金铎*，林家琪1,21,2，董真1,2，展天松1,2，敏1,2，焦库1,2，王彦红*1,2，刘

（1，扬州大学兽医学院, 州，江

2，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控

摘要：2013年4月，扬州大学动医院畜禽诊接诊一例山

病例，对其进行剖检，无菌恒温厌氧分培养，纯鉴别，革兰氏

应，结果表明为产气荚膜梭，并

关键词：产气荚膜梭菌；分离；鉴定。

产气荚膜梭菌旧名魏氏梭菌，产气膜杆菌，据致死性毒素

的中和实验，将此菌分为A 、B 、C 、D 、E 5类型，以菌体抗原

意义不大，菌体抗原与毒素分型之间没明显关系，毒素至少已经

其中α、β、ε、ι、δ、θ、κ、λ、μ、υ、CPE 、其他毒素、神经氨酸酶

等。A 型、C 型、D 型的某些菌株可产生肠毒素，A 型产气荚膜梭

物的气性坏疽，牛、羔羊、新生羊驼、

要引起羔羊痢疾，还可以引起犊牛、羔、山羊的毒血症或坏死性

菌是绵羊猝狙的病原。D 型、E 型菌是导致牛羊

结合相关知识，在此整理于扬州大学动医院所见一例羊源产气

的疾病。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2013年4月，江苏某养殖户饲养的240多只

24-48小时开始出现剧烈腹泻，拉水

率达60%。剖检后发现病死羊羔严重水，真胃大肠内容物呈糊

薄，或黄或黑，透明，充满空气，部分肠道黏膜充血出血，卡他性出性炎症, *基金项目：江高校优势学科建设工；江省大学生创新训计

作者简介：金铎（1992—），男，山东青岛人，州大学兽医学本科生，主要从事羊床

质粒指纹图谱

*

*通讯作者：王彦红，扬州大学兽医学院讲师，E-mail: wyh7405@163.com 通讯作者：刘文，扬大学兽医学院副

肝脏肿大。临床疑为产气荚膜梭感染，进一步进行实

1.2 细菌分离

取山羊的肠道、肝脏、脾脏、肾脏等变组织无菌环境下接

板上，在37℃条件下用烛缸厌氧罐进厌氧培养24小时。然后在

别挑取血平板上的单个菌落，在血平板麦康凯琼近进行鉴别培

落进行革兰氏染

1.3 生化试验

利用细菌微量生化反应管（购于杭州生物试有限公司，操

标准参照该公司操作方法与标准）对所离的菌株行生化指标测

进行暴烈牛乳发酵实验。在37℃件下培养24h ，然后

2 结 果

2.1 细菌分离

取山羊的病变组织（肺脏）在无菌环下接种于

养24h 后出现表面光滑、半透明、圆顶状的菌。菌落周围有溶

显的双溶血环，内环为完全溶血，外围不完全溶环。经过纯化

琼脂板上没有菌落生长。经过革兰氏染镜检，结

单个或成双的革兰氏阳性细菌，芽孢大卵圆。肝，肾脏，脾脏

同。

2.2 生化

分离菌接种在生化反应管后于37℃培24h ，取出观察，

酵葡萄糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖等，裂牛乳酵实验呈现明

他生化试验结果见下

表1生化实验结果

发酵反应

项目 消化酪蛋白 水解明胶 酯酶 卵磷脂酶 萄糖 麦芽糖 乳 蔗糖 吲哚验 露醇 硫化氢 硝酸盐实验 乳

3 讨 论 + - + + + + + - - + + +

本病例中病死山羊的肠道出现明显卡性渗出并伴有出血症状，肝脏和肾脏出现坏死灶。分离菌株为杆状，两端钝圆，单个或成双的革氏阳性细菌，芽孢大而卵圆。通过化验检验，结果表明病原菌与产气荚膜梭菌的生化应结果一致，从而证分离是产气荚膜菌。该病例的死亡较高，对羊群危害较。近年来，江浙一带地区养人越越多，产荚膜梭菌对于草动物的危害非常严重，病的研究有重要意义。本病的防治重在饲养管理，保持环境，温湿度稳定。平时要注意搞好境生，及时清理粪便，定期用生石灰、百杀等不同消毒剂杀灭环境中的病原体。不要突然更换饲料，平时可在料中加微量元素硒，增加益生菌以调节肠道的常菌群平对减少本病的发具有一定的临效果［3］。加强对畜舍环境和粪便内产荚膜梭菌的检测和监控有利该病的防控，对暴发过该病的地区，需要掌握其行形势以于采取合理防治措施［4］。该疾病发展快，治疗般是没太大效果。接疫苗是防本病的一种有效方法，预防羔羊痢疾、猝，肠毒血等，可用三联菌和五联菌苗进行免防

由于产气荚膜梭菌病常呈急性散, 目前尚无有效的治疗措施, 治疗时一般遵循心补液、解毒、镇静、调理肠的原则, 进行对症治疗；抗生素等药物, 如青霉素、四环素等, 值得注意的是，胺嘧啶和多粘菌类药物对产气荚梭菌生长没有抑作用，对其他的细菌却较强抑制作［5］，应用这两类药物治疗产气膜梭菌感染往往不会得到理想的结果；采用同型的高免血清治疗, 对症加减, 可收到一定的效果。中药治疗法, 采用能增加胃肠蠕动、清热解毒、凉血止痢、阻止瘟疫毒入机体的中药, 如黄芩黄连解汤减, 煎水灌服, 每2次, 连3～5d, 可收到良好的效果［6］。临床上，产气荚膜菌常与其他菌混合感染，如巴氏杆菌、肠杆菌、链球菌、葡萄球菌、沙氏菌、肺克雷伯菌等等［7］，在诊和治疗的时候应格外注意，不能仅仅针对单病原采对症治疗措施忽略可能的继发

产气荚膜梭菌是羊肠道内正常菌，正常情况下数量有限，肠道菌群处于平衡状态，其发病原因主要与气候变化饲养理不当或疫苗免疫失败有关，长期阴雨潮湿饲喂料过粗纤维含量较少，致道正菌群失调，产气荚膜

大量繁殖，产生毒素，使机体发病产气荚膜梭有不同的血清型［8］，确诊本病应靠实验室诊断血清型鉴定，

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A型产气荚膜梭菌的分离及鉴定

?２８?

ＣｈｉｎｅｓｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｌｅｔｉｎＶｏｌ．２３Ｎｏ．７２００７Ｊｕｌｙ

：／／．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．

Ａ型产气荚膜梭菌

高文伟１，郭宏伟１，任家琰１，蒋玉文２，杨茂荣３，赵玉臣３，柴奎强３，周县利３

２

（１山西农业大学动物科技学院，太谷０３０８０１；中国

３

山西省药物培植场，降县０４３６００）

摘要：从山西各鹿场采集鹿出血性肠炎急性病死鹿病料３９例，通病原微生物分离培养，形态观察和血清型鉴定，初步表分离到的产气膜梭主要是Ａ型，对ＰＣＲ产

ＰＣＲ得到了特异性的α毒素基因片段，因而Ａ型产气荚膜梭是引起山西鹿场发

的主要致病菌。为该疾病的防治和疫苗研制提依据。关键词：西鹿场；Ａ型产气膜梭菌；分离；鉴定中图分

文献标识码：Ａ

ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍＰｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓＧａｏＷｅｎｗｅｉ１，ＧｕｏＨｏｎｇｗｅｉ１，ＲｅｎＪｉａｙａｎ１，ＪｉａｎｇＹｕ２，ＹａｎｇＭａｏｒｏｎｇ３，

ＺｈａｏＹｕｃｈｅｎ３，ＣａｉＫｕｉｑｉａｎｇ３，ＺｈｏｕＸｉａｎｌｉ３

（１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ０３０８０１；２ＴｈｅＡｎｉｍａｌＭｅｄｉｃａｔｉｏｎＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ

Ａｃａｄｅｎｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１；３ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｔｉｏｎＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎＦｉｅｌｄ，Ｊｉａｎｇｘｉａｎ０４３６００）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ３９ｃａｓｅｓｏｆｃｅｒｖｕｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｅｎｔｅｒｉｔｉｓｉｎＳｈａｎｘｉｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｔｈｅｍａｊｏｒｍｉｃｒｏｂｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｅｘａｍｉｎｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ，ｔｈｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈｓｅｒｕｍｒｅａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｉｔｉｓｔｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＰＣＲａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＳｏｔｈｅｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｗａｓｍａｄｅｔｈａｔｔｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｉｓｔｈｅｍａｊｏｒｐａｔｈｏｇｅｎｔｈａｔｃａｕｓｉｎｇｃｅｒｖｕｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｅｎｔｅｒｉｔｉｓｉｎＳｈａｎｘｉｐｒｏｖｉｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅｒｅｆｏｒｅｐｒｏｖｉｄｅｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｈａｎｘｉｃｅｒｖｕｓｆａｒｍ，ｔｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ

目前，中国鹿养殖量逐渐增加，主要集中在东北和华北地区，山西鹿的存栏量位居全国列，而且不断呈上升态势。但随着鹿业的大规模发展，全国各养鹿场出了一以膘情较好青年公多发的发病急、死亡快、死率、以肠道出血为主要特

４］

疾病，给养鹿业造成很大的损失［１～。通过流行病学调查证明，在中国饲养的鹿中出血性肠炎发病率居首位，对中国养鹿业胁较大的传染病之一［５，６］。对于本病的治疗，理论上讲可以一些抗生素磺胺类物等进行对症治，但由患畜发病一般都比较急，所以来及治已死亡，而病势较缓，即使用

基金项目：山西省攻关项目“鹿出血性炎多价疫

９］

药物治疗，效果也很不理想［７～，因此对于该病的治，免疫预防尤重要。而根据病原菌病

特性，选用当地分离的菌种制成鹿源灭活苗免疫，能更确实可靠的预防本流行。所以该试验对山西某些场发生鹿出血性肠炎急病死鹿病料进行采集，过对原体进行鉴定，为研制

１材料与方法１．１试验材料

１．１．１试验动物普通昆明系

购自山西医科大学试验动

第一作者简介：高文伟，女，山西翼城县人，讲师，硕，主要从事家畜寄生虫教学和研究工。通地址：１９７０年出生，０３０８０１

业大学动物科技学院，Ｔｅｌ：０３５４－６２８８５２７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｘｎｄｇａｏｗｅｉ＠１６３．。

通讯作者简介：任家琰，硕士生导师，教授，主要从事兽微生物及免疫学的教和研究工作。收稿

中国农学通报第２３第７

：／／．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．

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分别采自山西省阳泉１．１．２病

市北庄鹿场，燕龛鹿场，昔阳县大寨鹿场发生出血性肠炎病死鹿。在鹿死亡２４ｈ内采集病死鹿的肝、脾、肾、肠膜淋巴结、病小肠及其内容物或发病期间的血。同时调查死亡鹿的发病史，临床症，观察死后鹿脏器的变情况。在病料采过程中尽可能避免污染，将采集的病料于壶，迅送实验室检测或－２０℃低温保

１．１．３产气荚膜梭菌分型血清产气荚膜梭Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型血清，购自中国

菌株编号：１．１．４标准株购

型产气荚膜杆菌ＡＴＣＣ１３１２４。１．２

试验方法

晰双溶血环的产气荚膜梭菌典型菌落，接种于斜面，３７℃恒温养箱中厌氧培养２４ｈ，取出后置２５℃有氧环境１ｈ，染色、镜，观察血斜面上菌落特性。同时接种厌氧肉肝胃酶化汤，革兰３７℃厌氧培养１８ｈ，氏染色、镜检。④生化验：将已化的细菌培养物接种各种生化养基中，包括糖发酵试验（葡萄糖、糖、麦芽糖、水杨苷、甘露醇、棉子等），吲哚试

硝酸盐还原试验，明胶液化验，

验，石蕊牛乳发酵试验等，通过其３７℃氧培养２４ｈ，生长表现判

１．２．２血清型鉴定取分离纯化的典型菌落，接种培养，离心，然后取上清夜，分２份；第一份菌液按（表１）分别加样入５灭菌小试管中，同时置３７℃恒温箱中用４０ｍｉｎ，之后每管混液注射小白鼠，２只／，０．４ｍｌ／只，７２ｈ判定结

第二份菌液加１％胰酶液，３７℃活化３０ｍｉｎ，之后按上述方

根据产气荚膜梭菌毒素与定型血清中和试验结果定表（表２），判定分离到的产气荚

１．２．１细菌的分离纯化①显微镜检查：取病死鹿的肝脏和空肠、回肠、盲肠、结肠等内容物粘膜抹片，革兰氏染色后，在显微镜下察。②细菌溶血性检查：分别产气荚膜菌疑似落接种于血板，３７℃培养观察血平板上是否产荚膜

分别从血平板上挑取有清β双溶血

表１

产气荚膜梭菌毒素中和试

１

２－０．２－－－０．６０．８

３－－０．２－０．２－０．６０．８

４－－－－－０．６０．８

５－－－－０．２０．６０．８

Ｂ

产气荚膜梭菌

０．２－－－－０．６０．８

ＣＤＥ

生理盐水菌液上清液

总量

表２产气荚膜梭菌毒素中

注射后小白鼠反应

Ｂ型抗毒素＋样品滤液Ｃ型抗毒素＋样品滤Ｄ型抗毒素＋样品滤液Ｅ型抗毒

结果判定

＋＋－－Ｃ型

＋＋＋－Ｄ型

＋－－－Ｂ型

－－－＋Ｅ型

＋＋＋＋Ａ型

注：“表示小白鼠存活；“表示小

１．２．３α毒素基因的ＰＣＲ检

将所分离到的产气荚膜梭菌（Ｊ５）以及Ａ型、Ｂ产气荚膜梭菌准菌株分别接种到肉

洗涤后３７℃培养７～８ｈ，４℃，５０００ｒｐｍ离心收集体，提取ＤＮＡ，将其溶于ＴＥ缓冲液中，

，应用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件（Ｇｅｎｂａｎｄ）α毒素基

设计引物：

Ｐ１：５＇－ＣＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＡ－３＇，Ｐ２：

在上游引物５＇－ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡ－３＇，

中引入ＮｃｏＩ酶切位点，下游引中引入ＸｈｏＩ酶切位点，由宝生物大连有限公司合成。模板经９４℃变性１ｍｉｎ，４５℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，经３５个循环后脂糖凝胶泳检测。ＰＣＲ产物克隆载体ｐＥＴ２８ａ（＋）中进行序列（宝生

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ＳＩＳ软件进行

２结果

２．１革兰氏

肠道取样中均可检测到呈阳性，两端钝圆、短杆状、有荚膜、单个成双排列的大杆菌，

菌体中央或近端，与Ａ型气荚

相符（见图１，。２）２．２

菌落形态和培养特性

将疑似菌落接种于血平板后，可见到血平板上养出的菌落围呈双溶血环，内

外环为

图１Ａ型产气荚膜杆菌标

油镜）（革兰氏染色，１７５０×

图２Ｊ５株产气荚膜

油镜）（革兰氏染色，１７５０×

不完全溶血。置２５℃有氧境下

灰绿色或草绿色。在厌气肉肝汤中，可见内有大量体产生，液面充

通过以上试验可初步判定分到的

表３

鉴定项目结

果

动力

石蕊牛乳暴烈发酵

２．３生化试验

试验测定了纯化细菌的１４项生化指标，结果见表离到的菌株的理生化特性基本一致，

氏细菌鉴定手册》（第八版）关于产气荚膜梭菌生化图谱，确认这些分离株均为

分离菌株的生

吲哚

硝酸盐还原

硫化氢

明胶液化

－葡萄糖⊕

＋麦芽糖⊕

－乳糖⊕

＋甘露醇

水杨苷

＋棉子糖⊕

卵磷脂酶蔗⊕

糖

＋－－

⊕”表示产酸产气；“表示阳；“表

２．４血清型

结果显示，３９株中有２８

梭菌抗血清均可中和其毒素，小白健活，而对照组小白鼠１２ｈ内全部死亡，加胰酶之后，结果和胰酶前相同，故可判定该菌血清型为Ａ型。可见，从３９例鹿出血性肠炎料中分离到２８株Ａ产气荚膜梭菌，占８７．２％，故Ａ型产气荚膜梭是料采地鹿出血性肠炎主要致病

２．５ＰＣＲ

经过３５个循环的ＰＣＲ扩增，以Ａ型标准菌株为阳性对照，Ｂ型标准菌株作为阴性

见图Ｊ５中获得了与标准菌片段大

２．６序列分析结果

１１］

测序结果（见图４）与国

一致，进一步证实了上述ＰＣＲ产

α毒素基因。３

讨论

产气荚膜梭菌是１９９２年以来引起鹿“猝死症”的主要原菌之一，与俞乃盛［１２］和孙立明［１３］等报道的病由Ｃ型和Ｄ产气荚膜梭菌引起不同，本试从大量病死鹿中分离到的产气荚膜梭，经血清型鉴主要是Ａ型，所以山西鹿“猝死症”要由Ａ型产气荚膜梭菌所引起，该病的治和多价地方疫苗制提供了依

该试验还根据ＧｅｎＢａｎｄ中α毒素基因的核苷酸序列，设计合成了１对引物，并在两引物的５ˊ端均设计了与载体相适应酶切位点。这样，经ＰＣＲ增后的α素基ＤＮＡ片段，纯化ＮｃｏＩ和ＸｈｏＩ双酶后，很利地将该片段连到用同样

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图３ＰＣＲ扩增α毒

Ｍ：ＤＬ－２０００

１．Ａ型产气荚膜杆菌标准菌株α毒素基因２．Ｊ５产气荚膜杆菌α素基因３．Ｂ型产气膜

１ＴＧＧＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＣＴＣＡＴＧＣＴＡＴＧＡＴＴＧＴＡＡＣＴＣＡ

５０ＡＧＧＴＧＴＴＴＣＡＡＴＣＴＴＡＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＴＧＴＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＧ

１００ＴＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＴＡＡＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＡＡＴＴＡ１５０ＧＧＴＴＣＴＡＣＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＡＴＡＴＧＡＴＣＴＡＴＡＴＣＡＡＧＡ２００ＴＣＡＴＴＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＡＴＡＧＴＴ２５０ＧＧＴＡＴＴＴＡＧＣＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣＣＴＧＡＣＡＣＡＧＧＧＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡ３００ＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＴＡＧＣＴＡＧＡＴＡＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＡＴＡＡＡＣＡＡＧＣ３５０ＴＡＣＡＴＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＣＴＡＴＴＴＴＧＧＡＧＡＴＡＴＡＧＡＴＡＣＴＣ４００ＣＡＴＡＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＡＡＴＧＴＴＡＣＴＧＣＣＧＴＴＧＡＴＡＧＣＧＣＡＧＧＡＣＡＴＧＴＴＡＡＧ４５０ＴＴＴＧＡＧＡＣＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＣＡＧＴ５００ＡＧＧＴＴＧＣＡＡＡＡＣＴＡＡＴＧＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＴＡＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧ５５０ＡＴＴＴＴＡＡＴＧＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＣＡＧＧＧ６００ＡＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡＣＴＡＴＡＧＴＣＡＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＴＡＧＴＴＧＧＧＡＴ

图４

重组质粒ｐＥＴ２８ａ（＋）ＤＥ的序列测定结果

的ｐＥＴ２８ａ（＋）载体上，并且将重组体经ＮｃｏＩ和ＸｈｏＩ双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，α毒素基因成功地定向克隆到了载质ｐＥＴ２８ａ（＋），重组质粒构建成功，然后将重组质粒化到ＢＬ２１受体菌中培养，再提取纯化重组质ｐＥＴ２８ａ（＋）ＤＥ，对插重组质粒的α毒素基因段进行了苷酸序列分析，结果表明，克隆的α素基在组质粒中连接向位和阅读框架是正的，说该病原

为Ａ型产气荚膜梭菌，从而为研制α毒素因工程亚单位和产气荚膜杆菌素多价基因工程苗提供了

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赵进，王冰，王兴刚．羔羊痢疾的诊疗报告［Ｊ］．畜牧与

（责任编辑：

产气荚膜梭菌

产气荚膜梭菌

产气荚膜梭菌是厌氧芽孢梭菌属中引起人严重疾病的重

1．生物学和

产气荚膜梭菌为厌革兰阳性粗大芽孢杆菌，无鞭毛，运动，孢子卵圆，次端，在一般培养基上稀少。无外孢子壁，无附属丝：表面菌落直径2～5mm ，形，有时边缘扩展、起，呈淡灰黄色，半透明，表面有光泽，可20～50℃生长，最适生长温度45℃，所有菌株发酵葡萄糖、麦芽、乳糖及蔗，产酸产气；多数菌株还原硝酸盐亚硝酸盐，能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含硫盐及铁盐的脂中形成黑色菌落。产气荚梭菌

该菌能分泌强烈的毒素和侵袭性酶，具有强烈致病性侵袭力，在人和动物体可形成荚膜。产气荚膜梭菌在自然界的土壤、水和空气中广泛存在，人和动物道是重要的寄居场所，一般各类粪便每克含量可达102～109之多，但不经肠道感染宿主，只是污染外环境。由于气荚膜梭菌是正常道菌群的一分，人体肠道对其无天然异免疫力，有人群均为易感者，以婴儿和年老体弱病情重。经口食人其主要传染途径，也可由伤口染，秋季节

2．致病性和

产气荚膜梭菌的致病物质为外毒素、肠毒和荚膜。外毒素据性质和致病性不同，分为A 、B 、c 、D 、E 5个类型，其中A 型菌株是人类最重要的致病菌，环境中的分离株80％以上属A 型，型可致气性坏、食物毒和坏死性结肠炎；C 、D 型也是人类的病原菌，C 型的分株能引人的坏死性肠炎；其为兽类病原

摄食被A 型或某些C 型菌株污染的食物，引的食物中毒，潜伏为8～24h ，发病时下腹部剧烈疼痛、腹泻，但为自限性感染，一1～2d 内可自，老弱患者和营养不良儿童偶可致死。另一种食物中毒的表现是坏死性肠炎，由C 型菌β毒素引起，潜伏期不到24h ，起病急，有烈腹痛、泻，肠黏膜出血性坏死，粪便带血，可发围循环竭、肠梗阻、腹膜炎等，死率

3．食品安全危害

产气荚膜梭菌在污、土壤、垃圾、人和动物的粪便以食品中均可检出，土壤的检出率达100％。被污染的食物主要是肉类和鱼贝类等蛋白质性食品，存较久或加热不足使菌大量繁殖，形成芽孢时产生大量的肠毒素，引起食源性疾病。多食肉而卫生条件差的城市和集食堂中易造成产气膜梭菌的扩传播，从而导致食物中毒流行。2009年4月21日河南省安阳县某焦化职工堂发隔夜熟鸡被产气荚膜梭菌污染，造成32人物中毒

产气荚膜芽孢梭菌

产气荚膜梭菌

形态：

本菌菌体两端钝圆，直杆状1-2×2-10μm，革兰氏阳性，卵圆形芽胞位于菌中央或近端，不比菌体明显膨大，但有些菌株在一般的培养条下很难成芽胞，无鞭毛，在和动活体组织内或在含血培养内生长时有可能形成荚

特征：

为梭状芽胞梭菌类属，是厌氧、无动力、能产生芽胞的革兰氏阳性粗大梭菌，单独或成双排列，两段钝圆，芽孢，卵圆形，位次端，在机体内可形成荚膜。鞭毛不能运动。产气荚膜梭菌易于成芽胞，芽的热抵抗很强。除了具有成芽胞耐热等特点之外，生化性状，素酶的异性等，同其它魏梭菌是一致

产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌，是引起源性胃肠炎最常见的病原之一。可引起典型的食物中毒、爆。由产气荚膜梭引起的疾病为魏梭菌中毒。患者临床特征是剧烈腹和腹泻，并可引起厌氧性蜂窝织炎、泌尿系感染食物中毒。在食品该菌数必须达到高时（1.0×107或更多），才能在道中生产毒素，病程通常在24小时，但某些体的不显著症可能会持续1至2周，报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。 产气荚膜梭菌广泛分布于环中，经常在人和许多家养及野生动物的肠中发现该细菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中，从牛肉、猪肉、羊、、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁分的产气荚膜梭菌，引起食物毒的食品大是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染引起中毒，原因是因为食品热不彻底，使芽胞在食品中大量繁殖所致，此外少熟食，由于加温不够或后污染而缓慢的冷却程中，细繁殖体量繁殖并形成胞产生毒素，其食品并不一定在色味上发现明显的化，人们误食了这样的熟或汤菜，就有可发

存在于人粪及温血动物的粪便内，可作粪便污染水体和土壤的指示菌。此菌具有芽胞，污染水体后存活时间较，对氯等消毒剂较强的抵抗力。如水体内未出粪大肠菌群和粪链球菌而仅检出此，说明该水以往曾过粪便污染。产荚膜梭菌为判断土壤是否被粪便污染及染度的示菌。通常用产气膜梭菌值表

当产品达到合适温度时，那些未被杀死的芽胞，由于蒸煮而使其可发芽。蒸煮后需要经过快速一致的冷却。事实上在所有暴发的病，气荚膜梭菌中的主要原因是没有经过恰当冷却事先好的食品，特别当做好的食品量又是很大，适当的热处理（60℃以）充分的再加热，冷食品（低中心温度为24℃）也是必要的控制施，培训食加工人员，仍是控制措的一个关键方

培养特性： 不严格的厌氧，普通营养琼脂上可生长，若加葡萄糖、血液则生长更。适宜生长温度37℃-47℃，生和繁殖速度极快，在适条

生化特性：发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及糖，产酸产气，化明胶，还原硝酸为亚硝酸盐，能将亚硫酸

毒素与分型

毒素：产气荚膜酸菌能产生外毒素和肠毒素。外毒素：致死毒素。坏死毒素和溶血素，毒性不强不耐热。还有透明质酶等酶类。肠毒素：不热，60℃经10min即可坏。耐酸，对碱有抵抗性，蛋酶等蛋白分解酶比较稳

产气荚膜梭菌检验培养基——改良SPS的研究

产气荚膜梭菌检验培养基——改良SPS的

研究

中国卫生检验杂志2002年6月第12卷第3期

ChineseJotmudofHealthlaboratoryTeetmology2002.June.12.No.3

[文章编号]1004--8685(2002)03—0339__1Dl 产荚膜梭菌检验培养基——

姚积源,居建华,顾伟忠

(上海市疾病预防控制中心培养基室,海201204) [中图分号]Q93—335[

产气荚膜梭菌污染了富含蛋白的食品后,能引起食物 中毒.有关文献报道,所引起的食中毒是继沙菌,金黄 色葡萄球菌之,列为第三位'5J.80年代初,我也有报 导'2J.我国的国家准(食品卫生生物检验方法)已明确 将该菌列入品致菌的检范围,所规定使用的计数培养 为亚硫酸盐一多粘菌素B一磺胺嘧啶琼脂(以下简称SPS). 我们在研商品化的脱水培养基时发现,国产培养基原料, 按国际SPS配方,所配制的培养基果不理想(经24h厌氧环 境养后细菌集落无黑色产).按国食品卫生检验方法 规定,产气膜梭菌在SPS培养上经24h厌氧环境培养后应 形成色菌落,然后取黑色菌落做确试验加以实.为 解这个问题,们参照了国外培养基厂商的配方,对SPS进 行改良,现将究结果报告如

l材料与方法

1.1菌种产气荚膜梭菌,菌号为64701,中医学细菌保藏

1.2厌氧培养装置GENbox厌氧发生盒厌氧发生指条, 法国生物梅

1.3培养基

1.3.1SPS配方按国

1.3.2改良SPS配方

蛋白胨10g;酵母

牛肉膏粉5g;柠檬

亚硫酸钠lg;琼脂

蒸馏水100Oral.

,调pH至7.0,l2l?高压灭菌15min,冷至50~C,按比例加 入以

A溶液:0.12%多粘菌素B硫酸盐水溶液10ml; B溶液:1.2%磺胺嘧啶水溶

1.4试验方法

1.4.1将标准菌株64701接种至疱肉培养基反复传培养. 然后分离血平,置厌氧环境培养,直至现产气荚膜梭明 显的菌落特征:菌

1.4.2取增菌培养后的疱肉培养基加一定量的生理盐水后,与麦氏比浊,然后再用生理盐水作倍稀释,按菌落计数要 求,将落数控制在30—300CFUml.取lml经稀

【方法改进】

入平皿,分别倾注SPS与改良SPS培养摇匀后放入厌环境 培养24h

2结果

产气荚膜梭菌在两种计数培养基上的特征表1. 表1产气荚膜梭菌在两

基上的菌落特征比较(24h)

由表l可看出,SPS培养基在24h厌氧培养后无黑色落 出现,而改良SPS培养基上可见明带有色的菌落.有别 性,可按国标食检

3讨论

产气荚膜梭菌与大多数梭状胞杆菌一样都具有还原亚 硫酸盐为硫醚的能力,硫醚再和橼酸铁或铁反应而使菌 落呈黑色.气荚膜梭菌外,其它的梭状芽孢杆菌被磺 胺嘧啶多粘菌素B所制_4J.改SPS配方与配方相比 主要区别于:1.增加亚硫酸钠的含量(1g/1000m1),使细菌 能还原底物的量提高;2.用枸橼酸铁铵替代枸橼酸,同样增 至lg/1000ml.我们在试验中发现如果在培养基中分别加入同 样的枸椽酸铁铵和枸橼酸铁,从菌产生明显的黑色菌落 方面作较,前者效果明显优于后者,我推测可能是枸橼酸 铁铵比枸橼酸铁更容易游离出铁离子;3.添加了牛肉膏粉,更 加了细菌需的营成分.通过以上验,我们认为改良 SPS培养基更适于食品产气荚膜梭计数. 参考

[1]TheOxoidManual6Edition,1990.

卫生防疫细菌检验[M].新华出版,1989. [2]

[3]GB4789食品生检验

[4]陈天寿主编.微生物培养基的制造与用[M].

15jManualofClinicatMicrobiology4Edition,WashingtonD.C.,1985.

(收稿日期:2001—05—05)

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