小乖乖喵
一、目的
了解并掌握米
二、原理
1）林—酚试剂中的钨酸和磷钼酸，碱性条件下极不稳定，被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼
2）蛋白中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙酸），用胰蛋白酶解蛋底物，生含酚基的氨基酸与福林—试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成
三、实验仪器
1、试管
2、7220分光光度计
3、恒温水浴锅
四、实验试剂
1、
2、0.55mol/L酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏，稀释并定容至1000ml 3、10%三氯乙
4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：
5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，0.5mol/L氢氧钠1ml湿润，
6、500ug/L酪氨酸溶液
7、胰蛋
五、实验步骤
1、标准曲线
管号 1 2 3 4 5 6
500ug/m
L酪氨0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
酸溶液
蒸馏水 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
2、
3、以光密
六、实验结果
组别 1 2 3 4 5 6 吸光度1 0 0.237 0.367 0.576 0.690 0.852 吸光度2 0 0.234 0.365 0.573 0.680 0.848 吸光度3 0 0.237 0.367 0.577 0.688 0.847 平均吸光度 0 0.236 0.366 0.575 0.686 0.849 酪氨酸含量（μg) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
酶活：在37℃下每分
样品中含酶活
A—样品定光
F—酶液稀释倍数
样液 0.38 0.38 0.38 0.38 Y
所以液中酪氨
酶活力单位
七、实验分析
1、 酶的实
空白：外误差读书范围在0,3~0.7或者0.3~0.8，用水调零做空，吸光度就可落在此范围，用对照管做空白就会有较大的
对照：是为了
2、 如何保
所有测得的数落在0.1到0.8之间且数据值逐渐增，本实验定的数就是准确的。胰蛋白酶一定刚提取新鲜酶；要在酶最适温度40℃下反应； 要在酶的适PH为7.5调节下反应； 催化反应的时间控制精确； 向1号试管加入三氯醋酸时要快； 加入各药品的量要精确，特
3、 稀的酶
不可以，是蛋
胰蛋白酶活力测定
实验
一、原理
福林—酚试剂中的磷酸和磷钼酸,在碱条件下极不稳定,易
蛋白质中具酚基的氨基酸,酪氨酸、色酸、丙氨,,用胰蛋白酶水蛋白物,生成含基的氨基酸与福林—酚剂反应,生成蓝色化合物,在一定的范围内,蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正
二、实验仪器
试管
7220分光光度计
恒温水浴锅
三、实验试剂
福林试B,见福林(Folin)-酚剂法定蛋白质的浓
10%
0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5),
0.5% 酪素
加少0. 2mol/L磷酸缓冲液稀。在水浴中煮沸溶解,却,稀释并容至100ml,冷藏在(冰箱)
500ug/L酪氨酸溶液
胰蛋白酶
四、实验步骤
标准曲线的制
112233445566管号管号
500ug/L500ug/L酪氨酸溶液
1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.200蒸馏水蒸水 各管中加0.5%酪素2ml,于37?水浴中反应15分钟,然后入10%三乙酸3ml,过滤除去淀,取清液1ml,加入0.55mol/L碳酸钠5ml,再入福林试剂1ml,于37 ?水浴中显色15分钟,测OD。 680光度为纵坐标,酪氨酸的微克数为横坐标绘制标曲线。 样品定,取燥的试管2支,按
1122
0.5%0.5%酪溶液酪素溶液2.02.02.02.03737水浴中酶解水浴中酶解1515分钟
0. 2mol/L0. 2mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液1.01.000
2mg/ml2mg/ml胰酶溶液胰酶溶液001.01.0
10%10%氯乙酸溶液
11113737水浴中
0.55mol/L0.55mol/L碳酸钠溶液碳酸钠溶液5.05.05.05.0
福林试剂福
OD680OD68000
五、结果计算
酶活,在37?下分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活
A—样品定光
F—酶液稀释倍数
原始数据,,注,7号为待测液,
液体编
0 1 2 3 4 5 7 号
分光光
0 0.057 0.172 0.201 0.255 0.373 0.919 度计
分光光
0 0.057 0.173 0.194 0.263 0.386 0.928 度计
分光光
0 0.068 0.174 0.194 0.271 0.391 0.934 度
0.45
0.4y = 0.0738x - 0.001620.35R = 0.9741
0.3系列10.25系列20.2系列30.15线性 (系列3)分光光度值0.1
0.05
0
-0.050123456
组数 酪酸浓
计算得X=12.583
换算后得
A=6.2915ug
F=3
故酶活力为1.2583单位
六,实验分析
误差分析:
试管液体的选取,
保证选用的蛋白酶
尽量持不同管溶液配
太久
取液时的操作,
各种容器
移液洗刷完后有润洗,
从水中拿出试管,没有使试管完冷却。是测得的分光值可能不准确,是液体的温度尽量相
分光光度
1. 分管光
2. 在用光光度计时,一定要先热,另外,比色皿要选用透明度好的,些比皿由于使用时间过长,或某些原因没有刷干净,色发暗,在某些程度上影响了实验结果,选取一定要注意。 胰蛋白酶是以活性的酶原形式存在物脏中,在 Ca 2+ 的存在下,被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活,从肽链 N 赖氨和亮氨酸残基之间断开,失去一段六肽,分子构象发生一定改变转为有活性的胰蛋白酶。 蛋白原的分子量为 24000,其等电点约为 pH8.9,胰蛋白酶的分子量与其原接近,23300,,其等电点约为 pH10.8,最适 pH7.6,8.0,在 pH=3 时最稳定,低于此 pH 时,胰蛋白易变性,在 pH>5时易自溶。Ca 2+ 子对胰白酶有稳定作用。 重金属离子,有机磷化合物和反应物能抑制胰蛋白酶的活性,胰脏、清和豆类物的种子中都存在着蛋酶抑制剂。最近发现在些的块,如土豆、薯、芋头等,中也存
胰蛋白酶能催蛋白质的水解,对于由碱性氨基酸,精氨酸、赖酸,的羧基与他氨基的氨基所形成的键具有高度的专性。此外能催化由碱性氨酸和羧基形成的酰胺键或酯键,其高度专性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次,酯键 > 酰胺键 > 肽键。因可利用含这些键的酰胺或酯类
底物来测定胰白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对苯胺,简 BAPA, 和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰 ,简称 BANA, 测定酰胺酶活力。 用苯甲酰-L-精氨酸乙酯 ,简称 BAEE,和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲,称 TAME,测定酯酶活力。酶力单位的定常因底物及测定方
酪素
微生物养基的氨基酸氮源,酪蛋白水得到,常见商名为水解酪素或酶解酪素。蛋白水解后富含21种氨基酸,氨基酸种类齐全,常用于制备培
胰蛋白酶的制备及活力的测定
1．学习蛋白
2．了解酶的
胰蛋白是以无活性的酶原形式存于动物胰中，在Ca2+的存下，被肠激酶或有活性的胰蛋酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去
肽，分子构发生一
胰蛋白酶的分子量约为24000，等电点为pH8.9，胰蛋白的分量与其酶接近（23300），其
胰蛋白易变性，在pH>5时自溶。Ca2+离子对胰白酶稳定作用。 重金属离子，机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植
子中存在着蛋酶抑制剂。最发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中
在有胰蛋
胰蛋酶能催化
基酸氨基所形的键具有高度专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰
或酯，其高度一性仍表现为碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性
为：键> 酰胺> 肽键。此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定
白酶活力。目前常苯甲酰-L-
萘酰胺（简BANA）测定酰胺酶活力。用苯酰-L-氨酸酯（简称BAEE）和甲苯磺-L-精氨甲酯（简称TAME）测定酯活力。本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常底物及测定方法
从动胰脏中提
然后根据等电沉淀的原理，
以硫酸铵分级盐析将蛋白酶原等（括大量的酸性杂蛋白以非蛋白杂质，
级盐析将胰蛋白酶原（包括大量糜白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。经
少量活性胰蛋白酶激，使其酶原转为有活性的胰蛋白酶（蛋白酶和弹性
被激活），被激活的溶液再以盐析级的方法除去糜蛋白酶弹性蛋白酶等
胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般经2～3次结晶后，可获得相当纯的胰蛋酶，比活力可达到8000～10000BAEE单位/毫蛋白，或更。 如需制备更的制剂，可用上述
（1）pH2.5乙酸
（2）2.5mol/L HSO。 24
（3）5 mol/L NaOH。
（4）2 mol/L NaOH。
（5）2mol/L HCl。
（6）0.001M HCl。
（7）硫酸铵。
（8）氯化钙。
（9）0.8 mol/L pH9.0冲液：取20ml 0.8 mol/L硼酸溶液，加80ml 0.2 mol/L四硼酸
（10）0.4 mol/L pH9.0硼酸缓冲液（用0.8 mol/L稀
（11）0.2 mol/L pH8.0酸缓冲液：取70ml 0.2 mol/L硼酸溶，加30ml 0.5 mol/L四酸钠溶液，混
（12）0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 缓冲液：取50mL 0.1 mol/LTris加29.2 mL mol/L HCl
（13）底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 缓冲液中加0.34mgBAEE和2.22mg的氯化钙。
（1）新鲜或冰冻
（2）食品加工机和高
（3）研钵。
（4）大玻璃
（5）布氏漏斗。
（6）抽滤瓶。
（7）纱布。
（8）恒温水浴。
（9）紫外分光光
（10）秒表。
（11）pH
（1）猪胰蛋白酶
猪胰脏1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂和结缔组，碎。 加入2倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15?搅拌提取24小时，四层纱 布过滤得乳白色滤液，用2.5M HSO调pH至2.5～3.0，放置3～4小
（约1.5L）。
加入固体硫酸铵（予先研细），液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过 夜后抽（挤压），得猪胰
（2）胰蛋白酶
向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入10积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶 解，得胰白酶原溶液。将研细的固无水氯化钙慢加入酶原溶
2-量按饼重的四分之计），使Ca2+与SO结合后，边加边搅均匀，边加边
中最终仍含有0.1M CaC。 l2
用5M NaOH调pH至8.0，加
8～10h，（2～3时取样一次，用0.001M HCl稀释），测定酶活性
活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5M HSO
除去CaSO4
（3）胰蛋白酶
将已激活的胰蛋白酶溶液按242g/L加入细粉固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和，放置小时后，
2．滤液按250g/L加入研细的硫
液。
（4）胰蛋白酶
将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）后进行结晶：按每克饼溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼缓冲液的计加入缓冲
用2M NaOH调pH至8.0，注
放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液变稠呈胶态，再加入总体的1/4～1/5 的pH8.0的0.2M硼酸缓液，使胶态散，必要时加
放置2～5天可得到大量蛋白酶结晶，待晶析出完全时，抽滤，母液回。 （5）胰蛋
将第一次结晶的胰蛋白酶产物进行重结晶：用约1的0.025M HCl，使上结晶散，加入约1.0～1.5倍体积的pH9.0 的0.8M硼酸冲液，至结晶酶全溶解，取样后，用2M NaOH调溶液pH至8.0（准确）（体过大，很难结），冰箱放置1～2天，可将量结晶抽滤得第二次结晶产物(母回收)，冰冻干燥后得重结晶的
以苯甲酰L—精氨酸酯（英文缩写BAEE）为底物，用外吸收法进行
L—精氨酸乙酯在波长253nm下的紫吸远弱于苯甲酰L—精氨（英文缩写为BA）。在胰白酶的催化下，随着酯键的解，苯甲酰L—精氨酸逐渐增
宜随之相应增加。
取2个光程为1厘米的带盖石英比色杯，分别加入25?热过的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl，作为空白，校正仪器的253nm处光吸零点。再一比色杯中加入0.2ml待测酶液（用量一般
并记时，每半分钟读数一次，共读3～4min。DA253/min 在0.05 ～ 0.100左右为。 绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出应起始点吸光度
DA253/min。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE底应液pH8.0，25?，应积3.0ml，光径1厘的条件下，测定DA253，
一BAEE单位。
胰蛋白酶溶液的活力单位（BAEE单位/ mL）＝ 胰蛋白酶比活力（BAEE单位 / mg ）＝
1．胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低的，否则可能因组织自溶导致实验失败。 2．在室
降低，比活性达到“3000～4000BAEE单位/mg蛋白”时可停止激活。 3．要想得胰蛋白酶结晶，在进行晶时应十分心地按规定条
前几步的分离纯化效愈好，则培养晶也较容易，因此每一
过稀难形成结晶，过则易形成无定沉淀析出，因此，必需到好处，一般
溶液开始时应略呈微浑
4．过酸或过碱会影响结晶的形成及酶活力变化，必须严格
5．第一次结晶时，3～5天后仍然无结晶，应检查pH，必时调整pH或接种，促使结晶形。结晶时间要短些。 1．取制备猪胰蛋白酶的过程，应特别意哪些主要环节
3．哪些因素是直接影响形晶体的主要原因？应注意哪些条件？ 4．在实验中，可采取什方法来提
实验六 胰蛋白酶的结晶及活力测定
实验一 胰蛋白酶的结
原理
胰蛋白酶（trypsin，EC.3.4.21.4）通常是以无活性的胰蛋酶（trypsinogen）形式存在于动物胰脏中。在生理条件下，胰蛋酶原随液分泌到十二指肠后，在小肠上腔有钙离子的环境中被激酶（enterokinase）或胰白酶所激活，其N端的赖氨酸与异亮氨酸之间一个肽键被水解而失去一个性6肽，分子构象发生改变，转变成有生物活
胰蛋白酶原的Mr约为24000，其等电点为pH8.9。胰蛋白酶的Mr为23400，等电点为pH10.8。胰蛋白酶在酸性条件下稳。通常pH3.0的溶内，在4的冰箱内储存数约至2年其活性无显著变化。当溶液的pH值小于2.5，胰蛋白酶易变性；pH大5.0时，容易发生自溶；在pH7.6~8.0时，其催化水
重金属离子，有机磷化合物和某应产物均可抑制胰蛋酶的活性。在胰脏、卵清和大豆中含有一些胰蛋白酶性具有抑制
胰蛋白酶催化水解蛋白质的能力，表现在它对碱氨基酸（如精氨酸、赖酸）羧基其氨基酸所形成的肽键具有高度的专一性。此外，还催化解有碱性氨基酸所成的酰胺键和酯键，胰蛋酶对这些化学键催化水解活性的敏感性次是酯键＞键＞肽键。因此，可以利含有这些化学键的人工合成的化物为底物来研究胰蛋白酶的专一
在动物的胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰白酶的性相蛋白水解酶，即：胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）称糜蛋白酶，弹性蛋白(elastase)。在制过程，采用的方法往往很难将三彼此分离开。而采用具有
从胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有胰蛋白酶原提取出来，后据等电点淀原理提取液的pH调至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋沉淀析。经硫酸铵分级盐析胰蛋白酶原，胰凝乳蛋白酶原和性蛋白酶原沉淀，抽滤后的沉淀物经水溶解并至pH8.0，用少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激，同时溶液中的胰凝乳蛋白原、蛋白酶原也被激活。三种酶原激活相互
流程图
激活后的酶溶液，用硫酸铵分级盐析法初步胰酶与胰凝乳蛋白酶和弹性白酶分开，收集胰蛋白酶部，通过结晶进一步纯化，使胰乳蛋白酶和性蛋白酶通过离
胰蛋白酶能水解酯键、酰胺键和肽键，根据这一性质，用人工合成的底物或天然的蛋白质（如酪蛋白）定胰蛋白酶的活性。目前，用于测胰蛋白活性工成的底物主是酰胺酯两。用苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（enzoyl-arginine p-nitro-anilide,简称BAPA）苯甲酰-L-精氨酰-β-精氨酸乙酯(enzoyl-arginine naphthylamide ,简称BANA)为底物测定酰胺酶的活力；用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（enzoyl-arginine ethyl ester, 简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸酯（tosyl-L-arginine methyl ester ，简TAME）为底物测定酯酶的活力。以BAEE
反应方程式
以人工合成的底物测定蛋白酶活力时，常采用紫外吸收法，酶活力单的规定因底物及
操作方法
一 结晶胰蛋白
（一）胰蛋白酶
1. 称取1kg（重）新鲜的或冻的动物胰脏，剥去脂肪及替组织。剪成
2. 加入2~2.5倍体预冷的pH2.5~3.0乙酸酸化水，在5~10℃下提6小时上，并不
3. 用4层纱布挤滤，拧挤出滤液；组再加入约1/2体积（500ml左右）的乙酸酸化，提取1~2小时。再次纱布过滤。
调至pH2.5~3.0，静置约4小时，使提取液的酸性蛋白
4. 用折叠滤纸过滤，收集全部的，加入粉状固体的硫酸铵0.75饱和度（按每1000ml滤液加492g，5℃）。放置过夜，使
5. 用布氏漏斗抽滤，压紧成滤饼。即可获胰蛋白
（二）胰蛋白酶
1. 将硫酸铵沉淀的胰蛋白酶原称（湿重），加入约10倍积的预冷蒸馏水（按滤重量计算），使滤饼完溶解，一情况滤饼中硫
2. 用5mol/L氧化钠将溶液至pH8.0，慢慢加入固无水氯化钙
度达到0.1mol/L（要减去一部分氯钙和硫酸铵结合生成硫酸钙沉的钙离子）。随
3. 取出0.1ml溶，稀释200倍定激活前的蛋白含量及酶活性（般情况是无活性
4. 加入2~5mg该种动物的胰蛋白激活启动酶，轻轻搅匀，4℃激活12~16小时25℃激活3~4小时。激活期间每一段时间测定
活增长情况，直到激活速度有快变慢或停止增长，表酶原已经
一般比活可达到3500~4500 BAEE单位/mg酶蛋白。
5. 酶原激活后，用2.5mol/L的硫酸至pH2.5~3.0，用滤纸过滤区硫酸沉淀。置
（三）胰蛋白酶的
1. 将以激活的胰蛋白酶溶液，慢加入固体硫酸铵至0.4饱和度（每1000ml 溶液加入240g硫酸）。使胰凝
2. 用布氏漏斗抽滤，收集滤液，（留做制备胰凝乳蛋白酶），再加入固体硫酸铵至0.75饱和度（每1000ml 溶液加250g硫酸
3. 在4℃放置约4小时，待胰蛋白酶完全淀析出后，用布氏漏斗抽滤，收集饼，即获得胰
二 胰蛋白酶的
1. N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为
N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯在波长253nm下的紫外吸收远于N-苯酰-L-精氨酸(benzoyl-L-arginine,简称BA)紫外光吸收。在胰蛋白酶化水解下，BAEE随着酯键的水解，水解BA逐渐增多，反应体的紫外光吸收亦随之相应增
取两个石英比色杯（带盖，光程为1cm），分别加入25℃预热过的2.8ml1.0mmol/L的BAEE物液。向一个色池内入0.2ml 10mmol/L的盐酸，波长253nm下调整仪器零点；向另一个比池内假如0.2ml胰蛋白酶溶液（酶的量一般为5~10μg 纯胰蛋白酶，是品应增加用量），立即盖上盖迅速颠倒几次混匀并计时，于253nm处测定其光吸收加（A253nm），每隔30秒读数一次，应持续5~7分钟。测得结果要使△253nm/min控制在0.05~0.1之间为宜。若偏离此范
以时间（t）为横坐标，光吸收值（A253nm）为纵坐标做直线，在直线分任选一个时间间隔（t）与应的光吸收值变化（△A253nm）。按列公式计算胰蛋
酶的活力单位（BAEE单位）=（△A253nm/min）/0.001
酶的比活力单位（BAEE单位/mg酶）=（△A253nm/min）×1000/（ε×0.001） 式中的△A253nm/min为每一分递增光吸收值；ε为测定时用的胰蛋白酶量（μg）；1000为酶蛋白的μg转换成mg的转换值；0.001为光吸收值每增加0.001定义为1个BAEE活力
2. 对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME）为
取2个石英比色杯（带盖，光程为1cm），分别加入经25℃预热过的2.8ml1.0mol/L TAMA 底物液。个比色杯加入0.2ml 10mmol/L的盐酸溶液作为空对照，在波长247nm下调整仪器的零点，然后另一个比色加入0.2ml胰蛋白酶溶液（用量5~10μg），盖上盖，迅速颠几混并计时，于波247nm处测定其光吸收。每隔30秒读数一次，反应持续5~7分钟。△247nm/min控制在0.05~0.1为宜。偏离此范围要适当增减酶量。 间（t）横坐标，光吸收（A247nm）为纵坐标做直线，在
间隔（t）与相应的光收值变化（△A247nm）。按下列公式计算蛋白酶的活力
酶的活力单位（TAME单位）=（△A247nm/min）/0.001
酶的比活力单位（TAME单位/mg酶）=（△A247nm/min）×1000/（ε×0.001） 式中的△A253nm/min为每一分递增光吸收值；ε为测定时用的胰蛋白酶量（μg）;1000为酶蛋白的μg转换成mg的转换值；0.001为光吸收值每增加0.001定义为1个TAME活力
3.甲酰-L-精氨酰-β-萘酰胺（BANA）为
取3只试管，其中两支为平行测定酶活力实验，均加入0.1ml0.25%BANA 乙溶液，0.4ml0.2mol/L，pH8.0磷酸盐缓冲液，加入1ml已释好酶液，混匀后37℃保温15分，后立即加入0.5ml 2mol/L的盐酸溶液，以停酶促反应，摇匀。另一支试管加试剂与前2支相同，只是先加入0.5ml 2mol/L的盐酸溶液，后加酶液。酶后亦同样保温15分钟，作为空对照。然后在3支试管中都加入1ml 0.1%的硝酸钠溶液，充振荡3分钟后，加入1.5ml 0.5%氨基磺酸铵溶液，再振荡2分钟，后加入2ml 0.05%的N-基-乙胺二盐酸乙醇溶液，摇匀。溶逐渐呈兰色，在25℃保温30分后，产物的颜即达稳定。于560nm测其光吸收。以同品量为横标，得相应的△560nm纵坐标做图，选择曲线的直线部分，按以下计算公式计
酶的活力单位（BANA单位）=（△A5603nm）/（0.01×t）
酶的比活力单位（BANA单位/mg酶）=（△A560nm）×1000/（ε×t×0.01） 式中的△A560nm为样品管吸收值－空白管光吸收值；ε为每个样品管所用的胰蛋酶量（μg）；1000为酶蛋白的μg转换成mg换值；0.01为光吸收值增加0.01定义为1个BANA活力单位的常数；t为保温时
在上述条件下，每钟光吸收值增加0.01时，所需酶
4.酪蛋白为底
以酪蛋白为底物，主要于测定胰蛋白酶制品的活力。按修改后的Kunitz法进行测
样品管：将酶液用0.1mol/L，pH8.0的硼酸缓冲稀释到适当的浓度（粗胰白粉约8~80μg/ml，结晶胰蛋白酶粉约2~20μg/ml），取不同量的酶液（0.1~1.0ml），并用0.1mol/L，pH8.0的硼酸缓液补足体积到1.0ml。然后在每个样品管中加入1ml预先37℃保温好的1%酪蛋白溶液，混匀，在37℃保温10分钟，立即加入3.0ml 5%的三氯乙酸，迅速摇匀，于
空白管：在每支试管中个加入1.0ml1%白溶液和3.0ml5%三乙酸，摇匀后，再加入1.0ml酶液（酶浓度分别与样管相同），37℃保温10
将样品管、空白管分别离心，取上清液于280nm策其光吸收值。以不同样品作横坐标，所得相应的△280nm为纵坐标作图，选择曲的直线部分按列公式计算胰蛋
酶的活力单位=△280nm/t
酶比活力（活力单
式中：△280nm为样品管光吸收值（A2）－空白管光吸收值（A1）；ε为每个样品管中胰蛋白酶
三 胰凝乳蛋白酶
以N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（N-acetyl-tyrosine ethyl ester简称ATEE）为底，用紫外吸
取2个石英比色杯（盖，光程为1cm），其中一个加蒸馏水，用于调零。另
入2.8ml ATEE—0.05mol/L，pH7.0的磷酸冲，0.20ml酶液（用量一般为10μg蛋的结酶），立即匀并计时，于237nm处测其光吸收值（降低），每半分钟读一
根据时间—光吸收系曲线中的直线部分，任选一时间间隔相应的光吸
，按以下计算公计算胰凝乳蛋白酶的活力单位和
酶的活力单位（ATEE单位）=△237nm/t ×0.001
比活力=酶活力单位数/mg蛋白质 =（△237nm×1000）/（ε×t×0.001）
式中：△237nm为任选一个时间间隔（min）光值变化（降低）；ε为测定时所用酶量（μg）；1000为酶蛋白由μg转换成mg时的转换；0.001为每分钟光密度降低0.001定
五 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶蛋白
根据蛋白质溶液在波长280nm处具紫外光吸收的特性，得光吸收值A280nm除以该蛋白质消系数或乘以该蛋白质的比消光系，即可计算出该蛋白质溶液浓度。白酶，胰凝乳蛋白及弹性蛋白酶的消光
胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶及弹性蛋白酶的消系数和
计算出的蛋白质的浓度
蛋白酶（mg/ml）=（A280nm×N）/消光系数 或 A280nm×
式中：N为测定时酶溶液
结果处理
1. 乘量所得到的胰蛋白
2. 计算结晶酶的比活力。以单位数/mg蛋
试剂和器材
试剂
1.pH2.5乙酸酸化水 2.10%乙酸
3.2.5mol/L硫酸 4.硫酸铵
5.氯化钙（AR） 6.5mol/L氢
7. 2mol/L氢
8. 0.8mol/L，pH9.0硼：取20ml0.8mol/L硼酸溶液，加30ml0.05mol/L四硼钠 溶液，混合
9. 0.8mol/L，pH9.0
10.0.2mol/L，ph8.0硼液：取70ml0.2mol/L硼酸溶液，加30ml0.05mol/L四硼 钠溶液，混合
11.2mol/L盐酸
12.ATEE—0.05mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液（每ml磷酸盐缓冲液中含0.25mg ATEE） 13.0.1mol/L pH8.0硼酸缓冲液
14.5%三氯
15.1%酪
16.0.25%BANA—乙醇溶液：于冰箱
17.0.1%亚
18.0.5%氨基
19.0.05%N-1-萘基-乙二胺盐酸乙醇溶：贮于冰箱
20.0.2mol/L，pH8.0磷酸盐缓液：取5.3ml 0.2mol/L磷酸二钠溶液，
0. 2mol/LL磷酸氢二钠溶液，混匀，检查溶
21.TAME—0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液：取29mg TAME，222mg氯化
0. 05mol/L，pH8.0 Tris-HCl缓冲液中
22.0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液
23.BAEE底物溶液的配：每ml 0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲
2.2mg氯化钙。如配制50ml0.05mol/L，pH8.0Tris-HCl缓冲液，加110mg氯化钙， 17mgBAEE（相当于1mmol/L BAEE）
器材
1. 新鲜动物胰脏
2. 剪刀、镊子
3. 搪瓷盘
4. 绞肉机
5. 标本缸（约17cmX25cm）
6. 乳钵
7. 大玻璃漏斗（直径17cm~12cm）
8. 塑料小桶
9. 离心机
10. 布氏漏
11. 抽滤瓶
12. 恒温水浴
13. 分光光度计
14. 纱布
15. pH试纸
实验九 胰蛋白酶活力测定
胰蛋白酶活力测定
一、实验原理
1、福林—酚试剂的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下不稳定，
。 物还原为蓝色化合物(
2、蛋白质中含具酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、氨酸)，用胰蛋白酶水解蛋白物，成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，一定的范围内，色化合物颜色的深
二、实验仪器
1、试管
2、7220分光
3、恒温水浴锅
三、实验试剂
1、福林试剂B:见福林(Folin)-酚试剂蛋白质的浓度部分(冰箱中) 2、0.55mol/L碳酸钠液:58.3g无水碳酸钠溶于馏水，稀释并
4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5):
5、0.5% 酪素溶液:称取0.5g酪素，0.5mol/L氢氧化钠1ml润，再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮溶解，冷却，
6、500ug/L酪
7、胰蛋白酶溶液(
四、实验步骤
1、标准曲线的制作:按下表
管号 1 2 3 4 5 6
500ug//酪
蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
各管中加0.5%酪素2ml，于37?水浴中反应15分，然后加入10%三氯乙酸 3ml，过滤去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，入福林试剂1ml，于37 ?水浴中
以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐绘制标
2、样品测定:取干燥的试管2支，下表加
管号 7 备注
0.5%酪素溶液 2.0 37水浴
2mg/ml胰酶溶
10%三氯乙酸溶液 3.0 过滤
上清液 1 37水浴中显
0.55mol/L碳酸钠溶
福林试剂B 1
OD680
酶活力:在37?下每分水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。 样品含酶活
A—样品测定光密度查曲线得相当
F—酶液稀
五、实验结果
管号 1 2 3 4 5 6 7(样品) 酪氨酸微克数 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ----------- OD680 0 0.157 0.258 0.379 0.499 0.585 0.993 OD680 0 0.156 0.259 0.379 0.496 0.585 0.993 OD680 0 0.157 0.258 0.378 0.497 0.585 0.994 OD680(均) 0 0.157 0.258 0.379 0.497 0.585 0.993 由上表可作
标准曲线
0.7y = 1.1617x + 0.02220.62R = 0.99430.5
0.4
0.3吸光度
0.2
0.1
0
00.10.20.30.40.50.6
酪氨酸(μg)
由上可知，样品的吸光度y=0.993，则x=0.8μg，即A=0.8μg 故根据公式品中含
A—样品测定光密度查曲线得相当
F—酶液稀释倍数
胰蛋白酶活力为:0.8 /15 ?13=0.69
六、实验分析
1. 测定胰蛋白酶
答:蛋白质中含具酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、氨酸)，用胰蛋白酶水解蛋白物，成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，一定的范围内，色化合物颜色的深
2. 胰蛋白酶的最适PH值多少? PH值胰酶稳定性有何影响? 答:胰白的最适PH值为8.1。蛋白酶的活性在一定的PH值范内随着PH值升高而升高，超过
