Enzyme solution
1.5 % cellulase RS，如果原生质体质量差，可以用R10代替
1% cellulysin (Yakult Honsha, Tokyo, Japan)
0.1% pectolyase Y-23
10 mM KCl
2 mM MgCl2
2 mM MES, pH 5.6 with tris
Heat the enzyme solution at 55℃ for 10 min (to inactivate proteases and enhance enzyme solubility) and cool it to room temperature before adding 10 mM CaCl2 5 mM; 0.1% BSA (Sigma A-6793)
0.33 M mannitol(sorbitol) to adjust π=290-300
The enzyme solution is light brown but clear (passed through a 0.45 μm filter).
Holding solution
5 mM KCl
2 mM CaCl2
1 mM MgCl2
10 mM Suc
10 mM Glc
2 mM MES (pH 5.7 with tris)
π=290-300 with mannitol or sorbitol
1. 提原生质体
a) 约50粒种子播种于10*10 cm的方形培养上，4度处理两天后，移入光照培养箱，22度，16小时光照。7-14天得苗子用于提根原生质体。 b) 将根切成0.5-1.0 mm的碎片，
c) 在水平摇床上，60rpm，28度酶解30-50分钟，不要太长。 d) 30 um尼龙膜过滤，用保存冲洗，
e) 200g，5分钟，收集原生质体；洗去上清，保
f) 加入8-10 ml存液稀释原生质体，吸取0.5 ml，挑选直径15-25 uM原生
g) 提取的原生质体可以在冰上保存24小时
2. 封接
a) 封接液
10 or 20 mM CaCl2
2 mM MES, pH=5.7 with tris
π=290-300 with mannitol or sorbitol
b) 封接完成后，换
3. 内液：
25 mM Na-gluconate
5 mM NaCl
10 mM EGTA
5 mM HEPES, pH=7.2 with NaOH
4. Holding=-70—100 mV
拟南芥叶肉原生质体分离条件的优化
282植物生理学通讯 第45卷 第3期，2009年3月
拟南芥叶肉原生质体分离条件
孙琳琳, 佟少明, 侯
辽宁师范大学生命科学学院, 辽宁大连116029
Conditions Optimization of Arabidopsis Mesophyll Protoplast Isolation
SUN Lin-Lin, TONG Shao-Ming, HOU He-Sheng*
College of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian, Liaoning 116029, China
提要: 以野生拟南芥的第5~8片叶子为材料, 在酶解液浓度和酶解时间相的条件下, 探讨不同苗龄、取材部位、离心条件对原生质体得率和质量影响。结果表明: 室内土培3~4周的拟南芥, 取中部叶片, 以离心为40~60×g , 升速档为1得到的原生质体得和质量最佳。关键: 拟芥; 原生
拟南原生体不仅遗背景清楚(Davey等2005), 且导入外源基因后, 其表达具有较好的同步性, 因而常作研外源的大分子物质, 如DNA 、RNA 和蛋白等(Sheen 2001; Walmsley和Arntzen 2003) 。但由于此种技对原生质体的分得率和量都有较高的求(Abel和Theologis 1994), 这就对拟南芥原生质体分技术提出了更高的要求。为本文从苗龄、取材位、离心条3个因素对离南原生质
横向切成0.5~1 mm的小, 置于盛有0.5 mol·L-1甘露醇等渗溶液的平皿中备。另一个培养皿, 入5 mL酶解液(15 mL 体系成分: 0.15 g纤素酶R10、1.09 g甘露醇、1 mL 4.5% MacerozymeR10、1 mL 0.3 mol·L-1 KCl、3 mL 0.1 mol·L-1MES 、7.45 mL灭菌水置于离心管中, 50 ℃水浴10 min, 冷却到室温, 再入1 mL 0.15 mol·L-1CaCl 2、50 μL β-巯乙醇、1.5 mL 1%牛清蛋白溶, 用前1 h配制。), 将浸泡于0.5 mol·L-1甘露醇溶液中的叶片小条移入中。用锡纸将培养包, 置23 ℃恒温摇床或恒温培养箱中, 酶解3 h后, 用200目的筛子(70 μm 尼龙膜) 去除大组织块, 取液。将过滤后的绿色混合物于10 mL离心中, 在3K15高低温离心机(国SIGMA 公司) , 4 ℃低温、升速档设1 (升速档有1~9档, 1档最低, 9档高) 、心力为60×g , 离心5 min。弃上清, 用4 mL冰冷的W5溶液(50 mL体系各成分用量: 0.92 g CaCl2、0.45 g NaCl、0.0185 gKCl 、0.045 g葡萄糖、0.015 g MES, pH值调整为5.6。) 轻柔洗涤管底的原生质体。升速档为1、心
溶液悬浮沉淀。观察计
材料与方法
取野生拟南芥(Arabidopsis thaliana) 种子于1.5 mL EP管中, 用10%次氯酸钠消毒10 min, 无菌水冲洗6次后, 入适量的0.1%琼脂糖使之悬浮, 用200 μL 移液枪点播在灭菌的MS 固体培基(1%蔗糖、0.8%琼脂, pH 5.8)上。置于4 ℃冰箱内处理3 d, 后转入光照养(温度为23 ℃, 光照强50~75 μmol·m-2·s-1, 每天照16 h, 黑暗8 h,相对湿度60%~70%) (Yoo2007) 。当长出4片叶子时, 将小苗移栽到营养土和蛭按体积比1:1合的培养介质, 塑保鲜膜覆
原质体的分主要参照Yoo 等(2007)文中的方法, 做了适当修改。选生长3~4周的拟南芥, 取其完全展开的叶片, 长度为1.5~2.5 cm。实验分别取叶片前端、中及末端的5~7 mm位, 各实验用的叶片为1 g。白上
收稿资助*
2008-09-20修定 2008-12-15
国家自然科学基金(30671439) 。
通讯作者(E-mail: hesheng_hou@126.com; Tel: 0411-84259112) 。
植物生理学通讯 第45卷 第3期，2009年3
结果与讨论
1 叶片取材部位对原生质体得率
从表1可见, 叶片中部所分离的生质体得率最高。其原因可能是叶片中间部位伸展最好, 边缘部位角质较厚, 分离
表1 不同叶片部位获得的原生质
原生质体得率/个·mL-1
组数
前部叶
第1组第2组第3组第4组
2.125×1052.000×1051.625×1052.125×1051.969×105
中部叶3.375×1053.250×1053.000×1053.625×1053.313×105
后部叶2.375×1052.125×1051.875×1052.000×1052.094×105
2 苗龄对原生质体得率
图1果显示: 生3~4周的拟南芥分离得到的原生质体个体体积较大、数量多(图1-a), 而生超过5周的拟南芥分离得到的原生质体个体体积较小、不饱、数也很少(图1-6), 产量差异非常明显。分析其原因可能是由于超过4周龄的南芥开由营养生长向生殖生长, 5龄的拟芥抽薹象已经极其普遍, 以致叶营养供给不充足, 含量降低, 细胞化加快, 胞膜通能力增,
3 离心升速档对原生质体质量
图1显示: 升速档为5时分离得到的生质体破损严重(图1-c); 而升速档设为1时原生质体破损较少(图1-d), 需再做一步的纯处
图1 不同苗龄和升速档对原生质体分离
a: 生长25 d拟南芥的第5~8片叶的中部分离得到的原生质体(×100); b: 生长38 d拟南芥的第5~8片叶的中部分离得到原生质体(×100); c: 以生长28 d拟南芥的第5~8片叶的中部材料, 升速档设为5时分离得到原生体(×400); d: 以生长28 d拟南芥的第5~8片的中部为材料, 升速为1时分得到生质
。
接用于下一步的实验。从表2的结果来看,
表2 升速档对原生质体得率
升速档51
碎片较多极少
原生质体得率/个·mL-1
1.250×10
5
得率也明显优于前
4 不同苗龄来源的原生质体的形
如2所示, 生长超过5周的拟南芥分离得到的原生质体为球形, 叶绿体分散在原生质体边缘, 中央液泡大而清澈, 细胞质稀薄(图2-a) 。而生长期为3~4周的拟南芥分离得到的生质体, 呈饱满球形, 淡绿色, 胞质稠密, 并有颗状含
3.625×105
284植物生理学通讯 第45卷 第3期，2009年3月
图2 不同苗龄的叶肉分离原生质体的形
a: 生长38 d拟南芥第5~8片叶的中部分离得到的原生质体(×400)和单个细胞; b: 生长28 d拟南芥第5~8片叶的中部分离得到的原生质体(×400)和单个胞; c: 生长28 d拟芥5~8片叶的中部分得到的原生质体(×400)和单个胞示壁不全
多清晰, 且均匀的分布在原生质体中, 中央液泡清澈, 说明周围被原生质包围, 生理活性较高(图2-b) 。图2-c 显示的是去壁不完全的绿体, 其形态不规则圆形, 但其生理态与
参考文献
Abel S, Theologis A (1994). Transient transformation of Arabidopsis
leaf protoplasts: a versatile experimental system to studygene expression. Plant J, 5 (3): 421~427
Davey MR, Anthony R, Powera JB (2005). Plant protoplasts:
status and biotechnological perspectives. Biotechnol Adv,23: 131~171
Sheen J (2001). Signal transduction in maize and Arabidopsis
mesophyll protoplasts. Plant Physiol, 127: 1466~1475Walmsley AM, Arntzen CJ (2003). Plant cell factories and mu-cosal vaccines. Curr Opin Biotechnol, 14: 145~150Yoo SD, Cho YH, Sheen J (2007). Arabidopsis mesophyll
protoplasts: a versatile cell system for transient gene ex-
pression analysis. Nature, 2 (7): 1565~1572
拟南芥原生质体转化
2.2.7 拟南芥原生质
制备酶解液10 ml
1．取幼嫩拟南芥叶片，使用新的单刀片将叶片切为0.5 mm-1 mm大小。 （用胶带把下表皮沾掉，效更好。放一小培
2．材料侵入10 ml酶解液中，暗培养3 h-4 h，至原生质体完从片上
3．酶解结束后轻轻晃动溶液，镜检酶解
4．使用200目不锈钢网筛过滤原生质体至新离心管中10ml 。（冰上）
5．100×g ，4℃，离心2 min，收集原
6．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，100×g 离
生质体，（重复三次）。（重悬时，先加入少些W5轻轻悬起原生质体，随再轻加
7．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，冰
8．100×g 离心2 min，收集原生质体，重悬原生质体于1/10体积MMg 中。（看细
9．取少量重悬原生质体镜检，其余用于转化或4℃存一周
2.2.8 原生质体
1．在2 ml离心管中一次加入10 μl 质DNA (10-20 μl ，大小在5 Kb之内) ，100 μl 原生质体，充分匀后加入110 μl PEG4000
2．上述混合物室温放置10-30 min。
3．反应结束后加入440 μl W5液体培养基，充
4．100×g 离心2 min，收集原生质体，移
5．加入500 μl W5溶液培养基，100×g 离心2 min，收集生质
可以重复两次）。
6．重悬原生质体于1 ml W5液体培养基中，在细胞培养板中，24℃
7．取黑暗培养18 h后的原生质体，加入荧光素底物，使用CCD 照相
2. 酶解液10ml
在一个10ml 试管中分别加入下
Cellulase R10 0.15 g
Macerozyme R10 0.04 g
200mM MES pH5.7 1 ml
200mM KCl 1 ml
D- Mannitol 0.728 g
1 M CaCl2 100 μl
加ddH 2O 至 10 ml（0.45um 过滤）
Cellulase R10 , Macerozyme R10 :Yakault of Japan 都是经科宏达买 能买到sigma 最了，其他品
3. W5培养基 50 ml
在一个100 ml三角瓶中分别加入下
2M NaCl 3.85 ml
200mM KCl 1.25 ml
200mM MES 0.5 ml
1M CaCl 2 6.25 ml
加ddH 2O 至 50 ml
4. MMg培养基 10 ml
在一个50 ml三角瓶中分别加入下
D-Mannitol 0.728 g
150mM MgCl 2 1 ml
200mM MES pH5.7 200 μl
加ddH 2O 至 10 ml
5. PEG/Ca2+溶液
在一个10 ml离心管中分别加入下
PEG4000 4 g
D-Mannitol 0.364 g
1M CaCl 2 1 ml 加ddH 2O 至 10 ml
拟南芥干旱突变体的筛选及其保卫细胞原生质体的分离
河南大学
硕士学位论文
拟南芥干旱突变体的筛选及其保卫细胞原生质体的分
申请学位级别:硕士
专业:细胞生物学
指导教师:宋纯鹏
20070501
河南大学2007届硕士毕
中文摘要
植物生长发过程中往往会遭遇到各种各样的胁迫。抗旱的分子生物和遗 传学知识及其所涉及到的分子机制。特别是对作物抗旱主效基因的的表达调控及上 游的信号传递知之甚少。而突变体作为剖析杂物学过程强有力的工,已被广 泛于植物发、代径及胞号
本实首先是对利用远外成像技术筛选拟南芥突变体方法的可行性进行多方 面的试验,优化筛选条件、确定筛选所幼苗的长时间、种植密度。然后用O.4%的乙酰甲基磺酸(EMS)诱变南芥(Arabidopsis thaliana)野生型。以8,10的 干旱进行迫处理南芥,用远红成像技术检测突变体野生型竹温度的小 差异,对M2代幼苗进行了规模的筛选。当植物叶片温与野生型即正常株的叶 片度有明显差,约差可
我以利用远外成像技术筛选出来的潜在干旱不敏感突变体do/21及其相应的 野生型c24为材料。为进一步用膜片钳研究其保卫细胞电生理学上的差异,我们针对膜 片钳技术的点摸索出了一套突变和野生型拟南的种植及卫原生体
关键词:干旱,突变体,远红外成像技术,保
拟南芥干旱突变体的筛选及其保卫细胞原生质
Abstract
Plants often encouat many kinds of environmental stresses.Knowledge about molecular mechanism of drought-resistant and its genetics,especially to expressions of main gene of drought—resistant and controls of upstream signal transduction.Mutant,a powerful tool of analyzing genetic process,has already been extensively used for research in plant growth,metabolism and signal transduetion.
Firstly We maked sure method of isolating Arabidopsisis mutant by thermal imagings in many ways on trial,optimize conditions for isolation,and confirm the good period of seedlings and fine density for isolation.Secondly We obtain an M2population derived from O.4%ethyl?methanesulfonate(EMS)一mutagenized wild type Arabidopsis thaliana.With the tiny difference of temperature leaf between mutant and wild type for index sign,We isolate M2seedlings by 8-10days drought—stress treatment by infrared thermography in a large scale.A great deal of doi and dos Arabidopsis mutant were isolated(the difference of leaf temperature between candidate mutant and wild type is very obvious.about 0.6-1.2℃1.
In our experiments.we use,drought insensitive mutants doi2i which was selected by far—red imaging methods and their corresponding wild type C24as materials.Based On the traits of patch clamp,we fumbled a successful method for planting mutant and wildtype materials and a successful method for guard cell protoplast preparation,
Key words:Arabidopsis thaliana,drought, mutant,infrared thermography,guard cell
河南大学2007届硕士毕
英文缩写表
Abbreviations
英文全称 英文缩写 中文名称 Ethyl methanesulfonate
髓S 乙酰甲基磺
III
美于学位论文独立完成和内容创新
本人河南大提出硕士学位串请。本人郑重声明:所呈交酌擎住论文是 本人在导师的指导下独立完成的,对所研究舌勺瀑题有新的见解。据我所知,除 史中特别加暇说明、标注和致谢的地方外,论支中不包括其人已发表或撰 写过的究成果,也不包其他人为得任何育、研机的
段保存、汇编学位论文(甄质文奉争电子支
(涉及保密肉各的学位论文毒解毒后适用车援
学位获得者:学住论天作者)签名
兰,t/?乳i飞毫
擎位论五指导数师荽名;——
:0口7卑
河南大学2007届硕士毕
1.前言
1.1干旱
干旱迫影响物生长发,造成作物严重减产fI】。全球干旱、半干早区约占土地总面 积的36%,占耕地面积的43%。我的干旱、半干旱地区主要分布在华北、西北,内蒙古和青 藏高原等地区,其积约占国土地面积的二分之一。干旱对农作物造成的损失在所有的非生 物胁迫中首位,在有影响作物产量品质的素中仅次于病虫。阐明植物适应和忍耐干 旱作用的子机理,不仅是现代生命科学亟需解决的重大基科学问题,而且对提高我国干、 半干旱地区的植覆盖,实现农业作物产和质越式增
1.1.1干旱胁迫对植物
干旱条件下,植物生长受到制。早先认为干旱造成片生长受抑制主要是为膨压低 致,现在认为这可能与细胞壁的硬化(指不可逆伸展能力,即伸性)响应有关。在干旱条 件下胞壁的硬化有效地限制了植物绿叶面积的扩大,因而也显著地降低了植物的蒸腾失 水,使植物有可能长间存活。故Neumann认为细胞壁的这釉硬化现象是一种植物对水分亏缺 反的主动适应性前馈机制口】。另外,干旱条件下,植的光合作受到影响。干旱不光 合速率降,而且还会抑制光台作用的原初反应、电子传递和光合磷酸化以及碳同化个过程 例。同时,由予不到外界C02,光能转变的化学能不通过C02固定被爿j,叶片就会发生 光抑制现象,造叶绿体超微结构持续地害或可逆的坏14翔。再者,旱条件下,活性 氧对植物体进行氧化伤害。一旦植物受严重的干旱胁迫,活氧的产生和抗氧化问的 平衡体系就被破坏,从而损伤的结构和抑制酶的活性,导致细胞因受化胁迫而伤害【“。膜 系统先受到活性氧的袭击,使对胁迫敏感磷脂和脂肪先受损,导致生物膜中脂质的过化, 使膜上的孔隙变大,性增加,离子大量泄漏,引叶绿素一蛋质复合结合松弛,叶绿 素含量明显降低,严重时
1.1.2植物耐旱性的生物
植物干旱胁迫的初反应是通过保卫细胞来调整气孔开度,防止植物体内水分的散失并 维持一的光合作用I”。气孔反应有砖种方式:一种叫第一线御(first lines of defense)。 它是对空气湿度的接反应,又叫“预”系统。当空气湿下降,保细胞及其附近表皮 细胞直向大气蒸发失水,引气孔关闭.此叶子其它位并未生水分缺,
拟南芥干旱突蹙体的筛选及je保’P.-细l胞原生质
分亏缺在整片叶子发生,降低了对植物产生伤的可能性;另一种叫第二线防御(second lines of defense)。它是对叶子水已经发生变的反应。当叶子水降至某一阈值时, 引起气孔关闭,而气孔关闭反过来又减少了水分散失和有助于叶子水势恢复。子水势增加, 则气孔再次开放IS]。其次,植物体可以过渗透调节来适应干旱胁迫。耐早植物在干早条件下 著的积累溶质,使细胞维持一定的膨压。通常累的物质包括脯氨酸、甜菜碱、甘露糖醇、 海糖、糖f”。干旱条件下溶积累的学功能有两种解”01。一是认溶质本身作 为一种渗透荆进行渗透调节,从而增强植物保持水分的能力,稳定体内的渗透平衡;二是认为 累的质可能作为种溶剂代替水参与生化反应。再者,植物体内的抗氧化御系统也可发 挥一定的用。它是由一些能清活性氧酶系和抗氧化物质组成,如氧化(SOD)、过 氧化酶(POD)、过氧化氢酶(cAT)和抗坏血酸(ASA)等。它们协同作用共同抵抗干旱胁 诱导的氧化伤害,单一的抗氧化酶或氧化物足以防御这种氧化胁。物在干旱胁下的 一种主生理变化是内源ABA平的显著增加…J。另外,ABA被认为在干旱胁迫中起着调节细 反的用11“。Leonardi等研究了ABA、脱水和Man处理ABA应答基因(即可被ABA诱导 的因)的表达。果表明,脱水导ABA应答基冈表达在时间上延,并被ABA生物合抑 制剂所抑制,说明脱水诱导的基因需内源ABA的生物合成和积累,并过ABA调的反 应来实现¨”。最后,在端干旱的情况下,诱导出Lea白(即胎发生后期富集蛋)对 植物所起的保护作用更加重要¨”。目前测Lea蛋白可能有以下三的作用:(1)作为脱水 保护剂。由于Lea白在结构上富含不带电荷的亲水氨基酸,一方面,它们可能像脯氨酸一样, 通过与细胞内其它的蛋白发生作用,使们的结构保持稳定111’1≈;另一方面,它们可能给细胞 内的束缚水提供了一个合衬质,从而使细胞结构在脱水中致遭受更大的破坏。(2)作为一 种调节蛋白而参与植物渗透调解…J。(3)通过与核结合调节细内其它因的表达。有些 Lea蛋白含一些带正电荷的保守区,有人推测这些区域可以
1-1.2.1干旱条件下植物气孔运动的调
目前关干旱件下气孔运的调控主要有两种理论:一种是传统的水力学控理论,认 为干旱下植物气孔运动受叶片水分状况控制;另一是化学号控制理论,认为干旱下植物气 孔运动受起源于受早根且随水流传递气孔复体的化学信号控制。水力信号(Hydraulic signal) 控制论认为:当壤干旱时,根系势降低,地上部的水分供减少,根——叶水链系统 内的水力特改变如:水势差减小、水流减、叶水势降低,从引起植物的系统反应——气 关闭、蒸腾降低,Malane认为植物系统反的水学号由两
2
河南大学2007届硕{:毕
应部分(膨的作用),即力变化的快速传递;另一分为从受早根系而的水(细汁)的 物理流动(渗透势的作用),这是~个慢速反应过程,在植物御反应的调节中具有重要意义; 这两个部分共同控制着干旱下植物气孔的反应””。化信号(Chemical signal)控制理为:当植物受到土干旱时,根系作为土壤干早的感受器而感受到干旱,并随之产生种化学物质, 随水流转运到叶片上的气孔复合体关闭气雌…。现在已有大量实验实:干旱下系脱 水产生ABA并随水流传递到叶片控制了植物的气孔导度,如在大麦、玉米【191、小[”、大豆 1201、向日葵【21】、水f22】、蚕豆【”I、苹果124】等数种植物上以根为料的研究都证明土壤含 量降,根ABA含量大幅度加,并同伴随气孔导度的下降。但是,ABA并非唯一根 系信号。Hansen等在向日葵上的发:干旱下木质部汁液中的ABA和碱解ABA复合 物的浓度均增加,复水ⅢⅡ均减少,因此他认为干旱下木质部汁液中ABA复合物浓度的加 是根系ABA代谢的结果,ABA复合体在旱下的增加是气孔控制的额号口”。另外CTK 可能为负信号参ABA气孔运动的调节,pH也可能参与ABA对气
1.2膻A和}∞z与气孔运动
对保卫细胞过化氢产生和生理功人们很早已开始研究研究表明ABA可以 通过NADPH氧化酶产过氧氢,同时过氧化又能中介ABA调节气的关闭并在微摩 尔水平上激活质膜Ca2+阮2”。近来研究显示:有两种磷脂酶2c(phosphatase2C):ABll 和ABl2被定位ABA和过氧化氢传导链中口引(图1-1)。利用激光扫描共焦技术的 究结果表ABA可诱导蚕豆气孔保卫细胞H202的产生129,30l。K+通存于保卫 细胞质膜上,K+流出和溶质丧失会起膨压降。导致孔关闭。安勇等用膜片钳 全细胞录进一步研究证明H202之所以能促进气孔关闭,是因为它抑制了保 卫细胞质膜内K+通道。同时,Pei等用拟南芥研究现H202通过激活质膜ca2+通道而参与了ABA诱导气孔运动过程。气孔保卫具有非常灵敏的感受外界信 号变化的力,干旱条件下,植物地上部分未检测任何水分化时,植物气孔 已迅关闭。气孔保细胞作为研究植物信号转良好模式体系,其结构与皮细 胞不同,保卫细胞含有绿体可进行光反,产02,ATP和NADPH[31】等。虽然在 卫细胞中已经测到Rubisco活性,但其碳同的能力较弱,因而强光(或逆境)下 就有可能积累较多的活化能j而这些正是活氧产生的条件。Purohit等首先发现02一 可促进孔关闭是由于质膜流动性的改变[32】;外源低浓度H202(104mo|/L)理 引胞内游离ca”浓度的
3
拟南芥干旱突变体的筛选及je保p细胞愿生质
H202(>10一5mol/L);JI起的气孔关闭则没有影响。说明在高度H202情况下,不是通 过Ca2+信号系统,而是通过影响质膜氧化还原状态,或者是膜的生物物理状态促进气 孔的关闭;低浓度H202作下,可启动Ca2+信号统。02-可以高胞内游离Ca2+度调节孔
.囤1-1;过氧化氧和ABA在保甲细胞中的信号转导关系(自Steven et aL,2002)
1.3拟南芥及突
L 3.1模式植物拟南芥的生物
拟南芥十字花科植物,虽然它与蓝,花椰菜、根等经济作物同科,但是它没有 生产价值。从高海拔的带地区到斯湛的那维北部寒冷地带的许多地方都有分布,我国的 东北、华南及新等地都有发。它广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研, 已成为一种典型的“模式”植。被誉植物界的“蝇”。拟南有如下几个主要特征:I 形态个体小高度只有30厘米左右。2生长周期快,从播种到收获种籽般只需要8周右。 3种籽多每株代产生数千粒种。4形态征简单:5因组小,只有5对染色体。拟 南芥植这种特性,不仅宜于分子操(农杆菌的转化),而且于在实验室中进行生理 和传分析。冈而在植物分子生物学,遗传学,植病理学,次生代谢和发育生物学究方 面得到了非泛的应用。DNA组分析随选择基因克
4
河南大学2007届硕士毕
因组有常低重复序列,仅lO—14%的高度重复序列或回文重复序列,23--27%为中度 重复序列,50--55%为单拷贝序列;核因组的单贝基因组序列更高,其基因易于被诱变 并可用染色体步行(chromosomal walking)来克隆大功能的片段,分离重叠部分,研究基因 的功能。尽管拟芥的基因组有在高等植物遍存在的大DNA重复区,它们却包 含了植物发育、代、环境信号应和抗病等所有功能所需的基,拟南芥基因组全列 测出,为人们在分析植物基因能提供了一个强有力的具,同时也为鉴定其它植物 功基提供了
1.3.2突变体的获得途径
突变义为DNA一结构或遗传物质的遗传能力的改变,这种改变(不是由于 遗传分离和遗传重组所起)的最终结果为基因型的改变,形成突变体【3”。其比 标是野生型,即在自然界种群中占绝大多数,因而常被视为正常的基因型或个体。 突变分为自发突和人工诱变,二者有本质上差别,都是DNA损伤来不及修 或者是易错修复之后,制差错带来一系变化,导突变型的现。发突
随着分子传学技术的展,人工诱变获得突变的途径和方法得了前所未 的突破。主要分为两个方面即正向遗传学(forward genetics)和反向传学(reverse genetics)方法。正向遗传学的方法是通过选突变体而进隆相关基因,用研究 参与胁迫响应过程中的信号转导级联反应及代谢化的基因。其策略是从功能(表型) 一突体一基因,最后德到具有相能(如对盐感和耐盐)的基因。而反向遗传学 方法则是是根据目的基因和T-DNA或转座序列突变体库中找出相应的敲除突变 ,而进行研究相关功能。其策略是从基因一(突体)一功能,最后到未基 因功能。两种方法可用于全基因组中筛选与某个过程有关的基因,都可以证实 完全或分失去功能的表。而,正向遗传方法存在基因定位隆的问题,现在线 虫染色体1上300个基因已由突变体证实但还没得到克隆。定位克隆常费时费力。 而反向遗传方法的优点就基因序列已知,观察到的突变表型都与已知的序相 联系,因此为列数据与生物
通人工诱获得突变体,最早成功的发现是美国生物学家谬勒,他运用X射 线作为诱发突变的手段诱发果蝇突变。目前,诱变的方法136】主要有三种:化学诱变、 物理诱变和入突变。物理诱变包x一射线、T.射线、子、n.粒
拟南芥干旱突变体的筛选及je保1】.细胞原生质
线等。紫外线使用最广泛、最有的诱变剂,在无菌条件下,用紫灯照射处理即 可。化学诱荆按其对DNA作式分为三类:(1)碱基类似物,在DNA的复制 过程中,它能掺入到DNA分子,但由于碱基类似物只是在结构上同天然基相似, 其功能及性质不同,从而引起突变,常用碱基类似物有5.尿嘧啶(BU)、2-氨基嘌 呤(AP)。(2)烷化剂,它一个或几个稳定的烷,能与核酸碱基相结合, 改变了核酸中的核苷酸化学组成。从而引起DNA制碱基配的改变。这类诱变 剂有乙烯弧胺(RI)、硫酸乙酯(DES),亚硝甲基脲(NMU)、乙甲磺(EMS) 。在某个剂量下进行死诱变,EMS具有较高的诱变效应。(3)抗生素类,它能 破坏DNA子构,造成染色断,如重丝氨酸、丝裂霉素C等。对于反向遗 传学,其方主要分插入突变p 7】和沉默。插入突变是利用分子生物学的方法 一已知序列DNA插入基因组产生的突。插入突有两种方法:转座子插法 和农杆菌中T-DNA插入法。由于插DNA序列通常是已知的,因可以用探针将之 分离,但这种法的缺点在于,果转是拷贝的,就很难确定突变是哪种插入 引起的。因沉默则是利用RNA干涉技术,人工导入可形成dsRNA的外源基冈以特 异性的抑制目的基因表达,可能成为后基因组时代进行基因能分析的重要手。在 植物体内,主要借助于农杆菌Ti质的导,将能在植物体内形成dsRNA质粒的 有效基因沉默结构转入植内,通过对特基因达的制,获得功能缺失突变, 来研究目的基因在不同生命活
这些理的目都是诱导某种能引起植物的生殖细胞遗传变异的细胞突,并利用适当 的筛选方法选择出突变体。筛选出的变异是否可以稳定遗传,以及具有什么性质,必须进行 遗传和生化分析才能确,对突变体进行鉴定。对筛选到的变以什么方进行鉴取决 于变
1.3.3拟南芥突变体的分类
拟南菜具有积小,生周期短,典型的自交繁殖,基因组小等特点,使得筛 选省力,且许多基因是单拷贝的,易于开展遗传作,成遗传和生理生化研究的首 选材料‘”l。早在1987年,被位的拟南突变体己接近100种‘3”。包括从开花启动 到胚胎形成等不同阶的突变体。人为将这些突体的划分三类‘40】:第一类为形 态变异株,是由于那控制植形态发育的基因发生变异后形成的。如,当控制 拟南芥花器官育的基因AP3发生异(petella变异)141】,变异
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源转变为雄蕊,当另一个控制器官发育的因PI(pistillata变异)发生变异后, 变异株中的花瓣则被转变成了花萼。第二类是生化变异株,是由于基因组中编码种 酶的因发生了变异而导致植物体内缺少某种特定的酶活力。例如。当编码乙醇脱氢 酶ADH发生异后,在变株蛋白质抽液中就测不到该酶活力。第三类是生理的 或称为植物激素和调节物质的变异,这是由于些参与植物合成的基因或参与 激素或调节质信号接及传递的基发生异后导致的。如GA不敏感变异 【4”,些变异株GAI(活性形式)量高于正常对照的80倍,表明这些基因 的变异不仅对外源的GA感,即使其内源的GA敏感性发生了改变,进一说明 这些基因在常情下很
筛选分析植物突变体研究植物基因功能和理清信号传导网络的一个有力手段。由于 这些突变体的变异位点的基参与了很重要的植物生理生化及发育过程,因此克隆这些基因, 研究这基因变异的分子基础和它们控制植物发育的机理,对于植物体的遗传学研究、发 育与代、利用有性状进行突育种等方面有重大指导义。值一提的,分离与鉴定 拟南芥新的变异工作仍在广泛的进行,并相当一部分工作是用一定的生化或环 件向的
1.3.4筛选抗性突变体的研
抗性突体的获既是进行变异论研究的材料,又与农业生产有密切关系。筛选抗 性变体是研究植物生长发育,代谢调控和阐明植物体适应逆境调控机制好途径。些年 来抗性突变体筛选已经取得了可喜的成就。如已选育出玉米耐盐突变体咿】、抗赖氨酸苏氨 酸和氨乙基半胱氨酸抗性突变体M4”、对盐超敏感突变体sos]一,,sos2-I和aos3.j等的获得 Ⅲ】。抗性突体类型大可分为抗基酸及其类似物、抗病、抗除剂、抗杀菌剂、耐盐、 寒、耐早、抗金属离、抗抗生素以及抗核酸基类似物等。大量抗性突变体的获得大 的推动细胞反应研究发展。干旱敏不敏感突变体筛选对植逆境生理
1.4远红外成像
1.4.1远红外成像技
红外成像术是利用物体自身各部分对红外辐射的差异把红外辐射图像转换为可视图 像的技术。红外线是一种电磁波,又称热线。红外辐射是自界存在的种
拟南芥干旱突变体的筛选及其保卫细胞原生质
电磁辐射,它是基于何物体在常规环境下都会产生自身的分子和原子无规则运动,并不 停地辐射出热红外能量。子和子的运动愈剧烈,辐射的能量愈大;反之,辐射的能量愈 。温度绝对零度以上的物体,都会因自身的分子运动而辐射出红外线。通过红外探器 将物体红热辐射功率信号转成电信号后,经成像装的放大处输出号就可以完全 一一对应地模拟扫物体表面温度的空间分布,形成视频信号传至示屏或监上,得到 与体面热
1.4.2远红外成像技术在生命科学中
军的应用红外成像技术发展的主要动力。但民用求的不断增长也为红外成像技术 的发展注入了新的活力。近些年来,红外成像技术在民用方面的要作用日益凸显,尤其在 命科学中的应发
1.4.2.1远红外成像技术在植物学研究
植物天生的固定性定了植物往往会通过调节自身体内的信号网络去适应不 断变化的环境刺激,在植物叶片表面的气孔行为会突出表现出来.植物体叶片上 表皮分布着很多的气孔,它的张开和闭合会调节叶片表面水分的蒸发,而水分的丧 会走叶片表面热量进而在温度上现出来。运用分辨率的红外成像仪对植物 气孔行为进行检测可我们及早的发植物生理应,尤其在逆胁迫
早在160年前就有人对物株冠和叶片温度进研究,大约在40年前人们对植 物进行热图记录研究,但是由于当时技术的限制仅仅是对物进行温度上的粗略检 测,进行的研究都还处于探索性阶段。自1980早期以来,远红外成像技术首先被 大量的应用于业和环境检测,们主要是通过空中摄像技术来对所探测的目标进行 宽围的检测和分析。直到敏感摄像技术得到了发,才开始对植物进行单株) 平上的研究.其具有的多功能性,准确性和较高的分辨率(可达0.Ol oC)使得对单株 物叶和幼苗的实时观测成为了可能。也此在植物研究中的掀起了热潮。如 在重力作下,对植物叶片表面与围环之间热换的影响的研【4”、过对植 物如拟南芥和大麦突变体的筛[48,49,50】、对植物气孔导究[st】、植物在胁迫环 境的研究[52,531、在寒冷环中植物体内的冰核形成过程的观测研究154,551、谷作物 由于病和阵风而造成的旗叶温度差异测量l”11”】、蒸腾速率研究‘”】、单胞 的研【”j等。研究成果十
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图l一2:用远红外成像技从大量的野生型(Landsbcrg)中区分出拟南芥abil-J
两株abiI.,突变体和野生型混种一起照片(正常条件下生长的10天的幼苗给予3天的干旱胁迫处理)。 右图:与左相对应的热
{|~
雹1.3;野生型和abH.,突变体
像和叶片的气孔导度
,
A:红外像 B:野生型(Lcr)、abil.,,曲i2.1和abal 突变体气孔导度差异 (自Assrn枷n etaL 2000) 1.5ABA诱导气关
ABA气孔动的调节已得到了公认,目前,保卫细胞中ABA信号转途径己大致勾 画出I删即;ABA与膜受体结合,通过G白激活脂酶c,从而导致lP,的释放。IP3一方面促 使Ca2+从胞ca2+库一液泡释放进入胞质。另一方面促使胞外ca2+通过阳离子通道进入胞。引 起内ca2+浓度高;另外,ABA可诱导胞碱化(pH值升高)。ca2+和pH升高可通调节蛋 白激酶/蛋白磷酸酶的活性激活外向。通道和阴离子通道,化内向K+通道,从导致细胞 压降低,诱导孔闭抑制气
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拟南芥干旱突变体的筛选及萁保卫细胞原生质
ABA'AB再㈣州
野柚强l埘ch舢lm 辄啦I—■呷e曲喀
图1-4保卫细胞ABA信号转导模式(Zhang
由于物化学分子生物技术的引入,膜片钳技术和激光共聚焦显微技术应用等, 保卫细胞ABA信号转导的研究已取得了重大展。但,由于整个信息传递途径错综复杂, 要想完全理解气孔保卫细胞刺与反应联全部过程,还有一些关键性的问题需要解决:如 不同的胁迫条件下如何应,各种使系统的作用,种信号体的鉴定以及新信号成分 的鉴定等。利模式材料南芥(其相关突变体),结合分子遗传学、细生物学及生物 物理学等相关术对上述问题进行研,可能为深识保卫细胞ABA信转导提
1.6论文的选题意义
干旱限制农业生产主要因素。开展作物抗早机制的研究对于解决我国水资源 短缺以及促进我国经济迅速发具有重大意义。从遗传学和分子生物学角度揭示作物 抗旱机则是提作物抗旱性的基本保障和通过基因工程培育高效抗旱作物的基础。 抗旱主效基因的隆与调是培育高效旱作物的关键。由于旱胁迫下号传和 基因表达及其调控非常复,对干旱敏感的基因和抗旱基因的突变分仍比较困 ,这就需在域进行
用0.4%的EMS诱变拟南芥野生型c2t。以8.10天的干旱进行胁迫处,用远红 外成像技术检测突变体和野生型叶面温度的微小差异,对M2代幼苗进行了大规模的 筛选。当植物叶片温与野生型即正常植株的叶片温度明显异,大约温差可达到 0.6.1.2℃,就被确定对干旱感和不感南芥
干敏感和敏感突变体的获得则为研究作物抗旱分子机制、克隆抗早主效基因 和阐明信号分子的转导机制提供直接的手段;为研究干旱、ABA、H202和气孔行为 间的信号传递网,揭示它们彼之间的时空关提良
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利用片钳技术对该变体及相应的野生型的保卫细胞在A-BA刺激下电生理方面 的差异作进一的研究,将有助于进~步完善干旱条件下植物细胞内的信转导网络。而 要实现这一研究必须先得到状态良好的保卫细胞原生质体,本试验在献提供原生质体 离方法的基础上以改进,摸索适合C。一及其突变体保卫胞原生质体分离方法,到状态 良好原生质体,高了用片钳录离
拟南芥干旱突变伟的筛选及萸保卫细胞原生质
2。突变体的筛选
2.1实验材料与
2.1.1实验材料
拟南芥野生型c24。
2.1.2实验仪器
远红热像仪(ThermaCAM@SC 3000Infrarecl Camera,Boston USA):波段8~9p m, 温度分辨率0.034C。空间分辨率lmrd。用该仪器系统所配IRwinReporl5.31热象图理程中 图像放大程序、面积分程序、温度频度分布方图程序进拟南芥面热象的计
2.2实验方法
2.2,1拟南芥种植
拟南种子经75%7,酵表面消毒30秒,移去乙醇。再加入0.1%升汞面消毒3分钟, 用无菌水冲洗3.5次后,种子点播予MS同体培养基(MS盐+3%蔗糖+0.7%琼脂,pH5.7)上, 4℃条件下春化2.4,放于培养闻(光,为16/￥h.度18~22。C,光照强
2.2.2诱变拟南芥野生
参照Wu等的法。取大约20.000粒种子用蒸馏水浸泡种子6-8个小,然后在含有 0.4%乙酰甲基磺酸、100mM KPOl4缓冲液中浸泡8小时,进行诱变。诱变的温度为宝温, 溶液的酸碱度(pH)为7.5。在诱变过程中给予轻微的震荡以免种子堆积在一起,同时也能 够使分散的种子在诱溶液中进行充分诱变,提诱变的几率。诱后_I{J双蒸水漂洗2-4小时,大需要漂20次左右以完全除遗留在种子上的诱剂EMS。漂洗后的诱变种子 直接嗣于播种或者放于纸上进行干理后贮藏保(注:变过枵
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以免被诱变剂的毒性伤
2.2.3用于筛选突变体植株
拟芥种子播丁=培养土(培养土是营养土和蛭石以l:3的体积比例混匀)中。株与株 周缘间距大约在1厘米左右(撒播较为稠密的植株可适当拔苗)。待种长到2.4真叶时(大 概需14.16天右)行
2.2.4热图(Thermal i.maging)处理
热图过用ThermaCAM@Sc 3000得到。空间分辨率’1.1mmd,像素320x 240pixels, 300C有小于0.030C的温度分辨率。垂直热图在商家标准的基础上生。因并不需要准 确的叶温故叶片的辐射率设为1.0。安装成像仪在垂直约距叶片40厘米的高度行观测, 同时连接好颜监视器以利于得到可视的株植物热。拍摄热图作为14-bitlMG的格 图存于PMCIA存储卡中.随后在计算机上通IRwinReport 5.31本的软
2.3实验结果
2.3.1拟南芥种子
经过O.4%EMS诱变的M,代拟南芥种子直点播于含有土壤的托盘中,经春化 后放于培养间进行培养。待种子(M2代)成熟后(8周左右),收获子放于干器 中干
图2-1:经0.4%EMS诱变野生型(C24)种子获
得的拟南芥M,代
2.3.2逆境胁迫下植物体叶温与正常叶温的对比及其
为验证远外成像技术筛选植物气孔突变体的可靠性。在干旱胁迫下生长 十天的拟南芥与未胁迫作对照幼苗相比,发现逆境胁迫确实能够导致叶面温度的升高 (2—2)。图中胁下蚕豆和拟芥叶温比正常高
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拟南芥干旱突变体的筛选及其保。l!细胞原生质
气的关闭,这可能是造成叶温改变的主要因素。有关研表明植物的气孔导度变化 与叶温的改变有关1“1,还有实验表明胁迫刺激如干旱会导致植株叶片气孔度发生 变化在热上有明显的现16”.这与本
A B
图2-2:胁迫条件下拟南芥叶与正常叶温的热圈对比及其分析上图为普通照片,下图为远红 外图片图A为胁处理图,
2.3.3正常情况下拟南芥幼苗之
用于证试验的拟南芥植密度及生长时间完全和用于筛选突变体的M2一样, 然后利用远红外成像仪进行叶面度记录发现正常情况下拟南芥幼苗之间热图表现 出一种比较稳定态势。株与株之间的叶温差异尽管存在但是相差很小大概在 (0.1.0.3℃)左右。(图2-3A、B、C)。明在正常情况下的拟芥幼苗叶基本 是一致的,若有突变叶温出现该很容易和野生型区分开,进而也说明运用红外 成技术筛选气孔有关的
A B C
圈2-3:正常情况下拟南芥苗之间热囝A、B、C均为野生型的远红外照片可以发现植株叶面 度基
2.3.4远红外成像技术筛选拟南芥气孔
采用远红成像仪对在胁迫下(干旱)生10天左右的M2拟南芥幼苗进行温度 差异筛选,干旱以胁迫天数和土壤含水量为标准,根部进行迫刺激。
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叶片面温度升高或降低筛选得到干旱和不敏感和敏感突变体,所不敏感就是突 变体对胁迫刺激产生的反应比野生型要不明显甚至就没有,这在气孔开关上表现在不 关闭气孔或关闭的慢,导致分继续从叶面蒸发最终现出叶温较低表型。反则 敏感温要
对于同一个盆中表上表现出温度与其他温度有明显差异的幼苗进行移出使 其分离作为突变体单独培养。从大约20,000粒M2代种子中初步筛选出了十几株侯选 突变体。把十几株侯选突变株播种繁殖得M3代,经观察全部是可育的。目前,已分 别得干旱敏和不敏感潜突变体12株和4株。这些突株分
A
B 圈2-‘;筛选的干旱敏感和小敏感突变体:A:对干旱不感的候
B:对干旱敏感的候选
拟南芥干旱突变体的筛选及j乓保卫细胞原生质
3.保卫细胞原生质体的分
3.1材料和方法
3.1.1实验材料的
实验材料:拟南芥野生型(CN生态型)及其相应的突
3.2实验方法
图3.1拟南芥野生型C“及其相应的突变体doi21
3.2.1拟南芥种植
3.2.1.1种子的处理 . 拟南芥种子经75%乙表面消毒30秒,移去乙醇,再加入0.1%升汞表面消毒5分钟,无 菌水冲洗3-5次后,种子点播蟠固体培养基(MS盐+3%蔗+0.6%琼
3.2.1.2幼苗的处理
根据Xi-Qing Wang,生长周左右的幼苗从培养皿转移到蛭石:营养士=2:1的土壤中继 续培养,生长条件为:/暗周8/16h,
根据Pei等,生长两周左右的幼苗从培养皿转移到蛭石:营养土=2:1土壤
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生长条件为:光黯周期16/8h,光照温
3.2.1.4.本实验采用
生长两周左右的幼苗从培养皿转到蛭石:营养土=3:1的土壤中继续培养,生长条件为:光/暗
另外种子播种于蛭石:营养=3:1的混合土壤中生长。生长条件为:光/暗周期8/16h,
3.2.2实验溶液
(1)基本介:5mmol/L Mes、0.5mmol/L CaCl2、0.5mmol/L MgCh、101.i mol/LKH2P04、 0.5mmol/L抗坏血酸,pH5.5(KOH),用甘露醇调
(2)酶液:1.3%纤维素酶RS、0.0075%果胶酶(Pectolyase Y-23)、0.25%牛血清蛋白、0.5 mmol/L抗坏血溶于基本
3。2.3保卫细胞原生质体
3.2.3.1方
取生长4.6周第轮伸展的拟南叶片,撕取片下表皮,用毛笔刷去表皮条上大部分 的叶肉细,在lO mL的基本介质漂洗后,用220izm的尼龙网收集表皮条,所得的表条 转入酶液中酶解,在26℃,60转,分的摇床上酶解约15~20分钟。酶解结束后,酶与表皮 条的混合转入离心管中,350rpm离心2分钟,然后用40llm尼龙网将混合液过滤(意在 除表皮条、积较大的叶肉和皮胞)。倒入积为10mL的离心中,加入基本介质使溶 液总体积不过8mL(以证充分离),在730-750rpm下离心10分钟,用本溶液再次洗 涤、离心2￣3次(转速前。每次离心弃去上清,用管将剩余的沉淀打匀),最后用2mL 的本质将沉淀的
3.2.3.2方
取生长4-6周的拟南芥叶片,转入含100m]冷蒸馏水的匀浆机中打制次,速度
拟南芥干旱突变体的筛选及其保卫细胞原生质
8,000—10,000rpm,时间分为1分,30秒,30秒,然后用2209m的尼龙网过滤,水冲洗后 再用10mL基本介质洗,所表皮条转酶
3.2.3.3方
依据Pei(】997),取生长4.6周的拟南芥叶片,转入含lOOml冷蒸馏的匀浆机中打制三 次,速度约为8,000—10,000rpm,时间为每次20秒.然后用2209m的尼龙网过滤,水洗后 再用10mL基本质漂,所表皮条转入酶液中,在22℃,60转/分摇床上酶解15~17小时。其他骤
3.2.3.4实验最终采
参照Pei等的方法,加以修改。取生长4-6周第三轮伸展拟南芥
3.3结果与分析
3.3.1材料培养的
方法培养材料缺是:植株根扎得不牢,生长不健壮,叶片较嫩,实验过程中保卫细胞 损伤,影响原生质体的质量;方法二的材料光照时间过长,导致植株营养期缩短,提早抽 苔,造成材料的浪废也不适宜作为膜片钳的实验料;本验吸取上方法的教训,将光时间 整为,暗周期8/16h,光强度100gmol?m-2.s~,延长材料营养期,高了料的
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另外,又将种子改为播种于花卉营土与蛭石比例为l:3的混合土壤中生长,苗生长得比较 壮实,保卫细胞状较好,验过程
3.3.2保卫细胞原生质体分离方法
关于表皮的制各,有实验表明,可以象蚕豆样撕取下表皮,但C:4与其突变体doi21叶片太小撕取表皮条难度太大,因此不用方法~而采匀浆机打的方法来获拟
由于液的配和拟南芥长状况及操作情况略有不同,游离细胞所需时间也可能不同。 一般经过显微观察确定酶解情况。方二是步酶解法,操作过程比较复杂,且第一步酶解效果 不大。方法三Pei(1997)采用的是15一17小时过夜酶解.其不便之处是时间间隔太长,不易 制酶解情况:另外22℃下过夜酶解易生细菌,影响酶解过程。以本实验用酶条件调整 为26℃,60转,分,问控制在的15'--20钟,既简化了实验过,又容易掌酶解时间,离 的生质体
3.30拟南芥保卫细胞原生质体
原生质体细胞膜状态膜片钳封接和记录过程有重要影响。本实验在有适量
豳3-2:拟芥保卫细胞原生质体酶解过程。^B,C,D,EF别为酶解o’5,10,15,20,25分钟时的拟南 芥保卫细胞;G为处于解离状态的拟南芥保卫细胞;H保卫细胞原生质的数量:I保卫细胞原质体与叶 肉胞原生质的比,l中尺
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拟南芥干旱突变体的筛选及其保卫细胞腺生质
白、抗血酸及当pH值和透压的条件下进行酶解,减少了酶解过程中对细胞的伤害。尼 龙网收集剑的表皮条(图3-2A)。通常在酶解开始15—20分钟后,生质体逐渐开始游离,当 有大量的原生质体出现时停止酶解(图3-21))。到的原生体纯度约为70%,其余为少量的 叶肉细胞和表皮细胞的原生质体。保卫细胞原生质体有圆滑外型、清晰的外膜和叶颗 粒(图3-2G),显微镜缀容易与叶肉细胞及表皮细胞原质体区分开(图3-2I)。选择直径 为4-5Pro的保卫细胞原质体进行膜片钳实验,证明保卫细状态稳定,封接成功率较, 特别是在加试剂处理时,封电流稳持续时间
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4.讨论
4.1远红外成像技术筛选拟南芥气孔突变体
叶片表皮气孔是植和环境进行气体水分交换的门,控制着光合与蒸腾 作用,因而直接影响植物的产量。气孔动对环境非常敏感,许环境因子(如盐浓 度、光照、温度和干旱等)的改变都会直接响气孔的开,所以气孔保卫细胞己被 作为良好的研究模式材料,用于研环境胁迫条件下的植物细胞信号转导制。保 卫细胞的气孔动是一个相复杂的生理活动,受许多内外因子的的影响。保卫细 胞能感受内外环境信号而调节其体积,控制气孔大小,主宰植物外界环境所进 行的水和体交换。作物片的开张程(常用气孔导度Stomatal conductance) 来表,是决定光合水分蒸腾强度的因素。Eastin和Sullivin认为水分的 胁迫引起光合产物的减少,首先是由气孔,而不是内部阻力。受到胁时植物会 发生一系化,叶片含水量减,水势降,孔关闭,气孔
一些与旱和过氧氢有关的突变体往与气孔的节有关,合成过程及调节 机制与气孔的生理行为有密切的关联,往往会造成气孔对水分的调节失衡。这造 成的一个典型表型就是致植物体叶表面能量的变化即温度出现震荡差异同时 伴随着叶片自身失水萎焉。然而,这种视觉上表型强度上很不易区分开, 不适宜于进行大规模的突变体筛选。叶片表面通过水分的蒸发带走热量从而导致了 叶面度的降低。这温度的降低可以通过外成像仪进行续的,非坏的检 测,因此供了一种单个植物体蒸腾作用方便的指示信。尤其是Raskin和 Ladyman(1988)通过远红成像仪成功的分离了由于喷施ABA而未能致气孔关闭 的大麦“cool”突变体,然而尽了这样令人兴奋结果,是一直却没有
叶片温度不仅依赖于水分蒸发的气孔导度,也依赖于周嗣的环境及植物本身 的变化包括:净辐射的吸收(absorbed net radiation)、空气的湿度(airhumidity)、 空气的温度(air temperature)和叶边缘的导度等因。所有的这些可以决定 片能量的衡。不过仍存在一个争的地方:成叶片度的降低主要是源于对流还 是蒸。而且蒸腾降温所带来的变不但依赖于气孔本的变化而要依赖于 孔度以及
2l
拟南芥干旱突变体的筛选及其保卫细胞原生质
在这项研究,我们对用远外成像技术筛选拟南芥孔突变体的适宜性行了摸。叶 片的温度依赖于气孔的开度和一些其他的复杂的因素,诸如:叶的形状、位置、辐射的吸 收率、空气的湿度、空气的温度和风的速度。运用拟南芥的失突变体和不敏感突变体作为 性对照,我们干旱条件下用热像检测气孔的发生的反应行为的条件进行了优化,实 验条件行了改善。本实验通过对拟南芥和蚕豆进行不同部的胁迫刺,对其叶片表现的 度化的分析表皮条下的气孔运动行为是基本一致的:胁迫刺激导致气孔的关闭,减少 了叶片表面的水蒸腾,叶片表面辐射于外界的热量减少。进而致了温度的升高。叶 片的生理状态、位置,甚是同叶片的不同部位往往于不的原因度的表现也会出 一定范围的差异。这也可能会给温度的测定带来一较大的误差可并不会影总体上的观 测。明无论是从根部还是从叶片直接刺激会导致叶片的气孔发生关闭,相应出温 度的升高。但是过氧化氢对拟南芥和蚕豆刺激的剂量与叶片温变化的关系需要进一步的 探讨。远红外像技术在植物体研究中的作挥,尤其是在突变体的筛选,整株植物水 平研究叶片气孔的
4.2筛选拟南芥突变体生长时期
界定用远红筛选拟南突变体的生长时期是一个非常复杂的过程。通过对同时期 拟南芥幼苗的远红外观察,发现随着幼苗生长时的延长叶片面积的扩大,植株的个体增 高,幼苗的热图表现出个体内温度显著差异,即是同一片较大的叶片其叶缘和叶中心的区 域的温度也会有一定的差异。就为筛选变体造成了一定困难。经反复的试验确筛 选的适宜时期为拟南芥长14—16天,时基生叶为4-6片,叶子不太大,生旺盛,叶的 各部位温度基本趋于一致,且叶片的位又几乎处于一水平面这就克了性高低
4.3筛选拟南芥突变体种植密度
利用红外成技术筛选拟南芥突变体主要是根据植物体叶面气孔开启影叶 片温度变化,以突变体和野生型叶温的差异为指标进行突变筛选。相关的报道不少“8’ “”…1,但都是对其方法的可行性进行究探讨,真正筛选出南芥突变体的报还 没有。因此多步骤需进
确片;I远红外筛选拟南芥突变体的幼苗种植密度同界定选拟南芥突变体生 长时期同样繁琐。通过对同一时期不同密度的拟南芥幼苗的远红外观察发现。发现密 度太大在红外照射下热幽中株株不易区分清,这影到温差异
河南大学2007届硕士毕
变株)的发现分离。密度太小在远红外照射下热图中株与株易区分清楚,但是一方 面会造成温度差异植株(潜在突变株)与其他正常植株进行对比的群体效应,降低筛 选侯选突变株的准确性;另一方面会增筛选工作量。经过多次试验确定筛选 适宜种植度为与株周问1厘
4.4拟南芥保卫细胞原生质
拟芥的叶结构和蚕豆有较大区别,其表皮条不易撕,尤其是C24及其突变体叶片 很小撕表皮条难度很大,要对其保卫细胞进行电生理方面的研究,建立一制备较为纯净的 南芥保卫胞原生质体的整体显
虽然也有献报道拟芥保卫细胞原生质酶解的方法,在实验过程中存在细胞易受 损伤、酶解时间不好把握等不足,而造成膜片钳实验中,别是进行药理学分析而加入试剂 处理时,容易出现封接成功率低、录时间短、接不稳等情况。我们以拟南芥已?为材料, 从分离方法入手,照Pandy等(2002)和Pei(1997)等的方法,了上述方分离的保 卫细胞原生质体的差别,总结出了得到高质量的拟南芥保卫细胞原生质体的一些方法、技巧a 在料培养方面,子播种于花卉营养土与石例为h 3的混土中生长,既提 供了物生长需的各种养分,又使土壤比较疏松,利于通气和吸水。此植株生长,提 取表皮条时的搅拌过程气孔保卫细胞的伤害较小。同调整光照强度和时问为:光/暗周期 8/16h照温度22℃,黑暗温度18。C,相对湿度80%左右,照强度120岫01?m’。?S~, 使植株营养
关于表皮条的制备,根据材料的特点采用匀浆机打制的方法来得拟南
由酶液的制和拟南芥生长状况及操作情况略有不同,游细胞所需时间也可能不同。 一般经过显微镜观察确定酶解情况。Pei等(1907)采用的是15~17小过夜酶解,其不便 之处是时间隔太长,易酶情
利用膜片钳全细胞记录方法分析拟南芥保卫细胞原生质体质膜内向K+通和C矿通
拟南芥干旱突变体的筛选及其保卫细胞原生质
电流特征。证明保卫细胞状态稳,封接成功率较高,特别是在加入试剂处理时,封接电流 平稳且持时间,实验
4.5问题与展望
综上所述,运j{j方法应该是一种气孔信号传导径的研究的有效方法。拟南 芥干旱突变体的筛选和膜片钳技术结合为研究植物应干旱的分子作用机制,克隆 抗旱有关基因及阐明胞内信号转导疑提供了直手段,同时也为在分子水平上认识 抗旱调控及信号转导提了依据。但是要从根本上解决植物抗性、隆抗旱有关基 、明示过化氢在生物体内的众多生理角色还需进一步深入研究并且需要一定的时 间。随着筛选技术的不断完善,相信,大筮拟干旱突变体将会因选技的改进 而分。除了筛选境突变体外们还可设想利用远红外成像技术筛选切与气孔 调节有的突变体,:选对光和空气中的C02量低的开放气孔能力降低的南 芥突变体、筛选对暗和空气中C02含量高情况下对气孔关闭能力降低的拟芥突变 植株等。除之外远红外成像技术适宜于对气给予给定的
河南大学2007届硕l:毕
5.结论
1.本实验对运用远红外成像技术选拟南芥气孔突变体的方法进行了摸索。确 定利用远红外成像技术筛选南芥孔突变
2.采用EMS诱变,运用红外成像技术分析拟南芥叶面温度差异,共计筛选得到 十几拟南干旱
3.通过对文献记载方法行比较加以改进,确定一套适合拟南芥C:a的保卫细原 质
拟南芥干旱突变体的筛选及其保卫细胞原生质
6.参考文献
11]BoyerJ s.Plantproductivity and environment.Science,1982,218:443-448
12]NeumannPM.The roleofcellwall adjustmentinplant resistancetowaterdeficiB.CropScience, 1995,35:1258.1266
13】卢从明,张其德,匡廷云。水分胁迫对光合作用影响的研究进展【J】。植物学通报,1994, 11(增
14】郭连旺,沈允钢。高等
151Mehdy M C.Active oxygen species in plant defense against pathogens.Plant Physiol,1994, 105:467-472
|61Wang B s.Biological free radicals and membrane damage of plants【J】.Plant Physiology Communications,1988,(2):12-16
[7lSeemann JR and Critehley C.Effect of salt Stress on the growth,ion content,stomatal behavior and photosynthetic capacity of a salt-sensitive species,Phaseolus vulgar括L.Planta,1985, 164:151.162
【8l刘友良。植物水分逆境生理。北京:农业出版社,1992,79-80
19l MeCue K F'Hanson A D.Trends Biotechnol,1990,8:358-362
【10]Bohnert HJ,Jensen R G Strategies for engincedng water stress tolerance in plants【J】.Trends Biotechnol,1996,14:89~97
【lllSkriveb Mundy.Gene regulation by abscisic acid and osmotic stress.The Plant Cell,1990,2: 503—512
112]Dure L III,Crouch M,Harada J,Ho T-hD,Mundy J,Quatrano ItS,Thomas T'Sung ZR. Common amino acid sequence domains among the LEA proteins ofhigher plants.Plant Mol Biol, 1989.12:475-486
【13]Leonardi A S,Heimovaara—Dijkstra and M Wang.Differential involvement of abscisic acid in dehydration and osmotic stress in rice cell suspension.PhysioLPlant,1995,93:31?37
114l何
116]Maione盹Hydraulic signals【M】.Phil.Trans.Roy.Soc.London Ser,B 341:33-39
117]Gollan T,Passioura J B,Munn S R Soil water status affects the stomatal conductance of fullyturgidwheatand sunflowerleaves【J】.Aust.J.PlantPhysiol,1986,13:459-464
【lSlTurnerNC,SchulZEED,GollanT.The responseof stomamandleafgas exchangeto vapor pressure deficits
and soil water content,e In the mesophytic herbaceous species
河南大学2007届硕士毕
annuus fJ】.Oecologia,1985,65:348-355
【19]Tardieu E,Zhang J,Daviesw J.What informalion is conveyed by ABA signal from maize root in dryingfield soil【J】,PlantCellandEnvironment,1992,15:185-191
[20lJackson M R Kowalewska K R Positive and negative messages from roots induce foliar desiccation and stomatal closure in flooded pea plants[J】.Exp Bot,1983,34:493?506
121]Zhang J,Daviesw J.Dose ABA in the xylem congo[the rate ofleafgrowth in soil“ed maize and Still—flowerplant【J】.JExpBot,1990,41:1125一1132
f221杨建昌,朱庆森,乔纳圣?
1231a!学臣,贾文琐。水分胁迫
[241Gowing D J.Day lesw,Jon SehG.A positive root-sourced signal as an indicator ofsoil drying in apple【J].Exp.Bot,1990,41:1535-1540
1251Hanscn H,Dorfling K.Changes of free and conjugated abscisic acid and phaseic acid in xylem sap ofdrought-stressed sunflower plants【J]JExp.Bot,1999,50:1599-1605
126]Allan AC,Fluhr R.Two district sources of elicited reactive oxygen species in tobacco epidermal cells.Plant cell,1997,9:1559—1572
127]Lee g,Choi HS,Suh,Doo IS,Oh KY,Choi EJ.,Taylor ATS,Low PS.Lee Y. 01jgOgalacturOnic acid and chitosan reduce stomatal aperture by inducing the evolution of reactive oxygen species from guard cells of tomato and Commelina communis.Plant Physiol 1999.121:147—152
1281Murata Y.,Pei Z.
1291苗雨晨。宋纯鹏,董发才,壬学臣。ABA诱导蚕豆气孔保卫细胞H202的产生。 植物生理学报,2000,26:53.58
1301骁,张霖,安国勇,高俊风,宋纯鹏。共聚焦显微技术研究ABA诱导蚕豆气 孔保卫细胞H202的产生。实验生
131]Assmann SM.Signal transduction in guard cell.Annu Rev cell Biol,1993,9:345?375 1321Purohit S,Kumar GP,Laloraya M,Laloraya MM.Involvement of superoxide radical in signal transduction regulation stomatal movements,Biochem Biophys Res 27
拟南芥干旱突变体的筛选及其保卫细胞原生质
Comm,1994,205:30-37
【331Priee AH,Taylor A,Ripley SJ,Griffiths A,Trewavas AJ.Oxidative signal in tobacco increase cytosolic calcium.Plant Ce//,1994,6:1301?1310
1341安国勇,宋纯鹏。超氧阴离通过提高【Ca2+]cyt调节保卫细胞K+通道和气孔运 动。生物物理学
13s1许智宏,植物生物技术。上海科学技术出版社,1997,p226—241
【361Meyerowitz EM.Arabidopsisthaliana.Ann RevGenet,1987,21:93-lll
f37】郑慧琼,赵毓橘.植物激素突变体。植物生理学报,1997,33:321?329
【3Sl白书农,谭克辉。拟
i391李文泽。植物生物技术与作物改良。中国科学出版社,1995,p171—178
【401许智宏,刘春明。植物分生物学研究中的“果蝇’.-拟南芥,植物发育的分子机理。 科学出版
1411Bowman JL.Genes directing flower development in Arabidopsis.Plant Ce
【421Reid JB.Internode length in pisum.A new slender mutant gibberthins,Planta,1992, 188:62-7l
1431张举仁。玉米耐盐植株的生及其后代的特性。植物体细胞无性系变异与育种,江苏科 学技术出版
1441缪树华,氨基酸过量合成的米突变体的选择与营养品质改良 植物体细胞无性 系变异与育种,江苏科学技术出
1451缪树华,抗
1471Kitaya Y,Kawai M,Tsuruyama J,et a1.The effect of gravity on surface temperatures of plant leaves.Plant Cell Environ,2003,26:497.503
{48]Mustiili AC,Meriot S,Vavasseur A,et ai. Arabidopsis OSTl protein kinase mediates the regulation of stomatal aperture by abscisic acid and acts upstream of reactive oxygen species production.Plant Cell,2002,14:3089—3099
1491Raskin L Ladyman,JAR.Isolation and characterization of a barley mutant with abseisic acid.insensitive stomata.Planta.1988.173:73.7
150]Assmann SM,Snyder JA,Julie YL.ABA—deficient(abal)and ABA-insensitive 2S
河南大学2007届硕士毕
(abil?J.abi2-』、mutants of Arabidopsis have a wild?type stomatal response to humidity Plant,Cell&Environment 2000,23:387—395
151JJones,H.G.Use of thermography for quantitative studies of spatial and temporal variation of stomatal conductance over leaf surfaces.Plant Cell Environ,I 999, 22:1043,】055
【52]Chaerle,L.Vander.Straeten,D.Imaging techniques and the early detection of plant stress[J].Trends Plant Science,2000.5:495-501
153]Hashimoto Y,Ino T,Kramer.Dynamic analysis of water stress of sunflower leaves by means of a thermal image processing system.Plant Physial. 1984,76:266—269
【54]Wisniewski M,Lindow SE,Ashworth EN.Observations of lee Nucleation and Propagation in Plants Using Infrared Video Thermography Plant Physial, 1997,113:327-334
【55]Pearee RS,Fuller MP.Freezing of barley studied by infrared video thermography. Plant Physial.2001.125:227-40
156]Nillson H E.Remote sensing and image analysis in plant pathology.Canadian Journal ofPlantPathology,1995,17:154—166
157]Daley P F.Chlorophyll fluorescence analysis and imaging in plant stress and disease[R].Canadian Journal ofPlant Pathology,1995,17:167—173
158]Inane Y-Remote detection of physiological depression in crop plants with infrared thermal imagery.1apan.10ur Crop Science.1990,59:762—768
159】Zohar O,Ikeda M,Shinagawa H.Thermal imaging of receptor—activated heat production in single cells Biop咖steal dournal,1998,74:82-89
160lZhang X,Dong FC,Gao JF,Song CP.Hydrogen peroxide—induced changes in intracellular pH of guard cells precede stomatal closure.Cell Research,2001,11: 37.43
161]Jones,H.G Use of thermography for quantitative studies of spatial and temporal varjation of stomatal conductance aver leaf surfaces.Plant Cell Environ 1999. 22:1043-1055
1621Assmann SM,Snyder JA,Julie YL.ABA-deficient(abal)and ABA—insensitive (abil一,,abi2一J)mutants of Arabidopsis have a wild—type stomatal response to humidity.Plant.Ceil世Environment 2000.23:387—395
拟南芥十早突变体的筛选及其保卫细胞原生质
致谢
衷感谢我导师宋纯鹏教授给我这样一个学习和锻的机会以及对我实验的悉心指 导。宋老师渊博的知识、严谨的治学态度、忘我的工作精神以及坦荡诚的为人处世风都 使我益匪浅并将成我
感张骁、国勇、江静、吕东、王棚涛、王棚程老在学习给予我的指导并¨帮助。 感谢宋玉伟、张国增、康熟丽在各方面给我提供的帮助、建议天怀,从你们的上我 学到很多东西,此
感谢李忠爱老师在论文完成中给予的
感我的同赵翔、闻玉、宙勇、李宝珠、张晓然、郭劲功、常琳等同学,与你们朝夕 相处的日子,在学习和生活上都得到你们的诸多帮助,我会牢记与你们结下的深厚友情。 最后特别感谢所在单位淮中学和我同我业
30
作者;段春阳 二零零七
拟南芥干旱突变体的筛选及其保卫细胞原生质体的分
学位授予单位:河南
本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1088556.aspx
烟草原生质体的分离纯化
2006年11月
第30卷第6期安徽大学学报(自然科学版)JournalofAnhuiUniversityNaturalScienceEditionNovember2006Vol.30No.6
烟草原
江 力,孔
(1.合肥工业大学生物与食品学院,安徽合肥 230009;2.
摘 要:研究从烟草叶片离原生质体的若干影响因素.过酶解法降解细胞壁释放出原生
利用离心和蔗糖漂浮法从粗取液中纯化出原生质体,并通
表明:酶的种类、质膜稳定、渗透压稳定剂、pH及酶解时间影响原生质体制备的重要因素.纤
含量2%,果胶酶含量1%,2-N-吗啉乙烷磺酸(MES)浓度50mmol/L,Ca2+与甘露醇作为渗透
剂,pH6左右,温28℃,酶解时间4h时原生质体的分离效果最
关键词:烟草;原生质体;
中图分类号:Q945 文献标识码:A 文章号:-()-、细胞融合、
[,.本
胞壁降解酶、、pH等因素对原质体制备的影响,旨对建立高效的草原生质体再生系统及其遗传操作有参考
1 材料与方法
1.1
供试材料为烟草(NicotianatabacumL.)品种云烟85.取充展开的叶片,用自来水冲洗干净,取2g叶片剪碎,加入20mL酶液(2%纤维素酶,1%胶酶,0.2mol/L的CaCl2,50mmol/LMES,0.6mol/L甘露醇)28℃酶解3-6h.将酶解后的原生质悬浮液用3层纱布过滤,600r/min离心5min.将淀的原生质体悬浮在2mL0.2mol/L的CaCl2?2H2O中,用注(装上长针头)离心管底缓缓入20%蔗糖溶液6mL,600r/min离心5min.在两溶液的界面之间出现一层纯净的整原生质体带,纯净原生体
1.2 最佳酶解时间的确定
将20mL酶液与2g叶片在28℃条件下保温,中间轻摇动几次,分
).8h后制备生质体,在显微
1.3 最佳pH的确定
配制酶液,并调节其pH值分别2、3、4、5、6、7、8、9、10,低温保存备用.将20mL酶液与2g
).28℃条件下保温处理4h(中间轻轻摇动2～3次)后制
1.4 质膜稳定(MES)和渗透
酶液中(pH6)分别加入5.0、25、50、100mmol/L浓度的MES,再各加入0.6mol/L甘露醇,低温下保存备用.将20mL酶液与2g叶片在28℃条件下保温4h(中间轻轻动2～3次)制备原生
).微
1.5 酶种类的确定
配制两种酶液,一种含2%纤维素酶和1%果酶,一含2%纤维素酶,酶液其他成分同1.2,低温下保存备用.将20mL酶液与2g叶片在28℃条件下保温4h(中间轻轻摇动2～3次)后制
).体,
收稿日期:2006-07-13
作者简介:江 力(1964-),女,福建长人,合肥工业大学讲师,
92安徽大学学(自然科学版)
2.1 酶时间对烟草
从图1a所示可以看出:随酶解时间的增加,原生质体产量不断提高,解时间为4h时,原生质体产量最,达到峰值.再延长解时间,原生质体产量不提高,反而急速下降.究其因,可能是在解过程中,随着酶解间的延长,细胞去壁程度愈完全,表现为原生质体形率逐渐上升.当酶解达到一定时间后,绝大多数的细胞已形成原生质体(图1b),此,再进行酶解作用,酶会进一步对原体发生作用而细胞质受到伤,造成大量原生质体破裂,从而使原生质体失活,表现为生质体形成率剧降低(图1c).原生质体的产量与时间密切相关,下面的各组验均采用
a b 酶
图1 酶解
2.2 pH对烟草原生质体制备的影响
pH与原生质体产率的关系曲线呈钟形曲线(图2a).当酶液pH值在6左右时,原生质体的分离效果最好(2b),降低或升高pH值都会原生质体产率下(图2c),pH对原生质体分离效果的响主要表现在pH对酶活力影
a pH与原生
图2 pH
2.3 质膜稳剂和渗透压稳定剂
50mmol/LMES,0.6mol/L甘露醇时原生质体的分离效最佳(见表1).于没有细胞壁,膜暴露在外界环境下,原质体的结构变得脆弱,在没有一定的渗透剂和稳剂的情况下,很快会破裂.因此加入一定浓度MES作为质膜稳定剂可以保护原生质体,尽避免质膜破裂而导致原生体破碎.渗透压稳定剂在原生质分离过程中是必不可的,因为仅有细胞质膜的原生质体对渗透压很敏感,渗压在原生质制备中,不起到保护原生质体于胀作用,而且还有助酶和底物
表1 MES浓度对烟草
MES
5
25
50
1006原生质体浓度(×10个/mL)表2 酶种类对烟生质体制备的影响酶纤维素酶+果胶酶纤维素
第6期江 力,等:烟草原生
2.4 酶种类对烟草
由表2可知:纤维素酶和果胶酶并用效果较好.能的原:在植物细胞壁的成分中有胞间层,又称胶层,位于两个相邻细胞之,为两相邻细胞所共有的层膜,主要成分为果胶质,果胶酶的使使得中胶被
3 讨 论
本实验结果显示纤维素酶与果胶酶混合用、甘作为渗透压稳定剂、质膜稳定剂(MES)浓度50mmol/L、pH在6左右(5.8～6.2)制备烟草原生体的效
温度对原生质体制备有双重影响,一方面随着温度的提高,酶解应速度加快;另方面,随着温度的增加,酶蛋白逐渐变性而使酶失活,且温度过高也会影响原生质体的稳定性.过酸或过碱影响酶活性,也影生质体的稳定性,从而影响原生质体制备效率.酶解间过短,原生体形
[7,8]全,影响原质体的制备与纯化;酶解时过长,质膜受到损伤,,最
[9]利于
生理状态
片.,极易受渗透压的影响而导致质膜破裂.因此,保持较高的渗透压以使原生质体在离前细胞处于质壁分离状态,分离之后不致膨胀破,从而提高原生质体的产率与活力.在酶液中
2++浓度的MES、露醇、Ca和K等可以起稳定质膜、稳定渗透压的
原生质体的收集方法也会一定程度上影响原生质体的产率与活力.本实验利用过滤-低离心法收集游的生质体,并通蔗糖漂浮法纯化.在纯过程中蔗糖溶液要达到一定浓度才使原生质体漂浮,否则原生质体仍悬浮在蔗糖溶液中甚沉于管底,达不到纯化的果.在漂浮法纯过程中,形成上下两相溶液时的操作要非常仔细,否则可能原生质体并未漂浮在蔗糖溶液.参
[1] 李志勇.细胞工(第二版)[M].北京:科
[2] 李春艳,李妮亚,陈少良.植物原生质体培养与融
(3):264-268.
[3] 赵维峰,孙光明.园艺物原生质体培养及应[J].热带
[4] MichaelR,PaulJ,BrianP,etal.Plantprotoplasts:statusandbiotechnologicalperspectives[J].Biotechnology
Advances,2005,23:131-171.
[5] 潘增光,邓秀新.苹果生质体制备培养及植再生[J].园
[6] 左红梅,任大明.纤维素化方法与原生质体的制[J].安徽农
[7] 陈名红,李天飞.4种基因草叶肉原生质体培养的究[J].江西农
[8] FroozabadyE.RapidplantregenerationfromNicotianamesophyprotoplasts[J].PlantSci,1986(46):127-131.
[9] 陈明红,熊立,陈学军.草叶肉原生质体制备
(4):326-329.
[10] 张红梅,王俊丽.植物生质体游离、培养及应[J].河北林
[11] 付春华,郭文武,邓秀新.类、橘类叶肉原生质体
-507.
[12] SairamRV,SeetharamaN,DeviPS,etal.Cultureandregenerationofmesophyll-derivedprotoplastsofsorghum
[J].SpringerBerlinHeidelberg,1999,18(12):972-979.[10,11,12][5,6]
94安徽大
Isolationandpurificationofprotoplastsfromtobaccoleaves
JIANGLi,KONGXiao2wei,WUXiao2jie,LIShao2song
2.SchoolofLifeScience,AnhuiUniversity,Hefei 230039,China)1211(1.SchoolofBiotechnologyandFoodEngineering,HefeiUniversityofTechnology,Hefei 230009,China;
Abstract:Thefactorsaffectingisolationandpurificationofprotoplastsfromtobaccoleaveswerestudied.Theprotoplastswerereleasedbydigestingcellwallswithcellulaseandpectolase,andwerepurificatedfromthecrudeextractsbycentrifugationandsuspendinginsucrosesolution.Theisolationefficiencyoftheproto2plasts(indifferentcondition)wasdecidedbycountingtheirnumberwithglobulimeter.Theresultsshowedthatenzyme,cellmemberstabilitizer,osmoticpressurestabilizer,pH,enzymolysistimesignificantlyaffectedisolationofprotoplastsfromleavesandinthisexperimenttemperaturepHandenzytimearethemostimportantinfluencefactors.
Keywords:tobacco;protoplast;isolationand责任编校:
(上接第83页)
参考文献:
[1] 马志毅,侯红绢,刘瑞强,.污水厂污泥做吸附剂
[2] 梁郁强,贾宗剑,江风
[3] 蒋成爱,吴启堂,吴顺辉,等.用剩余活性污泥吸Cu和Zn的初
(3):94-98.
[4] 王亚雄,郭瑾珑,刘瑞霞.微生物吸附剂对重金属
[5] 马娜,陈玲,熊辉.城市污泥的处置与用[J].生
[6] 谭铁鹏.污水污泥的资源化技术分析[J].云南
[7] 许晓路,申秀英.半连续性污泥法对污水中五价的去除[J].
[8] 谢冰,奚旦立,陈季华.污泥工艺对重金属的去及微生物的抵抗
283-292.2+2+
Applicationoftheactivesludgeinthedisposalofthecitysewage
TANLi2quan,LUBao2guang12
(1.SchoolofChemicalEngineering,MaomingCollege,Maoming 525000,China;
2.GuangzhouUrbanSewerageMonitoringStation,Guangzhou 510655,China)
Abstract:Inthedisposalofthecitysewage,alargesumofwastesludgewillbeproduced.Thecitysewageinourcountrycontainstoomuchheavymetals,thusitscomprehensiveusageintheagriculturefieldisrestricted.Theaimofthispaperistoexplorethepossibilitiesfortheproblembystudytheadsorptioneffectontheheavymetalsproducedbytheactivesludgeoutofthecitysewagedisposalprocess.
Keywords:wastesludge;heavymetal;remove
责任编校:李镜平
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