药的分子?机制,迄今?已经基本阐?明,人们研?究发现约9?5%左右的?RFP耐药?菌株中存在?rpoB基?因突变,且?多发生在r?poB50?7,533?位27个氨?基酸密码子?(81bp?)组成的区?域(即前述?的利福平耐?药决定区R?RDR)内?,这与我们?对4149?株利福平耐?药MTB株?rpoB基?因RRDR?序列的循证?分析结果(?93 64?%)相近(?相关数据另?文发表),?但是有文献?报道53
? 1、5?2
6?、516位?点的突变率?分别为39?.9%、3?4.2%和?7.5%
?,与本文的?54.44?%、27.?07%和8?.92%有?较大的差别?,尤其是5?31位点。?这可? ,4,
能是此?文献给出的?为来自全球?研究报道的?综合信息,?而本分析结?果则是特对?中国MTB?菌株而言,?那么其中又?蕴藏着一些?令人深思的?问题。依据?进化论的观?点突变应是?一种不受环?境影响的随?机发生过程?,这已得到?彷徨变异实?验和影印平?板等实验的?证实
?,5,。从?本质上讲,?细菌耐药基?因突变属于?一种进化形?式,其突变?模式也应遵?从随机过程?的一般规律?。但关于耐?药结核病发?生的一般机?制,则有优?势学说和顺?次选择学说?认为:
? 结核杆?菌在繁殖过?程中,极少?菌株自然突?变形成耐药?菌,在抗结?核药物选择?性压力存在?情况下,此?种自然突变?发生的频率?可能增加
? ,6,?。这就说明?:
?在危及细菌?生命安全的?情形之下,?突变似乎并?不完全随机?,而有定向?突变的倾向?。这对我们?深刻理解不?同报道间上?述位点突变?率之间的差?异也许有益?。我们也许?可以如此朴?素地思维:?
5?31位的丝?氨酸是RF?P最为关键?的作用的靶?位,MTB?在531位?产生碱基突?变是其最为?直接和简化?的“趋利避?害”方式。?另一方面,?我们知道:?
在?生物界中,?各种生物采?用较为通用?的遗传达室?法则,即应?用64上可?能的三联体?密码子中的?61个编码?20种不同?的氨基酸,?为降低突变?对物种变化?的影响,一?种氨基酸可?能由几个密?码子编码,?编码同一氨?基酸的多个?密码子仅在?第三位碱基?上存在差异?
,7?,。但我们?可以从表2?看到:
? MTB? rpoB?基因53
? 1、5?2
6?、516三?个位点发生?同义突变(?即单独第三?碱基突变)?的几率近乎?为零,而多?为第一、第?二碱基的单?碱基突变,?这也说明M?TB的耐药?基因突变并?非随机,而?是以较为特?定的方式。?此种特定的?方式我们可?以总结为:?
? ?碱基?突变多导致?有义突变;?
?尽?力避开其本?身的基因复?制“纠错机?制”,以单?碱基突变为?主。我们认?为:
? 在强大的?抗结核药物?环境压力下?,MTB以?此种最为“?经济”而简?约的方式达?则可较高效?率地达到基?因突变的目?标以利于其?生存,符合?生物进化的?一般原则。?此种推测是?否妥当,有?等更进一步?的研究予以?证实。从表?2还可看到?:
?突变率最高?的531位?点碱基突变?主类型较为?单一,而5?2
6?、516位? 碱基突变?主类型则相?对分散。为?何如此,目?前我们不得?而知。至于?53
?1、52
? 6、5?16位点与?其它位点的?联合突变,?由于发生率?不高,本文?未进行详尽?分析。这些?都有待人们?进行深入探?索。参考文?献
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结核杆菌的耐药机制及分子生物学检测方法进展
结核杆菌的耐药机制及分子生物学检测
方法进展
结核杆菌的耐药机制及分子生物学检测方法进展2009-06-28 19:39中国学术期刊网2007-05-07
结核病困扰人类已有上千年的历史,至今仍是严重的公共问题。全世界因结核病而死亡的人数比所有传染病死亡的总和还要多,耐多药结核病(multidrug resistant tuberculosis,MDR-TB)则有可能使结核病再度成为"不治之症",艾滋病的流行更是加剧了全球结核病的流行。因此,对结核病耐药机制的检测研究,尤其是对结核病耐药快速检测方法的研究已成为迫切的需要。1、耐药结核杆菌的耐药机制结核杆菌产生耐药性主要是由不合理用药引起的结核杆菌内抗结核药物作用靶基因突变所致,结核杆菌发生耐药的机制目前从细胞机制与分子机制或细胞水平与分子水平上来分析。1.1细胞水平上的耐药机制?结核杆菌对抗结核药物的耐药概率不同,从而说明细菌对疗效最差的药物最易发生耐药。?抗结核药物防止耐药的效力不同。?病灶中细菌数量、药物应用数与耐药发生率的关系;病灶中结核杆菌数量越大,耐药的机会越多;用药数越多,耐药的机会越少。?优势学说和顺次选择学说,顺次选择学说是造成MDR的主要原因,也是造成MDR-TB的主要原因。1.2分子水平上的耐药机制迄今为止,关于结核分支杆菌耐药性机制问题有3种观点:?细胞膜(壁)结构与组成发生变化,使细胞膜通透性改变,药物通透性降低,产生降解或灭活酶类,改变药物作用靶位。?质粒或转座子介导的耐药性,但结核分支杆菌是否存在质粒尚未得到确切的证据。?染色体突变介导的耐药,药物靶编码基因突变。近年国内外研究报告指出,耐药结核分支杆菌临床分离株药物靶编码基因发生突变,与耐药性密切相关,是结核分支杆菌耐药性的主要分子机制。Jungblut等采用2-DE和质谱技术,检测出了与异烟肼抗药性有关的蛋白。国内乐军等采用2-DE及MALD I技术对异烟肼耐药的结核分支杆菌和敏感菌株进行比较蛋白质组学研究,发现了存在于耐药菌株的26个细胞壁蛋白,并鉴定了其中6个蛋白,推测可能是海藻糖-6-磷酸磷酸酶(putative treha-lose-6-phosphate
phosphatase)、铁钼蛋白(moaA)、莽草酸5-脱氢酶(putative shikimate-5-
dehydrogenase)、葡萄糖胺果糖-6-磷酸氨基转移酶(glucosamine-fructose-6-
phosphate aminotrans-ferase)、吲哚-3-甘油磷酸合成酶(indole-3-glycerolphosphate synthase)、TetR家族转录调节因子(putative-TetR-family transcriptional regulator)。这6种蛋白质可能在结核分支杆菌细胞壁的合成以及细胞壁的新陈代谢中发挥重要作用,它们的发现为设计和开发新的抗结核药提供了重要信息。1.3蛋白质组学在结核病早期诊断研究中的应用结核病是结核分支杆菌引起的呼吸系统的主要传染性疾病,其病原学诊断主要依靠痰细菌涂片及细菌培养,但前者阳性率低,后者又需历时4~8周,耗时长。近几年出现的基因快速诊断,又因费用较高,实验室条件要求高,不易广泛开展。因而急需寻找快速、有效的早期诊断方法。Bahk等对H37Rv以及临床分离的结核分支杆菌K株和CDC1551进行比较蛋白质组学研究,发现了8种蛋白质:Rv0652、Rv1636、Rv2818c、Rv3369、Rv0566c、Rv3865、MT3304、Rv3160。这8种蛋白质在结核分支杆菌K株中含量相对较多。采用大肠杆菌分子克隆、表
rRv3369、rRv3874,联合酶联免疫吸附实验,达、纯化的方法得到rRv0566c、
对100份肺结核患者和100份健康人血清进行研究,结果显示rRv0566c、rRv3369、rRv3874诊断肺结核的敏感度分别是60%、74%、43%,特异度分别是96%、97%、84%。表明rRv3369和rRv3874有望成为肺结核早期诊断的分子标志物。1.4几种主要抗结核药的耐药分子机制1.4.1异烟肼近几年来的研究表明,过氧化氢酶--氧化物酶(catalase-peoxidase)的编码基因(Kat G)和(或)参与分支菌酸生物合成的烯酰基还原酶编码基因(inhA)改变,是结核杆菌耐异烟肼产生的主要分子机制,但这两种基因突变只能解释约80%的耐异烟肼分离株,ahpC基因在另外20%的耐异烟肼作用仍在研究中[6]。最近,Mdluli等发现β2酰酮酰基载体蛋白合成酶(kasa,β-ketoacylacyl carrier protein
synthetase)上出现了引起氨基酸改变的突变,仅发生于没有以上基因突变的异烟肼耐药菌中。1.4.2利福平目前研究表明,结核分支杆菌耐利福平是由于其作用靶分子RNA多聚酶β亚单位的编码基因(rpoB)突变所致。且突变均发生在rpoB 509~533位的25个氨基酸的(75 bp)组成的区域内,突变频率最高的是在氨基酸密码子531(丝氨酸?亮氨酸)上,其次为526(组氨酸?酪氨酸)。对RFP敏感的菌株目前尚未发现存在rpoB基因的突变,而耐药菌株的突变检出率确在90%以上。Kapur等[8]和Morris[9]分析的结核分支杆菌耐药分离株来自欧洲、非洲、拉丁美洲和亚洲等11个国家,所检测的药物靶基因及突变均无明显的地理差异,说明结核分支杆菌基因组稳定,进化变异缓慢。因此,了解rpoB突变分布频率有助于鉴定来自不同地理位置的耐药株。也有研究提出将检测rpoB基
因突变作为MDR诊断的代表性标志。1.4.3链霉素耐链霉素的结核分支杆菌编码核糖体的16SrRNA的rrS基因与核糖体蛋白S12rpsL基因发生突变,抑制药物结合到核糖体上的能力,影响16SrRNA的高顺序结构,使之对链霉素耐药。链霉素主要作用于结核分支杆菌的核糖体,诱导遗传密码的错读,抑制mRNA转译的开始,干扰转译过程中的校对,从而抑制蛋白质合成。核糖体蛋白S12的正常作用可能是维持读码过程中的一些轻微的不准确性,rpsL基因突变会导致S12蛋白改变,而严格要求核糖体只使用与每一密码对应的氨酰2tRNA上的每一密码,抑制了与诱导的遗传密码错读而产生耐药性。虽然新近研究表明,16SrRNA基因(rrS)突变也会导致部分结核分支杆菌产生链霉素耐药,但rpsL基因突变是链霉素耐药的主要的分子机制。1.4.4吡嗪酰胺目前认为吡嗪酰胺(PZA)在细胞内的酸性环境中经吡嗪酰胺酶作用转变成吡嗪酸而起杀菌作用。72%的PZA耐药菌株编码吡嗪酰胺酶的pncA基因突变,核苷酸丢失或氨基酸替换,
的PZA耐药菌的耐药机制仍在研究中。使酶活性丢失导致耐药。另28%
Sreevatsan发现,一旦结核分支杆菌对异烟肼、利福平、链霉素耐药时,很可能出现PZA耐药。1.4.5乙胺丁醇乙胺丁醇(EMB)可抑制[-214C]葡萄糖转入阿拉伯半乳糖的D-阿拉伯酸,并抑制阿拉伯半乳糖转入分支杆菌细胞壁,引起trehalose mono2和dimycolates的堆积。70%EMB耐药菌株编码葡萄糖合成转移酶的embB基因突变,氨基酸替换可改变药物-蛋白质的相互作用导致耐药;另外30%EMB耐药菌株可能与embB蛋白过分表达有关。1.4.6喹诺酮类药物耐喹诺酮与编码DNA螺旋酶(gyrase)亚单位的结构基因突变有关。突变集中在gyrA基因的保守区,87个密码子发生G?C突变,氨基酸置换。gyrA基因突变出现中、高度耐药,gyrB基因突变,呈现低度耐药。这个区域内碱基的突变导致了菌体解旋解A亚基与氟喹诺酮类药物结合区结构改变,抑制了两者结合而导致耐药。2、目前国内外应用于检测耐药结核杆菌的分子生物学方法随着分子生物学的发展,尤其是PCR技术的问世,检测耐药可以直接从基因入手,这样与传统的结核杆菌药敏试验相比,不仅大大缩短了检测周期,实现了自动化,而且也降低了生物实验室的危险性。耐药检测包括用PCR扩增基因组内携带的耐药性区域,和进行扩增产物的突变分析。结核分支杆菌耐药性的基因检测技术分为杂交系统和放大系统两大部分。多数放大系统基于杂交系统,其另一部分是PCR扩增技术。以下主要叙述应用于结核菌耐药性检测中的核酸检测技术。2.1 PCR/UHG Williams等创立在6 h内获得快速检测结核菌利福平耐药性的方法:先用巢式PCR扩增特异的rpoB基因片段,再与根据结核菌rpoB基因Rif
区合成的通用异源双链扩增子UHG(universal heteroduplex generator)探针杂交,如果标本中的结核菌rpo B基因有突变,则会产生异源双链,通过电泳可分离异源双链,确定其是否有利福平耐药性。此方法对涂片染色阳性、未经治疗的病例尤为适合。值得注意的是,PCR/UHG是依据rpo B基因Rif区的核
用BACTEC检测),但不能苷酸变化来确定其耐药性的,少数标本有耐药表现型(
查到其基因型变异,其耐药机制可能是在Rif区外,或不在rpoB基因。2.2探针检测LiPA(line probe assay)Martlila等根据固相反向杂交原则设计的检测方法,将靶DNA用带有生物素的引物进行PCR扩增,带生物素的PCR产物与膜固定的捕获探针杂交,再加入交联碱性磷酸酶的链霉亲和素,洗去未结合的链霉亲和素,加入底物显色,由此来检测靶DNA是否变异。LiPA已由Innogenetics开发成商业试剂盒(INNO2LiPARif.TB)用以检测结核菌利福平耐药性。此方法快速,所需的条件不太复杂,可较多地应用于临床检测。2.3错配分析(mismatch analysis)Nash等用利福平敏感株(H37Ra)和靶DNA一起进行PCR扩增,采用带有T7和SP6 RNA聚合酶启动子的引物。其PCR产物作为模板作RNA转录,转录体杂交后用RNase消化,突变点不能杂交将被切割,琼脂糖电泳可区分未被消化的转录体和断裂产物。错配分析较灵敏,但因涉及RNA操作,一般实验室不容易严格执行无RNA酶实验操作,临床上使用不多见。2.4变性梯度凝胶电泳(DGGE)其原理是双链DNA在递增的变性剂浓度梯度或温度梯度中电泳时,DNA不同区段可根据不同的溶解温度(Tm)而解离。杂交体中碱基的错配会造成相应区段的不稳定,致使同源体和杂交体之间相应区段的Tm差异可达6?。这样,野生型和突变型单链所形成的杂交体即可被区分出来。值得注意的是,DGGE在分析每一特定的PCR片段之前,需要通过预试验来确定其最佳的电泳条件,以获得最大的分离度。这需要一定的电泳条件,实验室可自行操作。Scarpellini等用DGGE检测临床标本,其基因型被证明是对利福平耐药的结核菌,仅1株对利福平敏感,而在48份脑脊液标本中,其基因型和表现型完全一致。2.5单链构象多态性(SSCP)其原理是在某一条件下,单链(ss)核酸在溶液中会形成一定的二级结构,其碱基的组成会影响二级结构的形成。单个核苷酸的变化也会改变ssDNA的构象,致使其在非变性电泳中泳动的速度发生变化。SSCP广泛用于结核菌耐药性分析,如检测rpoB、katG、rpsL基因等。在检测中要注意以下几个问题:SSCP检测的片段大小在150~200 bp之间,用SSCP检测较大片段时,所能检出的突变数会减少;要严格控制凝胶及电泳条件;要结合表现型检测结果。随着SSCP的标准化、自动化程度的改善,操作时间也
会相应缩短。2.6限制性片段长度多态性(RFLP)因为基因突变,在限制性内切酶酶切DNA片段时,其长度会发生变化,电泳得到其多态性变化。Nachamkin等进行了一系列试验来检测结核菌的耐药性。RFLP用于katG和rslP基因突变的检测,其特异度达100%,但其敏感度却只有28%;而检测rpoB基因的异源双链分析达到76%的敏感度和97%的特异度。突变可能发生在其他基因,而导致了RFLP检测的低敏感度。在检测耐药性时,要选用合适的方法,并在1份标本中检测所有的耐药基因。2.7 RT-PCR临床分离的标本常有多重耐药性,需用多种方法检测,也可根据结核菌的其他性质来确定其是否耐药。Patnaik等用RT-PCR检测分析结核菌的耐药性,采用前体rRNA特异的引物。前体rRNA有一末端茎结构,当成熟rRNA亚单位形成时此结构被切除。RNA合成受抑制将大大影响茎在细菌中的数量。因此,此方法可正确预测结核菌对利福平的耐药性;而异烟肼、乙胺丁醇对此无影响。2.8定量PCR Torres等用定量PCR确定结核菌对异烟肼的耐药性,把细菌放在不同浓度的异烟肼中培养,1~3周后可用定量PCR方法测到耐药株和敏感株间细菌DNA量的微小差异,以此确定菌株是否耐药。定量PCR准确可行,但不易普及。2.9分子信标为一茎环状结构的寡核苷酸探针,其环状区核苷酸序列与靶核酸互补,靠近两端的部分序列互补构成分子信标的茎部,两末端分别标记荧光基团和淬灭基团。当靶核酸存在时,茎部结构结合靶序列而打开,荧光基团和淬灭基团分开,产生荧光,荧光多少与茎部结构同靶序列结合的程度有关。Piatek等用该法检测了75份标本的rpoB基因的突变,方法直观,但需要发光检测仪器,也有可能错过新发生的突变。2.10枝链DNA(bDNA)是一个多重杂交系统,其检测灵敏度大大提高。将靶DNA与固相固定的特异探针杂交,再加入另一特异探针与靶DNA杂交,此探针可结合一树枝状bDNA,标记有(AP)的探针与bDNA结合,加入发光底物,用发光检测仪来测量发光强度,灵敏度高,接近PCR水平。已有人将此法用于细菌耐药性检测。2.11基因芯片(gene chip)技术基因芯片是指将大量不同的生物信息分子(如寡核苷酸、DNA或cDNA探针等)以高度密集的方式(通常每平方厘米点阵密度高于400),有序地固定在固相支持物(通常为玻璃)上而形成微阵列。当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子相结合后,用激光共聚焦荧光扫描或电荷偶联摄像机对荧光信号的强度进行检测,从而对杂交结果进行量化分析,所以可一次性对样本大量序列进行检测和分析。Jing等用cy5标记的引物对靶基因rpoB进行扩增,然后用NDA芯片检测PCR产物,结果其检出率为83%。利用基因芯片探针杂交方法还可以对2个以上不同的耐药性基因同时进行分析,如
结核杆菌对异烟肼、利福平、EMB、PZA等多种药物的耐药基因都可同时进行检测[28]。由于该方法灵敏、方便,特异度高、信息量大,且成本较低,因而具有广阔的临床应用前景。3、展望目前用于结核杆菌耐药性监测的传统方法耗时长不能满足临床治疗的需求,因此,国内外都在寻找1种快速而且灵敏度高的监测方法,以期快速的给临床治疗提供依据。由于结核菌耐药机制复杂,常有多重耐药,其耐药性检测也应选择合适的方法,检测多个耐药基因,并结合传统的培养方法。目前DNA芯片技术发展迅速,可在同一载体上进行多个基因检测,其具有高密度、高容量可导致一个量变到质变的过程,将是非常好的耐药性检测手段。这样可以在1个芯片上检测几种药物的耐药性,即加快了监测速度又节约了成本。随着分子生物学的发展,基因芯片技术的应用前景将会更加广阔,可以及时的为临床治疗提供依据。
分子生物学方法检测结核杆菌对利福平耐药性研究进展
分子生物学方法检测结核杆菌对利福平耐药性研究进展 摘要:近年对结核杆菌耐药机制的表明,rpB基因是利福平耐药基因,耐药株通常特定位点基因突变,可以鉴定突变有无而评估其利福平耐药性,本文对这做一简要综述。 结核病至今仍是世界上严重的公共卫生问题,估计全世界每年有…
摘要: 近年对结核杆菌耐药机制的表明,rpB基因是利福平耐药基因,耐药株通常特定位点基因突变,可以鉴定突变有无而评估其利福平耐药性,本文对这做一简要综述。
结核病至今仍是世界上严重的公共卫生问题,估计全世界每年有800万新病例,290万人死于结核病,是当今单病菌致死的最主要死因。近十几年来结核病疫情呈现全球性回升趋势,产生原因之耐药菌株的产生和播散。1990年我国结核病流行调查结果表明,我国临床分离株耐药率达39.9,,初始耐药率31.7,,复治继发耐药率47.8,。利福平是主要的抗结核药物,对利福平耐药常常化疗失败,且被是多耐药菌株的标志。早期迅速对结核患者利福平耐药性鉴定。现将进展做进一简要综述。
传统方法直接或间接含药培养结核分支杆菌利福平耐药性鉴定,这是体外结核杆菌耐药性的直接证据,并且可以其对利福平耐药程度。但各实验室间所用培养基不同,检测方法不同,结果判定标准不一,结果报告差异,并且结核分支杆菌本身属于缓慢生长菌,使得耐药培养耗时长,通常需8,12周,现代短程化疗需要。
近年发展起来的应用BATE460TB系统结核杆菌培养及药敏测定可以大大缩短结果回报,但此法在培养方法基础上仍需数天出结果,加之仪器试剂昂贵,有放射性污染等,限制了临床应用。
1 利福平耐药基因的
关于结核杆菌利福平耐药机制一直三种假设,膜通透性、耐药质粒介导及染色体组基因突变(耐药性基因),已证实耐药基因突变与利福平耐药有密切关系。
细菌利福平耐药基因在大肠杆菌。利福平耐药的大肠杆菌其RNA聚合酶有突变并且只在β亚上,并推知产生β亚突变的基因位点相接,对基因了大肠杆菌野生株编码RNA聚合酶β亚基因(rpB)序列,并耐利福平的大肠杆菌有rpB基因突变。编码RNA聚合酶基因在细菌进化中呈序列保守性,对大肠杆菌利福平耐药基因的资料,Telenti[1]对结核分支杆菌利福平耐药基因突变了,在与大肠杆菌rpB基因突变高发区(?区)位点(511,533aa)的长69bp片段内,64/66耐药株有突变,而未见于56株利福平敏感结核菌株。此后许多都证实结果,并于此区城内新的突变位点[2,5]。而iller[6]做了一项,他应用致点突变技术编码rpB基因531号氨基酸(参考大肠杆菌基因位点)碱基突变并将其导入利福平敏感的耻垢分支杆菌株LRZZZ中,使之了表型,即由原来的利福平敏感株转为利福平耐药,也证实rpB基因突变是利福平耐药的唯一原因。illias[4]对一患者感染的结核杆菌株利福平耐药表型转换前后做了rpB基因序列分析,证实表型后其耐药基因了。但rpB基因突变致利福平耐药详细机制还未明了。
2 分子生物学检测方法
上述对结核杆菌利福平耐药机制的为运用分子生物学方法耐药性评估了坚实的理论依据,其技术路线上是在用PR方法对rpB基因突变区域扩增基础上,对扩增产物突变鉴定,归纳如下:
2.1 直接顺序法 对突变高发区城序列分析是鉴定突变的最直观的方法,可以判定突变的有无及突变性质,其它间接鉴别方法的金标准。应用放射性同位素或荧光标记测序法,已许多突变位点及不同的氨基酸置换。突变在511-533区域内率达95,,以531,526,533,516四个位点最为常见[1,5]。illias了流行病学特征和结核杆菌利福平耐药突变性质之间的内在,突变位点及性质与耐药模式及程度,IS6110图谱及地位等无关系。但Taniguehi[5]有不同意见,他结果表明513,526,531位点的突变对利福平耐药而位点则低度耐药或无耐药性。总
之直接测序可以突变详细资料,还可以对新突变 鉴定,之处是仪器试剂昂贵,操作,成本高,有放射性污染,不适于推广应用。
2.2 多聚酶链式反应-单链构象多态性分析法(PR-SSP) 其原理为在非变性聚丙烯酰胺凝胶中相同长度单链DNA片段泳动距离的判定单个碱基变异。利福平耐药突变只在特定区域内,而PR方法扩增这段基因,直接电泳判定突变有无,大大简化了突变分析操作。Telenti[1]最先评估了放射性同位素标记PR-SSP方法的结核杆菌rpB突变中的应用价值。所有利福平耐药菌株均地被检测,证明此方法特异。它可以临床标本筛选,使结果回报缩至48,72小时。国内外本方法的较多,并已有用于临床痰标本及脑脊液标本检测的报道[2,7,8]。SSP方法为临床简便鉴定结核杆菌rpB基因突变开辟了新领域,,如每次电泳均需有标准结核杆菌株对照及有时差异不易区分、鉴别沉默突变[9]等,但仍不失为有应用前景的方法。
2.3 双脱氧指纹图法(didexy fingerprinting, ddF) 在对PR产和的rpB基因突变检测方法的中,Felee应用了ddF法[9],方法运用了双脱氧末端终止法及SSP法的原理,它将rpB基因片段复制产物做模板直接加入用于产生类似DNA测序产物的有放射性标记的不同长度的双脱氧末端片段,再行SSP,经放射自显影后得出针同突变的特异的ddF。,有rpB基因突变,在SSP电泳中可以从因单链构象产生的泳动距离差异在SSP中得以鉴别,其双脱氧末端终止位点不同于标准株,双脱氧末段片段数目也不同而得以区分。Felee检测出了有不同突变(包括了80,已报道的rpB突变)的所有多耐药菌株,每一突变均有特异的ddF。在与SSP分析法的对比中,ddF方法可以克服SSP结果受电泳条件、电泳大,受突变性质(位点及突变碱基)大及区分出,在和成本上都有优越性,但未见有临床应用情况的报道。
2.4 异源双链法(heterduplex fratin, HDF) HDF可用于检测DNA单个碱基突变或缺失,原理为突变基因与无突变基因PR扩增产物混合,变性后使其温度缓慢下降,可分别于突变与敏感株基因的异源双链,有同源双链,电泳后可将二者区分开来,并且突变不同(如单碱基突变,插入、或缺失),的异源双链迁移距离也不同。illias[4]用HDF法了结核杆菌利福平rpB突变检测的尝试,110株RFP耐药株经HDF检测多条带形,证明有异源双链,而敏感株则只一条同源双链,HDF法与DNA测序法符合率达100,。方法操作简便,判定容易,不需放射性标记,适合应用于临床,但报道较少。
2.5 反向系列探针杂交法(Inn line prbe assay, LiPA)LiPA方法基于探针杂交原理,先设计合成一系列探针,覆盖整个rpB突变高发区,S系列探针野毒株序列,R系列探针含数个有常见突变序列的探针,还可以设计有种属特异性的探针,将系列探针顺次固定于同一杂交膜上,在条件下与亲和素标记的PR产物杂交,检测杂交信号,不同杂交带谱判定出突变有无及大致位置。杂交方法可以种属鉴定,检测试剂盒已有厂家生产,结果判定容易,特异性高,易于标准化。如Beenhuer[10]应用此法对临床痰标本的检测中与药敏结果对照有97,(65/67)的符合率。最近有学者[11]应用此法对结核分支杆菌种属鉴定及PR敏感性测定,特异性达100,,对107株已知序列的结核杆菌临床分离株测定中,61株敏感株显示敏感型杂交带谱,203株耐药株除4株外均检测到突变带谱,误诊率下降到1.97,。之处是操作,成本较高。
分子生物学方法对结核杆菌RFP耐药性检测应用中均有、,特异等优点,可在72h内报告结果,可以早期临床诊治需要,是结核杆菌RFP耐药性测定发展趋势。下一步是临床标本rpB基因扩增特异性(因其单拷贝于基因组中),技术条件标准化、规范化,将耐药性诊断及种属鉴定 的方法,使其能够直接应用于临床的方法。 参考文献
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