CCP免疫组化质控抗体介绍

免疫组化在病理诊断中的作用已经得到全球广泛认同。由于免疫组化是一个步骤、多因素决定的实验方法，各实验室采的组织处与染色方不同、抗体克号和来源不尽相同，因此染色结果良莠不齐。质差的色切片可误导最终的病理诊，产生严重后果。为了使免疫化结果达到稳理想状态，外病理学家在免疫组化准化和质量控制方面进行了极地探索，

阳性部位：细胞核

对照：乳腺

雌激素受体存在于正常女阴皮肤、上、基底细胞，还有正常子宫上、肌细胞以及正常乳腺上皮细中。会阴部纤维上皮性息肉、平肌瘤、冲经鞘肿瘤、血管肌纤维

实验表明在以下肿瘤中也有表达：乳癌、上皮样平滑肌肿、黑色素瘤、脑膜瘤、化性血管瘤、甲腺腺瘤、卵巢和子内膜肿瘤、侵袭性盆腔粘液瘤、一些肺。ER表达阳性的乳腺病人如果对其进行激治疗往往有，后较，因此ER（与PR和C－erbB－2

C－erbB－2

阳性部位：细胞膜

对照：乳腺癌

C－erbB－2是一种癌基因。此基因编码的蛋白是相对分子量为185 000的膜蛋白，可以抑制氨酸激活性。该基的过度表达和扩增可见于多种肿瘤，尤其是癌中，与肿瘤的分化程和分级有密切关系。Wright等人乳研究表：此基因超量表达术后早期复发的危险增，总生存期

此抗体主要作为判断乳腺癌、卵巢癌、子内膜癌及消化肿瘤预后的参考标以及腺癌患者是否可以使用赫赛进行治疗。研表明，对ER／PR和c－erbB－2三者同时阳性表达

CD117

阳性

对照：淋巴结、胃肠间质肿瘤

c－kit原癌基因定位干染色体4q11－12，编码相分子质量为135 000的Ⅲ型跨醅氨酸激酶受体蛋白。配位体是早血细胞生长因子，也是生细黑色素细生长所需。CD117在正常细胞和肿瘤中均有表达，包括肥大胞、蜕膜细胞、80％～100％胃肠道间质瘤、黑色素、一些生殖细胞肿瘤、某些AML、些皮肤纤维瘤、某些管肉和Ewing肉瘤。平滑肌肿瘤和神经性瘤CD117阴性。由CD117广泛表达，因此用范围较窄。此抗体主要用

CK（pan）

阳性部位：细胞浆

对照：结肠、乳腺

AE1可与太多数的酸性细胞角蛋白（Ⅰ型）反应，而AE3识别有已知的碱性细胞角蛋白（Ⅱ型）。AE1／AE3抗体的混合物，括CK1－8、10、14、15、16、19。该抗体与几乎所有的上皮反（除肾上腺、肝细胞肿瘤，精原细胞瘤，一细胞肿瘤，一些类癌和岛细胞）而与些中间丝状蛋白无交叉应。此抗体可用于鳞状细胞肿瘤（包括梭细胞变异型）、腺癌、形细癌、小细胞、类癌、多型性腺瘤（上皮成分）、胸腺瘤、间皮瘤（包括瘤样成分）、脊索瘤，生殖细胞瘤（除外精原细胞瘤）、滑膜

CD3

阳性部

对照：淋巴结

CD3分子是由五条肽链以非共价键组成复台分子，分别称为γ、δ、ε、ξ、η，表达于有T细胞面。CD3分子与T细胞抗原识受体（TCR）组成复合受体分子，是T细胞别抗原的主要识别单位，具有稳定TCR结构和传活化信号的作。了小脑蒲肯野细胞弱阳性达CD3之外，B细胞、细胞、巨

因此，CD3是比较特异的T细胞抗体。抗体可识别瘤和非瘤性的T淋细胞及NK细胞。某些蕈样霉菌、多形性淋巴和间变性大细胞淋巴瘤出现CD3阴性。CD3ε可以表

CD20

阳性部位：细胞膜

对照：淋巴结

CD20分布于所有成熟的B细，但浆细胞多为阴。大多数B细胞淋瘤、一些骨髓瘤和约50％的B巴母细胞淋巴瘤表达CD20，并一些T淋巴细胞也弱表达CD20。CD20是B细较异的抗体。此抗体多用于标记B淋巴

EMA

阳性

对照：阑尾

EMA是一种相分子质量为400 000的跨膜糖蛋白，广泛分布于各种上皮细胞及来源的肿瘤。此抗体可以标记大部分正常上皮及上皮性肿瘤；在间皮瘤中常为胞浆着色；细胞、各种受T细活化外周血B胞及一些间质（脊和神经周围纤维细胞）也为阳；淋巴瘤中T胞丰富的B细胞淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤及其变异型、95％的大细胞间变型、单核样的B胞淋巴瘤以及18％的T细胞淋巴瘤阳性表达；还可在些骨髓瘤、60％的结节性淋细胞为主霍奇金淋巴瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤等肿阳性表。EMA常用于间应和间皮瘤的鉴别（间皮瘤中的膜染色更强）；间皮瘤和腺的鉴别（前者细膜着色）；基底细、鳞状细胞与皮肤基底胞癌的鉴别；淋巴结ALK阳性的大细胞间

阳性部位：细胞浆

对照：乳腺癌

免疫组织化学：乳腺、女性生殖道组织、巢、正常的外皮肤。另外，还表达外阴纤维上皮囊肿、阴道平肌肿瘤、阴道经鞘肿瘤，阴道血管肌维母胞瘤，浸润性骨盆血管黏液

浅谈免疫组化室内质控体会

来源：医源世界

免疫组化在我各医院已广泛开展，但多以说明书为基础操作规程，多厂家操作不，抗体效价滴度不尽相同，技术水平参差不齐，展项目多寡不一，判断标准各持一词，内质控更开展甚，成个别病大夫对免疫化果判地接受。介目前情况，免组化室间控室间调查势在必行。室间质控及室间调查的基础是室控，要想获得良好地真实地结，把好操作关，能保证免疫组化真正起到提示、证病理结果及指导临床治疗的作用，而室间质控终究是各实验室自身能解决的，作为们基层工作人员以待，唯室内质控可解燃眉之急，而免组化室内质控尚初级阶段，本自开展室内质控来，略有体会。现将对间质控的期盼与本科室内质控开展的体

尽管免疫组化在我国开展已有近20年的历史，但是各级医院设备差悬殊，技术力量水平不一，且普及到、下层医院还是近几年的事，用试剂是国外产品，只有粗略说书，倒背如流，实际工作中仍会遇一些一时难以解决的问题：结果可信度；抗体；结果判定标准；防脱剂的应用；反时间与温度的关系；实验温度冬夏温差太大；阴阳对照；PBS缓液冲洗度与量；抗原复等。于以上问题，们急于期盼中心实验室早日开展间质控与调查，及室内控的指导工，现将对中心实验的室间质控的期盼与我科近几年

1、对

1.1 中心实验应指出各试间的差异及优缺点，建议统一使

1.2 严格定操作规

1.3 建立统的抗体效价定方法，并提供给各基层实验

1.4 每年基层实验室

1.5 作好实验室技

1.6 定期开质控会议，提供资料，褒优批劣，促进

2、本

2.1 严格作规程，制定从取材、固定、脱水

2.2 比较家试剂，旦确定不轻易更换，尽量用

2.3 自制室质控片、

2.4 关于防脱片问题

（1）由于基层标本量少，形成批量，防脱剂每次配制太，造成大量浪费，践证明需每次现配。少量配（以APES防脱片剂为）每用前现涂：吸0.1ml，加

（2）玻片提前清洗干净，1%盐酸酒精浸泡后，再用弱碱性洗涤剂清洗，以除去玻表面的脂质及

（3）如稀释防脱片剂量太少能浸泡，可先用精灯将玻片预热60℃左右，用手背微烫，后用微量吸管吸取约40～50μl的1:50稀的APES防脱片剂，均匀玻片，干燥后，即可捞片。每次现涂（

（4）烤片时间：第2天工作疫组化可60℃烘烤过夜，当日

（5）捞片必须一成功，防止气形成而脱片，也防止玻片上的APES

（6）切片尽薄，以3μm厚为佳，实践证明

（7）溃疡坏死组织易脱片。

（8）冲洗过猛易脱片。

（9）整批脱片为脱片剂处理当；单张脱落为捞片不当或标本

（10）为防止个别脱片，每标本多准备1～2张备用片，操作同，至抗原修复后，易片步骤本过去，方可将备用片弃掉，但造成修复前3% H2O2用量大，与一抗、抗同步完，根据本科经验，可用临床使

（11）二步试剂可节步骤，减少洗涤、加液

（12）APES防脱片剂易燃、易发、易与玻璃制品合，应存放密闭的塑瓶中。本室买成APES防脱片剂于原包装封闭不严，1个月后就挥发0.5ml左右，大量晶在封口处形成，原有结晶下沉，后放玻磨塞瓶中，又解不开瓶塞，粘在一起，

（13）为防止脱片，如头天切片，可烤完片后二天脱蜡至水后再进行疫组化操。如头一天脱至

2.5 组织块大小与试剂显色的关系

应在显微镜下选择有意义的组织块，如组块太大，可在脱蜡至水用锋利的刀片将组织块至所需大小，一般0.6～0.8cm佳。因所有试剂都带滴嘴，一滴约50μl，本太大、抗体量太少，显色不足，必须多加试才能纠正，由试太贵，半滴要滴口与标本触，又易将片中液体带试剂，造成

2.6 对于反映温度与时间问题

凡是要求在37℃反应或4℃过夜的试剂，工作中可遇到加一抗、二抗时安排不合理，从而延长工作时间。如11加一抗，下午2点上班就超过一抗1～2h规时间，反应时间过可造成假性，以工作人员经不能按时上下班。本经验，根据下列温度与时间关系图，将温箱按中午时间调到图中夹角所示温或最长不超过表所示温度，即可上班后加二，如上午11点加一抗。将温度调至34℃，即可在下午2:20以二抗，作人员可自排时间。但应注意表中的时间为一分：0.5h30min；0.75h为45min，依次类推。横轴为时间，纵轴为温度。方便实

注意：显色时间过长阳强，显色时间太阳性程度弱。不得超过表所示时间，控

2.7 DAB显色时间

DAB显色时间长短不一可造成性程度不一（尤其对弱阳标本）。规范显色时间至关要，说明中3～10min限

2.8 对于要求室温反映的试剂

标准实验室温度是18～22℃，实际工作中却不，条件差的实验室天可低于12℃，夏可高于37℃，冬夏温差可达45℃。一切促反应温度最关键，反应程度也冬夏有，也是造果不定的具体原因。此种试剂可把温箱

2.9 本科试剂质控

由于某些基层实验室标本量太少，试剂包装量大些，造效期内抗体滴度下，由于抗体效价储放时成反比关，且为一渐进过程，掌握抗体效价，试剂质控的重要环节。我科是选用阳性强不同的标本，在购试

2.10 密切观察冰箱温度

上下格、内位置的温度，尽量放4℃位置，

2.11 为避免操作中的系统误差、偶然误差可自制室内质控物，以阳性和阳性两种为佳随每批标本作室内控。（因每批试剂只带1～2张性对照可室内质控物进行监）自制室质方法是：将定阳性程度的标本多做块，每次切十张，烤干备用，每次取两张随常规作，观察其稳定程度。室内控物如弱阳性（-）或增至一个（+）以，而阳性质控物由（+++）降至（++）或至（++++），差个（+），即为失控，立刻寻找原因，并记录在质控图上，分别将弱阳（±）和阳（+++）两质控物每次所测结在质控图上绘出曲线，进行统计，

2.12 PBS缓冲冲洗的量、酸碱度、冲

（1）配好的PBS缓冲应用0.1M盐酸或氢氧

（2）用

（3）冲力以水柱断续为佳，冲力过大性偏低并易脱，冲力偏小背景色。冲集中时易周边背景显色。标本太大应动冲洗，不要只冲一个。但注不要集中力量冲洗标本

2.13 滴加试前应尽量将PBS缓冲液沿组织块周围用滤纸

2.14 着色定位

染色成功的组织背景清晰，定明显，核、浆、着色与临床病理符或基本相符，如失需寻找原。除操作原因外，是否有非特性多克隆抗体存在，并注意标本前期处理的操作是否当。再者室内质控片是否清晰，

2.15 复染

大多数实验室用苏木素复染，数不复染观察。由于染苏木素核蓝紫色，尽管染色间比常缩短很多，一定程度上仍可与DAB显色顺色，而复染又影响观察病理组织结。本室甲基绿为复染剂，核绿色与黑

2.16 抗原修复

（以微波修复为例）经多次测量温度，观察高、中、低火与时间的关。本以中火4min，观察液后，停置5min，开低火5min，

2.17 抗原暴露用酶消化液

一次不要配

2.18 切片应以3μm为宜，因界限3～5μm，5μm厚接近3μm的1倍，胞

2.19 良好的取材、固定、脱水程是免疫组化质控的前提，浸蜡度固定的条件下，随大量标本固定、脱水，往往固定脱水好，专用中性甲醛固定及酒

2.20 特异性背景着色

（1）染

（2）血清蛋白密封不充分。

（3）内源过氧化物酶未完全阻断（

（4）内源性物素未断（肝、肾、胰腺，含

（5）

（6）防脱片剂太厚。

（7）缓冲液酸碱度未调。

2.21 结果判断标准

各厂家试剂敏感度及特异性不一致，在厂家试剂确后，我科判断标准根据、浆、膜位的数量及显

（1）间质晰，无背景着色，无肿瘤细

（2）间质清，无背

（3）间质清晰，无背景着

（4）间质清晰，无背景着色，肿瘤细胞着色及阳性强度达25%～50%为（++）。

（5）间质清晰，无背景着色，肿瘤细胞着色及阳性强度达50%～75%为（+++）。

（6）间质清晰，无背景着色，肿瘤细胞着色及阳性强度达75%以上为（++++）。

综上所述，免疫组化操作较简，影响因素却较，工作人员必须高度责任心、娴熟的术操作、严格的操作规程、完善的室内质制度、紧密结合理组织学，并有中心实验室间质及室间调查监控，才能取得满意

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90%或无水乙醇质 B,5

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热修无热修复缓冲枸橼酸

热孵育

微波炉 tris-EDTA/EGTA pH9

压

蒸锅 N/A

其他申

热修复详情热时间加热维持时间最高温

报

其他修复生物素封闭是否

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Polymer conjugate

其他

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显色剂 DAB 显色剂详情生产商产

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染色方请填自动染色机的型号，如为手

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参1加免疫组化质控的步骤

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[教学设计]免疫组化技术的标准化质控管理

免疫组化技术的标准化

免疫组化技术的标准化质

本

【

免疫细学是免疫学细胞化学相结合的一个分支学科，它是在免疫理论础上利用与抗体的特异性反应，胞或组织中定位抗原或抗体。免化技术用标记或显色物标的抗体测细胞和组内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目的。随免疫组织化学技术在临床研究与诊断中的广泛应用，因其反应步骤多，响因素复杂，质控制已被越来越多的病理术专家重视。2008年全国病理学技术进展和应用研讨会上提出质控用到免疫组化技术上。本文对免疫组化技术

1 标本的固

为了好地保持细胞和组织有的形态结构，止组织自溶，必须对标本进行固定。本固定的好是影响病诊断的关键，同也响免疫组化的结果，所以固定是质控要也关键步骤。影响标本定主要因素有以下几。?标本离体固定不及时:般离体标本要求15 min内须固定1，最好是手术室由专业的护士将离体的标本用清水冲洗干净后立即放入量浓度40 g/l中性甲醛内，固定液的用量为标本积的5,10倍。而目前本院手术室做不到这一点，这就要求病理技术员接到标本后要及时固定，能延误时间。但是在手术室和路上延误的间不能控制。因此，呼吁临床医生应和病理联合起来，将标本固定地点放在手术室，以使标本及时固，减少因定不时而出现的诊断难。?标本固定时间:40 g/l中甲醛渗透

增加浓度反降低渗透速度。一般手术用40 g/l中性甲固定的时间以12,24 h为佳，最长不要超过72 h;如穿标用aff液固2,4 h。有研究显，用40 g/l中性甲醛固1周后的标本，其组织抗原不能被检1。但是，日常工作中常常遇到有人催发病理报告情况，们希病理科的报告好像检验科那早晨下午就能拿到。这种情况只有缩短制片程序，包括固定时间，这种操作只增加病理诊断的风险，埋下误诊的隐患。?固定液的种类及浓度不恰当:免疫组化检测用的固定液有40 g/l中性醛、40 g/l钙?甲醛、40 g/l甲醛磷酸缓冲液等。穿刺标本可用aff液固定。固定液浓度过高、过低都会因组织固定差而导致组抗原丢失或易出现非特异性背景染色，而影响免疫组化结果。edta是用于骨组织脱钙的螯合，因在钙过程中对组织的破坏性小而得到广泛使用，缺点是脱时间太长。?标本固定时处理不当:如淋巴结组织往往因包膜没切开，影响了定液的渗透，使组织固差。大标本因没切开固定，而使标本固定不匀等，可影响免疫组化染色。我接诊很多低级别医院会诊标本，都存在以上问题，因固定差而直接影响免疫组化结

2 切片与烤

免组化检测的切厚以3,4 μm为宜，淋巴结组织可行2 μm厚切，太厚影染结果和诊断。因免疫组应步骤多，易出现脱片现象，需要载片处后方可使。处理方法:先将载玻用肥皂水洗后，放入清洁液中浸泡12,24 h，清水冲洗2 h，蒸馏水洗5遍，体积0.95乙醇浸泡后，用干净的绸布擦干，再挂。挂胶方法有很多，如: apes、铬矾明液、多聚赖氨酸等。切片裱片要完整，不能有气泡，烤片时温度不能过，65 ?烤30 min即可进行色。烤片时间

3 减少或消除非特异性

织中抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异

最常见的因是蛋白吸附于高电的胶原和结缔织成分上。常见的消除方法有:?在加第一抗体用体积数0.02,0.05山羊血清或牛血清封闭组织上带电荷，而去与第一抗体的非异性结合。此种方法般于不需抗修复的抗体或源性生物素较高的织效果佳。?体积分数0.03,0.06过氧化氢法是目前最常用的方法之一，我们认为体分数0.05过氧化氢处理10,15 min的效较好。?洗涤过程中用高盐缓冲液冲洗切片，也是消除非特异性染色方法之一。方法是将磷酸缓液中加入10 g/l的氯化钠(ph 7.4)。?稀释抗体浓度，但必须通过阳对照来掌握稀释的最佳浓度。我们的实践证明，应用京中杉试公司生的pv?9000二步法试剂盒，有效地避免内源性生素造成的

免疫组化理学上的应用常因甲醛固等素影响造成抗原失活。解因固定包埋导致抗原失活的问题有3个途径:?开发新抗以识别甲醛定组抗原或提免疫组化试剂的灵敏度;?用改良定液取代甲醛;?挽救因醛固定而失活的抗原，即抗原复。而后者因法简单而增敏效果显著，在病技术中得到广泛应用。抗修复响染结果的最关键因，目前最常用是加热沸法，少数用酶消化法。加热原修复是1991由shi等最先报道，其机制通过加热打开了组织抗原因甲醛固定所引起的抗原表位的交联。修复的方法有高法、微波法、浴等。英联邦疫细胞化学室间控组织(uk neqas?icc)进行的有105家实验室参与、历时两年的研究结果显示，er、pr染色偏弱是由于微波加热时间不足与实验中操作控制当所致，强烈推荐使用高压抗原修复2。国也有专家研究明，目前抗原修复最突出和最顽固的问题是修不够。各修复方法染色强度比较，高压法>水浴法>微法。抗原修复液常用的有枸橼酸缓冲液(ph 6.0)、edta缓冲液(ph 8.0,9.0)。在2008年全国病理学技术进展和应研讨会周小鸽教授做了下实验(图1):a类抗在任何ph条件下，修复效都很好;b类抗原在低和高ph时，修复效果好，但在中等ph时，

c类抗原着ph的增高，修复越来越好。如果验室只想用1种修复液，又能兼顾3类抗，就可择3条曲最靠近的区域所对的ph值，此处所对应的ph为8.0,9.0。因此，他认为高ph修复液比ph修复液更好。我们为压修复具有力稳定、受热匀、阳性检出率和阳强度高、背着色少等优点，对核色阳性的抗原用ph 9.0的edta修复液效果较好，胞浆胞染色阳性用ph 8.0的edta抗原修复液修复的较好，但如果采用ph 9.0的edta在高压修复时易脱片。高压修复的法是:先将高压锅内的修复煮沸，将切片放入高压锅内，将压力加热至大(105 kpa)1,2 min,加热功率要大于1 000 w。有研究表明，ki67与p53在用电磁炉热时，着功率的增强，阳强度反而减弱。们认为只要功率在800 w左右，不

5 标准化实验

免组化对照实验设立在免疫组化标准化中是极其必要的。随着病法律识的不断强，医患之间的矛盾越来越大，理医师的诊断风险也越来越大。这求医生染色结果有正确判断，同时也病理技术人提出了设立阳性和阴性对照的要求，这不但是对病人责，也是保护自己的一种方。阴性对照是用确定不含有待测抗原的组织作为阴对照组织，阳性对是对照组织中含有已知的抗3。我们认为在日常工作中设置阳性对照最关键，通常是用阑尾来做阳对照组，因为阑尾中含有多种组织分如上皮、淋巴

图1 3种抗原不同ph条件下修复效

总之，要做出好的免疫组化果，除了求病理技术员掌握丰富的论知识外，还要求有较强的责任，严格按标准化、规范化操作，只有这样才能更好地将免

【参考文献】

1王小亚,崔全才. 疫组织

2王伯?. 疫组织化

3王伯?, 李玉松. 病理学技术m. 北京:人民卫生出版社, 2001:365.

中

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