新疆乐农五

根据《生物学教学大》要求，培养学生自学生物学知识的能力，观植的生活习、形态构、生殖发育等方面的识……，主要是指培养学生的观察、实验动手能力，培养学生实事求是、认真细致和长期进行观察的科

《大纲》中还要求重视密切联系本地区动物种类的实际情况进行教学，选择或讲述当地常的和对经济发展有重要意义动植种类。根据新温带大陆性气候的点，棉花是该地区常重要的经济作物。在教材教版《九年义务教三年制初级中学》第一册（上）被子植物的分科中，我结合地区实际补充了“锦葵”一课教学，开辟了以班组为单位的生物角，让学生利用学校的实验种植棉花或到棉农棉田中进行棉花生长过的观

!品种特征特性

!

植株

棉株

生育期!(,天左右，絮期集中絮畅，易采摘，

$

枯

黄萎病病性指!!’(*，属抗枯黄萎品。对苗期根腐病和后期铃疫病有较强的抗性，抗旱能力

实验教学与仪器!

天停水。

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株高%,$%%01，果枝数&$/台，倒四叶宽!,$!

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酒精代水现象更明显

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九年制义务教育物理课第二册《做功和内能的改变》一节，为说物外功，内能小，设计一个演示实验。在准备验时，笔者发现：当向瓶内加压，压缩空气

我想，酒精的沸点比水，相应地，酒精气体比水蒸气更容易液化。果酒来代替，现象不更明显吗？找来酒精一，果不其然。当瓶塞被压缩空气冲出时，瓶即出现一股浓浓的“白雾”，连座在最后一排的同学也看得非

注意，不用乙醚来做此实验，因乙醚极易蒸发，生的气体扩散

在中学地理教学过中，有些教学挂图存在图形小、的足之，坐在教室后面的学生不易认，大大影响了教学效果。作为

制作的步骤是，首先将拟的地图描于玻璃片上，再在墙上钉上一张拟画的白，然后在纸的前方放幻灯投影仪，将描好地图玻璃片置投影的镜面上，最后将白纸上的投影绘下来。这样，制作出来的地图比较准确，而且十分适用，对教学帮

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肥

开始放!

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好地3月

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轻病虫害，保

通过开展以上活动，使学生对被子植物的部分内容有更地认识，培养学生实事求是、吃苦耐劳理论联系实际的科学严谨的学习

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节安

实验教学与仪器!

棉花生长过程

棉花生长过程

苗期----蕾期---花期---铃期----收获期常花苗（播）到拔的整个过程叫棉花的生，也叫大田生长期，需200天左

棉花的育期划分为5时期，即播种出苗期、苗期、

（1）播种出苗期

从棉子播种到50％的子叶出土并开，为播种出苗期。一般在4

（2）苗期

从出苗到田有50％棉株出现

（3）蕾期

从现蕾到50％棉株开第一朵叫蕾期，25－30，蕾期一般处于

（4）花铃期

从开花到有50％棉株第一个棉铃吐叫花铃期，需50－60天。期多处于7月上旬到8月中旬的气环境，营养长与生殖生长两时期，有70%上的干物质在花铃期成。是决定棉花产高低的关键期，也是棉田管理的重点时期。花铃期是棉花一生中需水多的时期，棉株对水反应敏感，如水分失调，代谢过程受阻，大量蕾铃脱落，并引起早衰，严重响棉

（5）吐絮期

从开始吐絮到收花结为吐絮期。约70天，一般在8月、开吐絮，9月为吐盛期，10月中、下到11月初基本收花完毕。棉铃积累

棉花从现蕾开始进入生殖长，从现蕾到吐絮期间，棉花既长根、茎、叶等营器，有蕾、开花、铃等生殖器的发育，营养长与生殖生重叠时间70－80天。此期影响棉花产量和质量因素主要有：阴雨连绵加重棉花烂铃、冷秋年份使棉花贪青迟熟，纤维发

棉纤维的马克隆值是纤维细度和成熟度的综合映，成熟度不同，不仅会引起纤维性能的，而且对成纱艺、质量及织物质量也会产生大的影，棉维的马值可作为评价棉纤内在品质的一个综合指，直接影响纤维的色泽、强、细度、天然性、弹性、吸湿、染色等；生期过长、过成熟的皮棉纤维较粗，不适合于纺中高档棉纱，马克隆值在4.1~4.3范围的皮棉，生长期较短，欠成熟，相对衣分率较低，但纤维细度，纤维单较高，成纱截面纤维根数多，强力高，可以

病 害

棉花红腐病

症 状 ：在苗未出土前受害。幼芽变棕色死亡；幼苗受害，幼茎基部幼根肥肿变粗，最初呈黄褐

防治方法 ：在苗期阴雨连绵，棉根病初发时，及时用40％多灵胶悬剂、65％代森锌可湿性剂或50％菌可湿性粉剂500-800倍液，25％多菌灵或30％稻脚青可湿性粉500-800倍液，25％多菌灵或30％稻脚青可湿性粉剂500倍液，70％托布津或15％三唑酮可湿性粉剂800-1000倍液喷洒，隔1周喷1，共

棉花黄萎病

症状：现蕾期病症状是叶片皱缩，叶色暗绿，厚脆，节间缩短，茎秆弯曲，病株形矮小，有的病株中、下部叶

防治方法：在病田和零星病田，采用12.5％治萎灵液剂200-250液，于初病后和发病高峰

棉花红粉病

症状：整铃壳表生松散的桔色绒状，比红腐病的层厚，病铃不能

防治方法：喷用50％多菌灵、70％托布津、75％百清或65％代森锌等

棉花炭疽病

症 状：棉籽和幼芽害，变褐腐烂；棉苗受害，幼茎基部初褐，渐呈红色凹陷梭形病斑，病重时斑包茎基部或根部，呈黑褐色湿腐状，棉苗

防治方法：在苗期阴雨连绵，棉苗病初发时，及时用40％多菌灵悬剂、65％代森锌可湿性粉剂或50％菌特湿粉剂500-800倍液，25％菌灵或30％稻脚青

症状：病株般不矮缩，多由下部叶片现病状，向上部发展，叶叶缘和叶脉间的叶

发生规律：发病与温度，枯萎病一般土温在20℃左右时开显，上升到25℃-28℃时形成发病高峰，当温上升到33℃以上，病菌受抑，出现暂性隐症，入秋后待土温下降到25℃左右，又出现第二次发

防治方法 在病田和零星病田，采用12.5％治萎灵液剂200-250液，于初发病后和发现高

棉花立枯病

症状：棉籽受害，造料籽和烂芽；幼苗茎基部受害，出现褐。水状病斑，并渐扩围绕嫩茎，病部缢缩变，黑褐色、湿腐状，病苗倒伏枯死。

防治方法：在苗期阴雨连绵，棉苗病初发时，及时用40％多胶悬剂、65％代森锌可湿性粉或50％菌特湿性粉剂500-800倍液，25％多菌灵或30％脚青可湿性粉500-800倍液，25％多菌灵或30％稻脚青可湿性粉剂500倍液，70％托布津或15％三唑酮可湿性粉剂800-1000倍液喷洒，隔1周喷1，共

棉花曲霉病

症 状 在壳裂缝处和虫孔处产生绿色或黄褐色的粉状层，高湿时呈绒毛状

发生规律：在高温多湿条件发生，8、9月份的雨量将成为

防治方法：喷用50％多菌灵、70％托布津、75％百清或65％代森锌等

棉花角斑病

症状：真叶病，初为褐色小点，扩大成油渍状透明病，后变为黑褐色病

发生规律：苗期土壤含水量较，7、8月份的铃雨量较大，尤遭

防治方法：在发初期，喷洒1:1:120-220波尔多液、25％叶枯唑可湿粉剂，或65％代森锌可湿

症状：全铃害，铃壳变黑、僵硬，开裂。铃壳上密生小点。高湿下全铃满布

防治方法：在烂铃原较复杂的棉区，可喷洒50％多菌、70％托布津、75％百清或65％代森锌等湿性粉剂500-1000倍液；为

棉花生长过程中使用的植物生长调节剂

棉花长过程

从棉花种子发到棉花收获，在不同的阶段使用不同的植物长调节剂，在使用适当

首先，在种子时期，为了减少低温等逆境缓萌发或引起烂子，可以采用植物生长剂加快发芽、促进全苗、苗壮苗齐。一般进棉萌发可采用药剂有：赤霉素、威复硝酚钠、中威胺脂、缩节胺等。需注意的，浓度不可过大，否容易出现药害；子可以适当的调低药液浓度，毛子可以调高施植物生长调节剂药液浓度；水浸种可以适当缩短时间；药液与种子质量比不要低于1:1，使浸种结束时种子都在液面下，这样才能证种子

其次，在棉花长期，用于促进生根的植生节剂也有很多，如中威萘乙酸

第三，在棉花育苗移时，为防止形成高脚苗和弱苗，可以在棉出，用一些植生长调剂在苗床叶面喷施，达促进根系发育，增强棉花对干旱、涝害等抗能力，起到控长壮苗的效果。最常见的是使用缩节胺、中威

第四，在棉花控防落，增加铃重上，应用最的长调节剂是中威缩节胺、中威矮素、中威增产灵、中威多效唑

最后，在棉催熟脱叶上，最常用的植长调节剂则是中威乙烯利中威噻苯隆，两者混

促花王3号棉花生长化调过程中的规范应用

促花

促花王3号是一种可代替农作物人工控疯长、促花保果的科研成果新产品，品特征为粉，针对不同用途和效能有种剂----A型和B型（在包装上表明）。 其能特征是：能有效抑制种作物主梢、赘芽、旁心疯长，促进芽分化。多开花，多坐果，防落果，促育，完全代替人工打芽和激素杀梢的传统粗放式做法，是目前唯一能把植物营养生长机转向生殖机能、提高授粉受精质量的物生

新疆是我国一大产棉区，种植面积连片规模庞大，单位面积种植度很高，在生长发育过程中,由于营养生长和生殖生长、个体和群体发育之间矛盾较突出,单靠传统的浇水、追肥、中耕、整等技术措施,动强度，作效低，很难按既定目标来控制其生进程。近年来利用棉花全程化控术将植物生长调节剂应用于常规的棉花栽培术中,有效调节棉花地上部与地部、营养生长与生殖生长的盾,对于改善株型和群体结构和棉田通风条件,提高光合强度,促进殖器官的发育,优化结铃模式,落,增加铃重,达到高产、优质、高效的目，有一定的收效。将促王3号有机地融入到棉花全程化控技术过程中，和其他有效药剂互相配合使，在总投资不增加的况下，能产生大的增益

根据棉花每个生长过程的生理点，整个化控过程可分为“化控”和“被动化控”。 “主动控”是到“株株着药”，加水适当可些，喷施速度可快，喷幅可宽些，喷洒到每株部即可； “被动化控”时要做到“全株着药”，加水适量多些，喷施速度宜慢些，喷幅宜窄些，应喷洒到每株上下及四围各个部位。具体

1、苗期化控：坚持促控结合、苗调控（即弱苗轻控、旺苗）和“早、轻、勤”的原则。苗“动化”调2次，即 2叶1心进行第次化调，缩节胺亩用0.3－0.5g；4叶1进行第二次化调，喷施促花王3号（A型），每隔15—20天喷一次，连喷3次，可发棵稳长、保早现蕾、多现蕾、现大蕾、早开花，促苗发，

2、蕾期化控：根据棉花长势合理调控，617叶1心进行第三次化控，亩缩节胺2－3g。同时要

一次，连喷3次，能有效控制抽疯长，促使棉树生长机能向生能转化，棉桃营养输送导管变，高棉膨活力，提高抗性，保蕾、保铃、桃，加快棉树循环现。对于土壤肥高，棉花长势的棉田，认真做好整枝，搞好“脱裤腿”工作，充提高植株养分的利用率。切实抓好棉田红蜘蛛的防治和灭除。药剂可选用杀螨剂，如三氯螨醇、

3、花蕾期化控：花铃期一般需化控次，第一次滴水前进行一次，缩节胺量3－5g；7月上旬打顶束后行一“动化控”，亩用节胺8－10g顶（喷洒包括棉株两侧尖）。及时打顶，当可见果枝为8－9台左右即可打顶或用促花王3号（B型）涂抹顶尖，保留7－9台果枝。打顶时要求把棉株两侧的群尖一并打掉。对于长势偏旺的棉田，切实做好人工枝工

棉花GhHMGR基因在胚珠生长发育过程中的功能

棉花 GhHMGR 基因在胚珠生长育过程中

马富磊 李德谋 李 志 杨卫娟 周 雪 游 宇 罗

西南大学生物术中心 / 农业部生物技术与作物品改良重点开放实验室 / 重庆市农业生物

摘

要: 采用植基因工程技术, 选用 CaMV35S 组成型启动子驱动棉花 3-羟基-3-甲基-

在花表达, 检 10 DPA(days post anthesis)棉花胚珠内 HMGR (3-hydroxy-3- methylglutaryl coenzyme A reductase)酶及可 溶性、脂质蛋白含量, 同时进行了珠离体培养。结果显, GhHMGR 在棉花光照部位(叶柄和铃壳)表达量相对较高, 非光照部位(根及胚珠)表达量低； 超量表达 GhHMGR 可部分恢复南芥 hmgr 突体性状； 相野生型, 超量表达系 10 DPA 胚珠 HMGR 含量高, 反义株系则降低； 且超量表株系总脂质及蛋白含量升, 可溶糖含量降, 反义株系则出现 反结果；HMGR 竞争性抑制剂洛伐汀处理会导致胚珠发育畸形。以上结果表明, GhHMGR 基因在花胚珠生长发育过 程中扮演重要的角

GhHMGR Gene Function in Ovule Development of Cotton (Gossypium hursutum L.)

MA Fu-Lei, LI De-Mou, LI Zhi, YANG Wei-Juan, ZHOU Xue, YOU Yu, and LUO Xiao-Ying

*

Biotechnology Research Center of Southwest University / Key Laboratory of Biotechnology and Crop Quality Improvement of Ministry of Agriculture / Chongqing Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Chongqing 400716, China

Abstract: The constitutive promoter CaMV35S was selected to drive the expression of GhHMGR gene in cotton by using the plant genetic engineering technology. The HMGR contents of ovule (10 DPA) of transgenic lines were detected, and the contents of total sugar, oil and protein as well. Meanwhile, we also performed ovule culture in vitro. The results showed that the expression level of GhHMGR was higher in part organ under light, such as petiole and boll shell than in root and ovule in dark. The GhHMGR gene could partly recover Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) hmgr mutant characteristics. Compared with wild-type（WT）, the HMGR contents of ovule (10 DPA) in overexpression transgenic lines increased, whereas decreased in suppression expression lines. While the contents of total oil and protein of overexpression transgenic lines increased, and that of total sugar decreased. Meanwhile, the suppression expression lines performed in an opposite trend. The investigation of ovule culture in vitro showed that ovules became deformity after treated with the inhibitor. All of these implied that expression of GhHMGR gene plays a key role in the development of cotton ovule. Keywords: cotton (Gossypium hursutum L.); GhHMGR; ovule; HMGR

棉花重要的经济作物, 其主要产品——维是世界上最重要的天然纤维之一, 我已为世界上最 大的棉花消费国和净口[1]。棉铃是整个棉花植株的主要器官, 铃壳、种子和纤维组成。棉花纤维即 种子表皮毛, 其所纤维素占熟棉纤维干重的 95％以上[2]。棉铃体积的增大在根本上种子表皮细胞

本由国家自科学基金项目(31171596)和

*

通讯作者(Corresponding author): 罗小英, E-mail: luoxy@swu.edu.cn

第一者联系方式：E-mail: stickler911@163.com Received(收稿日期): 2015-04-10; Accepted(接受期): 2015-09-06; Published online(网络出版日

1?

积的加决定。 3-羟-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶(HMGR)是甲戊酸(MVA)径中的第一个限速酶[3]。MVA 途径被 认为是所有三大生命领域(菌、生物、真核物)的最原次级代谢产物合成途径[4], 该途径主要发生 在胞质中。HMGR 是一种水膜蛋白, 实验明其主要定位在内质网上, 含 4 个亚基, 即 N-、跨 膜区、连接区和 C-末端区[5]。具有催化活性的 C-末端区和跨膜区在各植物种中高度保守。HMGR 作为甲 戊酸代谢类戊二烯化合物途的重要调控点, “碳流”的分配调控起重要作用[6]。而戊二烯化 合物通过调控早细胞分裂和后期细胞伸长来决定实最终大小。在快速生长植物组织中, HMGR 活性 总是很高, 而成熟组织中的活性则相对较低[7]。而且, 报道在茄组成型表达甜瓜 HMGR 因可以显 著增大番果实[8]。我们推测 HMGR 可能在棉花胚珠的细胞分裂分化及细胞伸长生长中发挥重要作用。本 文研究棉花胚发育过程中 HMGR 的功能, 为过基因工程段提高棉花产量品质等方提供理论依 据, 具有重要

1

1.1

材料与方法

试验材料 植表达载体 pLGN 及根癌农杆菌株 LBA4404 由本实验室保存,

尔 Leon Kochian 实验室惠。转 GhHMGR 基因棉花及拟南芥所用的达体 pBI121-PGhHMGR::GUS 均由作者构建。 棉花的遗传转化受体材料冀棉 14 (Gossypium hirstutum L.)受赠河北农业学马峙英教授；拟南芥 传转化受体料背景为 Columbia , 购于 Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC)。 1.2 棉花拟南芥遗传

[9]

的方法进行棉的遗传转化；采用浸花法[10]行拟南芥遗

1.3 GhHMGR 基因的表析 采用 EASY Spin 植物 RNA 快速提取试剂盒提棉花材料总 mRNA, 反转录获得 cDNA。以 GhHIS 内标基因, 以获得的 cDNA 为模板进行时定量 PCR, 程序 95℃ 3 min； 95℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40 个； 72 ℃ 5 min 。物序列为 GhHIS-F: 5'-GAAGCCTCATCGATACCGTC-3', GhHIS-R: 5'-CTA CCACTACCATCATGGC-3；GhHMGR-F: 5'-CCTTGGAAACATCCTTGCTAGACC-3', GhHMGR-R: 5'-CTT CCATTGAGGTTGGCACTGTTG-3'。 1.4 10 DPA内HMGR的提取及含量测定 参照Bradford[11]、Ge和Wu[12]的方法提取HMGR及测定含。 1.5 胚珠离体培养 参照Beasley和Ting的方法[13-14]离体培养棉花珠。 1.6 10 DPA胚珠内三类质取及测定分析 参照《现代植物生理学验指南》[15]提取及测可溶性糖。取适量新鲜植物材料(约1.5~3.0 g), 110℃ 杀青处理15 min, 37℃烘干；用球磨机将烘干材料磨成细粉, 过筛(80目)后用滤纸包裹置密闭容器中进行水 平3~4 d, 转品粉末至指形管, 置近红外

2

2.1

结果与分析

GhHMGR 因的表达模分析 GhHMGR及其启

2.1.1

585个氨基酸, 大小为62.7 kD, pI 5.99。 用(DNAMAN 6.0.3.99)软进行序列比对发现GhHMGR蛋白龙眼、 荔枝、 可可、 树、 毛白杨和拟南芥的HMGR蛋白同源性较高(图1), 与龙眼HMGR

2? ?

与枝HMGR相似97%, 一致性77%；与可可HMGR相似性100%, 一致性89%；与椴树HMGR相似性为 100%, 一

图1 棉GhHMGR与其他物种HMGR蛋白的序列比对 Fig. 1 Comparison of cotton GhHMGR and other species HMGR protein DlHMGR: 龙眼; LcHMGR: 荔枝; TcHMGR:

系统进化树分发现, 棉花HMGR与龙眼、荔枝、可、椴树和毛白杨HMGR有较近的亲缘关系, 与拟南芥HMGR亲缘关系

3?

图 2 GhHMGR 蛋白与其他物种 HMGR 蛋白的

根据公布雷蒙德氏棉基因组序, 扩增获得了该基因的启动列 PGhHMGR。 在 PlantCARE 网站分析 现该启动子不仅包含大量转录起始点(TATA-box), 转录增强(CAAT-box), 还含大光反应、激 反应、组织特异表达、胁迫反应和转录结位点等相

表 1 PGhHMGR 存的顺式作用元件 Table 1 cis-acting element of PGhHMGR 功能 Function Light responsive element Light responsive element Part of a light responsive element Part of a light responsive element Part of a light responsive element cis-acting element involved in light responsiveness cis -acting regulatory element involved in light responsiveness cis -acting regulatory element involved in light responsiveness Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness Part of gapA in (gapA-CMA1) involved with light responsiveness Auxin-responsive element cis -acting element involved in ABA and VP1 responsiveness cis -acting element involved in salicylic acid responsiveness cis -acting element involved in the abscisic acid responsiveness Elicitor-responsive element Gibberellin-responsive element cis -acting regulatory element involved in circadian control cis -regulatory element involved in endosperm expression Element involved in differentiation of the palisade mesophyll cells Element involved in the control of leaf morphology development Involved in shoot-specific expression and light responsiveness cis -acting regulatory element essential for the anaerobic induction cis -acting element involved in defense and stress responsiveness cis -acting element involved in heat stress responsiveness Ethylene-responsive element MYB binding site involved in drought-inducibility Box I Sp1 GA-motif GATA-motif TCT-motif ACE G-box G-Box ATCT-motif Box 4 ACA-motif TGA-element CE3 TCA-element ABRE EIRE GARE-motif circadian GCN4_motif HD-Zip 1 HD-Zip 2 as-2-box ARE TC-rich repeats HSE ERE MBS 元件 Motifs

2.1.2

GhHMGR 在棉花中的表

对野生型棉花 GhHMGR 基因的表达分发现其在棉

4?

胚珠等非光部位中表量相对较低, 而叶柄和铃壳等光照部位表达量相对较(图 3)。 在胚珠

?

期, GhHMGR 表达量随花天数的增加而增高, 在 10 DPA 时达到最高(图 4)。 纤维中 GhHMGR 基因表达 量总体随着开花天数增加而增高(图 5)。 转基因植株暗处理后检叶片中 GhHMGR 表达量发(图 6), 处理时间的长 GhHMGR 的表达量急剧下降, 推

图 3 棉不同官组织 GhHMGR 的表达水平 Fig. 3 Relative expression level of GhHMGR in different tissues and organs R: 根; S:茎; L: 叶; Pet: 花瓣; Sta: 雄蕊; Sti:柱头; Car: 果柄; Peti: 叶柄; Sep: 萼片; BS: 铃

图 4 不同时期胚 GhHMGR

图 5 不同时期

5?

图 6 暗处理不

2.1.3

PGhHMGR::GUS 转基因拟南组织化学染

以 pBI121-PGhHMGR::GUS 达载体转化拟

T2代拟南芥纯子组织化学染结果显示(图7)该启动子主在拟南芥莲座叶中央、 花序起始部位及角果基 达, 果柄上部也检测到GUS

图7 PGhHMGR::GUS在拟南芥T2代组织化学染色图。 Fig. 7 Histochemical analysis of tissues in transgenic Arabidopsis expressing PGhHMGR::GUS A: 2周大的幼苗；B, D: 花序；C: 角

2.2

棉遗传转化及基因棉花的得 将 GhHMGR 表载体转入棉花, 筛选获得超量表达与反义抑制

量表量上调较显著的 6 株系, 即 35S-9-1、35S-25-2、35S-25-6、35S-26-1、35S-26-2、35S-8-2；

6? ?

图8 35S-GhHMGR转基因株系表达量分析 Fig. 8 Relative expression of 35S-GhHMGR in the ovule of control and transgenic cotton plants expressing GhHMGR gene WT: 野生

2.3

hmgr 拟芥突变体的复 将筛选到的拟南芥hmgr纯合突变体再次种植, 用GhHMGR菌菌液对其花序进行浸染转

对照Col-0, hmgr合突变体的植株恢复正常, 株高已恢复与Col-0型基本一致, 但长弱, 且莲座叶、花 序幼

图9 南芥hmgr突变体的恢复 Fig. 9 GhHMGR functionally complemented hmgr mutant A: col, Columbia型拟南芥; hmgr(HM), 合突变体; GhHMGR, 恢复后hmgr突变表型后的植株。B: 花序; C: 莲座

2.4

10 DPA胚珠内HMGR含量测定 图 10 表明 WT 胚珠 HMGR

含量别为 2.54、4.75、3.72、2.64 mg g–1；反义制 T0 代株系 9-1#胚珠 HMGR 含量为 1.95 mg g–1。较 WT, 超量表达 T0 代株系 HMGR 含分别增加了 4.28%、94.81%、52.82%、8.34%, 反义抑 T0 代株系 9-1#HMGR 含量降低 19.93%。可知 GhHMGR 基因调决定了胚

7?

图10 转基因株系和野型株系胚珠(10 DPA)HMGR蛋

2.5 胚珠离体培 取转基因棉花开当天的胚珠离培养, 其培养基中别加入 10、20、50、100 和 200 μmol L–1 的洛 伐他汀, 32℃, 黑条件

图11 胚珠体培及表达量分析 Fig. 11 Ovule culture in vitro and relative expression level of GhHMGR WT 株系胚施 0、10、20、50、100 和 200 μmol L–1 不同浓度抑制

结果显示 , 20 μmol L–1 及其以上浓度洛伐他汀条件下胚珠发育畸

8? ?

GhHMGR 基因表量随抑制剂浓度的增呈上升趋势( 11), 推测原因是珠早期发育阶段, 抑制剂 HMGR 的作用底物竞争性结合, 故胚珠通过表达产生更多的 HMGR 来消除

图12 胚珠离培养及表达量分析 Fig. 12 Ovule culture in virto and relative expression level WT 及 GhHMGR 超量表达株系胚珠添加 0、20、50 μmol L–1 抑制剂处理及相对表达

另外现添加抑剂时, 量表达转基因植株 GhHMGR 表达量是 WT 8 倍(图 12), 且长势较 WT 好, 推棉花胚珠通过超量表达 GhHMGR 因来大量类异戊物质, 足胚珠早期发育需求, 从而 使转基因棉花胚珠出现优势表型；添加 20 μmol L–1 和 50 μmol L–1 抑剂时, 超量表达 GhHMGR 的胚 珠及纤维受到不同程度抑制而畸(图 12), GhHMGR 基因的表达水平与上述的结果一致。 2.6 10 DPA胚珠内三类质的含量分析 2 表明,相较 WT, T0 代超量表达株 26-1#、8-2#可溶性总糖浓度分别下了 57.33%、60.99%, T0 代 反义抑制株 5-1#可溶性总糖浓度增加了 48.3%；T0 代超量表达株系 26-1#、8-2#脂含量分升了 19.94%、28.09%, 而 T0 代反抑制株系则降低了 4.52%；T0 代超量表达株系 26-1#、8-2#总蛋白含量分别升 高 24.23%、32.25%, T0 代反义抑制株系降低了 6.31%。由此发现, GhHMGR 促使可溶性糖化为脂质

9?

表 2 转基株系野生型株系胚珠(10 DPA)内三类物质含量 Table 2 Contents of total sugar, oil, protein of ovule (10 DPA) in transgenic and wild-type lines (mg g–1) 株系 Line WT 35S-26-1 35S-8-2 35S-5-1(anti) 可溶性

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3.1

讨论

GhHMGR 源性比对及其达特性分析 序列比对分析示 GhHMGR 与龙眼、荔枝、可可、椴树、

较高源性。 Xia 等[16]现荔枝 LcHMGR 通过调控早期细胞分裂和后期细胞分化对果实最终大小起决定 性的作用 , 快速生长的织中 , HMGR 活性总很高 , 而成熟组织中的活性则相对较。故推测 GhHMGR 也应具有相似的功能。 GhHMGR 启动顺式作用件分析发现序列中存在大量的光反应元件, 且 在棉中的表达分析也发现光照是 GhHMGR 基因挥功能的必要件。 3.2 量表 GhHMGR 可复 hmgr 的部分突变表型 研究发现拟南芥 AtHMGR 突变后会使拟南芥植株矮小 , 出现衰、雄性不育等性状 [17] 。本文用 GhHMGR 超量表达转化拟南芥 hmgr 变体植株, 研现超量表达 GhHMGR 可恢拟南芥 hmgr 突变体 株高, 株长势依旧孱弱、叶片、花序幼小。说明棉花 GhHMGR 与 AtHMGR 功能互补, 具有决定 株高以及育性的功能, 但无法完全恢复突变体的所有性状。 3.3 GhHMGR 基因严格调控胚珠内 HMGR 的表达 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶(HMGR)是 MVA 途径中目前研究较多的一限速酶, 调下游异二 烯类化合物的生物成及其分配流向。 本文选取 CaMV35S 组成型启动子驱动 GhHMGR 基因在棉花植株中 表达分析发现, 相较 WT, 超量表达株系胚珠内的 HMGR 含量升高, 反义抑制株系珠内 HMGR 含 低。推 GhHMGR 基因正调 HMGR 的合成代谢, 但仍需进步的研究来证明。 3.4 HMGR 受抑制剂专性影响 洛伐他可抑制甲羟戊酸途径关酶 HMGR 的活性[18], 胚珠离体培养结果发现,超量表达株胚珠及 纤维发育较 WT 好, 且其胚珠对抑制剂也更敏感, 胚珠在 20 μmol L–1 以上洛伐他处理现畸形, 纤维 育不良。可见 HMGR 棉花胚及纤维发育过程中不或缺。但伐他汀抑制剂如何通过抑制 HMGR 来促使转基因胚珠的优势表的作用机制仍不清楚, 仍进一步的研究。 3.5 GhHMGR 可以促进可溶糖转化为蛋白及脂质 胚珠(10 DPA)三类物质的含量测定结果表明：相 WT, 超量表达株系可溶性总糖含量降低, 总脂质和 蛋白含量升高； 而抑制株系则相反。 结合以上结果推测, GhHMGR 可以促进糖物转化为脂或蛋, 从 而影响胚珠生长发育及种子的最终形成。 与前人关于改变 HMGR 够限制糖或丙酮酸在 MVA 途中 的代谢[19]这一研究果相一致。但 GhHMGR 如何调控其下游代谢产物的产率及物质相间的分配转变 比例还

4

结论

光照是 GhHMGR 转基因表达的必要条件。GhHMGR 启动子主要南芥的花序、果柄基

量表 GhHMGR 可部分恢拟南芥 hmgr 突变体矮小、 育的表型。 GhHMGR 基因正调控决定胚珠 HMGR 含量。HMGR 受抑制剂专一影响, 超量达 GhHMGR 株系胚珠纤维发育较 WT 好, 且其胚对抑制剂 更感。 GhHMGR 可促进胚珠内可溶性总糖类物质转化为白及脂质而

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育。综上可知 , GhHMGR 基因在棉花胚珠的生长育过程中起着重要作用 , 这也为我们结合基程手段 进行作物育种带来

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