9578471884
范文一：绿脓杆菌外毒素A对兔角膜基质细胞的毒性作用_cropped
() [ 文章编号 ] 16712587 ?20070320488203
绿脓杆菌外毒素 A 对兔角膜基质细胞的毒性作用
1 2 1 1 1 郝继龙, 王 菲, 周鸿雁, 赵文霞, 谷树严
()11 吉林大学中日联谊医院眼科 , 吉林 长春 130033 ; 21 黑龙江省哈尔滨市第一医院眼科 , 黑龙江 哈尔滨 150001
目 的 : 探 讨 绿 脓 杆 菌 外 毒 素 A 兔 对 角 膜 基 质 细 胞 的 毒 性 作 用 。方 法 : 含 兔 角 膜 基 质 细 胞 [ 摘 要 ] 5 - 1 - 1 () ) ( 1 ×10m?L 三维胶原凝胶表面添加提纯的不同浓度绿脓杆菌外毒素 A 01 1 、11 0 和 10 mg L? 后 , 放入无血清 M EM 培养液中 37 ?培养 24 h , 采用光学显微镜观察培养的兔角膜基质细胞形态学变化 , 采用酶联免
() 疫吸附法检测损伤的兔角膜基质细胞释放的乳酸脱氢酶 L D H含量 。结果 : 添加不同浓度绿脓杆菌外毒素 A - 1 () 01 1 、11 0 和 10 mg ?L 各组兔角膜基质细胞释放的 L D H , 与不添加绿脓杆菌外毒素 A 组比较 , 差异均有显 著
( ) 性 P < 01="" 01。添加不同浓度绿脓杆菌外毒素="" a="" 各组较不添加绿脓杆菌外毒素="" a="" 组="" ,="" 角膜基质细胞形态发生="" 变化="" ,="" 细胞由长纺锤形变为圆形="" ,="" 细胞伪足减少="" 。结论="" :="" 绿脓杆菌外毒素="" a="" ,="" 破坏角膜基质细胞="" ,="" 对兔角膜基="" 质细胞毒性作用有剂量依赖性="" 。="">
假单胞菌 , 铜绿 ; 角膜基质细胞 ; 外毒素类 ; 乳酸脱氢酶 [ 关键词 ]
1 2 R772[ 中图分类号 ] [ 文献标识码 ] A
Toxic eff ect of exotoxin A of Pse u domon as a e r u gi nos a on keratocytes
1 2 1 1 1HAO J i2lo ng, WA N G Fei, Z HO U Ho ng2yan, Z HAO Wen2xia, GU Shu2ya n (11 Dep art ment of Op ht hal molo gy , China2J apa n U nio n Ho spital , J ilin U niver sit y , Cha ngchun 130033 , China ;
)21 Depa rt ment of Op ht hal molo gy , Fir st Ho spital of Haer bin , Haer bin 150001 , China Abstract : Obje ctive To st udy t he to xic eff ect of exo to xin A of Pse u d om on as ae ru g i nos a o n keratocytes. Metho ds Three2dimensio nal gel s of t yp e I collagen co ntaining ra bbit keratocyte s were incubated in t he p resence of - 1 ( ) diff erent co ncent ratio ns of exo to xin A 01 1 , 11 0 , 10 mg ?L , cultivated fo r 24 h at 37 ?, t he change of keratocytes in mo rp holo gy wa s o bserved under t he light micro scop e , and t he a mo unt of lact ate dehydro gena se () ( ) L D Hwa s mea sured by enzyme linked immuno so r bent a ssay EL ISA . Re sult s The L D H co ntent s in diff erent
- 1 () co ncent ratio ns 01 1 , 11 0 , 10 mg ?L of exo to xin A gro up s were higher t han t hat in t he gro up wit ho ut exo to xin A ( ) P < 01="" 01.="" the="" no="" r="" mal="" keratocyte="" s="" were="" lo="" ng="" at="" ractoid.="" when="" keratocyte="" s="" were="" incubated="" in="" t="" he="" p="" resence="" of="" diff="" erent="" co="" ncent="" ratio="" ns="" of="" exo="" to="" xi="" n="" a="" ,="" t="" hey="" changed="" into="" cycloid="" .="" conclusio="" n="" pse="" u="" d="" om="" on="" as="" exo="" to="" xin="" a="" of="" ae="" r="" u="" g="" i="" nos="" a="" can="" inj="" ur="" y="" keratocyte="" s="" and="" it="" s="" eff="" ect="" i="" s="" in="" a="" do="" se2dep="" endent="" ma="" nner="" .="">
Key words : Pseudo mo na s aer ugi no sa ; keratocyte s ; exo to xins ; lactate dehydro gena se
绿脓杆菌引起角膜溃疡时角膜融解的速度非常 角膜炎或角膜溃疡中的损伤机 制目 前尚 不 十分 清
迅速 , 有些病例角膜穿孔发生在 24 h 之内 。角膜 A 对角膜 楚 。本文作者旨在研究绿脓杆菌外毒素
基质细胞的毒性作用 。 溃疡是绿脓杆菌产生的一些致病因子持续存在的结
果 , 如外毒素 A 、弹性蛋白酶 、脂多糖以及胞外酶 1 材料与方法 S 、磷脂酶 C 、碱性蛋白酶 、碱性磷酸酶等均可以
引起角膜结构的损害 。角膜基质细胞在绿脓杆菌性 11 1 兔角膜基质细胞的分离 、培养 兔角膜基质
205217 2006[ 收稿日期 ] ()吉林省科技厅资助课题 20010524 [ 基金项目 ] () 郝继龙 1964 - , 男 , 吉林省磐石市人 , 主任医师 , 医学博士 , 主要从事角膜病及眼表疾病研究 。 [ 作者简介 ] ( )郝继龙 Tel : 0431284995313 , E2mail : haojlzrl y @ya hoo1 co m1 cn [ 通讯作者 ]
[ 1 ] ( ) 差 x ?s表示 , 添加不同浓度外毒素 A 各组的角 细胞按照 Mi shi ma 等描述的方法进行培养 。实
(验用大耳白兔 吉林大学白求恩医学部动物中心提 膜基质细胞释放的 L D H 量与不添加外毒素 A 组比 ) 较统计学处理采用 Du nnet t 多重对照检验 。 供, 体重 2 , 3 k g , 通过耳缘静脉注射超量苯巴
比妥钠麻醉致死 , 摘除眼球 , 以无菌 PB S 充分洗 2 结 果 净眼球表面血液 , 沿角膜缘内 2 mm 处环形剪开制
成角膜片 , 再以含抗生素的 PB S 反复漂洗 , 使之 21 1 兔角膜基质细胞形态变化 光镜下观察三维 灭菌 。然后将角膜内皮连同后弹力层一并剥去 , 再 胶原凝胶中培养 24 h 的角膜基质细胞为长纺缍形
[ 3 ] ( ) 与中性蛋白酶 美国 Si gma 公司反应 后刮 除 上 或双极细胞形, 有较长的细胞伪足并由细胞两端
( ) ( 皮 , 剩余角 膜 基 质 切 成 碎 块 与 I 型 胶 原 酶 美 国 伸出 , 见图 1A 封二。添加 不 同浓 度 01 1 、11 0
- 1 ) Si gma 公司反应 4 h 以溶解角膜基质胶原 , 分离 和 10 mg L? 绿脓杆菌外毒素 A 三维胶原凝胶培 出角膜基质细胞 。收集细胞悬液 , 加等量体积 5 % 养的角膜基质细胞随外毒素 A 浓度升高 , 细胞形
( 态发生变化 , 细胞由长纺缍形变为圆形 , 细胞伪足 小牛血 清 的 组 织 培 养 基 ti ssue cult ure me di um ,
- 1 ) ( ) TCM 199 培 养 液 混 匀 , 离 心 5 mi n 减少 , 见图 1B 、C 、D 封二。10 mg L? 浓 度
- 1 () 时 , 兔角膜基质细胞部分呈圆形 , 边界不清 , 部分 1 500 r m?i n , 去上清 , 再加上述培养液 , 混
( ) 匀 , 移入培养 瓶 美国 Co st a r 公 司中 培养 , 待 细胞破碎 , 呈断片状 , 表明绿脓杆菌外毒素 A 对 细胞达到融合状态后传代培养 , 传至第 5 代即可用 兔角膜基质细胞具有毒性作用 。由此提示绿脓杆菌
外毒素 A 在角膜炎角膜组织破坏方面具有重要作 于实验 。
11 2 兔角膜基质细胞三维胶原凝胶的调制 参照 用 。
文献 [ 2 ]方法进行 。传到第 5 代的角膜基质细胞达 21 2 EL ISA 法检测兔角膜基 质 细胞 释放 的 L D H
( ) 到融合状态后以胰蛋白酶 美国 Si gma 公司消 通过 EL ISA 方 法 定 量 检 测 L D H 的 结 果 表 明 , 绿
( 化 , 加入 10 %小牛血清的基本 培养 液 mi ni mum 脓杆菌外毒素 A 作用于角膜基质细胞 , 随着外
) e sse ntial medi u m , M EM, 混匀 , 收集细胞悬液 , 毒素 A 浓度增加 , L D H 释放量增加 , 与不添加绿
- 1 离心 1 500 r ?mi n , 弃上清 , 加不含小牛血清的 M 脓杆菌外毒素 A 对照组比较 , 差异均具有显著性
6 - 1 ( ) EM , 混匀 , 计数 , 调成每毫升含 21 2 ×10细胞 的P < 01="" 01,="" 即添加="" 01="" 1="" 、11="" 0="" 和="" 10="" mg="" 绿脓="">
( 细胞悬液 。分别取 I 型胶原溶液 日本新田公司 凝杆 菌 外 毒 素 A 各 组 角 膜 基 质 细 胞 释 放 L D H ) ( ((() ) 胶[ 19014 mL , 取 5 倍 改 良 培 养 液 Dul becco ’s 1 59 ?21 33、2011 17 ?21 66和 4191 88 ?
) )mo difie d Ea gle ’s me di u m , DM EM 缓 冲 21 76w ro blew skl unit s/ well ] , 与 不 添 加 绿 脓 杆4 mL ,
- 1- 1 ( ( ) A 组 [ 1781 92 ?31 13 w ro blew skl 菌 外 毒 素 mmol ?L 液 含 01 05 mmol ?L NaO H 01 26
- 1 ( ( 差 异 均 具 有 显 著 性 P
) ( ) 本新 田 公 司 2 mL , 取 细 胞 悬 液 细 胞 浓 度 为 01 01。
6 - 1 ) 21 2 ×10m?L 2 mL , 依次加入离心管中 : 按 I3 讨 论 型胶原 : 5 倍 DM EM 液 : PB S 缓冲液 : 细胞悬液
的体积比为 7 : 2 : 1 : 1 的比例冰浴中快速充分混 绿脓杆菌外毒素 A 由 613 个氨基酸构成 , 相 匀 , 加入 24 孔培养板 , 每孔 01 5 mL 。将培养板置 对分子质量为 66 000 , 对热不稳定 , 其在使烟酰胺
( ) 37 ?孵育 30 mi n , 使凝胶化 , 于上 述凝 胶表 面 分 腺嘌呤二核者酸 N AD的腺苷 52二磷酸核糖基
( ) ( ( 别加入含 有 提 纯 的 不 同 浓 度 外 毒 素 A 0 、01 1 、 AD P R部分向与蛋白合成有关的延长因子 EF2
- 1 ) ) 11 0 和 10 mg ?L , 美国 Si gma 公司后 , 放入 2转移 时 , 发 挥 触 媒 作 用 , 生 成 的 AD P R2EF22 无血清 M EM 培养液中 , 37 ?培养 24 h 。 复合物成为非活性产物 , 蛋白合成不能进行 , 使哺
( ) 11 3 酶联免疫吸附 EL ISA 法检测兔角膜基质乳动物致死 。外毒素 A 被认为是绿脓杆菌性角膜
L D H 采用 EL ISA 法定量检测兔角 细胞释放的 溃疡重要致病因子 , 其在非毒性浓度 , 抑制淋巴增 膜基质细胞受损后释放的 L D H 含量 , 实验操作按 殖并抑制淋巴细胞和巨噬细胞肿瘤坏死因子 、淋巴
[ 4 ] [ 5 ] γ(毒素及2干扰素的产生。Hallet t 等将提纯的 照试剂盒说明进行 试剂盒由大阪日本商事株式会
) μ社提供。 外毒素 A 15g 添加到受损的活体鼠角膜表面 , 光 11 4 统 计 学 处 理 L D H 的 量 以 均 数 ?标 准 镜 、电镜观察角膜损害结果表明外毒素 A 杀死上
[ J ] . Inve st Op ht hal mol Vi s Sci , 1987 , 28 : 152121526 . 皮和内皮细胞 , 导致角膜基质细胞肿胀 。
[ 2 ] Hao J L , Nagano T , Na ka mura M , et al . Gala r di n i nhi bit s 本研究结果显示 , 绿脓杆菌外毒素 A 对兔角 collagen degradatio n by ra bbit keratocyt e s by i n hi biti ng t he 膜基质细胞的毒性作用表现在细胞形态改变及细胞 activatio n of p ro2mat ri x met allop ro t ei na se s [ J ] . Exp Eye 破坏后胞内物质的释放 , 这种毒性作用表现在随绿 Re s , 1999 , 68 : 5652572 .
脓杆菌外毒素 A 浓度增加 , 兔角膜基质细胞由长 α[ 3 ] 郝继龙 , 谷树严 , 尹正玉 , 等. 肿瘤坏死因子2对兔角膜基
质细胞胶原降 解 代 谢 的 影 响 [ J ] . 白 求 恩 医 科 大 学 学 报 , 纺缍形变为圆形 , 部分细胞破碎 , 呈断片状 ; 随绿 ( ) 2001 , 27 6: 6292630 . 脓杆菌外毒 素 A 浓度 增 加 , 细 胞 内 L D H 释 放 增 St a uga s Re m , Ha r rer P P , Fer rant e A , et al . Inductio n of [ 4 ] 加 。正是由于绿脓杆菌产生外毒素 A 这样一些可 ( ) ( ) Tu mo r necro si s f acto r TN F a nd i nt erleuki n21 IL21 by 以持续存在的致病因子 , 使绿脓杆菌性角膜溃疡可 p seudo mo na s aer ugi no sn and Exo to xi n A i nduced supp re ssio n [ 6 ] of L ymp hop rolif eratio n a nd TN F , l ymp ho to xi n , Ga mma 以持续到应用抗生素有效之后 。Pa st ra na 等学者
i nt erf ero n a nd IL21 p ro dnctio n i n hu ma n leukocyt e s [ J ] . 认为 , 低密度脂蛋白 L R P1B 是绿脓杆菌外毒素 A ( ) Inf ect Immun , 1992 , 60 8: 316223168 . 的主要受体 , 这提示我们今后临床上可能应用绿脓 Hallet t L D , Ber k RS , Iglew ski B H . Micro scopic [ 5 ] 杆菌外毒素 A 受体拮抗剂或是外毒素 A 抗体的辅 cha ract eri natio n of ocula r da mage p ro duced by p seudo mo na s 助性治疗绿脓杆菌性角膜溃疡 。 ( ) aer ugi no sa to xi n A [ J ] . Inf ect Immun , 1981 , 34 3 :
102521035 . [ 参考文献 ] Pa st ra na DV , Ha n so n AJ , Kni sel y J , et al . L R P1B [ 6 ]
f unctio ns a s a recep to r fo r Pseudo mo na s exoto xi n [ J ] . [ 1 ] Mi shi ma H , Ya sumoto K , Ni shida T , et al . Fi bro necti n ( ) Biochi m Biop hys Act a , 2005 , 25 3: 2342239 . en ha nce s t he p hagocytic activit y of cult ured ra bbit keratocyt es
阴道内投砷致死 1 例报告
() 吉林公安高等专科学校 吉林 长春 130012王 闯
1 资料与方法
() 11 1 简要案情 一农民到公安局报案称其姐 35 岁被丈夫害死 。经查 , 死者近日在县医院多次就医 , 被诊为感冒 、肾 炎 、中毒性痢疾 。因病情严重 , 转入省医院治疗 。妇科会诊时发现死者阴道内有一纸包 , 内有白色结晶物 。死者之夫当场
解释是给王某治妇科病的白矾 。法医验尸的同时 , 将提取的白色结晶物送毒物检验 。
11 2 尸检情况 死者发育良好 , 营养中等 , 颜面瘦削呈脱水貌 , 尸斑暗紫色 。双眼球 、睑结合膜水肿 、四肢末梢发绀 。阴 道口处见少量灰白色黏液溢出 。解剖见胃内容空虚 , 大 、小肠充血充气 , 胃大弯中部见 11 0 cm ×11 5cm 出血点 。肝体积增 大 、浊肿 , 被膜见小米粒大小点状出血 , 剖面发黄 。肾体积增大 、浊肿 , 被膜及肾盂处亦见小米粒大小出血点 。两肺呈暗 红色 , 有捻发音 , 切开见泡沫状液体溢出 。大脑两半球体积均增大 、脑沟变浅 、脑回变平 。子宫颈后壁黏膜 见 11 7cm × 01 8cm 出血点 、坏死 , 其周围红肿 、质地硬 。
- 1 11 3 毒物检验 死者胃内容及肝 、肾中均检出砷 。其中肾 、肝和胃含砷量分别为 01 300 、01 290 和 01 005 mg ?kg 。
死因分析 ?尸体未见机械性损伤和机械性窒息征象 , 可排除外力性死亡 ; ?尸体剖验未见脑 、心 、肝 、肾 、肺等重 11 4
要脏器疾病病理性 改 变 , 可 排 除 疾 病 性 死 亡 ; ?尸 检 见 死 者 颜 面 苍 白 、瘦 削 呈 脱 水 貌 , 子 宫 颈 右 后 壁 粘 膜 有 11 7cm × 11 8cm 出血 、坏死 , 肝 、肾肿大并出血 , 心 、肺亦见出血 。说明全身主要脏器出现中毒样改变 。而子宫颈后壁黏膜坏死区 既非外伤 , 也不是妇科疾病所致 , 而是妇 科检查从阴道中发现的砷 所形成 。这充分说 明王某砷中毒的侵入途径 为阴道 ; ?从毒物中检出砷的含量看 , 胃内容含砷量低于肝 、肾近 600 倍 , 足以说明王某砷中毒毒物入侵途径不是消化道所致 。 11 5 结 论 死者系阴道内被放置毒物三氧化二砷致中毒身亡 。
2 讨 论
?注意毒物入侵途径 。当前刑事犯罪向智能化发展 , 杀人手段日趋复杂 、隐蔽 。此罕见的阴道投砷杀人案例 , 提示检 验尸体时要注意身体各部位 , 以防漏检 。 ?注意勘查中毒现场 。案犯在审讯中曾供认 , 利用性交之机将砷放入受害者阴道 , 并将包装纸扔道灶灰堂内 。法医闻讯后 , 立即去现场搜查出 8 cm ×7 cm 、8 cm ×6 cm 黄纸片 2 张 , 纸片检验纸片含毒物三
氧化二砷 。结案中案犯翻供 、喊冤 , 但现场中搜出的含砷纸块这一物证 , 为案犯投毒杀人敲响丧钟 。 ?正确地认识砷中毒的毒理作用 。本例王某砷中毒不是以常见的消化道侵入表现为胃肠炎症状发病 , 而是以一般状态 , 患感冒 、肾炎 、中毒性 痢疾就医 。这正是由于砷的特殊入侵途径导致阴道黏膜吸收中毒而致的罕见案例 。这也提示法医在搜集病史时 , 要注意那 些与临床诊断相悖的症象 , 而从死亡途径上多加思考 。
范文二：【doc】绿脓杆菌外毒素A的细胞毒性和细胞表面受体密度
绿脓杆菌外毒素A的细胞毒性和细胞表面
受体密度 中国药理学毒理学杂志1992年11月;6(4)'' ?卵.脓杆菌外毒素A的细胞毒性和细胞表面受体密度 f2j7.,,
f军事医学科学院微生物流行病研究所.北京100071) 摘要用徽量蛔胞法观察了肝癌蛔抱
SMMC7721.成纤维细胞L929,肺癌蛔胞A549覆 中目地鼠卵巢细胞cHOkl等4棘传代蛔胞对绿脓轩 茸外毒素A蛔胞毒诈用的敏感rl生,结果SMMC一7721 最敏感.L929班之,A549班于前两者.CHOk1置 捷用ELISA法显示各细胞抹表面绿脓杆茸,卜毒素A 受体,且用圈俸分析比较受体密度,结果与蛔胞毒作 用一致.sMMC,7721为重高.显示丁蛔胞毒敏砉 程度与受体量呈正相关.
关键词兰苎竺堕墨圭主垒胞毒诈用
绿脓扦菌感染在临床十分常见,且治疗极为棘 手,已知外毒素A(简称PEA)是绿脓杆菌的主要致 病因子之一,有致死作用和细胞毒作用.其作用方式 是毒素分子首先与靶细胞表面受体结合,经受体舟导 的内吞作用而内化.在胞浆内,PEA使延伸因子 EF2分子ADP一棱糖基化而失去活性,从而抑制蛋 白质的台成?为了解细胞对PEA细胞毒作用的敏 感性与细胞表面PEA受体的关系,奉文观察了4株 传代细胞对PEA细胞毒作用的敏感性,比鞍了这几 椿细胞表面PEA受体密度的差异
材料和方法
抗PEA血清舶制备家兔经20mg卡彳r苗足 掌致敏后10d,用PEA(ListBiological Laboratories,Inc.,USA)13g与福氏完垒佐剂混 匀后局部淋巴结和皮下多点免疫,第二,第--~d'用等 量毒素与福氏不完垒佐剂混匀后皮下多点免疫.两针 闻间隔2wk,末针后5d试血取血清
PEA的制备根据Liu的方法产毒,经醋
酸锌和硫酸铵盐析得精制毒素再经抗PEA亲和层析 柱层析,所得毒素静脉注射小鼠LDso为0.128/tg? kg,.免疫电泳呈单条电诛沅淀弧?
传代细胞株小鼠成纤推细胞L929.本所二室 赠^肝癌细胞SMMC一7721.本院二所赠.人肺癌细 胞A549及中国地鼠卵巢细胞CHOk1.本院八所赠. 细胞固定液为20%甲醒.50%丙酮,30%木图像分 卜06-26收蒜1992—02-09接受
析仪:Quantimet970,英国剑桥产
细胞毒作用采用微量细胞法.根据lglewsl~i 的方法稍加改进?备传代细胞株传3代后.挑生长 良好者用0.25%胰蛋白酶消化,制成细胞悬液,调整 浓度至4×10?ml,移至无菌细胞板,每孔50/*1. 每孔再加八用细胞培养液稀释成不同浓度的PEA50 .混匀后用半透膜封边,置37/7,5%CO,条件下培 养4d.每24h镜下观察细胞生长情况一次.以37?作 用1h的PEA和抗PEA血清混合液为对照孔,另以 细胞培养液为空白对照.
细胞片的制作将上述各株细胞悬液调整浓度至 Io6个?m,在lO孔载玻片上涂片.每孔20乩 37?迅速干燥后经细胞固定液固定5nfin.置4?备用 细胞片的染色根据PEA与靶细胞表面特异
性PEA受体结合的特点,用ELlSA方珐显示细胞表 面PEA受体.取各株细胞的细胞片先与l0PEA室 温下作用30rain,001too!?L.'PBST(碡鲮盐缓冲 液,含0.04%Tween20,pH72)洗3次后,与抗 PEA血清室温下作用1h后用PBST洗3次,再与羊 抗兔lgG—HRP室温下作用1h.PBST洗3次. TMB显色3rain,流木冲洗终止反应,以与等量抗 PEA血清混合.37?保温1h的倍量PEA作阴性对 照细胞片干爆后光镜观察或图像分析
结果
PEA的细胞毒作用对照孔细胞在4d观察期 间生长良好,束见细胞死亡.试验组中SMMc7721 和L929细胞毒作用出现较早,24h已有部分细胞死 亡,而A549和CHOkl仅见个别细胞死亡表1显示 72h时各椿细胞闻的反应,在同一浓度PEA的作用 F告细胞问的反应程度有区别.如05ng?ml时, SMMC7721,L929和A549均有不同程度的细胞死 亡,而CHOkl基本无反应4批结果显示.各细胞株 对PEA的反应不同.其最低敏感剂量是: SMMC7721为0.】,L929为05.A549为0.5. CHOkl为10I1g?mr'
细胞片的显徽镜观察在显微镜下4株细胞着 色深浅各异,对照片基本不着色,试验片以 SMMC一7721着色最澡,呈蓝色}L929次之.呈蓝 绿色lA549和CHOkl呈淡绿色SMMC772l,
?290?ch_meseJoHrnatofPharmacologyandToxicology1992Nov;H4,
Tab1.Sensitivityof4celllinestocytotoxicityel"PEA
Cettline—Cont—
rol0OO40020152510.0.
PEA:PseudomonasaeruginosaexotoxJnATheceilswere
incubatedat37?for72h,5%COafterPEAwas added+?:over80%ceilsdead+:ovel-50%cells dead+:oellsincfea3e:ceilsgrowwel1 L929,A549着色依次递减,A549和CHOkl区别不
明显.表明PEA和各细胞株表面结合量有区别.如果
PEA是先与细胞表面受体特异性结合.厨此j击所显示
的染色裸浅可以代表细胞表面PEA受体的多少
像分析 细胞片图像分析用Quantimet970图
仪先在对照片上计数1O个细胞,计算出平均灰度作
本底,再在试验片上计数100个以上细胞,测出灰
度,减去奉底,并测出细胞面积从表2可见,就平均
灰度来看,sMMC一7721和L929,A549.cHOkl 之间,L929和A549,CHOkl之间有明显差异,
A549和CHOkl之间没有明显差异.就平均面积来
看,A549和CHOkl之间有显着差异所以总的说
来,4株细胞之间均有差异.即细胞表面受体量为
SMMC-7721>L929>A549).CHOk1. Tab2.Photoanalysisofstainedreceptorof4celllines
?sforoverl00ce1]s',<005.…,<000I,tom—
paredwithSMMC一772l;P<0.00],compa坤dwith
L929;#P(0.001.comparedwithA549. 讨论
Middlebrook报道PEA对多种哺乳动物细胞有细
胞毒作用,以L929和3T3细胞最敏感'根据
Pavlovskis培小鼠静脉洼射PEA,小鼠出现肝坏
死"}胡福泉发现PEA在小鼠肝畦分布最多,肾,
鞯攻之本文选用肝癌传代细胞SMMC7721观
察PEA的细胞毒作用,井与其它细胞进行比较,结
果表明SMMC7721最敏感,最低敏感浓度0lng?
ml,.比L929敏感闰此可考虑用SMMC7721替代文
献介绍的L929作为研究PEA细胞毒作用机理的工具
细胞,不仅反应敏感性高,而且更符合PEA致病作
用的临床实际
Maahart用同位寨标记PEA,证实L929表面有
PEA受体存在?,本文根据配基受体,抗原抗体特
异性结合的特点,用酶标抗体显示PEA.在4株传代
细胞表面均有PEA存在,与Manhart的结果一致
推测选4株细胞表面有PEA受体存在.图像分析结果
SMMC,772I平均反度最高,L929,A549,CHOkl
则依次递减,表示4株细胞间表面PEA受体量有差
异,以SMMC一7721的PEA受体多.结合PEA对
SMMC一7721毒性最强分析,可以认为捆胞表面受体
量与细胞对PEA的敏感性之间存在相关性,细狍表
面受件多,对PEA的敏感性高,反之,敏感性低选
从另一角度说明细胞表面PEA受体与PEA的细胞毒
作用强弱的相关性,
参考文献
1NJcasTIExotoxfosofPseudomonasaeruginosa.In: SokatchJR.Nicho[asornstonL.edsTheBacteria NewYork:AmericanPresslnc,l986l95—206
2LiuPV.YoshiiS.HsiehH.ExotoxinsofPseudomonas aeruginosa?Concentration.pufJticatJonand characterizationofexotoxinAJInfectDisl973,128 (4):5l4-519
3IglewskiBH,SadoffJCToxininhibitorsofproteinsyn thesis:production,purificalion,andassayof Pseudomonasaerugi,-rosatoxinAIn:MoldaveK
GrossmanL.eds.Methodinen~ymology.V0l?New
York:Acad唧icPress.I979780—793
4MJddtebrookJL.DorlandRBResponseofcultured mammalianceltstotheexotoxinsofPseudomonas acrugJnosaandCorynebacteriumdiphtheriae: differentialcytotoxicityCan,Microfiiollq7723(2): 183189
5PavlovskisOR,CallabanLT.PollackMPseudomonas aerugJnosaexotoxJnIn:Sch]essingerDed MicrobiologyWashington:AmericanSocietyfor Microbiology.I975252—262
6胡福泉,周善章绿微杆菌外毒素A靶细胞的实验研究
第三军医大学1987.9(1):14
7ManhartMD,MorrisRE,BonventrePFLepplaSSa, elingerCBEvidenseforPscudomonasexotoxJnA reapersonplasmamembraneoftoxin-sensitiveLM fibroblastslr#rectlmmun1984.4S(3):5一种3
中国药理学与毒理学杂志1992年11月;6(4)?291?
Cytotoxicityandcellularsurfacereceptordensity ofPseudomonasaeruginosaexotoxinA
YANGLi—Bang,ZHUANGHan—Lan
(InstituteofMicrobiologyandEpidemiology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beiji
ng】00071)
AB盯RACTThecytotoxicactivitiesof
Pseudomonasaerugino~,aCXOtOxinA(PEA)wercdeter- mined1n4strainsofculturedcelllines,i.e.human hepatomacelISMMC-7721.mousefibroblastL929, human1ungcarcinomaA549andCHOkI.andthe CytotoxJcconcentrationofPEAtothecellIineswere
01,0.5,0.5,and10ng?mrl,respectivelyThe seccptorsofPEAonthesecellswemdemonstratedbv ELISAandmeasuredbypictureanalyseLTheresults showthatthereceptorden~tyofSMMC-7721isthe highest.Thediffefencesinthedensityofreceptors amongthefourdifferentcelllinesappeartoaccount f.rthediffefencesintheircytotoxicsensitivitiesThe resultssuggestthattheSMMC一7721couldbeauseful
celllineinthestudyofthepathogenesisof PseudomonasaeruginosaexotoxinA.
1【EYWORDS
receptorexotoxinA
Pseudomonasaeruginosa
eytotoxicity
2ndInternationalSymposiumon
IonChannelsandCalciumAntagonists(ISICCA-93) November9-13,1993Guangzhou,China
ISICCA一93containsthefollowingscientificthemes:?
physiologicalandpharmacologicalpropertiesofionchan. ncls,?intracellularcalciumreceOtursandionchannels.?
mechmfismandactionofdrugsinteractingwithion channels,?membranetransductionandcalciumsignallingand?
ionicdysfunctionindiseases
Pleasecontact:DrCHENYi,YueDepartmentofPharmacology. GnangdongMedicalandPharmaceuticalCollege Guangzhou510224,P.R.China
第二届国际离子通道及钙拮抗剂会议(ISICCA一93)
第二届国际离子通道硬钙拈抗荆(【sIccA)研讨会籍于1993年I1月9日至13日
在广州举行会谈期间将舟
五个专题进行广泛的学术交流.专题为:?细胞膜离子通道及其离子麓I?细胞内钙相关的通道及钙受体;?作用
于离子通道的药物及其作用机理}?细胞膜腠信号及转导I@离子通道理论与疾病.
联系人:广东医药学院药理教研室陈一岳,广州510224
范文三：绿脓杆菌外毒素A对兔角膜基质细胞的毒性作用
绿脓杆菌外毒素A对兔角膜基质细胞的毒
性作用
488
第33卷第3期
2007年5月
吉林大学(医学版)
JournalofJilinUniversity(MedicineEdition)
Vo1.33No.3
Mav2007
[文章编号]1671—587X(2007)03—0488—03
绿脓杆菌外毒素A对兔角膜基质细胞的毒性作用
郝继龙,王菲,
(1.吉林大学中日联谊医院眼科,吉林长春130033;
周鸿雁,赵文霞,谷树严
2.黑龙江省哈尔滨市第一医院眼科,黑龙江哈尔滨150001) [摘要]目的:探讨绿脓杆菌外毒素A兔对角膜基质细胞的毒性作用.方法:含兔角膜基质细胞
(I×10?mL)三维胶原凝胶表面添加提纯的不同浓度绿脓杆菌外毒素A(O.1,1.0和10mg?L)后,放
人无血清MEM培养液中37?培养24h,采用光学显微镜观察培养的兔角膜基质细胞形态学变化,采用酶联免
疫吸附法检测损伤的兔角膜基质细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)含量.结果:添加不同浓度绿脓杆菌外毒素A
(O.1,1.0和10mg?L)各组兔角膜基质细胞释放的LDH,与不添加绿脓杆菌外毒素A组比较,差异均有显
着性(P<O.01).添加不同浓度绿脓杆菌外毒素A各组较不添加绿脓杆菌外毒素A组,角膜基质细胞形态发生
变化,细胞由长纺锤形变为圆形,细胞伪足减少.结论:绿脓杆菌外毒素A,破坏角膜
基质细胞,对兔角膜基
质细胞毒性作用有剂量依赖性.
[关键词]假单胞菌,铜绿;角膜基质细胞;外毒素类;乳酸脱氢酶
[中图分类号-IR772.2[文献标识码]A
ToxiceffectofexotoxinAofPseudomonasaeruginosaonkeratocytes
HAOji—long,WANGFei,ZHOUHong—yan,ZHAOWen-xia,GUShu-yan
(1.DepartmentofOphthalmology,China-JapanUnionHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China;
2.DepartmentofOphthalmology,FirstHospitalofHaerbin,Haerbin150001,China) Abstract:ObjectiveTostudythetoxiceffectofexotoxinAofPseudomonasaeruginosaonkeratocytes.
MethodsThree-dimensionalgelsoftypeIcollagencontainingrabbitkeratocyteswereincubatedinthepresenceof
differentconcentrationsofexotoxinA(0.1,1.0,10mg?L
一),cultivatedfor24hat37?,thechangeof
keratocytesinmorphologywasobservedunderthelightmicroscope,andtheamountoflactatedehydrogenase
(LDH)wasmeasuredbyenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA).ResultsTheLDHcontentsindifferent
concentrations(O.1,1.0,10mg?L)ofexotoxinAgroupswerehigherthanthatinthegroupwithoutexotoxin
A(P<0.01).Thenormalkeratocyteswerelongatractoid.Whenkeratocyteswereincubatedinthepresenceof
differentconcentrationsofexotoxinA,theychangedintocycloid.ConclusionExotoxinAofPseudomonas
aerugDs口caninjurykeratocytesanditseffectisinados~dependentmanner. Keywords:Pseudomonasaeruginosa;keratocytes;exotoxins;lactatedehydrogenase 绿脓杆菌引起角膜溃疡时角膜融解的速度非常
迅速,有些病例角膜穿孔发生在24h之内.角膜 溃疡是绿脓杆菌产生的一些致病因子持续存在的结 果,如外毒素A,弹性蛋白酶,脂多糖以及胞外酶 s,磷脂酶c,碱性蛋白酶,碱性磷酸酶等均可以 引起角膜结构的损害.角膜基质细胞在绿脓杆菌性 [收稿日期]
[基金项目]
[作者简介]
[通讯作者]
角膜炎或角膜溃疡中的损伤机制目前尚不十分清 楚.本文作者旨在研究绿脓杆菌外毒素A对角膜 基质细胞的毒性作用.
1材料与方法
1.1兔角膜基质细胞的分离,培养兔角膜基质 2006,05—17
吉林省科技厅资助课题(20010524) 郝继龙(1964一),男,吉林省磐石市人,主任医师,医学博士,主要从事角膜病及眼表
疾病研究.
郝继龙(Tel:0431—84995313,E-mail:haojlzrly@yahoo.com.cn)
郝继龙,等.绿脓杆菌外毒素A对兔角膜基质细胞的毒性作用489
细胞按照Mishima等l_1描述的方法进行培养.实 验用大耳白兔(吉林大学白求恩医学部动物中心提 供),体重2,3kg,通过耳缘静脉注射超量苯巴 比妥钠麻醉致死,摘除眼球,以无菌PBS充分洗 净眼球表面血液,沿角膜缘内2mm处环形剪开制 成角膜片,再以含抗生素的PBS反复漂洗,使之 灭菌.然后将角膜内皮连同后弹力层一并剥去,再 与中性蛋白酶(美国Sigma公司)反应后刮除上
皮,剩余角膜基质切成碎块与I型胶原酶(美国 Sigma公司)反应4h以溶解角膜基质胶原,分离 出角膜基质细胞.收集细胞悬液,加等量体积5 小牛血清的组织培养基(tissueculturemedium,
TCM)199培养液混匀,离心5min
(1500r?min-1),去上清,再加上述培养液,混 匀,移入培养瓶(美国Costar公司)中培养,待 细胞达到融合状态后传代培养,传至第5代即可用 于实验.
1.2兔角膜基质细胞三维胶原凝胶的调制参照 文献E2]方法进行.传到第5代的角膜基质细胞达 到融合状态后以胰蛋白酶(美国Sigma公司)消 化,加入10小牛血清的基本培养液(minimum essentialmedium,MEM),混匀,收集细胞悬液, 离心1500r?min_.,弃上清,加不含小牛血清的 MEM,混匀,计数,调成每毫升含2.2×10细胞 的细胞悬液.分别取I型胶原溶液(日本新田公司 凝胶)14mL,取5倍改良培养液(Dulbecco'S modifiedEagle'Smedium,DMEM)4mL,缓冲 液(含0.05mmol?L_.NaOH0.26mmol?L
NaHCO3和0.2mmol?L_.HEPES,pH7.3(日 本新田公司)2mL,取细胞悬液(细胞浓度为 2.2×10?mL)2mL,依次加入离心管中:按I 型胶原:5倍DMEM液:PBS缓冲液:细胞悬液 的体积比为7:2:1:1的比例冰浴中快速充分混 匀,加入24孔培养板,每孔0.5mL.将培养板置 37?孵育30min,使凝胶化,于上述凝胶表面分 别加入含有提纯的不同浓度外毒素A(0,0.1, 1.0和10mg?L_.,美国Sigma公司)后,放入
无血清MEM培养液中,37?培养24h. 1.3酶联免疫吸附(ELISA)法检测兔角膜基质 细胞释放的LDH采用ELISA法定量检测兔角 膜基质细胞受损后释放的LDH含量,实验操作按 照试剂盒说明进行(试剂盒由大阪日本商事株式会 社提供).
1.4统计学处理LDH的量以均数?标准 差(z?s)表示,添加不同浓度外毒素A各组的角 膜基质细胞释放的LDH量与不添加外毒素A组比 较统计学处理采用Dunnett多重对照检验. 2结果
2.1兔角膜基质细胞形态变化光镜下观察三维 胶原凝胶中培养24h的角膜基质细胞为长纺缍形 或双极细胞形],有较长的细胞伪足并由细胞两端 伸出,见图1A(封二).添加不同浓度0.1,1.0 和10mg?L绿脓杆菌外毒素A三维胶原凝胶培 养的角膜基质细胞随外毒素A浓度升高,细胞形 态发生变化,细胞由长纺缍形变为圆形,细胞伪足 减少,见图1B,C,D(封二).10mg?L浓度
时,兔角膜基质细胞部分呈圆形,边界不清,部分 细胞破碎,呈断片状,表明绿脓杆菌外毒素A对 兔角膜基质细胞具有毒性作用.由此提示绿脓杆菌 外毒素A在角膜炎角膜组织破坏方面具有重要作 用.
2.2ELISA法检测兔角膜基质细胞释放的LDH 通过ELISA方法定量检测LDH的结果表明, 绿脓杆菌外毒素A作用于角膜基质细胞,随着外 毒素A浓度增加,LDH释放量增加,与不添加绿 脓杆菌外毒素A对照组比较,差异均具有显着性
(P<0.01),即添加0.1,1.0和10mg?L绿脓 杆菌外毒素A各组角膜基质细胞释放LDH [(190.59?2.33),(201.17?2.66)和(419.88? 2.76)wroblewsklunits/wel1],与不添加绿脓杆 菌外毒素A组[(178.92?3.13)wroblewskl units/wel1]比较,差异均具有显着性(P< 0.01)
3讨论
绿脓杆菌外毒素A由613个氨基酸构成,相 对分子质量为66000,对热不稳定,其在使烟酰胺 腺嘌呤二核者酸(NAD)的腺苷5一二磷酸核糖基 (ADPR)部分向与蛋白合成有关的延长因子(El:e- 2)转移时,发挥触媒作用,生成的ADPR-EF一2 复合物成为非活性产物,蛋白合成不能进行,使哺 乳动物致死.外毒素A被认为是绿脓杆菌性角膜 溃疡重要致病因子,其在非毒性浓度,抑制淋巴增 殖并抑制淋巴细胞和巨噬细胞肿瘤坏死因子,淋巴 毒素及7一干扰素的产生l_4].Hallett等l_5将提纯的 外毒素A15Fg添加到受损的活体鼠角膜表面,光 镜,电镜观察角膜损害结果表明外毒素A杀死上
49O吉林大学(医学版)第33卷第3期2007年5月 皮和内皮细胞,导致角膜基质细胞肿胀. 本研究结果显示,绿脓杆菌外毒素A对兔角 膜基质细胞的毒性作用表现在细胞形态改变及细胞 破坏后胞内物质的释放,这种毒性作用表现在随绿 脓杆菌外毒素A浓度增加,兔角膜基质细胞由长 纺缍形变为圆形,部分细胞破碎,呈断片状;随绿 脓杆菌外毒素A浓度增加,细胞内LDH释放增
加.正是由于绿脓杆菌产生外毒素A这样一些可
以持续存在的致病因子,使绿脓杆菌性角膜溃疡可
以持续到应用抗生素有效之后.Pastrana等[6学者
认为,低密度脂蛋白LRPIB是绿脓杆菌外毒素A
的主要受体,这提示我们今后临床上可能应用绿脓
杆菌外毒素A受体拮抗剂或是外毒素A抗体的辅
助性治疗绿脓杆菌性角膜溃疡.
[参考文献]
EliMishimaH,YasumotoK,NishidaT,eta1.Fibronectin enhancesthephagocyticactivityofculturedrabbitkeratocytes EJ].InvestOphthalmolVisSci,1987,28:1521—1526.
E2]HaoJL,NaganoT,NakamuraM,eta1.Galardininhibits collagendegradationbyrabbitkeratocytesbyinhibitingthe activationofpro-matrixmeta11oproteinases[J].ExpEye Res,1999,68:565—572.
E3]郝继龙,谷树严,尹正玉,等.肿瘤坏死因子一a对兔角膜基
质细胞胶原降解代谢的影响[J].白求恩医科大学,
2001,27(6):629-630.
[4]StaugasRem,HarrerPP,FerranteA,eta1.Inductionof Tumornecrosisfactor(TNF)andinterleukin一1(IL一1)by
pseudomonasaeruginosnandExotoxinAinducedsuppression ofLymphoproliferationandTNF,lymphotoxin,Gamma interferonandIL-1prodnctioninhumanleukocytes[J]. InfectImmun,1992,60(8):3162-3168.
[5]HallettLD,BerkRS,IglewskiBH.Microscopic characterinationofoculardamageproducedbypseudomonas aeruginosatoxinA[J].InfectImmun,1981,34(3): 1025—1035.
[6]PastranaDV,HansonAJ,KniselyJ,eta1.LRP1B functionsasareceptorforPseudomonasexotoxin[J].
BiochimBiophysActa,2005,25(3):234—239.
阴道内投砷致死1例报告
吉林公安高等专科学校(吉林长春130012)王闯
1资料与方法
1.1简要案情一农民到公安局报案称其姐(35岁)被丈夫害死.经查,死者近日在县医院多次就医,被诊为感冒,肾
炎,中毒性痢疾.因病情严重,转入省医院治疗.妇科会诊时发现死者阴道内有一纸包,内有白色结晶物.死者之夫当场
解释是给王某治妇科病的白矾.法医验尸的同时,将提取的白色结晶物送毒物检验.
1.2尸检情况死者发育良好,营养中等,颜面瘦削呈脱水貌,尸斑暗紫色.双眼球,睑结合膜水肿,四肢末梢发绀.阴
道口处见少量灰白色黏液溢出.解剖见胃内容空虚,大,小肠充血充气,胃大弯中部见1.0cm×1.5cm出血点.肝体积增
大,浊肿,被膜见小米粒大小点状出血,剖面发黄.肾体积增大,浊肿,被膜及肾盂处亦见小米粒大小出血点.两肺呈暗
红色,有捻发音,切开见泡沫状液体溢出.大脑两半球体积均增大,脑沟变浅,脑回变平.子宫颈后壁黏膜见1.7cm×
0.8cm出血点,坏死,其周围红肿,质地硬.
1.3毒物检验死者胃内容及肝,肾中均检出砷.其中肾,肝和胃含砷量分别为0.300,0.290和0.005mg?kg.
1.4死因分析?尸体未见机械性损伤和机械性窒息征象,可排除外力性死亡;?尸体剖验未见脑,心,肝,肾,肺等重
要脏器疾病病理性改变,可排除疾病性死亡;?尸检见死者颜面苍白,瘦削呈脱水貌,子宫颈右后壁粘膜有1.7cm×
1.8cm出血,坏死,肝,肾肿大并出血,心,肺亦见出血.说明全身主要脏器出现中毒样改变.而子宫颈后壁黏膜坏死区
既非外伤,也不是妇科疾病所致,而是妇科检查从阴道中发现的砷所形成.这充分说明王某砷中毒的侵入途径为阴道;
?从毒物中检出砷的含量看,胃内容含砷量低于肝,肾近600倍,足以说明王某砷中毒毒物入侵途径不是消化道所致.
1.5结论死者系阴道内被放置毒物三氧化二砷致中毒身亡.
2讨论
?注意毒物入侵途径.当前刑事犯罪向智能化发展,杀人手段日趋复杂,隐蔽.此罕见的阴道投砷杀人案例,提示检
验尸体时要注意身体各部位,以防漏检.?注意勘查中毒现场.案犯在审讯中曾供认,利用性交之机将砷放人受害者阴道,
并将包装纸扔道灶灰堂内.法医闻讯后,立即去现场搜查出8cmX7cm,8cmX6cm黄纸片2张,纸片检验纸片含毒物三
氧化二砷.结案中案犯翻供,喊冤,但现场中搜出的含砷纸块这一物证,为案犯投毒杀人敲响丧钟.?正确地认识砷中毒
的毒理作用.本例王某砷中毒不是以常见的消化道侵入表现为胃肠炎症状发病,而是以一般状态,患感冒,肾炎,中毒性
痢疾就医.这正是由于砷的特殊入侵途径导致阴道黏膜吸收中毒而致的罕见案例.这也提示法医在搜集病史时,要注意那
些与临床诊断相悖的症象,而从死亡途径上多加思考.
范文四：重组人白细胞介素2_绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性
重组人白细胞介素 !" 绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性胡志明，林来兴妹，周明乾，陈泽洪，王小宁(第一军医大学分子免疫研究所，广东 广州 #$%#&)#
-./0摘要:目的 探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素 绿脓杆菌外毒素()融合蛋白进行纯化与复性的 !’ ()!’*+,,
效果。方法 采用该所发明的新方法提纯包涵体，包涵体复性后，样品经 离子交换层析，获得融合蛋1+2+’3456789:4<>
白纯品。结果此包涵体分离纯化技术简获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到 =#，复性回收率为 ?%。结论 >>
便、实用，可为中试研究和规模化生产提供基础。
关键词:白细胞介素 ;绿脓杆菌外毒素;融合蛋白;纯化;复性 !
中图分类号:@A=!B$$ 文献标识码:2 文章编号:$%%%’!#?(!%%?)!%A’%!%,’%!
#$%$&($ + #(#($ % #&$( $(#01$234+4 5(5$ !"’)*’*,*’"’)*),).*’*/"’**,,"*’’,"))*’,))*---
0;<"6782’9= %"4$)* 3#)(,$* !::
CD E6F’GFHJ )(K)2(I LFHI’G4JF ECMDNFHI’OF7 J HPC+K E4’69HJI Q2K. LF79’HFHI
(H:RFR0R4N9/4T0/78 9S (GG0H9/9I UJ
>.4(#’&(? @.A,&($B, Y9 4W7/07R4 R64 4SS4TR7 H9W4/ 9S 755897T6 S98 508FSFT7RF9H 7HV 84H7R087RF9H 9S 84T9GZFH7HR 60G7H -./0FHR48/40[FH’!’5:40V9G9H7: 4]\9R9\FH ^ S0:F9H589R4F B CH(+4 2 H9W4/ 508FSFT7RF9H G4R69V 4:R7Z/F:64VFH 908 ()!’*+,,,/)-./0/7Z987R98U_7: 7V95R4VS98 R64 508FSFT7RF9HFHT/0:F9H 9S R64 Z9VJ 7HV U 7SR48 84H7R087RF9J 84T9GZFH7HRH60G7H ()!’*+,,
S0:F9H 589R4FH_7: 508FSF4V 1+2+’3456789:4 ZU < f9h’4\t67hi4t689g7r9i8756="" b="" du40(4="" y64508fru="" 9s="" r64="" s0:f9h="" 589r4fh="" ,"-./0="" r67r="" 84r7fh="" fr:zf9/9ift7/7="" trfwfru="" _7:="" 7:="" 6fi67:="#J" 7hv="" 7="" 84t9w48u="" 87r4="" 9w48%="" 9s="" r64="" 84s9/v4v="" s0:f9h="" 589r4fh="">>()!’*+,,
_7: 7T6F4W4B VE)*&0"4$)* Y64 508FSFT7RF9H7HV 84S9/VFHI G4R69V S98 FHT/0:F9H FHZ9VU R6F: 7V95R4V :R0VU :FG5/4 F: 7HV
587TRFT7J _6FT6/ /7U:R64 S90HV7RF9H7 /78I4’:T7/4 S98 589V0TRF9H 9S R64 S0:F9H B 589R4FH
F,GH)#+4? FHR48/40[FH’‘ 5:40V9G9H7:!4\ 5R9\F‘ HS0:F9H589R4FH ‘ 508FSFT7RF9‘ 84H7R087RF9HH
Y8U5R9H、a47:R4 +\R87TR (M \S98V);尿素 (*89G4I7)‘ 当前，疾病的导向治疗已成为生物医学研究的热
点，重组免疫毒素的利用不失为一条切实可行的途径。 Y8F: ( 上海伯奥生物科技公司);1+2+’3456789:4 < 0-./重组人白细胞介素="" 绿脓杆菌外毒素()="" !’="" ()!’*+,,(*678g7tf);7其余试剂为国产分析纯。="" 融合蛋白是通过="" ()’!="" 基因与改构的绿脓杆菌外毒素="" &b!="" 方法="" -./0="" 基因在体外重组表达的一种嵌合蛋白，能通过="" ()’!="" &b!b&="" ()!’*+,,在大肠杆菌中诱导表达="" 从="" )b="" 琼="">
脂平板上挑取单菌落接种于 - G/ )b 试管中，A% !培 识别 ()’!@ 靶细胞并利用 *:40V9G9H7:的细胞毒 性
养过夜，以 &"#%在 )bcN= 培养基中放大，A% 培养 !作用选择性地杀灭这类细胞，可用于移植物排斥反应
至对数生长期，升温至 诱导培养 6，离心收集 -! - !以及某些淋巴瘤 Y 淋巴细胞白血病、自身免疫性疾 ,,&-./0 菌体，蛋白电泳鉴定表达量。 病的治疗。本所成功构建了 融合基因 ()!’*+,,
&BB 包 涵 体 制 备 取 # 菌 体 溶 于 #% G/ 含 !# !!I 并在大肠杆菌中高效表达，其表达产物以包涵体的形
GG9/c) Y8F:’CP/ ( 5Cd?B%)、 GG9/c) +1Y2 培养液 !式存在。由于包涵体无活性且难溶解，因此其纯化复 ,,!中，加溶菌酶 !# GI，搅拌 &% GFH 后， 置于 - !冰箱过 性一直是生物工程制药中的难点。我们应用本所发
-./0 夜。冰浴中超声 A% #&% 次，每次间隔 ,% 。裂解液于 ::明的包涵体纯化工艺，对 ()!’*+,,融合蛋白的纯
，&% %%% 8cGFH 离心 &% GF H，收集沉淀。将沉淀物 - !化与复性进行了研究。
经 Y8F:缓冲液清冼后， 加 #%G/ - G9/c) 尿素在室温
下 作 用 A%GF H， 充 分 搅 拌 后 ，&% %%% 8cGFH 离 心 &%
GFH，收集沉淀。再用 #%G/ %B#>Y8FR9H\’&%% (含 &% & 材料和方法
&B& 材料-./0 ,,A*)a#’()!’*+,,工 程 菌 株 (本 所 构 建 );GG9/c) +1Y2)洗涤一遍，&% %%% 8cGFH 离心 &% GF H，
收集沉淀。最后用 &%GG9/c) Y8F:’CP/清洗两遍以 去 收稿日期:!%%&’&%’&# 除沉淀中可能含有的上述洗液。离心收集沉淀，即为 基金项目:国家自然科学基金]A=?%%&,^;-广东省医学科研立项课题 包 涵 体 。 将 包 涵 体 经 我 所 专 利 技 术 (专 利 号 :(2&==?A&)%
作者简介:胡志明]&=,,’^，男，湖北黄冈人，&==e 年毕业于第一军医大 PK&&,===?2)精制处理，即为精制包涵体。 -./0 学，硕士，助理研究员，电话f%!%’?#&-?A!J+’G7F!f/ 6XGgSFGGB4V00BTH &BBA 融合蛋白的复性 在进行复性条件 !()!’*+,,
研究时，仅一条件V 如氧化型谷胱甘肽()浓度、 +..+大的提高，经凝胶光密度图像分析系统分析，结果显复性液 IW 值、复性时间X改变，其他维持不变。采用 M2(图 )，且包涵体的可溶性大大 示其纯度提高至 3!
一步稀释(;)和分步稀释(P)两种方法复性:(;)将精 提高，用 S E9,Y$ 尿素溶解包涵体 ，在尿素浓度降低至 制包涵体溶解于 S E9,Y$ 尿素中，蛋白质浓度调 至 N 2Z! E9,Y$时 ，包涵体仍保持很高的溶解度，而用常规
方法制备的包涵体，尿素浓度稀释至 * E9,Y$时 ，有 EGYE，, 搅拌，每 !2 EFJ 用复性液(IW SZ2，含 %2 *!
大量的蛋白析出。 EE9,Y$8>F@&W[, 、% EE9,Y$ 、 EE9,Y$ ) (/80*+..+
*+,- 将尿素浓度降低 E9,Y$直至终浓度为 E9,Y$，然后将 !!%ZC #$%&’())融合蛋白的复性研究 其一步降至 2Z! E9,Y$，继续搅拌 !2 EFJ后 ，* 放置 !
%2H 。(P)取与(;)法同样样品，用复性液一步将尿素 两种方法复性结果显示，采用分步稀释法复性，浓度稀释至 2Z!E9,Y$，* !放置 %2H 。 复性的回收率是 S2，而采用一步稀释法复性，回收 3*+,- 率为 O2。因此，采用分步稀释法复性 #$%&’())优 3
于一步稀释法。 *+,- /(0(& !Z%Z* #$%&’())融合蛋白的离子交换层析 *+,- %Z* #$%&’())融合蛋白的活性测定 .=IH;>9@= TT 刀 豆 蛋 白 ([9J0)诱 导 的 小 鼠 脾 细 胞 ，植 物 血 凝 素 (’W0)诱导的人外周血淋巴细胞作 靶 细 胞 ， 检 测 *+,- #$%&’())融合蛋白的杀伤效应。 讨论C 大肠杆菌具有结构简单、易培养、转化简便、高表 达等优点，但其表达产物通常以不溶性的包涵体形式 存在，为其纯化、复性带来了困难，因此解决好包涵体 % 结 果 *+,- ,,O%Z! #$%&’())的表达 。纯化与复性的问题对生物工程制药具有重大意义 经 *% 诱导，收集菌体， 电泳， !23./.&’0+(!*+,- 我所构建的 #$%&’())可在大肠杆菌内得到高效表 经考马斯亮蓝染色，在相对分子质量 S2 222处有 一 达，表达产物以包涵体形式存在。现有包涵体提取工艺 明显表达带，经扫描，表达量约占菌体总蛋白量的 存在包涵体在盐酸胍和脲素中的溶解度有限的技术 %23(图 )。 !难题，需浓度较高，一般所需尿素浓度 S\!2 E9,Y$，盐酸 ,，,)N胍 )\S E9,Y$。在如此高浓度变性剂条件下采用凝 胶过滤，离子交换等方法进一步纯化，不但成本高，而 ,S,且得率极低，且分离效果不理想。我所建立的包涵 体提取工艺解决了这一难题，大大提高了包涵体的纯 度和溶解度，因此，可在包涵体这一步直接复性，再进 行色谱分离纯化。为了取得较好的复性效果，我们对 复性的稀释方法，氧化剂的浓度，复性液的 IW 值，复 性时间等参数做了较系统的研究，确定了重组蛋白 *+,- #$%&’())复性的最适宜条件。因此，我们所用的包 涵体纯化复性工艺是一个先进的、实用的包涵体分离 纯化技术，为中试研究和规模化生产打下了基础。 *+,- 图 ! #$%&’())融合蛋白 ./.&’0+(1!234电泳分析 ;*2< "#$%="" &&&+="" ,%-/="" 010234"4="" 56=""><4"51> =>5?@"1 5 %689:;, <=,,-,;>,?@;:= 9A "#$%& *% B C6 89:;, <=,,-,;>,?@;:= 9A参考文献:!!;: ! ,,.:>9E 8^5 _=,,=? 5 b99QD9>:H8+ 5 () %Z #J:=>,=-KFJ&%>=<=i:9>& !‘a*" #$%& ;: C2 B *6 $9D E9,=<-,;>D=FGH: I>9:=FJ E;>K=>@ !!*+,- 1LM N2225 ) )%25 * C225 C!2 25 %22 24B O5 )6#$%&’())FJ<,-@f9j ’qf="">=<:=qfee -j9@-ii="">=@@FR=:H=>;IF= 6 @ ;J:FP9Q?& 9> <?:9KFJ=&P;@=Q > P9QF=@B N6 #J<,-@f9j p9q?="" i-="">FAF=Q P?; J9R=,FJR=J:F9 B SJ6 ,, :;>G=:FJG E9,=<-,=@ cz="" #ee="" -j9,="" a="R5" !mm%5=""><:6 %m!c!&)zc*+,-="" *+,-="" #$%&’());a:="">>=J;: ->;:F9BJ M6#$%&’() )I->FAF=QP? ,,% bF,,F;E@ 5 T>;JK 5 e-:H 5 () %Z [?:9I,;@EF<><, -@f9j="" ‘;j="" aeb$*/(0(&.="IH;">9@= TT F9J&=U<> .<><5= !ms%5="" )6="" moz=""> %Z% 不同提纯法对包涵体的纯度及溶解性的影响 ,C,高基民5 黄洪莲5 王小宁5 等Z 人白细胞介素 &%& 绿脓杆菌外毒素 融 ,,O常规方法提取的包涵体纯度达到 左右。采 )23合基因的克隆及高效表达,c,Z 生物工程学报5 !MM)5 !%(%)6 !%M&CZ C用新工艺对包涵体进行处理后，包涵体的纯度有了较 (下转 %!* 页) 肉瘤组织血管特异性亲和短肽行免疫组织化学鉴定，行亲和筛选，并已筛选出多种器官特异性和肿瘤特异,,,,J#性短肽。HIIJbHIIT 年 D%?c-%67.和7 d%e&AA: 共筛选 结果证实其与骨肉瘤组织有较高的特异性亲和作用，,,N出 H" 种器官特异性亲和肽。HIIT 年 a>%=在荷瘤鼠 而与正常组织及乳腺癌组织不能明显结合，再次说明体内筛选，得到了与乳腺癌血管内皮特异性结合的短 了该模型的有效性。另外，对于其他肿瘤或含血管丰 肽，分别含有整合素配体的基序 d$^CO5 及53$d5， 富的组织来说，模拟体内环境的灌流及噬菌体肽库的 将之与阿霉素交联用于荷瘤鼠靶向化疗，结果显示疗 筛选同样存在着很多问题，而该模型的成功建立也将 效明显增强而毒性反应降低。 为其提供很好的参考与借鉴。 关于噬菌体呈现技术在活体组织器官中的应用， 在下一步的研究中，我们将对该短肽进行同源性 目前国内外研究还仅限于在肿瘤细胞或动物模型中 分析及功能分析，以期找到一种骨肉瘤组织血管的特 进行筛选，在人类活组织中的筛选则未见报道。以人 异性标识物，从而进一步揭示肿瘤血管特性，为肿瘤 类活组织为靶进行的生物淘筛的意义在于可更直接 发生及其信号传导等的研究提供线索。同时，也可将 地应用于临床，但是，肿瘤组织或血管在离体条件下， 此短肽标记放射性同位素或与肿瘤化疗药物交联以 血管内皮产生的抗原及各种生物大分子的保存问题 进行靶向化疗的动物实验研究(这部分实验正在进行 尚未得到很好解决。 中)，并将其逐步用于临床诊断及靶向治疗。 本研究通过结合骨肉瘤血管特点的分析，提出了 建立一种尽可能接近于肿瘤在体环境的肽库筛选模 型，此方法简单、实用。我们采用类似于 0%./:.8&>@@ 的血管灌流装置，简便易行，本实验研究中的 !T 例骨 参考文献: 肉瘤标本均建模成功，可直接用于灌流实验且具有很 ,H,]&7;-.:. SQ a>%=1 Q d%e&AA: ^Q ! " #$4 R8:.A7@7G%A7&. &@ >:G:=A&> 67/%.8? g7A9 =9%/: 87?=6%Y =:=A78: 67_>%>7:? ,(,4 ( 3-G6 Q Q ):8HIII好的科学性:利用噬菌体呈现技术进行生物淘筛，为 O"KLM TTNCT4 \了使所筛选的靶标(某些抗原、受体或配基等)不失去 ,, !hB%8%Q Ri%g%‘3Q 3%B%E->%‘4 5&E=%>7?&. &@A9: :@@:GA? &@.7@:87=7.: 其生物学活性，就要求肿瘤组织离体后尽快建模及生 %.8 .7?&687=7.: &. G&>&.%>Y ;%?&G&.?A>7GA7&. 7. A9: 6%./:.8&>@@C 物淘筛。本实验通过术前的 2 线平片及 ^fa 检查能 =:>@-?:8>%A 9:%> ,A,4 ( 5%>87&;%?GD9%>E%G& Q 6Q N\M HO\CI4 (!"""较好的进行肿瘤血管的定位，此模型最大程度地模拟 ,N, a>%= Q D%?c-%67.7Q d -&?6%9A7S4 5%.G:> A>:%AE:.A _Y A%>/:A:8 1d了人类在体肿瘤的生理环境，其中包括压力、温度、电 8>-/ 8:67;:>YA& A -E&> ;%?G-6%A7. % ->:E& -?: E&8:6 ,(,4 fG7:.G:Q 解质、氧气供应等的模拟，并经多项指标的检测，表明 HIITQ K\NOILM N##CT"4 !#I 其与人体生理环境基本一致，而且建模时间短，可立 ,, O,%Y:?a( Q 07 0jQ 07==E%.)S 4 fG7:.G:Q E:87G7.Q :%.8 A9:@ -A-4>:即进行生物淘筛，符合实验要求，所切除肿瘤组织剖 a.A7;%?G-6%> A9:>%=YM % .:g %==>&%G9 A&A>:%AE:.A G%.G:> ,(, 4 F)(Q 开所见也证实了所建立模型的可靠性。 HIIIQ NHTQ T\NCJ4 ,, 我们从此模型中筛选出一种骨肉瘤血管特异性 d-&?6%9A7 S4 ‘%>/:A7./ A-E&> ;%?G-6%A-9&E7./ >: g7A9=:=A78:? @>&E\ =9%/:87?=6% ,(,Y4 f:E7. 5%.G:>F7& Q 6!"""Q H"KJLM HN\CO!4 亲和肽(基序为 d0‘d)，而以正常组织为靶进行的生 ,J,D%?c-%67.7 dQ d-&?6%9A7S4 h>%. A%>/:A7./*, - *-+ -?7./ =9%/: 87?=6%Y 物淘筛并未筛选到特异性亲和短肽。将筛选得到的骨 =:=A78:67_>%>7: ,(,4? 3%A->Q :HIIJQ NT"KJ\#!LM NJOC4 J ,#,d%e&AA: Q a>%= Q ,%/:8&>. Q " #$4 )&6:G-6%> 9:A:>&/:.:7AY &@ ^1!) A9: ;%?G-:.8&A9:676%> -E >:;:%6:8_Y * -*-+ =9%/:87?=6% ,(,Y4 ( 5 67. , R.;:?AQ HIITQ H"!K!LM ON"C#4 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Q Q (O)M HTTCI4 H物制品学杂志HIIJI(上接 !"# 页) ,J,唐松山4 大肠杆菌外源基因表达产物的下游技术,(,4 国外医$%& * ,-%./ ,0* 1%./ 23* !" #$4 56&.7./ %.8 97/96:;:6 ()学? 遗传学分册Q Q HT(N)M H!O4 HII\:<=>:??7&. &@ 7.A:>6: -B7. !CD?:-8&E&.%? :<><7.@-?7&. .:="" 7.="" ,#,]%.:="" (zq="" ,%="">A7:Y^R 4 Z&>E%A7&.&@ >:G&E_7.%.A =>&A:7.? 7.G6 -?7&.%&’(!)*’(*# ’+$*,(,4 597. ( F7&A:G9.&*HII6J* H!K!LM H!ICNN4 _&87:?7. S4G&67 ,(,4 ‘7_A:GQ9 HITTQ JM I\4 ,O,胡志明* 周明乾Q 林来兴妹Q 等4 R0C!CDSJJO$6融合蛋白生物学- 活 ,T,F-G9.:> (Q D%?A%.RQ F>7.BE%.. 4 a E:A9&8@&> 7.G>:% ?7./ A9: Y7:68[性测定,(,4 第一军医大学学报Q HIITQ HTUNVM !!TCN"4 &@ =>&=:>6Y @&68:8>:G&E_7.%.A =>&A:7.M ?7./6:CG9%7.?7EE -.&A&<7.? ,-="" w)q="" w9&-)x="" q="" 07.6%72)="" q="" !"="" #$4=""><7g7ay &@="" %??%y?r0!c=""> @>&E >:.%A->%A7&. &@ _%GA:>7%6 7.G6-?7&. _&87:?,(, 4 a.%6 F7&G9:Q EDSJJO$6-@ -?7&. =>&A:7. ,(,4 ( Z7>?A )76 ):8 [.7;Q HIITQ HT UNVM Q KVM !JNC#"4 HII!!"\!!!TCN"4 ,\,白东亭Q 许丽锋Q 祁自柏Q 等4 重组大肠杆菌的包涵体,(,4 中国生 — 1— 2016-05-13 国家自然科学基金资助项目 (81372447) 。 岑丹维 (1991-) ,女,浙江舟山人,硕士生。 张丽芳,教授,博士生导师,Email :wenzhouzlf@126.com。 收稿日期:基金项目:作者简介:通信作者:载体, 构建pET32a (+) /PE38KDEL重组质粒, 将测序正确的重组质粒转化到 E.coli BL21(DE3) 感受态细菌 中, 经异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导表达重组PE38KDEL蛋白, 经Ni -NTA亲和层析法制备纯化蛋白, 采用 SDS -PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。进一步将PE38KDEL纯化蛋白免疫日本大耳白兔制备PE38KDEL 特异性多克隆抗体, 并采集免疫前后血清, 用ELISA法检测免疫后的抗体反应和效价。 结果:成功构建 了pET32a (+) /PE38KDEL重组质粒。在原核表达系统中该质粒成功表达并获得纯化的PE38KDEL蛋白。 SDS -PAGE电泳显示蛋白分子质量约为57 kDa, 与预计理论值大小相符合。 Western blot法检测结果显示, 在分 子质量约57 kDa处出现单一条带。通过免疫大耳白兔成功获得PE38KDEL特异性多克隆抗体, 抗体效价高达 1:60 000。 结论:PE38KDEL蛋白可诱导兔产生特异性多克隆血清抗体, 且该抗体效价高、特异性强, 为进 一步研究基于PE38KDEL毒素的生物学和免疫学等功能奠定了基础。 [关键词] 铜绿假单胞菌;外毒素类; PE38KDEL;多克隆抗体;兔 [中图分类号] R3 [文献标志码] A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.001 Prokaryotic expression of recombinant PE38KDEL protein and preparation of its polyclonal antibodyCEN Danwei, SONG Yiling, ZHANG Chanqiong, MAO Shanshan, YE Xiaoxian, CHEN Jun, CHEN Shao, ZHU Shanli, ZHANG Lifang. Institute of Molecular Virology and Immunology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035Abstract:Objective: To prepare PE38KDEL recombinant protein from Pseudomonas exotoxin A in pro-karyotic expression system and prepare the PE38KDEL specific polyclonal antibody. Methods: The C-terminal 609-613 amine acid REDLK from Pseudomonas aeruginosa exotoxin (PE) genes (PE38) was mutanted to KDEL. After prokaryotic codon optimization (http://www.jcat.de), the full gene sequences were synthesized and then cloned into expression vector pET32a (+) prokaryotic expression vector inserted into Hind III and Xho I and constructed the recombinant plasmid pET32a (+)/PE38KDEL. After sequenced, the plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced by isopropyl beta-D-1-thiogalactoside (IPTG) to get the PE38KDEL protein. The recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography, SDS-PAGE and Western blot were used to identify it. Then, the rabbits were immunized by the PE38KDEL purified protein. The sera were collected before and after immunized. The antibody reaction and titer were detected by ELISA. Results: The pET32a (+)/PE38KDEL recombinant plasmid was successfully constructed and the protein was expressed and purified in the prokaryotic expression system. The protein molecular weight was about 57 kDa which was in accordance with the expected theoretical value. The PE38KDEL polyclonal antibody was obtained by immunization of rabbits and the titer of it was as high as 1:60 000. Conclusion: The PE38KDEL recombinant protein can induce the rabbit to produce serum polyclonal antibody which has high titer and strong specificity and can be used for further study which laid a solid foundation on the biology and immunology function. Key words:Pseudomonas aeruginosa; exotoxins; PE38KDEL; polyclonal antibody; rabbits 第 47卷 温 州 医 科 大 学 学 报 第 1期 绿脓杆菌在自然界分布广泛, 常引起人类伤口 的化脓性感染, 由于感染后脓液和渗出液呈绿色, 亦被称为铜绿色假单胞菌,其致病特点为致病力 较低但抗药性强。绿脓杆菌分泌的绿脓杆菌外毒 素 (Pseudomonas aeruginosa exotoxin, PE) 可通 过抑制细胞蛋白质合成, 发挥损伤和杀死细胞的作 用 [1]。由于这种特性, 将PE与特定的载体结合 (如 单克隆抗体、 细胞因子等) 组成相应的免疫毒素, 可 用于肿瘤的靶向治疗研究 [2]。相对于传统的化疗和 放疗, 免疫毒素治疗具有靶向性, 能特异性杀伤肿 瘤细胞, 近年来, PE类重组免疫毒素被广泛报道 [3]。 将PE的C端REDLK突变为KDEL获得的PE38KDEL, 进 入细胞的跨膜能力和毒素作用活性变得更强, 因此 PE38KDEL更适合作为免疫毒素的毒素部分进行研 究 [4]。本研究通过对PE毒素密码子的原核优化及 碱基突变, 获得经修饰的PE38KDEL基因, 并通过全 基因合成及分子克隆技术, 构建了原核表达重组质 粒, 经原核系统制备PE38KDEL重组蛋白, 进一步免 疫日本大耳白兔制备了PE38KDEL特异性兔多克隆抗 体, 为基于PE38KDEL免疫毒素的生物学和免疫学等 功能研究提供了必要的检测抗体。 1? 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 试剂与酶类:蛋白电泳marker、 限制性内切 酶 Hind I I I和 Xho I、T4DNA 连接酶均购自美国 Fermentas公司, PCR产物纯化试剂盒、1 kb DNA marker、DL2000 DNA marker、2×Taq PCR Mix、 质粒小提试剂盒均购自北京天根生化科技有限公 司, Cycle -pure纯化试剂盒、完全弗氏佐剂、不完 全弗氏佐剂均购自美国Sigma公司, 氨苄青霉素购 自山东齐鲁制药有限公司, 异丙基 -β-D -硫代吡喃半 乳糖苷 (IPTG) 购自德国默克公司, 鼠抗His单克隆 抗体购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司, 辣根过 氧化物酶 (HRP) 标记的山羊抗兔IgG (H+L) 抗体、 山羊抗鼠IgG (H+L) 抗体购自杭州联科生物技术有 限公司, 镍螯合亲和层析胶体 (Ni-NTA Agarose) 购 自美国Qiagen公司, 脱脂奶粉购自美国BD公司, 单 组分TMB显色液购自湖州英创生物科技有限公司。 1.1.2 质粒和菌株:pET32a (+) 克隆载体和 E.coli BL21(DE3) 均为本实验室原先保存。 1.1.3 实验动物:健康日本大耳白兔, 雄性, 体质 量1.8~2.4 kg, 由温州医科大学实验动物中心提 供, 动物合格证号:SYXK (浙) 2014-0006。 1.2 方法 1.2.1 PE38KDEL重组质粒构建:从GenBank中获 取PE全长毒素 (AE004091.2) 的全氨基酸序列后缺 失整个Domain Ia区获得PE40氨基酸序列, 在其基 础上将第365-第380位的氨基酸缺失, 并将羧基端 REDLK通过突变修饰为KDEL, 从而获得PE改造后的 PE38KDEL氨基酸序列, 通过生物网站进行原核表达 密码子优化 (http://www.jcat.de/) 获得PE38KDEL 密码子优化全基因序列,交由上海生物工程有限 公司全基因合成后,克隆至pET32a (+) 载体,构 建pET32a (+) /PE38KDEL重组质粒。将重组质粒 转化到 E.coli BL21(DE3) 感受态细菌, 利用氨苄 抗性筛选阳性克隆,并用特异性引物 (Ozlf FT: CCGCCGAAAGACGAACTGTAACTCGAG, Ozlf RT:CCGCC GAAAGACGAACTGTAACTCGAG) 进行PCR验证, 提取阳 性克隆菌株DNA后经酶切和测序鉴定。质粒的提取、 酶切、酶连、转化等按照分子克隆技术常规方法进 行。 1.2.2 PE38KDEL重组蛋白表达、鉴定及纯化:将 pET32a (+) /PE38KDEL重组质粒转化入 E.coli BL21 (DE3) 后, 接种至1 mL含100 μg/mL终浓度氨苄青 霉素的LB培养液中, 37 ℃, 250 r/min震荡培养过 夜。培养至吸光度A 600 =0.6~0.8时, 加入终浓度 为1 mmol/L的IPTG, 37 ℃, 250 r/min诱导8 h后 12 000 r/min离心5 min收集细菌菌体, 加入40 μL 8 mol/L尿素溶解菌体沉淀, 经100 ℃加热煮沸5 min 破菌, 取样进行十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶 电泳 (SDS-PAGE) 分析。小鼠抗His单克隆抗体为一 抗 (1:10 000) , HRP -羊抗鼠IgG (H+L) 作为二抗, 进 行Western blot分析和鉴定。经SDS -PAGE电泳和 Western blot法鉴定后进行重组蛋白的纯化, 即进 一步收集经IPTG诱导后的菌液, 经PBS洗涤2次后 加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1 mmol/L, 冰浴 中超声破菌, 12 000 r/min离心20 min收集上清, 用Ni -NTA Agarose亲和层析柱纯化和收集纯化后的 蛋白。 1.2.3 PE38KDEL蛋白兔多克隆抗体的制备及效价 分析:PE38KDEL纯化蛋白免疫日本大耳白兔, 分为 3组, 分别是PE38KDE 10 μg组、PE38KDE 50 μg组、 PE38KDE 100 μg组, 同时设置TRX -His蛋白对照组 和PBS对照组。分别于1、3、5周时进行免疫, 首次 免疫抗原与完全弗氏佐剂等量混合, 充分乳化, 第 — 2— 第 1期 第 47卷 2、第3次免疫抗原与不完全弗氏佐剂等量混合, 每 次每只家兔于背部皮下多点注射。 同时, 于0、 2、 4、 6周时兔耳缘静脉取血, 于第8周时心脏取血, 收集 的血液于37 ℃水浴锅中静置30 min后, 放置于高 速离心机中, 4 ℃, 3 000 r/min离心10 min, 分离 上层血清并置于-80 ℃分装保存备用。 用间接ELISA法检测0、 2、 4、 6、 8周时的血清抗 体反应。即将PE38KDEL纯化蛋白按终浓度10 μg/mL 包被ELISA板, 放置于4 ℃包被过夜, 经PBS洗涤、 3%脱脂牛奶封闭, 将免疫的兔血清稀释为1:100, 二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG (H+L) 。反应结果置 于BioElx800酶标仪中, 于450 nm波长处读取吸光 度 (A) 值, 所有血清标本均重复3孔, 以TRX -His蛋 白和PBS免疫血清作为对照组。同时ELI -SA法检测 免疫6周后血清抗体效价, 方法同上, 经洗涤、封 闭后将6周时的血清分别倍比稀释为1:100、1:500、 1:2 500、1:12 500、1:62 500、1:312 500, 所有血 清标本均重复3孔。 1.2.4 PE38KDEL蛋白兔多克隆抗体特异性分析鉴 定:诱导表达后的PE38KDEL菌株和纯化后的PE -38KDEL蛋白经电泳转膜, 以1:10 000稀释的兔多克 隆血清抗体为一抗, HRP标记的山羊抗兔抗体IgG (H+L) 为二抗, 进行Western blot检测, ECL发光液 显色分析。 2? 结果 2.1 pET32a (+) /PE38KDEL重组质粒构建及鉴定 通过全基因合成PE38KDEL片段, 通过 Hind I I I和 Xho I酶切位点将其克隆至pET32a (+) 载体相应位 置, 成功构建了pET32a (+) /PE38KDEL重组质粒 (见 图1A) 。琼脂糖凝胶电泳分析显示, 在约7 000 bp 位置可见清晰单一的重组质粒条带。通过特异性引 物PCR扩增鉴定, 在图1B中第3泳道可见约1 100 bp单一条带, 证明了所构建重组质粒正确。进一步测 序结果显示, 重组质粒构建完全正确 (见图1C) 。 2.2 pET32a (+) /PE38KDEL重组质粒原核表达及鉴 定 通过将重组质粒导入BL21大肠杆菌, 经IPTG诱 导表达, 裂解菌体后取上清小样经SDS -PAGE电泳分 析可见诱导后在57 kDa位置出现蛋白条带, 未诱导 的重组菌体则无此条带。通过Ni -NTA亲和层析, 在 57 kDa位置同样出现单一清晰的电泳条带并且与理 论预计蛋白大小相符, 表明重组质粒转化、诱导及 纯化成功 (见图2A) 。通过Western blot法 (一抗为 His鼠单克隆抗体) 检测, 在57 kDa处出现阳性单 一条带 (见图2B) 。 2.3 PE38KDEL蛋白免疫后兔血清抗体IgG反应及效 价 通过ELISA法检测抗体反应和效价, 结果显示, 在蛋白免疫家兔2周后, 注射PE38KDEL重组蛋白的 家兔开始出现特异性IgG抗体反应, 至第6周时血 清免疫效果达最高峰 (见图3A) 。 PE38KDEL蛋白3个 免疫剂量组之间的IgG抗体反应随蛋白注射剂量增 大而加强 (见图3B) 。取6周时免疫血清做抗体稀释 滴度检测, 间接ELISA法检测结果显示, 100 μg免 疫组PE38KDEL多克隆抗体血清的效价可达1:60 000 (见图3C) 。 2.4 PE38KDEL蛋白兔多克隆抗体特异性分析鉴定 诱导表达后的PE38KDEL菌株和纯化后的PE38KDEL 蛋白经电泳转膜, 以免疫后第6周家兔血清抗体为 一抗, HRP标记的山羊抗兔抗体IgG (H+L) 为二抗, 用Western blot法检测其与PE38KDEL蛋白结合的特 异性。结果显示, 在相对分子质量约57 kDa处可见 特异性单一阳性信号条带 (见图4) 。 3? 讨论 PE为单链蛋白, 全长由613个氨基酸组成, 包括 3个不同结构域, 即受体结合区 (Domain I) 、跨膜 区 (Domain I I) 和催化区 (Domain I I I) [5]。 Domain Ia具有细胞结合识别能力, Domain Ib功能目前尚 不清楚, 大部分氨基酸的缺失不影响其毒素分子活 性, Domain I I具有跨膜转运功能, Domain I I I具有 ADP核糖基化活性, 能抑制蛋白质合成, 是PE细胞 毒性作用的主要依赖区 [6]。将PE的Ia区缺失即得 到PE40, 将它直接与靶向分子融合即可构成选择性 杀伤特定靶细胞的免疫毒素, 但由于其相对分子质 量较大, 肿瘤组织穿透力较低 [7], 影响肿瘤靶向治 疗的效果。进一步将PE的Ib区去掉, 得到的PE38相对分子量较小 [8-9], 将PE催化区最后5个氨基酸 REDLK突变为KDEL, 可提高其进入细胞的跨膜能力, 增强毒素作用的活性, 使免疫毒素更具杀伤力 [10]。 BRINKMANN等 [11]研究发现, 由多种人类肿瘤相关抗 原的鼠源单抗B3制成的免疫毒素B3(Fv) -PE40和 B3(Fv) -PE38KDEL对多种肿瘤细胞均有杀伤作用, 均可使肿瘤组织块缩小甚至消退, 而修饰改造后的 PE38KDEL分子杀伤肿瘤细胞的作用更强。故本研究 将PE38KDEL作为研究对象。 本研究对PE38KDEL基因进行原核密码子优化, 岑丹维, 等:绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备 — 3— 温 州 医 科 大 学 学 报 A B C A:重组质粒pET32a (+) /PE38KDEL构建图; B:重组质粒pET32a (+) /PE38KDEL酶切鉴定[M为1 kb DNA marker, 1-2为pET32a (+) /PE38KDEL重组质粒 Himd II I 单酶切, 3为pET32a (+) /PE38KDEL重组质粒PCR产物]; C:重组质粒pET32a (+) /PE38KDEL测序图 图1 重组质粒pET32a (+) /PE38KDEL构建及酶切鉴定 — 4— — 5— 使目的基因更适合于原核表达, 以利于增加蛋白表 达量。密码子优化协调是进行蛋白质异源系统表 达常用的手段。经过密码子优化的异源系统表达 可实现目的蛋白的高产量, 同时保证表达系统稳定 性 [12-13]。密码子优化协调有多种方法, 不同优化 方法作用下蛋白表达效果差异较大。目前常用的密 码子优化方法有:改造宿主、稀有密码子替换、异 源表达宿主的选择或同源表达、密码子对优化、密 码子对协调等 [14]。根据以上理论和设想, 并通过在 线 (http://www.jcat.de) 预测, 本研究对PE38KDEL 重组蛋白原核密码子进行了密码子对优化, 并进行 了原核表达, 获得了较高的目的蛋白表达。 免疫毒素由毒性蛋白和相应配体 (生长因子、 抗 体等) 连接在一起组成, 其配体可以与一种靶细胞抗 原结合, 在配体的靶向介导下, 免疫毒素被细胞逐渐 内吞并通过其连接的毒素部分达到杀伤靶细胞的目 的 [15]。 自1999年美国FDA批准免疫毒素ONTAK (DAB389- IL2) 上市用于治疗成人皮肤T细胞淋巴瘤 [16]以来, 肿瘤免疫毒素靶向治疗研究成果显著。目前, 国外 基于PE38KDEL构建的免疫毒素已有15种进入了I期 A:SDS -PAGE电泳; B:Western blot法检测; M为蛋白marker, 1为BL21菌 株, 2为诱导后的TRX -His蛋白, 3为诱导后的PE38KDEL菌株, 4为纯化后 PE38KDEL蛋白 图2 pET32a (+) /PE38KDEL重组质粒原核表达 A:PE38KDEL蛋白免疫兔血清抗体反应检测; B:PE38KDEL蛋白不同剂量组免 疫兔血清抗体反应检测; C:PE38KDEL蛋白免疫兔血清抗体效价检测 图3 PE38KDEL重组蛋白免疫后兔血清抗体的反应和效价检测 1为BL21菌株; 2为诱导后TRX -His蛋白; 3为诱导后的PE38KDEL菌株; 4为纯 化后的PE38KDEL蛋白 图4 Western blot法检测PE38KDEL兔血清抗体的特异性 临床试验 [17]。本研究制备的PE38KDEL蛋白为进一 步研究免疫毒素提供了基础。 单克隆抗体因具有高度特异性而在临床和基础 研究方面广泛应用。由于单克隆抗体仅能够识别一 个B细胞表位而具有其应用的局限性, 因此多克隆 A A B B C 岑丹维, 等:绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备 — 6— 第 47卷 温 州 医 科 大 学 学 报 第 1期 5503.[8] KAWAKAMI K, TERABE M, KIOI M, et al. Intratumor- al therapy with IL13-PE38 results in effective CTL-mediated suppression of IL-13Ralpha2-expressing contralateral tu- mors[J]. Clin Cancer Res, 2006, 12(15): 4678-4686.[9] GEBHARDT M M, EBERLE K E, RADTKE P, et al. Bac- ulovirus resistance in codling moth is virus isolate-depen- dent and the consequence of a mutation in viral gene pe38 [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(44): 15711-15716.[10] LIU H, SEIJSING J, FREJD F Y, et al. Target-specific cyto- toxic effects on HER2-expressing cells by the tripartite fu- sion toxin ZHER2: 2 891-ABD-PE38X8, including a target- ing affibody molecule and a half-life extension domain[J]. Int J Oncol, 2015, 47(2): 601-609. [11] BRINKMANN U, PAI L H, FITZGERALD D J, et al. B3(Fv)-PE38KDEL, a single-chain immunotoxin that causes complete regression of a human carcinoma in mice[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991, 88(19): 8616-8620. [12] STACHYRA A, REDKIEWICZ P, KOSSON P, et al. Codon optimization of antigen coding sequences improves the im- mune potential of DNA vaccines against avian influenza vi- rus H5N1 in mice and chickens[J]. Virol J, 2016, 13(1): 143- 153. [13] BOYCHEV A S, CHKODROV G, IVANOV I. Codon pairs in the genome of Escherichia coli[J]. Bioinformatics, 2003, 19(8): 987-998. [14] 蔡海莺, 李杨, 张辉, 等. 基因设计对重组蛋白表达的影响 研究进展[J]. 生物工程学报, 2013, 29(9): 1201-1213. [15] KREITMAN R J. Recombinant immunotoxins for the treat- ment of chemo resistant hematologic malignancies[J]. Curr Pharm Des, 2009, 15(23): 2652-2664. [16] PIASCIK P. FDA approves fusion protein for treatment of lymphoma[J]. J Am Pharm Assoc (Wash), 1999, 39(4): 571- 572. [17] BAO X, CHANDRAMOHAN V , REYNOLDS R P. Preclini- cal toxicity evaluation of a novel immunotoxin D2C7- (scdsFv)-PE38KDEL administered via intracerebral convec- tion-enhanced delivery in rats[J]. Invest New Drugs, 2016, 11(1): 1-10. [18] 徐悦 玥 , 蔡冉, 马颖, 等. 肺炎链球菌表面蛋白A的原核表 达、纯化及其多克隆抗体的制备[J]. 中国生物制品学杂 志, 2015, 28(4): 372-382. [19] 王冰冰, 涂建欣, 吕艳, 等. HPV16型E7重组蛋白的表达 及其多克隆抗体的制备[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2014, 30(2): 167-175. [20] 贾慧娜, 罗海玲. 多克隆抗体制备方法的研究进展[J]. 中 国草食动物科学, 2012, S1: 66-69. (本文编辑:丁敏娇) 抗体的制备和研究仍然有较广的应用前景。徐悦 玥 等 [18]通过原核优化表达肺炎链球菌表面蛋白A并通 过纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔, 制备了高纯度 和高效价的多克隆抗体, 具有快速检测肺炎链球菌 的应用价值。本实验室通过同样方法制备的人乳头 瘤病毒E7蛋白的多克隆抗体, 具有特异性强和效价 高的特点, 不仅可识别宫颈癌Siha细胞和Caski细 胞株中的天然HPV16 E7蛋白, 也可识别HPV16 E7重 组蛋白, 可应用于HPV16 E7的检测 [19] 。因此, 针对 多个B细胞抗原表位的多克隆抗体仍具有研究的意 义和必要性 [20]。 综上所述,本研究利用密码子对优化的方法 设计了PE38KDEL基因, 通过原核表达系统获得了 PE38KDEL重组蛋白, 进一步将该重组蛋白作为特异 性抗原免疫日本大耳白兔, 获得了高效价血清多克 隆抗体, 经ELISA法检测其效价达到1:60 000, 经 Western blot法检测其能特异性识别PE38KDEL蛋 白。本研究制备的多克隆抗体, 具有制备过程短、 特异性强、成本低和抗体效价高等优点。 参考文献: [1] MICHALSKA M,WOLF P. Pseudomonas exotoxin A: opti- mized by evolution for effective killing[J]. Front Microbiol, 2015, 6: 963. [2] V ALLERA D A. Gene therapy with immunotoxins[J]. Meth- ods Mol Biol, 2001, 166: 235-246. [3] 祁志荣. PE类重组免疫毒素的研究进展[J]. 微生物学免疫 学进展, 2006, 34(1): 50-53. [4] XIONG W B, HUANG N, FENG Y, et al. Creation and anti- cancer potency in HeLa cells of a novel chimeric toxin, HMGNCIDIN, composed of HMGN2 a-helical domain and PE38 KDEL domain III[J]. Chin Med J (Engl), 2008, 121 (1): 82-95. [5] KENNEDY P E, BERA T K, WANG Q C, et al. Anti-HIV-1 immunotoxin 3B3(Fv)-PE38: enhanced potency against clinical isolates in human PBMCs and macrophages, and negligible hepatotoxicity in macaques[J]. J Leukoc Biol, 2006, 80(5): 1175-1182. [6] LI M,WANG B, WU Z, et al. Treatment of Dutch rat mod- els of glioma using EphrinA1-PE38/GM-CSF chitosan nanoparticles by in situ activation of dendritic cells[J]. Tu- mour Biol, 2015, 36(10): 7961-7966. [7] LI M, WANG B, WU Z, et al. A novel recombinant protein of ephrinA1-PE38/GM-CSF activate dendritic cells vaccine in rats with glioma[J]. Tumour Biol, 2015, 36(7): 5497- 转载请注明出处范文大全网 » 绿脓杆菌外毒素A对兔角膜基质范文五：绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备_岑丹维
