(1.湖南农业大学园艺林学院 ，南 长沙 410128;2.物种创与源利用国家点实验室培养基地，湖南长沙 410128) 摘 要:前以木质纤维素为原料制备燃料乙醇成为全球研究热，发五碳糖产乙醇的菌种选育是其键技术之一。文中综述 了微生物发酵碳糖产醇的机理，五碳糖发酵自然微生物的种类及菌种遗传改良的研究进展，并对后菌种的研究方向进行简 要论述。 关 键 词:五碳糖;乙醇;发酵;

中图分类号:TQ223.1 文献标识码:A 文章编

Research progreinss microorganism for ethanol fermentation by pentose 1, 21, 22HE Yinglong, XIONG Xingyao*, SU Xiaojun (1.College of Horticulture and Landscape, Hu'nanA gricultural University, Changsha 410128,Ch ina;

2.Pre-StateK ey Laboratoryf or Germplasm Innovation and Utilization of Crop, Changsha 410128,Chi na) Abstract: Bioconversion of lignocelluloses to ethanol has becomeg lobala researchfocus in recent years. The breedof m icrobes for fermenting pen- toset o ethanoli s oneof the keyt echnologies. The mechanismof bioconversion of pentoseto ethanoli s introduced in this paper. The advancesthe on natural strainsof pentose ermentaton andg enetc mprovement werer evewed. In additon, the research prospect wdiasscu ssed. fiiiii

Key words: pentose; ethanofelr;m entation; improvement

由于石油等化源的大量开采，消耗过快，石油源储备已经到了

收稿日

基金项目:国

作者简介:贺应龙(1985-)，男，湖南宁乡人，在读硕士究生，要从事生

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

biosynthesis[J]. Sci, 1999,284(5418):1368 -1372. SCHUMANN J, HERTWECK C. Advances in cloning, functional [23]

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业科技, 2008,2 9(3):292-295. 的克隆及其序列析比较[J]. 广

2010 年 4 期 中国酿

源替代品已经解决人类能源问题的必然径。生物其前研究得最且最具有工业应用前景的是休哈塔[10]乙醇良好的化石能源替代品，作为一种可再能源，其 假丝酵母和树干毕酵母。汤斌等选出一株休塔假 [1]丝酵母TZ8-13，对木糖和葡萄糖都有良好发酵性能，比化能源更清洁，能有效减少温室气体的排放。生

糖 浓度为60g/L时的乙醇产量分别达21.6g/L和质乙醇的生

24.2g/L。树 毕赤酵母能很好地利用木糖，副产较质，传统的乙

少，乙醇转率较 高，几乎接近0.51g/g(乙醇/为人类生存所必需，世界范围内的食问题并未

木质纤维原料丰富，而且廉，因此，利用木质纤维 2.2 细菌 细菌发的底物广

木质纤维素主要由纤维素、半纤维素木质素3大部 短 。 能利用木糖产乙醇细菌主要 有 嗜细菌 3[]组成，分别占35%~50%、20%~35%和10%~15% 。纤维素 (Clostridium thermohydrosulfuricum)，多粘芽孢杆(Bacil- 水解后六碳糖(要为葡萄糖)，较易被统工业微生 lus polymyxa)，大肠杆菌(Escherichia coli)，嗜水气单胞菌 物转化为乙醇，而半纤维素水解后主要得到五碳糖(主要 [12][13](Aeromonash ydrophila)等。LACIS L S报道一株极 为木糖)，通常情况下不能被传统工业微生物转化成乙

由于半纤维素在木质纤维素中所占比例大，因此，开展 热细菌Clostridium ther mohydrosulfuricum，该细在 五碳糖发酵菌株选育工作对于推动整个纤维素燃料乙醇 木糖培养上连续培养可获得0.44g/g乙醇。厌氧嗜制备技术的发展有重要意义。纤维素的降解产物木糖 [14]梭 可以直接利用纤维素和半维素产乙醇。韩如[4]过去一直被视为不发酵性糖，WNG P 等出木糖 “”AY[15] 等分离获得一株嗜热厌氧纤维素降解细菌被一些微生物发酵生成乙醇，引起究者的关注，本文概述 Clostridium sp. E VA4，在最适条件下利1%纤维素滤纸了五碳糖发酵菌种的研究进展，并展望了今后的研究方

培养120h，乙 浓度可达1.123g/L。 1 微生物酵五碳乙醇的机理 半纤维素降解产物2.3 真菌 真菌发酵木糖的研究主要在尖廉孢菌木、阿拉伯等，但主要为 (Fusarium [5]木糖，约占90%，因此发酵碳糖产乙醇的机理研究主[16]oxysporum)和糙脉菌(Neurospora crassa)2类菌上。 集中木糖的发酵机理上。到目前为止，微物转化[9，17]目前报道能发酵木糖产乙醇的真菌主要有:F. oxysporum 木糖 成乙醇的途主要有2条，表现在木糖转化为酮VTT-D-80134(3)，Neurosporac rassa NCIM 870，Paecilomyces 糖途径 sp. NFI. ATCC 20766，F. sambucium VTT-D-77056等。JOSHI 的差异上:一是糖经木糖还原酶(yose reductase，R) XlX[18]A等筛选出一株F.oxysporum D-140，发酵54.8g/L的木作用为木糖醇，然后木糖醇脱氢酶(Xylitol dehy 糖 drogenase，XDH)脱氢为木酮糖;二是木 液获得醇最大浓度为13.2g/L。真菌产生的酶系较丰 构酶(yose somerase，)作用直接异构为木酮糖。木糖 XliXI富，包纤维素和半纤维酶，仅能发酵单糖，而 转化为木酮后，通过木酮糖激酶(Xylulokinase，XK) 且还能发酵二糖和多糖，适合于植物纤维物质的同步 酸化生成5-磷酸木酮糖进入磷酸戊糖途径( Pentosepho s- 糖化发酵。 phatep athway，PPP)，再通过糖解途径或ED途生成丙 3 五糖发酵株的改 [6-8]酮酸，丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢作用转化为乙醇。 3.1 基因水平改一般况下，酵母菌和丝状真菌通途径一代谢木生 自然界中的微生物多数只能利用六碳糖，能 乙醇，细菌通过途径二代谢木糖转化为乙，其流程: 五碳糖，部分微生物虽然能同时用五碳糖和六碳糖，但 (途径一:酵母菌、丝状真菌) 产乙醇能力却很低。基因工程方法是一种非常有效的

XK 生物传改良手段。目

高效转化乙醇的株，研究思路主要有2条:是 木糖 木酮糖 5-磷酸木酮糖?酸戊糖途? 高 效代谢六碳糖的菌种中引入碳糖代谢途径;二X(I 途二:细菌) 是向 能利用混合糖但产醇能力低的菌种中引入

2 自然界中利用五碳糖的微生

2.1 酵母菌

酵母菌利用木糖化为乙醇的能力较强，主要管 Zymomonas mobilis能有效利六碳糖，是引入五碳糖 囊 酵 母(Pachysolen tannophilus)、树 干 毕 赤 酵 母(Pichia 代谢途径构建工程菌的良好宿主，也是目前主要的研

[9]stipitis)哈塔假丝酵母(Candida shehatae)3种类型。

因此研究要采取2种途

2010 No,4 China Brewing Serial No,217 ??10 Forum and Summary

[19-20]谢途:一是同时引入分别编码木糖还原酶XR木糖 84%。而

醇脱氢酶XDH的2个基因，即木酶基因xyl1和整合后的株显示出良好稳定性;另一方面造成酸脱 木

3.1.2 引入产乙醇关键酶基因 xylA，其编 码木糖

糖。 自界有些微生物能

同时引入xyl1 和xyl2基因:酵母不利用五碳 碳糖，但乙醇率很低。通过高产乙醇的关键酶，够大 糖，目许多研究是通过途一向其引入木糖代谢途径。 大提高菌种对乙醇的转化能力。目前这类研究的主要

[21]鲍晓等构建出同时具有木糖还原xyl1木糖 象是大肠杆菌(Escherichia coli)。大肠杆能代谢五碳糖 脱氢酶基因xyl2及超表达转醛酶tal1和转酮酶tkl1和六糖，但缺乏丙酮酸脱羧酶，而且乙醇脱氢酶?活

[28]基 因的酿酵母重组菌株，并试图过增强XDH表很低，所以乙醇产量很低。INGRAM L O等最先将 达来 减少木糖醇的积累，结果发现，当XR/XDH 比值为运动发单胞菌中的丙酮脱羧酶pdc和乙醇脱氢酶0.06时， 产物中检测不到木糖醇，其他副产也有所下adh 基因引入到大肠杆菌中获得高水平的表达，此工

[22]降，而乙醇 率却有所提。杨忞等克隆毕酵母的有较 好产醇力。并在基础上进一步在乙醛平xyl1和热带假 丝酵母的xyl2构建出了染色体整合质粒板上筛 选得到高产株K011，K011能很好地发木糖YIp5-kanR-x12， 以期整合到发酵性能良好的酿酒酵母基和葡萄糖 产乙醇，是有效发酵混合最为理想的菌种之组中，得到能稳 定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的工程菌

株。 很重组大肠杆菌由

引入xylA基因:菌的木糖异构酶可直接将木糖转

[29]化 为木酮，不需要任何辅酶因子，最初被认为

[23]利用 木糖的酿酒酵母工程菌利径。鲍明等从PET 操纵的pLOI297质粒引入营养缺陷型菌嗜热细 菌中隆木糖异构基因xylA并转移至酿酒酵FMJ39中获 得FBR3，FBR3发酵能力接近K011并

[30]母中得到 重组H612，首在国内成功实现xylA在酿持能稳。 等将大肠杆丙酮酸甲酸裂解酶酒酵母中的 活性表达;同为了使木糖代谢向乙醇生pfl基因连同运动发 酵胞菌的pdc和adhB入大肠成的方向，又 在转化中引入并超表达转酮酶因tkl1杆菌TOP10感受态细胞 获得重组菌E.co TOP10-p，lifl和转醛酶基 tal1，得到的菌可以发酵木糖，乙醇浓度也能稳定地利用葡萄糖和木 糖产乙

[24]3.2 细胞水平改良 达1.3g/L。沈煜

thermophus的xy和酿酒 酵母身的xks，入酿酒illAi原生质体融合技术是将遗传状不同的2个细胞酵母工业菌株NAN-27的染色 合为一个新细胞，两亲株的整套因相互重新合体中，得到工程菌株NAN-114，木糖消耗率和乙醇率均 的一 技术，属于细胞工程。国内外对原生质体融

[6]有较大提高。LIU X L等通过用xylAxksi同时化酿术的研 究都比较成熟。过原生质融合进行基因重酒 酵母 EF-326得EF1014，不能在以木糖为一碳组已成 为微生物遗传育种的一种有效的工具，是工业源的 养基上生长，且能在厌氧条件下产乙醇。目前菌株改良

[31-33] 重要手段之一。为止， 能

采用原生质体融合技术可以使酵母菌得代谢木糖 且重酶 的最适温度和最适pH偏高，导致得到的程产醇的能，究者们进行了许多方面的研究。涂振 菌利用木糖 转化乙醇的效率较低。 [34]东等将季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)和塔 运动发酵单胞菌发碳糖的力稍次于酿酒酵 假丝酵(Candda shehatea)进行原生质体合得到融合 i母，不谢五碳，也是通过引入xylA使菌株能代谢木 子XX2，能代谢木糖，与对照相比乙醇产量提高了[19][35]糖的主要研究对象。ZHANG M等将取自大肠杆菌木 37.7%。 KORDOWSKAW M等采用原生质体

术得到酿 酒酵母和母的融合子，融合子对乙醇的耐糖异构

受能力比 亲本高，产乙醇的速率有所降低。 因 talB和转酮糖基

4 展望 选育乙醇高和耐抑制物能力强的五碳糖发酵获

菌 为唯一

种是一项长期而十意义的工作，也是植物纤维素原料 值的86%。为

生物转化生产乙醇的领域。到目前为止，这方面的研 发酵单胞菌代谢

[25-27] 究已得了许多进展，获得了一些能直接发酵五糖产M

乙醇的微生物，通过利

到运动发 单胞菌染色体上

2010 年 4 期 中国酿

2007,2(54):53-55. 因工程株，为五糖谢种选育提供很好的种质[15] 韩如羏，陈美，闵 航，. 嗜热厌氧细菌 Clostridiumsp. EVA4 菌 资源。仍有许多问题需要决，如从自界中筛选出的 株直接转化纤维素产乙醇的研究，应用与环境生物学，1999，5 种普遍存在产醇能力低、耐受性能差，代谢底物范

(Supp):170-174. l窄、副产物多，发酵条件控制等;通过改良手段得 [16] 赵 昕，高培基. 半纤维素的酒精发酵[J]. 工业生，1993，2(32):25-27. 到的重组菌的乙醇产率和耐受性仍偏低，不到工业化应 [17] 陈艳萍，勇 强，刘纲，等. 戊发酵微生物及其育[J]. 纤维素 用要求;于改的菌多以实验室菌株为主;菌株改 与技术，2001，9(3):57-61. 后性状的遗传不稳定等。未来的研究将主要集中在2个方 [18] JOSHI A, GARG SK , VERMA J. Production of ethanolf rom sugarsin 面:(1)继续从自然界选高效代谢五碳糖产乙的菌种， wood hydrolysateby Fusarium oxysporum[J]. World J Microb Biot , 以扩大菌种的种质范围;(2)继续对菌种进行遗改， 1990,6 (1):10-14. 新改良方法和条件，以提高工程菌株优良性状的高效 [19] ZHANG M, EDDY C, DEANDA K, et al. Metabolic engineering of a 稳定表。 pentosem etabolism pathway in ethanologenic Zymomonmasob ilis [J]. 随着石油的枯竭和全球温效应的加剧，利用可再生 Science, 1995, 267 (5195):240-243. 木质纤维素类原料生产燃料乙醇已成为各国发展新能源 [20] 徐桂转， 春，张百. 代谢工程在再生资生产料酒精中 的略选择。相信随着研的不段深入和技术的不进 研究进展[J]. 酿酒科技，2005(9):43-47. 步，高利用五碳糖制醇的菌种必定能实现工业化 [21] 鲍晓, 东,曲音波,等. 木糖代谢基因表达水对酿酒酵母重组 应用，为推动利用木质纤

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五碳糖发酵生产乙醇的菌种研究进展

五碳糖

2010No.4

?8?SerialNo.217ChinaBrewingF

orumandSummary

五碳糖

贺应

(1.湖南农业

重点实验培养基地,

摘要:当前以质纤维素为原料制备燃乙醇已成

乙醇的菌选育是其关

了微生物发酵碳糖产乙醇的机理,碳糖发酵

良的研究展,并对今后

要论述.

关键词:五碳糖;乙醇;发酵;改良

中图分类号:TQ223.1文献标识码:A文章编号:0254—5071(201O)04—0008—04

Researchprogressinmicroorganismforethanolfermentationbypentose HEYinglong一,XIONGXingyao,,SUXiaojun.

f1.Collegeo~HorticultureandLandscape,Hu'nanAgriculturalUniversity,Changsha4101

2&China;

2.一

StateKeyLaboratoryforGermplasmInnovationandUtilizationofCrop,Changsha41012&China)

Abstract:Bioconversionoflignocellulosestoethanolhasbecomeaglobalresearchfocusinre

centyears.Thebreedofmicrobesforfermentingpen-

tosetoethanolisoneofthekeytechnologies.Themechanismofbioconversionofpentosetoet

hanolisinmoducedinthispaper.Theadvancesonthe

naturalstrainsofpentosefermentationandgeneticimprovementwerereviewed.Inaddition,t

heresearchprospectwasdiscussed.

Keywords:pentose;ethanol;fermentation;improvement 由于石油

步.

收稿13期:2009—12—23

基金项目:国家

作者简介:贺应(1985.),男,湖南乡人,在读

究工作;熊兴耀,教授,通讯作者.

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citrininproductionintheindustrialimportantstrainMonascus

purpureusSM001[J].MetabEng,2010,12(1):1-7. [33]高蓝,李浩明.红曲聚酮类次生代谢

专论与

总第217期?9?

源替代品经是解决人类能

乙醇是良的化石能源替代

比化石能源清洁,能有效减

质乙醇的产原料来源于木

质,传统的醇生产以玉米等

为人类生存必需,世界范围

而且以粮食原料生产乙醇价

木质纤维素料丰富,而且价

素类物

木质纤维

分组成,分别

水解后产生碳糖(主要为葡

物转化为醇,而半纤维素

为木糖),常情况下不能被

由于半纤素在木质纤维素

五碳糖发菌株选育工作对

制备技术发展具有重要意

过去一直被

被一些微

了五碳糖发酵菌研究进展,并展望了今后

半纤维素降解的物有木糖,阿拉伯糖等,但主要 木,约占90%[5】,因此发酵五碳糖产醇的机理究主要 集中在木糖的发酵机理.到目为止,微生物转化木 成乙醇的径主要有2条,表现在木糖转化为木酮糖途径 的差异上:一是木糖

作用还原为木糖醇,后由木糖醇脱氢酶(Xylitoldehy drogenase,XDH)作用脱氢为木糖;二是木经木糖异 构酶(Xyloseisomerase,XI)作用直接异为木酮糖.木糖 转化为木酮后,通过木酮糖激酶(Xylulokinase,XK)磷 酸生成5一磷酸木

phatepathway,PPP),再通过糖酵解途径或ED途径生丙 酮,经丙酮酸

般情况下,酵母菌和丝菌通过途径一代谢木糖产生 乙醇,细菌通途径二谢木糖转

木酮………径

XI(途径二:细菌)

糖酵解EMP/ED--~乙醇

2自然

2.1酵母菌

酵母菌利用木糖转化为醇的能力较强,主要有管 酵母(Pachysolentannophilus),树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)3种类f9]. 其中目研究得最多且具有工业应用前景的是休哈塔 假丝酵母和树干毕赤酵母.汤斌ol筛选一株休哈塔假 丝

浓度为60g/L时的乙醇产量分达21.6g/L~H24.2g/L.树干 毕赤酵母能很好地利用木,副产物较,乙醇转化率较 ,几乎接近理论值0.51g/g(乙醇/消耗的糖)[111. 2.2细

细菌发酵底物广泛(包括

间短.能用木糖产乙

(Clostridiumthermohydrosulfim'cum),多粘芽杆菌(Bacil. 1uspolymyxa),大肠杆菌(Escherichiacold,嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila)等].LACISLS等【13]报道一株 端嗜热细菌Clostridiumthermohydrosulfuricum,该细菌在 木糖培养基上连续培可获得0.44g/g~.厌氧热梭 菌可以直接利用纤维素和半纤维素产乙醇?.韩如彭等[15] 分离获得一株嗜热厌氧纤维素降解细菌Clostridiumsp. EVA4,在最适条件下

2-3真菌

真菌发酵木糖的研主要集中在尖廉孢菌(Fusarium oxysporum)和粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)2类菌上_l61. 目前道能发酵木糖产乙醇

sp.NFI.ATCC20766,FsambuciumVTT—D一77056等.JOSHI A等筛选出一EoxyspommD.140,发酵54.8g/L木糖 溶液获得乙醇最大浓度13.2g/L.真菌产生的系较丰 富,包括纤维素酶和半纤维素酶等,不仅能发酵单糖,而 且还能发酵二糖

3五

3.1基因水平改良

自然界中微牛物多数

五碳糖,部分微生虽然能同时利用五碳糖和碳糖, 乙能力却很低.基因工程方法是一种非常有效的 生物遗传良手段.目前,利用该技术来获得五碳糖稳 高效转化乙醇的菌株,研究思路主要有2条:一是能高 效代谢六碳糖的菌种中引入五碳糖代谢途径;二是向 利用混合糖但产

3.1.1引入五碳糖代谢途径

酿酒酵母Saccharomycescerevisiae~运动发单胞菌 Zymomonasmobilis都能有效利用六碳糖,是引入五碳糖 代途径构建工程菌的好宿主,也是前主要的研 对象.虽然两者都不能利用木糖,却能代谢木酮糖产乙, 因此研究要采取2种途径引入木糖向木酮糖转化的

2010No.4

?10?SerialNo.217ChinaBrewingF orumandSummary

谢途径[恻:一是同时引入分别编码木还原酶XR和木糖 脱氢酶XDH的2个基因,即糖还原酶基因xyn和木糖 醇脱氢基因xyl2.二是引入糖异构酶基因xylA,其编 码木糖异构酶XI,将木糖直接异构转为木酮糖. 同时引入xyll~1]xyl2基:酿酒酵母不能用五碳 糖,前许多研究是通过途径一引入木糖谢途径. 鲍晓明等构建同时具有木糖还原酶因xyn和木糖 醇脱氢酶基因xyl2以及超表达醛tall和转酮tkll基 因的酿酒酵母重组菌株,并试图通过增强XDH的表达来 减少木糖醇的累,结果发现,当XR/XDH比值为0.06时, 产物中检测不木糖醇,其他副产物也所下降,而乙醇 得率却有所提高.杨志等克隆毕赤酵母的xvl1和

丝酵母的xyl2构建出了整合质粒Y[p5一kanR-xl2, 以期整到发酵性能好的酿酒酵

引入xylA基因:细菌的木糖异构酶直接将木糖转 为木酮糖,不需要辅酶子,初被认为是构建利用 木糖的酿酒酵工程菌的便利途径.鲍晓明等嗜热细 中克隆木异构酶基xylA并转移至酿酒酵母得到 重组体H612,首次在国内成功实现xylA在酿酒酵母中的 活性表达;同时为了使木糖谢流向乙醇生成的方向,又 在转化子引入并超表达转酮酶基因tkll和转醛酶基因 tall,得到的菌株可以木糖,乙醇浓度达1.3g/L.沈煜 将来自嗜热细Ther1]lusthermophilus的xylA和酿酒 自身的xksi,插入酿酒酵母工业菌株NAN.27的染色 体中,到程株NAN.114,木糖耗率和乙醇产率均 有较大提高.L1UXL同等通用xylA和xksi同时转化酿酒 酵母EF一326获得EF1014,不仅能在木糖为一碳源的 培养基生长,而且能在厌氧条件下产乙醇.目前为止, 能到活表达xy]A的酿酒酵只是少数,而且重组酶 的最适温度和最适pH值偏高,导致得到的工程菌利用木糖 转化乙醇的效率

运动发酵单胞菌发酵六碳糖的力稍次于酿酒 母,不能代谢五碳糖,也是通过引入Xv使株能谢 糖的主要研对象.ZHANGM等[19]将取自大肠杆菌的木 异构酶基因~ylA,木酮糖激酶基因~ylB,醛酶基 talB和转酮糖基tktA4个基因引入运动发酵单胞菌中 重组菌CP4(pZBS),4种酶均到活表达.在木糖 为唯一碳源的培养基中CP4(pZB5)的乙醇产量达到理论 值的86%.为增强引入基因的稳定性,同为了扩大运 动

M等口分别于2001年~12oo2年

araA,araD,talB和tktA这7个基因的纵插到运动发 单胞菌染色体上乳酸脱氢酶基因(1dh)所在点,得到 菌株AX101能发酵木糖和拉糖,乙醇产率达到理论 的84%.而一方面解决重组质粒载体不稳定的问题, 整合后的菌株显示出良好稳定性;另一方面造成乳

3.1.2引入高产乙醇关键酶基因

自然界有些微生物能代谢混合糖,包括五碳六 碳糖,但乙醇率很低.通过高产的关,能大 大高菌种对乙醇的转化能力.目前类研究的主要对 象是大肠菌(Escherichiacoli).肠杆菌能代谢五碳糖 和六碳,但缺乏丙酮酸脱羧酶,而且乙醇脱氢酶II活性 又低,所以其乙醇产量很低.INGRAML0等最先将 运发酵单胞菌中的丙酮酸脱羧酶pdc和乙脱氢酶adh 基因引入到大肠杆菌中得高水平的表达,此工程有较 好的产乙醇能.在此基础上进一步在乙醛平板上筛 选得到菌株K011,K011能好地发酵木糖和葡萄糖 产乙醇,是有效发酵混合糖最为理想的一. 很多重组大肠杆菌由于所引入的基因存在于质粒 上,稳定性较差,因此须向养中加抗以防止其 丢失.HESPELLRB等[剀利用基因重组技术将含有PET 操纵子的pLOI297质粒引入营养缺陷型菌株FMJ39中获 得FBR3,FBR3发酵能接近K01l并能维持性能稳定.高 文等【划将大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶pn基因连同运发 酵胞菌的pdc和adhB肠杆菌TOP10感受态细胞 获得重组菌E.coliTOP10一pfl,也能稳定地利用葡萄糖和木 糖产

3.2细胞水平改良

原生质体融合技是将遗传性状不同的2个细胞 一个新细胞,使两亲株的整套基因相互重组合的一 种技术,属于细胞工程.国内外对原生体融合技术的研 究比较成熟.过原生质融合进行基因重组已经成 为微生物遗传育种的一种有

采用原生质体融合技术可以酵母菌获得谢木糖 产乙醇的能,研究者们行了多方的研究.涂 东等[蚓将季也蒙毕赤酵母(Pichiaguillermondi13和休哈塔 假丝酵母(Candidashehatea)进行原生质体融合得到融合 XX2,能代谢木糖,对照相比乙产提高了37.7%. KORDOWSKAWM等口5】采用原生质体融合技术得到酿 酵母和管囊酵母的融合,融合子对乙醇的耐受能力比 亲本高,但产乙醇的速率有所降

4展望

选育乙醇产量高和抑制物能力强的五碳糖发酵菌 种项长期而十有意义的工作,也是植物纤维原料 生转化生产乙醇的核心领域.到目前为止,方面的研 究已经取了许多进展,得了一些直接发酵五碳糖产 乙醇的微生物,通过利用生物技术改手段得到了一基 专论与综述中国酿造2010年第4

总第217期?11?

因工程菌株,为五碳代谢菌种的选育提供了很好种质 资源.但有问题需要决,如从自然界中筛选出的 菌种普遍在产醇能力,耐受性能差,代谢底物范围 窄,副产物多,发酵件难控制等缺陷;通过改手段得 到的重组的乙醇产率耐受性仍偏低,达不到工业化应 用要求;用于改良的菌株多以实验室株为主;菌株改良 后性状的遗传不稳定等.未来的研究将丰要集中在2

面:(1)续从自然界筛选

以扩大菌种

创新改良法和条件,以提

稳定表达.

随着石油枯竭和全球温

木质纤维类原料牛产燃料

的战略选.相信随着研究

步,高效用五碳糖制取乙

应用,为动利用木质纤维

重要贡献.

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五碳糖和六碳糖共发酵生产酒精菌株选育的研究进展

化 工 进 展

2013年第32卷第1

·151·

五碳糖和碳糖共发酵生

张 强，冀 伟，王一东

（长春理工学生命科学技术

摘 要：利用纤维质原料酵生产燃料酒是目前研究的热点。综了五碳糖和六糖发酵产精菌株选育的究进展。主要介绍了利用自然微生物、重组运动发单胞菌（Zymomonas mobilis）、重组大杆菌（Escherichia coli）和重组酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 酒精发酵的进展情况。指出定向进化或改变多个相关基因群，使细胞整体满足木糖的谢需求，以及对重组菌进随机突变、进化育并结合现代高通量筛选等技术是未来研究工作的

关键词：燃酒精；纤维质原

中图分类号：TK 6 志码：A 文章

Research progress of strains using pentoses and hexoses in ethanol

production

ZHANG Qiang, JI Wei, WANG Yidong

（School of Life Science and Technology ,Changchun University of Science and Technology， Changchun 130022，Jilin,

China ）

Abstract ：The research on fuel ethanol from lignocellulosesis a hot topic. Research progress of strains using pentoses and hexoses in ethanol production was reviewed. Progress of natural microbe, recombinant Zymomonas mobilis, Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae was presented. Direct evolution or changing a number of related gene cluster that make the overall level of the cell to adapt to xylose metabolism, and random mutagenesis and evolutionary engineering of the recombinant strains combining modern high-throughput screening are the focus of future research. Key words：fuel ethanol; lignocellulosic material; Zymomonas mobilis; pentose; hexose

纤维质原料是地球最丰富的可再生资源，主要由维、半纤维素和质素构成。我国每年可利用的维质原料约在7×108 t，主要来自农业、林、工业以及城市的废物，这些都是精生产的富原料。 随着世界能源危机日趋恶化，利用成本低廉的维质原料发酵

尽管纤维质原来源广泛、成本廉价，生物转成酒精的工艺过程非复杂。目前整体水平尚处于中试阶段，要由于原料预处、纤维素酶解、水物发酵三大关键技术尚未取得工业化突破。有关纤维质原料制取酒精的预处理技术、

技术目前论述较多，为纤原料酒精生产提供了新的研究思路。因此本文要对另

纤维素水解要产物是葡萄糖糖，而半纤维素水解产物要是木糖等五碳糖。传统用于精发酵的生物，例如酿酒

收稿日期：2012-07-05；修改稿期：2012-07-15。 基金项目：林省科技发展重点项目（20120411）。 第一作者及联人；张强（1969—），男，博士，副教授，主要从事生物质能源的研

·152· 化 工 进 展 2013年第32卷

维质原料的木糖，可

增加25%[2-3]。

因此选育能共发酵碳糖和六碳糖生产酒精的菌株，对于实现纤维

本文主要介绍了利用微生物、重组运动发酵单胞菌、重组大杆菌以及重组酿酒

1 自然微生物

过去人们一认为木糖不能用于发酵。直到1980年科家发现，一些细菌、酵母菌等可过发酵木糖产酒精，目前

主要包括树

酵母（Pachysolen tannop hilus）、休哈塔假丝酵母

（Candida shehatae）和

够利用葡萄糖也能木糖进行酒精发酵。汤斌 等[4]经过筛选

后利用木和葡萄糖进行发

时，酒精产分别达到21.6 g/L

们目前研究多、最深入且最具工业应用

Agbogbo 等[5]首先采用树干毕赤酵母

（P. stipitis CBS 6054）葡萄糖和糖合（60g/L）进行了详细酒精发酵研究，见表1。验结果表明，菌体对葡萄糖利用优先于木糖，葡萄糖大部分于细生长，而木糖主要用于精合成。因此虽然萄糖的消耗较高，但酒精得率相对较低；而木糖虽然消耗率较低，但酒精得率相对高。所以从表1中到随着混合物中木糖比例增高，酒精得率也明显增

后来Agbogob 又上述菌种作为发酵菌种，将玉米秸秆经过稀硫处理后，用过滤后的

表1 干毕赤酵母发酵

酒精生产率 葡萄糖消

底物 /g?(L·h)－

1

/g?(L·h)－1

/g?(L·h)－

1

/g·g

－1

100% G 0.24 0.58 0 0.42 75% G+25%X 0.19 0.58 0.28 0.4 50%G+ 50%X 0.19 0.54 0.37 0.44 25%G+ 75%X 0.2 0.54 0.42 0.45 100% X

0.2

0.46

0.44

注：G 为葡萄糖；X 为木糖。

8 g葡

0.44g/g[6]。

Ferrari 等[7]利用稀硫酸处理的解液，采树干毕赤酵母（Pichia stipitis NRRLY- 7124.）作为发酵菌，在氧传递率 2.4 mmol/ (L·h)，pH 值6.5情

虽然树干毕赤酵母能够五碳糖和六碳糖，但对酒精和抑制剂耐受度，导致酵液中酒

工业生产的应用。脱

果。作者用湿热预处理（195 ℃，15 min）后的玉米秸秆水解液，分采用中法、饱和生石

干毕赤酵母（ Pichia stipitis 58376）对脱毒后的水解液进行精发酵。结果表明：树干毕赤酵母对玉米秸秆水液中抑制剂很敏，经过3种法脱毒处后，酒精得率都得到明显提高。最佳的脱毒方法饱和生石灰法，酒精浓度达到12.2 g/L，

酒精得率

2.1 究思路 目前对

菌种研究除了自然微生物外、主要集中在运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）等基因改造上。运动发酵胞菌和酿酒酵母生长速度快，酒精得率高，但是不能够用五碳糖；而大杆菌虽然能够六碳糖和五碳糖，但酒精得，副产物，所以研究者往往运用基因工手段来解决这些微五碳糖和六碳糖共发酵的问题[9-11]。目前研究思路包括：一是在效代谢六碳糖的菌种中引入五碳糖代谢途径；二是向能利用混合糖但酒精得率低的菌种中引入高酒精关键酶基因，例如来自运动酵单胞菌的两个酒精转化重要基因pdc （丙酮酸脱羧酶基因）adh （酒精脱氢酶基因）。通过这两种方法实现五碳糖和六碳糖高效酒精

2.2 碳糖和六碳糖代谢途径 葡萄糖很容易利用的碳源，许多微生物都能够利用葡萄糖发酵生产精。葡萄糖先经过糖酵解途径ED 途径生成丙酮酸，然后丙酮酸在丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶作用下生成酒

五碳糖的代谢主是指木糖的代谢，传统的酿酵母体内因

第1期 张强等：碳糖和六碳糖共

能利用木糖，但可以利用木糖的异构体——木酮糖。自然界中可以通过两种途径转化为木酮。在真菌中，木糖在糖还原（xylose reductase）和木糖醇脱氢酶（xylitol dehydrogenase）共同作用下使木糖转化为酮糖；而在细菌中，则过木糖异构酶（xylose isomerase）一步转木酮糖[7]。木糖能够转化为木酮是实现木糖酒精发酵关键。利用木糖进行酒精发酵，代谢径如图1所示。糖化酮糖后，过木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，在转醛醇酶和转酮醇酶的作用下，5-磷酸木糖进一步转化成葡萄糖-6-磷和甘油 醛-3-磷酸，由此进入磷戊糖途径（PPP ）[12-13]，最终丙酮酸脱羧还原为酒精。 2.3 重组运动发酵

运动发酵单胞菌是目唯一通过ED 途径厌发酵葡萄的生。它拥有高的将丙酮酸转化成酒精的丙酮酸脱酶（pdc ）和酒精脱氢酶（adh ） 酶系统，此动发酵单胞菌生长速度，酒精得率高，是不能利用碳糖[14-16]。因而可以将与五碳糖代谢途径有关的酶引到该细胞中，从构建重组运动发酵单胞菌，使其能代谢利用五碳

这些酶包括木糖异构酶xylose isomerase、木糖激酶xylulokinase 、转醇酶transaldolase 和转酮酶transketolase 。 人们早期仅将木糖异酶基因以木酮糖激酶基因转入到运动发酵胞菌中，但研究结果并不理想，主要因为转醛醇酶和转酮酶的活性太低，而这两种酶是五碳糖代谢的关酶。后来美可再生能源实验室Zhang 等[17]来自大肠杆菌的木糖异构酶（XI ）、木酮糖激酶（XK ）、talB （转醛醇酶基）tktA （转酮醇酶基因）一同转入到运酵单胞菌中，得到组运动菌Z. mobilis CP4 （pZB5）。然后利用该菌株糖（25 g/L）作为唯一碳源进行酒精发酵试验，酒精率可达到理论值的86%，在木糖和萄各25 g/L 组成的混合培养中进行酒精发酵试验，两种糖的转化率都可达到95%。后来Zhang 等又利用同源重组技术将运动发酵单胞菌进行木糖酵所需要的7个因进行染体整合，整合菌株在4% 葡萄糖和4%木糖组成的混合培养基中行酒精发酵试，酒精率达到理论值的83%。这果与前面重组菌株CP4的酒精得率结果非常接近，整合菌株大大增加了外源基因的稳定性，酒精发酵的副产物也明

Chou [18]利用磷酸戊途7 代谢基因构建了能同发酵葡萄糖和木糖的基因工程菌株 pZB301，对含葡萄糖30 g/L、木糖30 g/L混合培养基进行酒精发酵试验，酒精的得率达到理论

图1 五碳糖和六碳糖酒精发酵途径

·154· 化 工 进 展 2013年第32卷

82%～84%。

但是以上些菌种由于木基因都存在于质粒中，为防止质粒的丢失，往在培养基加入一定量

大肠杆菌可以利用葡糖等六碳糖和木糖等五碳进行酒精酵。由大杆菌的谢机制以及糖代谢途径比较复杂，体缺乏强有力酒精发酵酶系统，酒精只是其代谢产物中很的一分。因此对于大肠杆菌改造目标是增强产酒精的能，可采用基因工程手段将运动发酵单胞菌的两个酒精转化重要基因pdc 及adh 隆到大肠杆菌中，组成PET 操纵子进行酒精发

Ingram 等[19]在20世纪80代利动发酵单胞菌中高活力丙酮酸脱羧酶基因和酒氢酶基建了PET 操子（pLOI297），并将该操纵子入到大肠杆菌中构建成基因工程，然用该工程菌酵葡萄糖生产精，酒精产达到理论值的84%。Escherichia coli K011是带有PET 操纵子的一种染体整合菌。 其中木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因的达水平分别出发菌株的3倍多和2倍多，被认为是近来用于发混合糖产酒精的比较理想的菌种之一[20]。Moniruzzaman [21]采用该株对玉纤氨爆破产物进行酒精发酵试验，水解液混合糖含量为47 g/L，最终酒浓度为21 g/L，酒精得率达到理论值的98%。但是，在葡萄糖和木糖共存时，是优利用葡萄糖，然后再利用木糖。后来Yomano 等[22]对KO11的适应性进行究，得对酒精具强耐受性的新菌株LY01，利用该菌对140 g/L木进行发酵，酒精浓度达到了60 g/L，发酵时间也由120 h缩短为96 h ，并且对木质纤维素水解产物中抑制剂受性远高于KO11。高文等[23]将大肠杆菌丙酮酸酸裂解酶pfl 基因连同运动发酵单胞菌的pdc 和adh 基一同转入肠杆菌TOP10感受态细胞，得重组菌E.coli TOP10-pfl，也能稳定利用葡萄糖和木糖产酒精，从而在大肠杆菌中建立了一条新的代谢糖产酒的

2.5 重组酿酒酵母

酿酒酵母是传酒精工业生产经常使的菌株，于体内缺乏木糖转化木酮糖的酶，因此不能利用木糖，只能用木酮糖。为决此问题，人们在

杨忞等[26]利用休哈塔假丝酵母的木原酶基因XYL1和热带假丝酵母的木脱氢因XYL2，分别构建出重组表达质粒pACT2-xyl1和pDR195-xyl2，并用这两个粒构建出组酵母染色体整合质粒YIp5-kanR-x12，希望通过同源重组技术将其整到酿酒酵母中，得到稳定代谢葡萄糖和木糖产酒精的重组母菌株。叶凯等[27]将木糖还原酶因xyl1和木糖醇脱氢酶基因xyl2串联在一起，导入含组型GAP 的PYES2载体中，构建了PYES2-GAP-xyl1-xyl2质，然后导到酿酒酵母中，该重组酿酒酵能高效利用秸秆中纤维素和半降解的五碳糖和六碳糖，并且申报了专利技术。沈煜[28]将木酮糖激酶因 （XYL3）隆到已含有XYL1和XYL2因的酿酒酵母转化子中，得到重组酿酒酵HSXY-251，与原始菌株相比，木糖醇的产量降低了84.9%，酒精量提高了36%。另外研发现，利用基因工程段构建重组酿酒酵母时，必须同时提高转化子的木酮糖酶（XK ）活性。然而由于木糖途径下游不畅以及氧化还原不平衡等原因，目前重酿酒酵母的木糖代谢工程还有待进一步研究。 2.6

除了前面介绍的然微生物、重组运动发酵单胞和大肠杆菌重组酿酒酵母以外，还有一其它产酒细菌的相关报道。例如克雷白氏菌（Klebsiella oxytoca K），但野生克雷白氏菌的发酵产物主要为有机酸，酒精产较低，对酒精耐受性也较差，因此对其进行改造难度较

3 结 论

利用纤维质原料生产酒精，关键一就是找到能共酵五碳糖和六碳糖的生产种。到目前为，这方的究已取得了许多进展，但仍有许多问题需要解决。第一，自然微生物普遍存在酒生产能力低、耐受性差、副产物多等缺陷；而通过基工程手段获的重组菌，酒精产率和受性仍偏低。第二，用于改的菌株多以实菌株为主，改良后的菌株遗性状不稳定，力较，难以工化应用。第三，目前研究还有很大的局限性。人们只是对某个代谢途径中单个基因或者几个基因行了改造，也就是只改变了细局部代谢平衡，对糖整个代谢中出现的问题并没有完全解决，所以结果并不

从木糖

第1期 张强等：碳糖和六碳糖共

化或同时改多个相关基因群，胞代谢从整体上发生改，从而适应木糖酒精代谢的需。另外对重菌进行随机突

相信随着基工程、代谢工程白质工程等学科的发展，面了解产酒精微生物代谢网络生理功能和控机制，进一

参 考 文 献

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代谢五碳糖和六碳糖产乙醇重组大肠杆菌的构建

代谢五碳和六碳糖产

李学

(首都师范学生命科学学院

摘要:利用PER和分子克隆技术将运动发单胞菌乙醇

连接转化至大

建 的重组菌不能够利用葡萄糖也能够利

先

利用葡萄糖。

关键词:丙酮脱羧酶基因十运动发酵单

1引言

本质纤维是一种非常有吸引工业制乙醇的原料(它要来源于农作物废弃物，其 解产物中

10,,4096木糖则不能被充分利用。 六碳塘较容

因此，如果找到一种能同时利用碳糖和六碳糖醇的菌种，理论上可以高乙醇产量的 25,。 运动酵单胞菌(Z(脚omonas mobilis)是一种可用于大规模醇生产的优良菌种，最 早发现于非洲等热带地区的酒中，在厌条件下主要通过ED径代谢萄糖”1。2= mobilis可以酵葡萄糖、果糖、蔗糖等六糖产乙醇，不能用五碳糖。磷酸化的葡萄 糖经ED途径产生丙酮酸，再经丙酮酸脱氢酶PDC脱羧生成乙醛，继而在乙醇氢酶ADH的 作用下由NADH还原形成乙醇。这种强脱羧酶一乙醇脱氢酶(PDC—ADH)系统在

常见，而在细中却很少见，糖酵解生成丙酮酸通过

物(如乙酸、酸等)。这些副产物的产在降低糖转

有着不同程度的

的水平 又较低，但是它含有代谢五碳糖的酸戊糖途径

糖也能够代谢碳糖，但是其代谢产物包大量醛类、

部

近年来，国内外多研究者都致力于构建代谢五碳糖

mobilis 菌。Ingram等人于1987构建了由朋f

of p8}(production ethan01)纵子“3。并将该

KOll。在厌条件下，该茸可发酵半纤维水解产物中

”。。随后十多中，又有很多产乙醇基因工菌被成功构

pet操纵子为础进行改造的。在我国，目还没有成功

报道。

本文描述了从zmobilis中克隆出产乙醇

的质粒连接，构建

DGM—pdc的,coli能利用葡萄糖和木糖产乙醇。 粒

2材料和方法

2 1材料 2(1(1试剂和

酶 IPTG、X-Gal购自SIG姒公司;Taq DNA聚合酶

自北京天为时技有限公司，各种限制性内

提取试剂盒 购上海生工生物工程技术

PROMEGA公司，其它试剂和酶购自北天为时代科

公

2 1(2菌株、质培养条件 菌种和质粒运动发酵单胞

BL21由本实验。质粒pGM—T EASY购北京天为时代科

限公司。质

培养基和培条件髓培养基(10,糖，0(5,酵母膏，0(1,硫酸铵，0(1,磷酸二氢钾， 0(05蛹E酸

105pH722)3772121rpm蛋白胨，,化钠，(,酵

体培养，固体平3772培养箱中倒置培养，于,coli

糖用于培养,2(coli(pGM—pdc)“1。乙B

2，2方法

2(2(1引物设计及POR反

应

根据GeneBank中检索到的Z mobilispdc和adhB基因全序列设计引物，引物由上海

DNA 亚生物

Polymerse 进行PCR扩反，反应程为:9572预变性5min;9472变性30s，5472退45s，7272延 伸90s，35个循环:7272延伸lOmin，反应体系为50uL”1。PCR产物进

琼脂糖凝胶电泳检

测。

2，2 2目的基克隆 。 将PCR产物化回收后，与

15min。加A后的目的基

因在T4连接酶的用下与载体pGM—T EASY连接，连

感受态细胞均匀

2 2(3重组子的

挑选白色菌落接于20mL LB液体培基中摇菌过

(20uL体系)，剩余菌液置472冰箱保备用。电泳检

增出目的基因落，从剩余菡液中提取质

因

347

的质粒为重组质。对重组质粒进行测序分析，测序分析由

2(2(4乙醇发酵

中。 四种重组菌株TOPIO(pGM—adhB)、TOPIO(pGM—pdc)、BL21(pGM—adhB)、

BL21(pGM—pdc)用于 发酵实验。取lOuL生长至对

50ug,mL Amp的LB液体 培养基中，同时加IPTG(

主菌TOPIOBL21作对照。乙醇浓用气相色谱

浓

第二次发酵试验:从第一次发酵实验中筛出乙醇产量

LB液体培养基中养至对数期，412离心收菌， 发酵试验。

用冰冷的ddH20洗菌两次，用3mLddH20重新悬浮沉

(553+2)8h 20mL 不同底物培养

3结果分析

3 1 z，?6，，，s pdc和adhB基因的克隆 PCR产物8,琼脂糖凝胶电泳检测结果见图

1(Marker条带大小由

3000bp，2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp)。结果表明，扩增片段大小约为1(7kb

和1(2kb，与已知序

图3第一次

圈2

3--Markerl—pGM-pdc酶切，2—-p如t

4—pGM-adhB

Marker

3(2重组质粒的构

用EcoRI酶，进行琼脂糖凝胶电泳，结如图2。结

重组质粒

3(3基因序列分析

重组质粒经测析结果表明，adhB基因序

mobilisZM4 p99 源，开放阅框为1149bp。pdc基因序列与Z 出基因序同源性为,，有3个碱基的差异，蛋质同源性为100,，开放阅读框度为1704bp。 3 4重组菌的乙醇发酵 第一次发酵验结果见图3，结果表明:i)与对照组比较，带有

pGM-pdc的,coli

经48h发酵后，乙醇产量有明显的提高，最大浓达到0(79,(v,v)。这表明pdc基因 ,coli中得到了高效表达:2)株TOPIO比BL21的乙醇产稍高:3)培葬基中加IPTG 的组乙醇产量比不加IPTG组低，这可能是由于pdc基因的表达并不是由载体

LacZ启动，而IPTG能够诱导LacZ结构基因的

醇的产生

有所抑制，或者这种诱导表达了培养基中的葡萄糖与乙醇途径形成了竞争性抑制 用。4)动pdc基

第二次发酵实验结图4、图5。结果表明:1)带

72h的乙醇浓度别为0(76,和0(63,:2) 能够

在葡萄糖和糖同时存在时，先利用葡萄糖，葡萄糖和糖混合培养基，葡萄糖消耗 为51(6,，木糖消耗量

434258 萄糖的消耗量

6

i o 8 3

6 乏o 2 之j善蠢蕞 ? 1 蘸0(4 q O 0 256h 64h 72hOh 8h 16h 24h 32h 40h 48h 0 时问 oh 8h 16h 24h 32h 40h 48h 55h 64h 72h—?6TOf*lO 5,—?一T'O(pc}pdc)5, aH时间 —tr—TIII、10 jn—?r—T叶IO?pG}坤1 +1DPIO拇目c)W—-一O"IOPl0, —{?t?io 3,?2“—??一T呼IO?*}p“)3,?2” ?--'6--EetO ax—}10Iq0(DG{I-Mt)m —卜T?，,一lOHI --If---I'Q'[0({:GII-m1，,?N 图5第二次发酵实验糖的消耗乙

图4

4分析讨论

结果表明，携带zmobilispdc基因的

20多倍，这说大肠杆菌中糖代谢途径已有了一定改

349

mobilis 最终生成乙醇而不是其他代谢

量并没有明显的，这是因为，在耱代谢途径adhB基

用是将把芮酮酸

即使插入adhB因也不能提高乙醇产量。们下一步的

的下游，使之pdc基因一同表达，进一提高乙醇产

木糖

参考文献 r嚣ource to r廿lcwable And utilization， 1(Aristos Aristidou M两a Penni坻Me*(abolic enginocring applications Curf锄tOpinioninBiotanlmology，2000(1n:187?198 2(R(G(E(MU]LRAY，Bact

S锄b嘣比D州d W(russell， 分子克窿实验指南(第

350

发酵五碳糖和六碳糖产乙醇染色体整合大肠杆菌的构建

发

肠杆菌的构建

第25卷第2期

2007年4月

可再生能塬

RenewableEnergyResources

Vo1.25No.2

Apr.2007

发

整

高,田沈,张晶,刘继开,张亚珍,

(

摘:为了保外源基因表达的稳定性,少发酵副产物的生成,根据同源重组原理,将大肠

酸解酶pn因两侧的基因片段作为同源断,构建了带有运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因pdc

氢基因adhB的整合重组质粒PA—pn,用化学法转人大肠杆菌TOP10的感受态细胞,将经过苄青

得的重组子行PCR扩增,证明pdcadhB基因整合到了大肠杆菌的染色体基因组丙酮酸酸

因pn位点上.醇发酵结果表明,重组菌E.coliTOP10一pfl不但能稳定地利用葡萄糖产乙醇,能

木产乙醇.在大肠杆菌中建立一条新的代谢糖生成

convertingpentoseandhexosetoethanol

GAOWen,TIANShen,ZHANGJing,LIUJi-kai,ZHANGYa—zhen,YANGXiu—shan

(CollegeofLifeScience,CapitalNormalUniversity,Beijing100037,China) Abstract:InordertoimprovethestabilityofrecombinantplasmidinthebioengineeredEs—

cherichiacoliandreducetheby-productsduringtheethanolfermentation,integrativeplasmid

PA——

pflcarryingZymomonasmobilisbiofunctionalpyruvatedecarboxylaseandalcoholdehydroge—

naseIIgeneswasconstructedbasingontwopyruvateformatelyasefragmentsandtransferredinto

E.coliTOPIO.Transformantsconferringampicillinresistancewereanalyzed,PCRamplificationre—

vealedthatthefermentativegenes(pdcandadhB)wereintegratedintotheE.colichromosome withinthepyruvateformatelyasegenebyhomologousrecombination.Andtheresultfromthefer—

mentationofglucoseandxylosebyE.coliTOP10-pflindicatedthatitcanstablyconvertbothglu—

coseandxylosetoethano1.Thisresearchsuccessfullyintroducethenovelpathwayforfermenting

glucosetoethanolinE.coli.

Keywords:escheirchiacoli;integrativeplasmid;homologousrecombination;ethanolfermenta—

tionofglucoseandxylose

木纤维素是一种可再生资源,用木

素产燃料乙醇替代石油燃料,对社会经

持发展具有重要的意义.高效代谢木糖

收稿日期:

基金项目:

作者简介:

通讯作者:

糖乙醇

由

2006—11-29.

国"863"题资助项(2002AA514010). 高文(1983一),女,硕士研究生,研究方向为与发酵工程. 杨秀山(1946一),男,教授,士生导师,要从事微物学和

研

22可再生能源

(Z.mobilis)只能利用六碳糖产乙醇,所以构建 代谢糖和葡萄糖产乙醇的因重组菌是提高 木和葡萄糖利用率和乙醇产率的重要途径. 由于大肠杆菌(E.coli)繁殖快,代谢强,染色体 上具有代谢木糖的所有基因,所以近年来成为 代谢木糖和葡萄糖产乙重组菌的研究热. Ingram成功构建了乙醇重组大肠杆菌KOI1. 但需要加入氯霉素保稳表达;Dien将质粒 pL01297转入乳酸脱氢酶LDH和酮酸甲酸 解酶PFL的活到抑制的E.coliFMJ39中. 经分离和驯化得菌株FBR3:Bruce质粒 pL01297转入ldh和pn因活性受到抑的 E.coliDC1368NZNIll中.构建了2株新的 E.coli重组菌FBR4和FBR5.虽然FBR3/4/5 需加抗生.但过量表达要消耗大的碳,氮 源,对宿主细胞造成沉重谢

酮脱羧酶pdc和乙醇脱氢酶adhB基因的质 粒,转化到E.coli,得到了重组大肠杆菌 TOP10(pLPA),乙醇产量有了明显提高.此类质 粒虽然具有高的拷贝数,但不能稳定遗传,尤 在非选择养条件下质粒失.另外,大 肠杆菌在糖酵解时生成的丙酸除了发生 醇外,还通过其他途径生成副产物(如甲酸, 乳酸等).这些副产物降低糖转成乙醇的效 .同时对乙醇的产

外基因的染色体整合.可使新导人基因 稳遗传.外源基因可通过插入序,转座子 和同源重组的方法整合到宿主细胞的染色体 上.其中同源重组能按照人们所预期的基因位 置甚至碱基序列置进行染体整合【2J,并可 定向灭活靶因.丙酮酸甲酸裂解酶pn基因 乳酸脱氢酶ldhA基因是大肠杆酵过程 中催化产生物的关键酶基因.在大肠杆菌 内具有非常高的表水平【3_.I4].氧下, 编码的pfl,ldh将丙酮酸转化为甲酸和乳酸,代 表了与醇发酵竞争机制的代谢途径【5_.将 2个因所在的位置作整位点既可以增 强外源基因

本究构建了可整在E.coli染色体丙酮 酸甲酸裂解酶pn上且不需抗生素便可稳定表 达pdc和adhB基因的载体.外源基因引入 E.coli体丙酮酸甲酸裂解酶pn因的读码 框.希望通

PFL蛋白的失活来降低生产成本.提高乙醇产 量.

1试验内容

1.1试验材料

1.1.1菌种,质粒及培养基

菌和质粒:大肠杆菌E.coliTOP10由本实 室保存,质粒PA由本实验室构建,质粒pGM—T EASY购自北京天为时代科技有限公司. LB培养基:每升培基中含l0g胰蛋胨, l0g氯钠,5g酵,pH值为7.2,固体培养基 加20g琼脂;在LB培养中加2%萄(

(pLPA),E.coliTOP10一pfl;在LB培养基中加5% 葡萄糖用于E.coli同重组

1.1.2试剂和酶

X—Gal,TaqDNA聚合酶.DNA纯化回收试剂 盒均购自北京鼎生物技术有限责任公司:T4 DNA连接酶,质粒提试剂盒购自北京天为代 科技限公司;各种限

PROMEGA司:细菌DNA提取试剂盒购自上海 华舜生物工程有限公司:其它试和酶购自北京 天为时代科技有公司和北京鼎国生物技术有 责任公司;引物合成和因测序由上海工生物 工程技术

1.1.3引物设计及PCR反应

根GeneBank中检索到的E.coliTOP10

因全序列计插在pdc基因前和

的引物5端均计NaeI限制性位点:插在 adhB基因后的pn基因片断P2的两引物5端均 设计SacI限

以E.coliTOP10因组DNA为模版.用普通 TaqDNAPolymerase进行PCR扩增反应.两段基 因反应程序分别为Pl片段:95?预变性5min. 94?变30s,57oC退火45s.72oC延伸60s,35 :1'2片段:95?预变性5min.94oC变性30 s,58oC退火45s,72oC延

高.等酵五碳糖和六碳糖产乙醇染色体整合大肠杆菌的

体均为5OL,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电

1.1.4在pdc基前和adhB摹L大|后的Dn基 片段与T

将PCR产物纯化回收,Pl,P2T4连接 酶的作用下与载体pGM—TEASY连接,分别称为 pGM—T—P1和pGM-T—P2,连接产物分别转化 TOP10感受态细胞,将转化的感受细匀涂 布于含60p~g/mLAmp和X—gal

1.1.5重组子的筛选,鉴定

挑白色菌落接种于20mLLB液体培养基 中摇菌(37?)夜,进行菌落PCR和提取质粒, 用EcoRI进行酶切鉴定.够切下目的基因质 粒

1.1.6带有pd(.和adhB基因的整合载体的构建 用NaeI酶切pGM—T—P1质粒得到目的段 P1后,将段P1与经过NaeI

(质粒为本实验室已经建好的带有pdc基因 和adhB基因的pGM_TEASY质粒)相连,将P1 基因定向插入在PA质粒上的pdc基因前:再用 SacI酶切pGM—T—P2质粒得到目的片段P2后, 段P2与经过SacI酶切的PA—P1质粒相连, 将P2基因定向插入PA—P1质

1.1.7染色体整合

整质粒转化大肠杆菌TOP10的感受细 胞,加人60tLg/mL氨苄抗生素,在30,35,37?下 分别以12h为一代,在加入了5%葡萄糖的LB培 养基进行三代传代培养.由于在失去抗性选 的环境下质粒会丢失,再在加入

1:4000,1:10000的比例进行五代不加抗素的传 代培养,使质粒上的pdc因和adhB基因整合到 大杆菌

1.1.8染色体整合菌株的鉴定

根GeneBank中检索的E.coliTOP10ad— hB和pn基因的全序列设计检测引物,以 E.coliTOP10变异菌株的基因组DNA为模版, 用普通TaqDNAPolymerase进行PCR扩增反 应,反应程序:95?预变性5min,94oC变性 30S,58oC退火45S,72oC延伸90S,35个 环.反应体系为5OL,对PCR

1.1.9重组菌E.coliTOP10一pfl的发酵试验 分别

不糖含量(5%G,5%X,3%G+2%X)的发酵培养 基中,将E.coliTOP10一pfl置于35oC.TOP10 (pLPA)置于37?.转速均为8Or/min摇床上培 :将E.coliTOP10置于37?培养.每 隔12h取样,取样时用5mol/LNaOH调节pH 至7.0~0.2.用气相色

2.1同源重组片段的制备

以株E.coliTOP10总DNA为模板,经PCR 扩增成功得到P1(pn基因从375bp到1092bp 的片段,长为719bp)P2(p玎基因从1502bp 到2124bp的片断,长为622bp).电泳检测结果 图1.两断接到pGM—TEASY载体上, 经EcoRI酶切后.电证能够成功切下P1,P2 目

1'

一

Fig.1AgaroseelectrophoresisforPCRproducts

1-DNA分子量标准r,2一P1.3

l23

图2pGM—T—PI/2EcoRI酶切

Fig.2AgaroseelectrophoresisforEcoRIdigestedpGM—T— P1/2

1-DNA分子量标准,2一Pl,3

2.2整合质粒的构建

P1片段按NaeI位点定向插入本实验室已 构建好的带pdc基因和adhB基因的重组质粒 PA的pdc基因前,用BamHI单

24可再生能源

因

729bp.?_.

1IIIl冒图3HaeI酶切验证P2连接正反 Fig.3VerificaionofP2'SligationdirectionbyHaeIdigestion

1-DNA分子标准,2l:5,3一l:7,l—Maker 插入在PA质的adhB基因后得到PA—pn,用 HaeI单酶切验证P2基因的连接结果(图4).此 图4BamltI酶切

Fi昏4VerificationofP1'sligationdirectionbyBamHIdigestion

1-DNA分子量准.2一P1,3-P2 质粒已备了与大肠杆菌进行染色体整合的功 能.构建整合质粒的技术路线

?l?

zz

肠菌染色体上原有基因的片段.整合质粒转 化大肠杆TOP10的感受态细胞后,经过三代 加入抗生素和五代不加入抗生素的培养,提取 变异菌株的基因组DNA做PCR,得到的目的 片段包括原PA质上adhB因从778bp以 后的全序列,整合质粒上插在adhB因后的 P2段全序列以及大肠杆菌染色体上Dn 基因从2124bp~i]2233bp片,电泳检测 基因测序证明同源

124

1208bp

图6PCR产物的琼脂糖凝股电泳

Fig.6AgaroseelectrophoresisforPCRproducts

1-DNA分子量标准,2—30oC,3—35oC,4—37? 2.4重组菌E.coliTOP10一pfl的发酵试 E.coliTOP10一pfl在含糖和葡

基培养时,能稳定地利用葡萄和木糖产乙 醇.乙体积含量比E.coliTOP10有了一定的提 高,但是与E.coliTOP10(pLPA)相比还有较大 差距.重组菌E.coliTOP10一pfl发酵5%葡萄 时.发酵72h后乙醇体积分数为0.2%:发酵5% 糖,发酵72h后乙醇体积分数为0.14%.木 糖发酵的乙醇含量低于萄糖酵的乙醇含量. 这可能是因为

菌发酵混合糖(含萄糖3%和木糖2%)时, 发酵72h后醇体积分数为0.9%,比不含外 源基因的始菌株E.coliTOP10提高

图5整合质粒构建的技术路线图

Fig.5Constructionoftheintegrativevector

2.3大肠杆菌TOP10染色体变异株的鉴定 若pdc和adhB基因功地整合人大肠杆 菌的染色体中,则以变异菌株的DNA为模板 做PCR.应能得既包括2段基

橐1.5

l

磕0.5

0

l22436486U72

t,h

图73%G+2%X

3分析讨论

试

高.等酵五碳糖和六碳糖产乙醇染色体整合大肠杆菌的

基序列的染色体整合质粒,并以此将丙酸 脱羧酶pdc和乙醇氢酶adhB基因整合到了 大肠杆菌染色体上.得到了大肠杆菌TOP10的 变异株TOP10一pfl.同源组将基因片段整合入 染色体2种形式,一种是单交.一种双交 换.们构建的染色合质粒是一种双交 整合质粒.双交换质粒较单交换质粒有更高的 整合率【6l'1f71.一来说,在同源重组中,同源 片段越长.整合频率越高f61.同源重组获得整合 的重要条之一是在宿主细胞因DNA 和质粒DNA

,合载上同源片断Pl,P2的选择保证了同 源重

本验特点:?将运动发单胞菌丙酮酸 羧酶pdc和乙醇脱氢酶adhB基因插入大肠杆菌 的染色体中,提高了这2个基因稳定性;?使用 不带抗生素抗性标记的整合载将外源基因整合 在染色体上后.通过提将整合重组子筛 选出来.这样获的重组子就不含有何抗生素 抗基因.为工程

保.这无疑是一条便有效的构建无抗生素基 因工程菌途径;?使丙酮酸甲酸裂解酶结构基因 失活.切断了条与发酵产乙醇竞争的途径.减 了副

乙发酵试验表明.菌株TOP10一pfl稳 定地利用葡萄糖和木糖产乙醇,在大肠杆菌中 建立一条新的代谢糖产乙醇的途径.但是菌 与E.coliTOP10(pLPA)相比表较低,这主要 是由于整合在染色上pdcadhB基因的表达 受染色体组拷贝数限制.虽然其表达量质粒 表达量少.但却可以稳定

定的优越性.

为减少副产物产量,提高乙醇量和增 加丙酮酸羧酶pdc和乙醇脱氢酶adhB基因 的表达量.本实验室正在构建另一个带有运动 发酵单胞菌丙酮酸脱羧pdc和乙醇脱氢酶 adhB基因的整合质,将其插入在大杆菌 的乳酸脱氢酶ldhA的核酸序列.彻底变 杆菌的代谢途径.使大肠杆菌在厌氧条件 只能通过表达PDC和ADHB白进行发 酵.以此来提高木糖

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;

;替代能源项目:

+有关人士透露.中国石油总公司计划与英

油(BP)公司联合入股广西新天德能源公司,这将

国油公司第一次在中国投资替代能源项

;前3家公司正在磋商具体细节.包括合作

j资公司,拓展内地可再生能源业

目中国的政策鼓励清洁能源的使用,相

;会越来越大.而且目前中国不允许用高粱等

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:天德能源公司现拥有中国南最大的乙醇: 厂,每年可生产木薯乙醇达l0万t,其母公司为广西天? :昌投资公司.英国石油公司日前宣布,将在替代能源和 i可再生能源增加1倍的投资,计划未来10a内发i +展为收入达60美元的业

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